Summary
本研究描述了在多囊卵巢综合征小鼠模型中直接测量肝葡萄糖产生的方法是使用稳定的同位素葡萄糖示踪剂 通过 尾静脉在空腹和富葡萄糖状态中串联。
Abstract
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见疾病，可导致葡萄糖代谢紊乱，如胰岛素抵抗和葡萄糖耐受。葡萄糖代谢失调是该疾病的重要表现，是其发病机制的关键。因此，涉及评估PCOS中葡萄糖代谢的研究至关重要。很少有研究使用非放射性葡萄糖示踪剂直接在PCOS模型中量化肝葡萄糖的产生。在本研究中，我们讨论了通过气相色谱 - 质谱法（GCMS）测量[6，6-2H2]葡萄糖（一种稳定的同位素葡萄糖示踪剂）的M + 2富集来量化PCOS小鼠模型中肝葡萄糖产生速率的分步说明。该过程涉及创建稳定的同位素葡萄糖示踪剂溶液，使用尾静脉导管放置和在同一小鼠中同时在空腹和富葡萄糖状态下输注葡萄糖示踪剂。在GCMS中使用五乙酸衍生物测量[6，6-2H2]葡萄糖的富集。该技术可应用于涉及直接测量肝葡萄糖产生速率的各种研究。
Introduction
多囊卵巢综合征 （PCOS） 是一种常见疾病，见于 12%-20% 的育龄妇女1，2。它是一种复杂的疾病，导致表型多发性变异，包括多囊卵巢、月经不调和高雄激素血症的临床或实验室证据，通常在女性符合三个标准中的两个时诊断出来3。PCOS的一个主要方面，也是其发病机制的一个关键因素，是在患有该疾病的女性中发现的代谢紊乱。患有PCOS的女性胰岛素抵抗，葡萄糖不耐受，肥胖和代谢综合征的发生率较高3，4，5，6。胰岛素抵抗不仅是该疾病的一种表现，而且被认为通过增强卵巢中黄体生成素的作用来促进其发病机制，从而导致雄激素产生增加7，8。胰岛素抵抗被认为有几种可能的起源，但研究表明这可能是由于胰岛素受体信号传导的异常模式9，10。研究已经使用高胰岛素血症 - 正常血糖钳夹的金标准技术评估了PCOS患者的胰岛素抵抗11，12，13，14，15。与对照组相比，无论BMI如何，患有PCOS的女性具有更高水平的胰岛素抵抗。胰岛素对葡萄糖产生的控制在导致葡萄糖产生过量的胰岛素抵抗性疾病中受损。例如，糖尿病患者的糖异生率增加，糖原溶解抑制受损16。此外，在糖尿病大鼠中观察到葡萄糖产生的抑制受损17。虽然钳夹研究可以测量胰岛素抵抗，但PCOS中很少有研究专注于直接测量空腹和进食状态下的葡萄糖产生。这需要使用非放射性同位素葡萄糖示踪剂输注和 通过 质谱法进行测量。
动物模型已被广泛用于PCOS研究。瘦型和肥胖型 PCOS 小鼠模型都是通过产前、青春期前或青春期后施用雄激素来创建的18。啮齿动物PCOS模型也显示出与各自对照组相比的代谢差异。我们实验室先前的数据显示PCOS小鼠模型（瘦和肥胖）中的葡萄糖耐量测试异常（GTT），与人类PCOS文献一致19。使用瘦肉和肥胖的动物模型可以进一步研究代谢差异。具体而言，该模型允许使用同位素葡萄糖示踪剂直接评估葡萄糖产生速率。最常用的稳定同位素葡萄糖示踪剂之一是[6，6-2H2]葡萄糖。[6，6-2H2]葡萄糖富集可以使用前面描述的五乙酸衍生物进行测量20。
在这项研究中，我们的目标是使用同位素葡萄糖输注测量PCOS小鼠在空腹和富葡萄糖状态下肝葡萄糖的产生率。这些技术可以应用于涉及葡萄糖动力学的广泛实验。
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Protocol
所有动物程序均由贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. [6，6-2H2]葡萄糖的制备
- 手术前一天，在生理盐水中制备稳定的同位素葡萄糖示踪剂。对于该实验，使用[6，6-2H2]葡萄糖作为示踪剂来测量血浆葡萄糖出现率。
注意：在本实验中，测量了空腹和富葡萄糖条件下的葡萄糖产生，因此在两种不同的制剂中制备葡萄糖同位素。以最终输注剂量分别接近1mg / （kg·min）和2mg / （kg·min）的方式制备溶液。这些浓度通过先前的几项试点研究进行了优化。 - 制备第一种仅注入[6，6-2H2]葡萄糖作为示踪剂，通过将无菌和不含热原的[6，6-2H2]葡萄糖溶解在无菌的0.9%氯化钠溶液中来代表空腹状况。
- 通过将[6，6-2H2]葡萄糖示踪剂与非同位素葡萄糖（〜20mg / kg·min）溶解在无菌的0.9%氯化钠溶液中以模拟进料条件来制备第二次输注物。
注意：在本实验中，使用[6，6-2H2]葡萄糖在（~）1.08mg/（kg·min）（空腹条件）和（~）1.9mg/kg·min（富含葡萄糖的条件）下注恒定速率的葡萄糖。为了模拟"富含葡萄糖的条件"，将D-葡萄糖输注速率设定为（~）18.8mg/（kg·min）。 - 制备溶液后，用0.22μm过滤器无菌过滤溶液并储存在4°C。 在输注之前将溶液加热到室温。将溶液加载到预先标记的1 mL注射器上。
- 设置泵以促进仅包含示踪剂的第一次输注（用于基础条件）的定速恒定速率输注，并对泵进行编程，以150μL / h的恒定速率输注同位素3小时。
- 在3小时禁食设置结束时，用含有同位素示踪剂和D-葡萄糖的第二个输注注射器替换第一个输注注射器（用于模拟进给状态），并以600μL / h启动15分钟。将泵设置为以150μL / h的恒定速率输注，再持续3小时。
2. 输液实验的设置
- 在实验开始前3小时，将小鼠从家笼中取出并将它们放入禁食笼中。对于该实验，使用来自C57BL / 6J菌株的4个月大雌性小鼠。
注意：鉴于其微创性质，该程序在手术前或手术期间不需要任何镇痛。 - 通过将小鼠分组到每个胰岛素泵的设定数量的小鼠中来组装笼中设备。将隔板放在平坦，稳定的底座上，为小鼠制作单独的摊位。重要的是要进入尾静脉导管以便输液运行，因此请确保笼门底部有一个缺口。
注意：视频中显示的笼子是专门为此实验制作的。笼子是透明的，由有机玻璃制成。有一个平坦，稳定的底座（标准笼式设备），隔板位于其上。该设置由几个部分组成，以便根据桌子的高度和实验者的需求，在几种不同的环境中轻松设置。笼子的门滑动关闭，底部有一个缺口，允许尾巴通过。 - 组装含有 1 mL 基底输液的 1 mL 注射器，然后使用 0.28 mm 内径 x 0.61 mm 的聚乙烯管连接到输液泵管。
- 通过将速率设置为150μL / h（这是基础速率）来准备输注泵。
- 将水浴加热至48°C。
- 准备靠近水浴的导管插入站，其中包含30 G 0.5英寸针头，0.3 mm内径x 0.64毫米硅胶管和1英寸透明转孔胶带。
- 禁食3小时后，开始导管插入过程，详见下文。
3. 导管插入
- 选择一个鼠标并将其放在可以进入尾部的安全支架中。使用什么的一个例子是将瓶子切成两半，尾巴上有一个缺口。将支架放在平坦的底座上。在尾部的近端部分放置一块胶带，以便为更远端的导管插入留出空间。
注：为此任务选择的胶带类型必须具有中等强度和粘合性。该实验中使用了多用途的纸质标签胶带，因为它温和且易于剥离。 - 准备导管（30 G针连接到0.3mm硅胶管和PE-10气体灭菌），方法是将其连接到含有无菌肝素化盐水冲洗的1mL注射器上。轻轻冲洗导管。
- 将鼠标带到水浴中，将尾巴插入水浴中约30-45秒。这有助于扩张尾部脉管系统以进行导管放置。
- 在无菌条件下进行导管插入。一旦尾巴变暖，用苯扎氯铵湿巾清洁尾巴，并放置一个小的铜，无齿鳄鱼钳，该钳以前被轮廓化为尾巴的形状，作为尾巴近端的止血带。在放大镜下观察侧尾静脉，然后小心地将导管插入尾静脉并取出针头。轻轻冲洗溶液以确保导管的通畅性。
- 在插入部位周围缠绕一块1英寸的经孔胶带以固定导管。从尾部取下小止血带。
4. 输液设置和第一次输液
- 将鼠标放入单独的笼子中并关闭滑动门，确保尾巴通过凹口突出并保持在笼子外。
- 在整个导管和尾部上再放一块胶带，将其固定在笼子的底板上。多用途彩色标签胶带用于此步骤。
- 断开冲洗与尾静脉导管的连接，并在导管的硅胶管上放置一个小夹子，以防止在从泵连接输液管路时回流。
- 牢固连接后，取下夹具并用由输液组成的底漆溶液冲洗。确保溶液在管道中是透明的，没有血迹。
- 记下输注开始的时间，以确保其运行总时间约为3小时。如果同时使用多个笼子，则应交错放置，以有效管理输液时间。
- 一旦注输液管线正常工作，请从鼠标上取下盖子。将标准床上用品放在鼠标周围。
- 用含有示踪剂的第一次输注开始输注，并连续运行3小时。在输液期间，继续检查小鼠的健康状况以及输液管路。确保输液管已正确固定，并且线路连接点没有泄漏。
5. 血液采样
- 第一次输注完成后，停止输注，在导管上的弹性管上放置一个夹子以防止回流。轻轻地将小鼠从其围栏中取出而不干扰导管以收集血液。将它们放在笼子附近的地方抽血。对于该实验，小鼠使用4毫米柳叶刀进行了脸颊静脉穿刺。
- 在所需的小瓶中收集约75μL血液。为了在制备质谱分析中使样品脱蛋白，将约15μL血液加入500μL丙酮中。剩余的血液可用于 通过 血糖仪检查血糖水平和/或离心分离血浆以用于未来的激素测定。
6. 第二次输液
- 通过断开管道与注射器的连接，将其与注射器断开，并将其替换为含有示踪剂和葡萄糖的第二次输液，从而从注射器泵中取出输液。使用富含葡萄糖的同位素葡萄糖输注重复步骤4.2至4.7。
- 要达到稳定状态，以600μL / h的速度推注第二次输注15分钟。记下每组笼子的开始时间。将输注速率降低至150μL / h以完成总输注时间的3小时。
- 重复步骤 5.1 和 5.2。
- 停止输液泵并轻轻取出尾静脉导管，在导管部位施加压力直到出血停止，然后将小鼠送回其家庭笼中。
- 用标准肥皂和水彻底消毒笼子设置。
注意：这是一个生存过程。如果需要，可以将小鼠放回笼子并保存以进行进一步的体验。建议在手术后至少一周内不要进行进一步的体验，以确保足够的动物福利。
7. 质谱
- 将样品送出进行质谱分析。
- 分析
- 使用五乙酸衍生物通过胃色谱 - 质谱（GCMS）测量[6，6-2H2]葡萄糖的同位素富集21，22。简而言之，该方法涉及葡萄糖的五乙酸衍生物的制备，然后使用GCMS 20，22进行样品分析。
- 计算
- 在稳态条件下执行所有动力学测量。使用已建立的同位素稀释方程，根据血浆中[6，6-2H2]葡萄糖的M+ 2富集计算总血浆葡萄糖出现率（葡萄糖Ra）21。在稳态条件下，假设葡萄糖的出现速率等于葡萄糖的消失速率。内源性葡萄糖产生率（mg/（kg·min））（GPR）=葡萄糖Ra - 外源性葡萄糖。
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Representative Results
使用先前描述的同位素稀释方程，使用五乙酸衍生物从空腹和富葡萄糖条件下的M + 2富集[6，6-2H2]葡萄糖计算总血浆葡萄糖率（葡萄糖Ra）21。在稳态条件下，假设葡萄糖的出现速率等于葡萄糖的消失速率。对照组，空腹6 h后总葡萄糖Ra为19.98±2.53 mg/（kg·min），富糖条件下总葡萄糖Ra为25.80±1.76 mg/（kg·min）。使用上面列出的计算，空腹6小时后GPR为19.08±2.53 mg /（kg·min），在富含葡萄糖的条件下为8.56±1.40 mg /（kg·min））（表1和图1）。
图1：空腹和富含葡萄糖的条件下的葡萄糖生产率 请单击此处查看此图的放大版本。
| 禁食 | 富含葡萄糖 | |
| （平均±标清） | （平均±标清） | |
| 葡萄糖拉，毫克/（公斤/分钟） | 19.98 ± 2.53 | 25.80 ± 1.76 |
| GPR，毫克/（公斤/分钟） | 19.08 ± 2.53 | 8.56 ± 1.40 |
| Ra，葡萄糖出现率;GPR，葡萄糖产量 | ||
表1：空腹和富含葡萄糖的条件下的Ra和GPR
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Discussion
高血糖和葡萄糖代谢/稳态异常是 PCOS 的特征。血糖水平通过饮食中的葡萄糖和葡萄糖 通过 糖原分解和糖异生和糖原生成的组合来维持，在激素和酶的控制下。肝葡萄糖的产生因循环葡萄糖水平升高而受到抑制。在葡萄糖代谢异常的疾病中，葡萄糖产生的抑制调节受到损害，导致高血糖。虽然许多研究表明，在PCOS动物模型中间接测量了肝葡萄糖的产生，但很少有人直接测量肝葡萄糖的产生。在这项研究中，我们描述了一种直接的方法来同时测量多只小鼠的肝葡萄糖产生速率。该技术可应用于各种小鼠模型中涉及葡萄糖代谢的许多研究。此外，该技术可以作为应用其他测量的基础，例如糖异生和糖原分解的测量20，23。
该实验的关键组成部分是导管插入和定义[6，6-2H2]葡萄糖和天然葡萄糖在产生输注溶液时的精确测量值，以便充分执行GCMS。使用的导管插入技术由Marini等人描述，200624。虽然有侵入性方法通过颈动脉和颈静脉导管进行输注和取样25，26，27，但插入微创尾静脉导管以侵入性和时间密集度较小的方式实现了相同的目标。虽然每个尾静脉可以放置两根导管，一根用于输液，一根用于采样，但我们使用一根导管进行输注，然后通过脸颊静脉穿刺进行采样，因为只有两个采样时间点。但是，如果一项研究包括多个采样时间点，则插入第二尾静脉导管可以帮助促进这一点28。
精确的测量对于涉及质谱的计算至关重要，以确保准确的结果。我们使用葡萄糖示踪剂来测量葡萄糖的外观是[6，6-2H2]葡萄糖21。虽然其他非放射性示踪剂已被用于其他研究，但这是我们实验室中常用的稳定同位素20。稳定的葡萄糖示踪剂优于放射性葡萄糖示踪剂，因为它具有更高的安全性、自然存在、缺乏影响研究时间的半衰期以及组合不同示踪剂的能力29。示踪剂的选择取决于进行研究的研究人员的自由裁量权和专业知识。
这项研究有一些局限性，包括程序的技术要求。然而，与更具侵入性的导管插入术（即颈动脉和颈外静脉导管插入术）相比，该技术简单、高效且发病率较低。如果使用两根尾静脉导管，则有报道称输液的错误富集值干扰了采样导管24。然而，在大多数研究中，不需要多个样品，因为稳态是已知的。最后，尽管质谱法提供了精确的测量，但它需要额外的技能，专业知识和成本。
在这项研究中，我们描述了一种在PCOS小鼠模型中测量总肝葡萄糖产生速率的简单，准确的方法。该技术应作为涉及小鼠模型葡萄糖代谢的多项研究的基础。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了贝勒医学院（ALG）妇产科系的培训资助以及美国国立卫生研究院为CSB，SC和JM提供的R-01研究补助金（补助金编号DK114689）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride solution | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringe | VWR | 75846-756 | Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution) |
| 1-inch clear transpore tape | 3M | 70200400169 | |
| 1-inch Labeling tape | Fisher | GS07F161BA | Brand is example |
| 5 mL syringe containing heparanized saline flush | McKesson | 191-MIH-2235 | One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride) |
| 5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets | Fisher Scientific | NC9891620 | 5 mm if animal is between 2 and 6 months |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Advanced hot plate stirrer | VWR | 97042-602 | Brand is example |
| BD 27 gauge 0.5 inch needles | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 gauge 0.5 inch needles | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Beaker, 1000 mL | Any brand | ||
| Caging pellets | |||
| Clear VOA glass vials with closed-top cap | Fisher Scientific | 05-719-120 | For storage of acetone and blood draw samples |
| Copper toothless alligator clamp for tourniquet | Amazon | Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper | |
| D-(+)-glucose >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucose (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD | VWR | 62999-042 | |
| Magnifying glass | Amazon | Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand | |
| Microbalance | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Any similar model with 0.0001g accuracy can be used |
| Nalgene bottle, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom |
| PHD Ultra multi-syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| Plexiglass sheet | Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion | ||
| Plexiglass sheets and dividers | Any brand; used to cage mice during infusion |
References
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al. Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria. Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).
- Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group . Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).
- Goodarzi, M. O., et al. Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis. Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).
- Azziz, R. Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).
- Baskind, N. E., Balen, A. H. Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome. Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).
- Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).
- Bremer, A. A. Polycystic ovary syndrome in the pediatric population. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).
- Dunaif, A., et al. Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).
- Højlund, K., et al. Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment. Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).
- Moghetti, P., et al. Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).
- Ovalle, F., Azziz, R. Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus. Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).
- Dunaif, A., et al. Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome. Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).
- Hutchison, S. K., et al. Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).
- Stepto, N. K., et al. Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp. Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).
- Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with "mild" and "severe" type 2 diabetes. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).
- Blesson, C. S., et al. Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats. Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538 (2019).
- Caldwell, A. S., et al. Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models. Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).
- Chappell, N. R., et al. Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes. Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).
- Chacko, S. K., et al. Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide. Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).
- Bier, D. M., et al. Measurement of "true" glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose. Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).
- Chacko, S. K., Sunehag, A. L. Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).
- Chacko, S. K., et al. Effect of ghrelin on glucose regulation in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice. Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).
- Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917 (2014).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188 (2011).
- Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739 (2012).
- Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. In vivo urea kinetic studies in conscious mice. The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).
- Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. How to measure hepatic insulin resistance. Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).
