Summary
Este estudo descreve a medição direta da produção de glicose hepática em um modelo de rato com síndrome do ovário policístico usando um rastreador de glicose isotópico estável via veia da cauda em estados ricos em jejum e glicose em conjunto.
Abstract
A síndrome do ovário policístico (SPC) é uma doença comum que resulta em distúrbios do metabolismo da glicose, como resistência à insulina e intolerância à glicose. O metabolismo de glicose disregulado é uma manifestação importante da doença e é a chave para sua patogênese. Portanto, estudos envolvendo avaliação do metabolismo da glicose no PCOS são de extrema importância. Pouquíssimos estudos quantificaram a produção de glicose hepática diretamente nos modelos PCOS usando rastreadores de glicose não radioativos. Neste estudo, discutimos instruções passo a passo para a quantificação da taxa de produção de glicose hepática em um modelo de camundongo PCOS medindo o enriquecimento M+2 da glicose de [6,6-2H2], um rastreador de glicose isotópico estável, via cromatografia a gás - espectrometria de massa (GCMS). Este procedimento envolve a criação de uma solução estável de rastreador de glicose isotópica, o uso da colocação do cateter da veia da cauda e a infusão do rastreador de glicose em estados ricos em jejum e glicose no mesmo camundongo em conjunto. O enriquecimento da glicose [6,6-2H2]é medido utilizando-se derivado de pentaacetato em GCMS. Esta técnica pode ser aplicada a uma grande variedade de estudos envolvendo a medição direta da taxa de produção de glicose hepática.
Introduction
A síndrome do ovário policístico (SPC) é uma doença comum que ocorre em 12%-20% das mulheres em idade reprodutiva1,2. É uma doença complexa que resulta em fenótipos variáveis envolvendo ovários policísticos, menstruações irregulares e evidências clínicas ou laboratoriais de hiperandrogenemia, e é tipicamente diagnosticada quando uma mulher atende a dois dos três critérios3. Um aspecto predominante do SPC, e um fator-chave em sua patogênese, são os desarranjos metabólicos que são encontrados em mulheres que têm a doença. Mulheres com SPC têm maiores incidências de resistência à insulina, intolerância à glicose, obesidade e síndrome metabólica3,4,5,6. A resistência à insulina não é apenas uma manifestação da doença, mas acredita-se que contribua para sua patogênese, potencializando a ação do hormônio luteinizador no ovário, levando assim ao aumento da produção de androgênio7,8. Acredita-se que a resistência à insulina tenha várias origens possíveis, mas estudos sugerem que pode ser devido a padrões anormais de sinal do receptor de insulina9,10. Estudos avaliaram a resistência à insulina em pacientes com PCOS usando a técnica padrão-ouro do grampo hiperinsulinemico-euglicêmico11,12,13,14,15. Mulheres com SPC, independentemente do IMC, têm níveis mais elevados de resistência à insulina em comparação com os controles. O controle de insulina sobre a produção de glicose é prejudicado em distúrbios da resistência à insulina levando ao excesso de produção de glicose. Por exemplo, pacientes diabéticos têm aumentado as taxas de gliconeogênese e supressão prejudicada da glicogenólise16. Além disso, a supressão prejudicada da produção de glicose tem sido observada em ratos diabéticos17. Embora os estudos de grampo possam dar uma medida de resistência à insulina, poucos estudos no PCOS se concentram na medição direta da produção de glicose em estados em jejum e alimentados. Isso requer o uso de uma infusão isotópica de glicose não radioativa e medição através de espectrometria de massa.
Modelos animais têm sido amplamente utilizados em pesquisas de PCOS. Ambos os modelos de murina PCOS magra e obesa foram criados através da administração de andrógenos pré-natais, prepubertalmente ou pós-pubertally18. Os modelos de PCOS de roedores também demonstram diferenças metabólicas em comparação com seus respectivos controles. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram testes anormais de tolerância à glicose (GTT) em modelos de mouse PCOS (magros e obesos), consistentes com a literatura humana de PCOS19. O uso de um modelo animal magro e obeso permite uma investigação mais aprofundada sobre diferenças metabólicas. Especificamente, este modelo permite a avaliação da taxa de produção de glicose diretamente usando rastreadores de glicose isotópicas. Um dos rastreadores de glicose isotópica estáveis mais usados é a glicose [6,6-2H2]. O enriquecimento de glicose [6,6-2H2] pode ser medido usando um derivado de pentaacetato como descrito anteriormente20.
Neste estudo, nosso objetivo foi medir a taxa de produção de glicose hepática em jejum e estado rico em glicose em camundongos PCOS usando infusão de glicose isotópica. Essas técnicas podem ser aplicadas a uma ampla gama de experimentos envolvendo cinética de glicose.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina baylor.
1. Preparação de [6,6-2H2]glicose
- Um dia antes do procedimento, prepare o rastreador de glicose isótopo estável em soro fisiológico normal. Para este experimento, a glicose [6,6-2H2] foi usada como rastreador para medir a taxa de aparência da glicose plasmática.
NOTA: Neste experimento, a produção de glicose durante o jejum e as condições ricas em glicose foram medidas, de modo que o isótopo de glicose foi preparado em duas preparações diferentes. Prepare as soluções de forma que a dose final de infusão seja próxima de 1 mg/(kg·min) e 2 mg/(kg·min), respectivamente. Essas concentrações foram otimizadas por vários estudos piloto anteriores. - Prepare o primeiro infusor com apenas [6,6-2H2]glicose como rastreador para representar a condição de jejum dissolvendo estéril e livre de pyrogen [6,6-2H2]glicose em solução estéril de cloreto de sódio 0,9%.
- Prepare o segundo infundido dissolvendo tanto o rastreador de glicose [6,6-2H2], juntamente com a glicose não isotópica (~20 mg/kg·min) em solução estéril de cloreto de sódio 0,9% para simular a condição alimentada.
NOTA: No presente experimento, foi utilizada uma infusão constante de glicose de [6,6-2H2]a (~) 1,08 mg/(kg·min) (condição de jejum) e (~) 1,9 mg/kg·min (condição rica em glicose). Para imitar a "condição rica em glicose", a taxa de infusão d-glicose foi fixada em (~) 18,8 mg/(kg·min). - Uma vez que as soluções estejam preparadas, estéril filtre as soluções com um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 °C. Aqueça as soluções à temperatura ambiente antes da infusão. Carregue as soluções em seringas pré-rotuladas de 1 mL.
- Configure a bomba para facilitar uma infusão constante do primeiro infusor (para condição basal) contendo apenas o rastreador, e programe a bomba para uma infusão constante do isótopo a 150 μL/h por 3 h.
- No final do jejum de 3 horas, substitua a primeira seringa infundida pela segunda seringa infundida contendo o rastreador isotópico e a d-glicose (para o estado alimentado simulado), e forque a infusão para o intial 15 min a 600 μL/h. Coloque a bomba em uma infusão de taxa constante a 150 μL/h para as 3 horas adicionais.
2. Configuração de experimentos de infusão
- Remova os ratos de suas gaiolas domésticas e coloque-os em suas gaiolas de jejum 3h antes do início do experimento. Para este experimento, foi utilizado um camundongo de 4 meses da cepa C57BL/6J.
NOTA: Este procedimento não requer nenhuma analgesia antes ou durante o procedimento, dada a sua natureza minimamente invasiva. - Monte o equipamento de caging agrupando os ratos em um número definido de ratos por bomba de insulina. Coloque divisórias em cima de uma base plana e estável para fazer baias individuais para os ratos. É importante ter acesso ao cateter da veia traseira para que a infusão corra, para garantir que haja um entalhe na parte inferior da porta da gaiola.
NOTA: As gaiolas mostradas no vídeo foram feitas especificamente para este experimento. As gaiolas são claras e feitas de plexiglass. Há uma base plana e estável (equipamento padrão de caging) sobre a qual as partições se sentam. Esta configuração consiste em várias peças para permitir a facilidade de configuração em vários ambientes diferentes, dependendo da altura da mesa e das necessidades do experimentador. A porta da gaiola desliza para fechar e tem um entalhe na parte inferior para permitir que a cauda se encaixe. - Monte as seringas de 1 mL contendo 1 mL de infusão basal e, em seguida, conecte-se à tubulação da bomba de infusão usando o tubo de polietileno 0,28 mm ID x 0,61 mm.
- Prepare a bomba de infusão definindo a taxa para 150 μL/h, que é a taxa basal.
- Aqueça um banho de água a 48 °C.
- Prepare a estação de inserção do cateter adjacente ao banho de água contendo agulhas de 30 G 0,5 polegadas, tubos de 0,3 mm ID x 0,64 mm de tubos silasticos e fita transpora clara de 1 polegada.
- Após 3h de jejum, inicie o processo de inserção do cateter, que é detalhado abaixo.
3. Inserção do cateter
- Selecione um mouse e coloque-o em um suporte seguro com acesso à cauda. Um exemplo do que usar é uma garrafa cortada ao meio com um entalhe para a cauda. Coloque o suporte em uma base plana. Coloque uma fita sobre a porção proximal da cauda para permitir espaço para inserção de cateter de forma mais distral.
NOTA: O tipo de fita escolhida para esta tarefa deve ter resistência moderada e adesão. A fita de rotulagem multiuso baseada em papel foi usada neste experimento, pois é leve e fácil de descascar. - Prepare o cateter (agulha de 30 G presa a tubos silasticos de 0,3 mm e PE-10 foram esterilizados a gás) prendendo-o a uma seringa de 1 mL contendo descarga salina estéril heparinizada. Lave o cateter suavemente.
- Leve o rato para o banho de água e insira a cauda no banho de água por aproximadamente 30-45 s. Isso ajuda a dilatar a vasculatura da cauda para a colocação do cateter.
- Realize a inserção do cateter em condições estéreis. Uma vez que a cauda é aquecida, limpe a cauda com lenços de benzalkonium e coloque um pequeno grampo de jacaré de cobre, desdentado, que foi previamente contornado à forma da cauda, como um torniquete na extremidade proximal da cauda. Visualize a veia lateral da cauda sob uma lupa e, em seguida, insira cuidadosamente o cateter na veia da cauda e retire a agulha. Lave a solução suavemente para garantir a patência do cateter.
- Enrole um pedaço de fita transpora de 1 polegada ao redor do local de inserção para fixar o cateter. Remova o pequeno torniquete da cauda.
4. Configuração de infusão e primeira infusão
- Coloque o mouse em sua gaiola individual e feche a porta de correr, garantindo que a cauda esteja saliente através do entalhe e permaneça fora da gaiola.
- Coloque um pedaço adicional de fita sobre todo o cateter e a cauda para fixá-lo na placa base da gaiola. Multiuso colorido, fita de etiqueta foi usado para esta etapa.
- Desconecte a descarga do cateter da veia da cauda e coloque um pequeno grampo na tubulação silastic do cateter para evitar o fluxo de volta enquanto conecta a linha infundida da bomba.
- Uma vez conectado com segurança, remova o grampo e lave com a solução de escoramento, que consiste no infusor. Certifique-se de que a solução está clara na tubulação e não manchada de sangue.
- Anote o tempo de início da infusão para garantir que ela funcione pelo tempo total de aproximadamente 3h. Se várias gaiolas forem usadas simultaneamente, elas devem ser escalonadas para gerenciar os tempos de infusão de forma eficaz.
- Uma vez que as linhas de infusão estejam funcionando corretamente, remova a tampa do mouse. Coloque a cama padrão ao redor do mouse.
- Inicie a infusão com o primeiro infusor contendo o rastreador e execute-o por 3h continuamente. Durante a duração da infusão, continue a verificar o bem-estar dos camundongos, bem como as linhas de infusão. Certifique-se de que a tubulação de infusão está devidamente protegida e que não há vazamentos dos pontos de conexão da linha.
5. Amostragem de sangue
- Após a conclusão da primeira infusão, pare a infusão, coloque um grampo na tubulação sística no cateter para evitar o fluxo de volta. Remova suavemente os ratos de seus gabinetes sem perturbar o cateter para coletar sangue. Coloque-os em um ponto perto das gaiolas para tirar sangue. Para este experimento, os camundongos foram submetidos à venipuntura da bochecha usando uma lanceta de 4 mm.
- Coletar ~75 μL de sangue no frasco desejado. Para desproteinizar amostras em preparação para espectrometria de massa, adicione aproximadamente 15 μL de sangue a 500 μL de acetona. O restante do sangue pode ser usado para verificar o nível de glicose no sangue através do glucometer e/ou centrifusado para separar o plasma para futuros ensaios hormonais.
6. Segunda infusão
- Remova os infundidos das bombas de seringa desconectando o tubo das seringas e substitua-o pelo segundo infusor contendo o rastreador junto com a glicose. Repita as etapas 4.2 a 4.7 usando a infusão de glicose isotópica rica em glicose.
- Para chegar a um estado estável, execute um bolus do segundo infusor a 600 μL/h por 15 min. Observe o horário de partida para cada grupo de gaiolas. Diminua a taxa de infusão para 150 μL/h para completar as 3h do tempo total de infusão.
- Repita as etapas 5.1 e 5.2.
- Pare a bomba de infusão e remova o cateter da veia da cauda suavemente, aplique pressão nos locais do cateter até que o sangramento pare e devolva os ratos para suas gaiolas domésticas.
- Santize e desinfete completamente a configuração de caging com água e sabão padrão.
NOTA: Este é um procedimento de sobrevivência. Os ratos podem ser devolvidos às gaiolas e mantidos para mais experiências, se necessário. Recomenda-se que não seja realizada mais experiência por pelo menos uma semana após este procedimento para garantir o bem-estar animal adequado.
7. Espectrometria de massa
- Envie as amostras para espectrometria de massa.
- Análises
- Meça o enriquecimento isotópico de [6,6-2H2]glicose por gascromatografia - espectrometria de massa (GCMS) utilizando o derivado pentaacetato21,22. Resumidamente, este método envolve a preparação do derivado pentaacetato da glicose, seguido da análise amostral utilizando GCMS 20,22.
- Cálculos
- Realizar todas as medidas cinéticas em condições estáveis de estado. A taxa total de aparência de glicose plasmática (glicose Ra) foi calculada a partir do enriquecimento M+2 de glicose [6,6-2H2]no plasma usando equações de diluição de isótopos estabelecidas21. Em condições estáveis do estado, supõe-se que a taxa de aparecimento de glicose é igual à taxa de desaparecimento da glicose. Taxa de produção de glicose endógena (mg/(kg·min)) (GPR) = glicoseRa - glicose exógena.
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Representative Results
Utilizando equações de diluição de isótopos descritas anteriormente, a taxa total de glicose plasmática (glucoseRa) foi calculada a partir do enriquecimento M+2 de [6,6-2H2]glicose em condições de jejum e glicose rica usando o derivado pentaacetato21. Em condições de estado estável, presume-se que a taxa de aparecimento de glicose seja igual à taxa de desaparecimento da glicose. No grupo controle, a glicose total foi de 19,98 ± 2,53 mg/(kg·min) após jejum de 6h e 25,80 ± 1,76 mg/(kg·min) em condições ricas em glicose. Utilizando o cálculo listado acima, a RGP foi de 19,08 ± 2,53 mg/(kg·min) após jejum de 6h e 8,56 ± 1,40 mg/(kg·min)) em condições ricas em glicose (Tabela 1 e Figura 1).
Figura 1: Taxa de produção de glicose em condições ricas em jejum e glicose Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Jejum | Rico em glicose | |
| (média ± SD) | (média ± SD) | |
| Glicose Ra, mg/(kg.min) | 19.98 ± 2.53 | 25.80 ± 1.76 |
| GPR, mg/ (kg.min) | 19.08 ± 2.53 | 8.56 ± 1.40 |
| Ra, taxa de aparência de glicose; GPR, taxa de produção de glicose | ||
Tabela 1: Ra e GPR em condições de jejum e glicose ricas em glicose
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Discussion
Hiperglicemia e metabolismo de glicose anormal/homeostase são características do PCOS. O nível de glicose no sangue é mantido por uma combinação de glicose da dieta e produção de glicose através da glicogenólise e da gliconeogênese e glicogênese, sob o controle de hormônios e enzimas. A produção de glicose hepática é suprimida pela presença de aumento dos níveis de glicose circulante. Em desordens do metabolismo anormal da glicose, a regulação da supressão da produção de glicose está comprometida levando à hiperglicemia. Embora muitos estudos tenham demonstrado medidas indiretas da produção de glicose hepática em um modelo animal PCOS, poucos mediram diretamente a produção de glicose hepática. Neste estudo descrevemos uma maneira simples de medir a taxa de produção de glicose hepática em vários camundongos ao mesmo tempo. Esta técnica pode ser aplicada a muitos estudos envolvendo o metabolismo da glicose em vários modelos de camundongos. Além disso, essa técnica pode servir como base sobre a qual medidas adicionais podem ser aplicadas, como a medição da gliconeogênese e da glicogenólise20,23.
Os componentes críticos deste experimento são a inserção do cateter e a definição das medidas exatas de glicose e glicose natural [6,6-2H2]ao criar soluções de infusão para realizar adequadamente a GCMS. A técnica de inserção do cateter utilizada é descrita por Marini et al. 200624. Embora existam métodos invasivos de administração de infusões e amostragem através de artéria carótida e cateteres vesículas jugular25,26,27, a inserção de um cateter de veias traseiras minimamente invasiva atinge os mesmos objetivos de forma menos invasiva e menos intensiva. Embora dois cateteres possam ser colocados em cada veia da cauda, um para infusão e outro para amostragem, utilizamos um cateter para infusão e, em seguida, realizamos a amostragem via venipuntura da bochecha, uma vez que havia apenas dois pontos de tempo para amostragem. No entanto, se um estudo incluiu vários pontos de tempo para amostragem, a inserção de um segundo cateter de veias da cauda pode ajudar a facilitar este 28.
Medições exatas são cruciais para cálculos envolvendo espectrometria de massa para garantir resultados precisos. Usamos o rastreador de glicose para medir o aparecimento da glicose é [6,6-2H2]glicose21. Embora outros rastreadores não radioativos tenham sido empregados em outros estudos, este é um isótopo estável que é comumente usado em nosso laboratório20. Rastreadores de glicose estáveis são preferidos em vez de rastreadores de glicose radioativos devido ao melhor perfil de segurança, presença natural, falta de meia-vida que afeta o tempo de estudo e capacidade de combinar diferentes rastreadores29. A escolha do rastreador depende da discrição e da expertise dos pesquisadores que realizam o estudo.
Existem algumas limitações deste estudo, incluindo a demanda técnica do procedimento. No entanto, em comparação com técnicas mais invasivas para cateterismo (ou seja, cateterização da artéria carótida e veia jugular externa), essa técnica é simples, eficiente e menos mórbida. Se utilizando dois cateteres da veia da cauda, houve relatos de valores de enriquecimento errôneos da infusão interferindo no cateter amostral24. No entanto, na maioria dos estudos, a necessidade de múltiplas amostras não é justificada porque o estado estável é conhecido. Por fim, embora a espectrometria de massa dê medidas precisas, requer habilidades adicionais, experiência e custo.
Neste estudo, descrevemos uma maneira simples e precisa de medir a taxa de produção total de glicose hepática em um modelo de mouse PCOS. Esta técnica deve servir de base para múltiplos estudos envolvendo o metabolismo de glicose de modelos de camundongos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de formação do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Baylor College of Medicine (ALG) e R-01 (Grant # DK114689) para CSB, SC e JM dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
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