Summary
Dette bidrag beskriver, hvordan man opsætter proteinkrystallisation på krystal-mod-krystal-enheder, og hvordan man udfører automatiseret seriel dataindsamling ved stuetemperatur ved hjælp af on-chip-krystalliseringsplatformen.
Abstract
Biokemiske reaktioner og biologiske processer kan bedst forstås ved at demonstrere, hvordan proteiner overgår mellem deres funktionelle tilstande. Da kryogene temperaturer er ikke-fysiologiske og kan forhindre, afskrække eller endda ændre proteinstrukturdynamik, er en robust metode til rutinemæssige røntgendiffraktionseksperimenter ved stuetemperatur meget ønskelig. Krystal-på-krystal-enheden og dens ledsagende hardware og software, der anvendes i denne protokol, er designet til at muliggøre in situ-røntgendiffraktion ved stuetemperatur for proteinkrystaller i forskellige størrelser uden prøvemanipulation. Her præsenterer vi protokollerne for de vigtigste trin fra enhedssamling, on-chip krystallisering, optisk scanning, krystalgenkendelse til røntgenskudsplanlægning og automatiseret dataindsamling. Da denne platform ikke kræver krystalhøst eller nogen anden prøvemanipulation, kan hundreder til tusinder af proteinkrystaller dyrket på chip introduceres i en røntgenstråle på en programmerbar og høj kapacitet.
Introduction
På grund af de ioniserende virkninger af røntgenstråling har proteinkrystallografi i høj grad været begrænset til kryogene forhold i de sidste tre årtier. Derfor stammer den nuværende viden om proteinbevægelser under dens funktion i vid udstrækning fra sammenligninger mellem statiske strukturer observeret i forskellige tilstande under kryogene forhold. Kryogene temperaturer forhindrer imidlertid uundgåeligt udviklingen af en biokemisk reaktion eller interkonvertering mellem forskellige konformationstilstande, mens proteinmolekyler er på arbejde. For direkte at observere proteinstrukturdynamik ved atomopløsning ved krystallografi er der behov for robuste og rutinemæssige metoder til udførelse af diffraktionseksperimenter ved stuetemperatur, hvilket kræver tekniske innovationer inden for prøvelevering, dataindsamling og posterior dataanalyse. Til dette formål har de seneste fremskridt inden for seriel krystallografi tilbudt nye muligheder for at fange de molekylære billeder af mellemprodukter og kortvarige strukturelle arter ved stuetemperatur 1,2,3. I modsætning til strategien "en-krystal-en-datasæt", der i vid udstrækning anvendes i konventionel kryokrystallografi, vedtager seriel krystallografi en dataindsamlingsstrategi svarende til enkeltpartikel kryo-elektronmikroskopi. Specifikt indsamles de eksperimentelle data i seriel krystallografi i små fraktioner fra et stort antal individuelle prøver efterfulgt af intensiv databehandling, hvor datafraktioner evalueres og kombineres til et komplet datasæt til bestemmelse af 3D-struktur4. Denne "one-crystal-one-shot"-strategi letter effektivt røntgenstrålingsskaderne på proteinkrystaller ved stuetemperatur via en diffraktion før destruktionsstrategi5.
Da seriel krystallografi kræver et stort antal proteinkrystaller for at fuldføre et datasæt, udgør det store tekniske udfordringer for mange biologiske systemer, hvor proteinprøver er begrænsede og / eller delikat krystalhåndtering er involveret. En anden vigtig overvejelse er, hvordan man bedst bevarer krystalintegriteten i serielle diffraktionseksperimenter. In situ-diffraktionsmetoderne løser disse problemer ved at tillade proteinkrystaller at diffraktere direkte fra, hvor de vokser uden at bryde krystallisationskammerets segl 6,7,8,9. Disse håndteringsfrie metoder er naturligvis kompatible med storstilet seriel diffraktion. Vi har for nylig rapporteret design og implementering af en krystallisationsanordning til in situ-diffraktion baseret på et krystal-på-krystal-koncept - proteinkrystaller dyrket direkte på monokrystallinsk kvarts11. Denne "krystal-på-krystal" enhed tilbyder flere fordele. For det første har den et røntgen- og lysgennemsigtigt vindue lavet af et monokrystallinsk kvartssubstrat, der producerer lidt baggrundsspredning, hvilket resulterer i fremragende signal-støj-forhold i diffraktionsbilleder fra proteinkrystaller. For det andet er enkeltkrystalkvarts en fremragende dampspærre svarende til glas og derved giver et stabilt miljø for proteinkrystallisation. I modsætning hertil er andre krystallisationsanordninger, der anvender polymerbaserede substrater, tilbøjelige til at tørre på grund af dampgennemtrængelighed, medmindre polymermaterialet har en betydelig tykkelse, hvilket følgelig bidrager til høj baggrundsspredning10. For det tredje muliggør denne enhed levering af et stort antal proteinkrystaller til røntgenstrålen uden nogen form for krystalmanipulation eller høst, hvilket er afgørende for at bevare krystalintegriteten11.
For at strømline serielle røntgendiffraktionseksperimenter ved hjælp af krystal-på-krystal-enhederne har vi udviklet en diffraktometerprototype for at lette let skift mellem den optiske scanning og røntgendiffraktionstilstand12. Dette diffraktometer har et lille fodaftryk og er blevet brugt til seriel dataindsamling ved to strålelinjer af Advanced Photon Source (APS) på Argonne National Laboratory. Specifikt brugte vi BioCARS 14-ID-B til Laue-diffraktion og LS-CAT 21-ID-D til monokromatisk svingning. Denne diffraktometerhardware er ikke påkrævet, hvis en synkrotron- eller røntgenfri elektronlaserstrålelinje er udstyret med to nøglefunktioner: (1) motoriseret prøvepositionering med et vandringsområde på ±12 mm rundt om røntgenstrålen i alle retninger; og (2) et digitalkamera på aksen til krystalvisning under lysbelysning, der er sikkert for proteinkrystaller under undersøgelse. Den monokrystallinske kvartsenhed udgør sammen med et bærbart diffraktometer og styringssoftwaren til optisk scanning, krystalgenkendelse og automatiseret in situ-dataindsamling tilsammen inSituX-platformen til seriel krystallografi. Selvom denne udvikling primært er motiveret af dens dynamiske krystallografiapplikationer ved hjælp af en polykromatisk røntgenkilde, har vi demonstreret potentialet i denne teknologi til at understøtte monokromatiske svingningsmetoder10,12. Med automatisering tilbyder denne platform en seriel dataindsamlingsmetode med høj kapacitet ved stuetemperatur med overkommeligt proteinforbrug.
I dette bidrag beskriver vi detaljeret, hvordan man opsætter on-chip krystallisation i et vådt laboratorium, og hvordan man udfører seriel røntgendataindsamling ved en synkrotronstrålelinje ved hjælp af inSituX-platformen.
Batchmetoden anvendes til at opstille on-chip krystallisation under en betingelse svarende til dampdiffusionsmetoden opnået for den samme proteinprøve (tabel 1). Som udgangspunkt anbefaler vi at bruge bundfald ved 1,2-1,5x koncentration af det til dampdiffusionsmetoden. Om nødvendigt kan batchkrystallisationstilstanden optimeres yderligere via fingitterscreening. Kvartsskiver er ikke nødvendige for optimeringsforsøg; glasdæksler kan bruges i stedet (se nedenfor). Delvist indlæste krystallisationsenheder anbefales for at holde optimeringsforsøg i mindre skala. En række proteinprøver er blevet krystalliseret med succes på sådanne anordninger ved anvendelse af batchmetoden10 (tabel 1).
Selve enheden består af følgende dele: 1) en ydre ring; 2) to kvarts wafers; 3) en skivelignende shim af plast eller rustfrit stål; 4) en fastholdelsesring 5) mikroskop nedsænkningsolie som fugemasse (figur 1). Det samlede volumen af krystallisationsopløsningen indlæst på en chip afhænger af formålet med eksperimentet. Krystallisationskammerets kapacitet kan justeres ved at vælge en shim af forskellig tykkelse og / eller indvendig diameter. Vi opsætter rutinemæssigt krystallisationsanordninger på 10-20 μL i kapacitet ved hjælp af shims på 50-100 μm i tykkelse. En typisk enhed kan producere titusinder til tusinder af proteinkrystaller, der er tilstrækkelige til seriel dataindsamling (figur 2).
Når det lykkes, vil on-chip krystallisation producere titusinder til hundreder eller endda tusinder af proteinkrystaller på hver kvartsenhed klar til røntgendiffraktion. Ved en synkrotronstrålelinje er en sådan anordning monteret på et tre-akset oversættelsestrin af diffraktometeret ved hjælp af en kinematisk mekanisme. Krystalliseringsvinduet på en monteret enhed scannes optisk og afbildes i titusinder til hundredvis af mikrografer. Disse mikrografer sys derefter i en montage med høj opløsning. For lysfølsomme krystaller kan optisk scanning udføres under infrarødt (IR) lys for at undgå utilsigtet fotoaktivering. En computer vision software er blevet udviklet til at identificere og lokalisere proteinkrystaller tilfældigt fordelt på enheden. Disse krystaller rangeres derefter efter deres størrelse, form og position for at informere eller guide dataindsamlingsstrategien i seriel krystallografi. For eksempel kan enkelte eller flere skud placeres på hver målrettet krystal. Brugere kunne planlægge et enkelt pas eller flere ruter gennem målrettede krystaller. Vi har implementeret software til at beregne forskellige rejseruter. For eksempel beregnes den korteste rute ved hjælp af algoritmer, der adresserer den rejsende sælgers problem13. Til pumpesonde dynamiske krystallografiske applikationer kan timingen og varigheden af laser (pumpe) og røntgen (sonde) skud vælges. En automatiseret seriel dataindsamling er programmeret til at translokere hver målrettet krystal til røntgenstrålen efter hinanden.
Nøglekomponenterne i insituX-diffraktometeret inkluderer: 1) en enhedsholder; 2) et treakset oversættelsestrin 3) en lyskilde til optisk scanning; 4) et stop for røntgenstråler 5) pumpelasere, hvis lysfølsomme proteiner undersøges; 6) Raspberry Pi mikrocomputer udstyret med et IR-følsomt kamera; 7) Styringssoftware til synkronisering af motorer, kamera, lyskilder, pumpelaser og til grænseflade med strålelinjekontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enhedens formontering
- Mærk den ydre ring (30 mm diameter) til identifikation af prøven. Medtag om nødvendigt projektnavn, enhedsnummer, krystalliseringstilstand og dato (figur 1A). Placer den ydre ring på hovedet på en ren overflade (figur 1B), og placer forsigtigt en kvartsskive inde i ringen (figur 1C). Denne første kvartsskive fungerer som et indgangsvindue til de indfaldende røntgenstråler.
- Hæld en lille mængde mikroskop nedsænkningsolie (viskositet på 150 cSt) i en petriskål. Dyp en shim i olien, og sørg for, at begge sider af shim er korrekt olieret (figur 1D). Fjern den overskydende olie ved at duppe shim på en ren overflade.
- Placer den olierede shim oven på den første kvartsskive (figur 1E).
BEMÆRK: Nedsænkningsolie er et fremragende fugemasse, der beskytter krystallisationskammeret mod potentielt damptab. Korrekt monterede chips holder normalt i uger uden synlig tørring. Dette trin før montering udføres under rumlys. For lysfølsomme prøver skal alle efterfølgende trin, herunder prøvebelastning, opbevaring af udstyr og observation, udføres under sikkerhedslys.
2. Prøvebelastning og enhedssamling
- Brug en pipette til grundigt at blande proteinopløsningen og krystallisationsbufferen på den første kvartsskive. Volumenforholdet mellem proteinprøven og bufferen varierer typisk fra 2: 1 til 1: 2 (figur 1F). Sørg for, at det samlede volumen af krystallisationsopløsningen ikke overstiger krystallisationskammerets maksimale kapacitet bestemt af shimstørrelsen og tykkelsen. Undgå luftbobler under blanding.
BEMÆRK: Sammensætningen af en krystallisationsbuffer varierer fra et eksperiment til et andet. Se tabel 1 for krystallisationsbetingelser. - Anbring den anden kvartsskive over den blandede opløsning, når opløsningen begynder at sprede sig (figur 1G). Denne anden kvartsskive tjener som udgangsvindue for de diffrakterede røntgenstråler.
- Tryk let på den anden kvartsskive på kanten for at hjælpe med at sprede olien, mens du skubber luft ud. Fastgør enheden ved at skrue en holderring ind i den ydre ring (figur 1H). Brug om nødvendigt et tilspændingsværktøj (figur 1I). Vær opmærksom på, at overspænding kan få sarte kvartsvafere til at deformere eller endda revne.
3. Optimering af enhedslagring og krystallisering
- Opbevar de samlede enheder (figur 1J) i en kasse ved stuetemperatur eller inde i en inkubator med temperaturregulering.
BEMÆRK: Proteinkrystaller kan forekomme om et par timer til dage, efter at en krystallisationsanordning er samlet. Typiske resultater fra on-chip krystallisation er vist for flere repræsentative proteinprøver (figur 2). - Overvåg krystalvækst ved at observere krystallisationsanordningen under et mikroskop. Optimer om nødvendigt krystallisationsbetingelserne ved gentagelser af afsnit 1-3.
4. Kalibrering
BEMÆRK: De programmer og kommandoer, der er nævnt i afsnittene nedenfor, køres i inSituX-software.
- Installer en tynd krystal af doteret yttrium aluminium granat på chipholderen (figur 3). Installer strålestoppet. Tag røntgenfluorescensbilleder af den direkte stråle ved at køre programmet:
burnmark.py.param
hvorer et brugervalgt navn til krystalliseringsenheden. .param er et filnavn, der indeholder enhedsspecifikke kontrolparametre. Standardværdierne erstattes gradvist af specifikke værdier langs protokollen. Et eksempel på.param-filen vises i supplerende fil 1. - Find den nøjagtige position af den direkte røntgenstråle ved at køre stråleprofilmonteringsprogrammet:
beam.py-D
hvorer filnavnet på røntgenfluorescensbilledet (figur 4).
BEMÆRK: Dette program beregner de præcise direkte strålepositioner samt strålestørrelsen. Strålepositionen markerer translokationsdestinationen for alle krystaller fra den samme enhed. Strålestørrelsen bruges også til målplanlægning.
5. Optisk scanning
- Anbring en krystallisationsanordning i chipholderen, og fastgør enheden ved hjælp af en tommelskrue (figur 3A).
- Monter chipholderen på diffraktometerets oversættelsestrin gennem en kinematisk mekanisme (figur 3B).
- Installer en ordentlig lyskilde til at tage mikrografer fra enhedens optiske vindue. Hvidt lys, IR-lys eller andet lys efter eget valg kan bruges afhængigt af proteinprøvens lysfølsomhed samt formålet med eksperimentet.
- Kør scanningsprogrammet:
scan.py.param
Dette program fanger et sæt mikrografer, der automatisk overføres til bestemte brugercomputere. - Kør fliseprogrammet på en brugercomputer:
tile.py-x -y
hvor < x > og
BEMÆRK: Trin 5.4 og 5.5 tager normalt et par minutter. Det samlede antal mikrografer varierer fra flere tiere til hundreder afhængigt af scanningsområdet og forstørrelsen. - Kør krystalfindingsprogrammet:
findX.py-c -w -x
hvorer flisebilledet. Dette program udfører krystalgenkendelse og skudplanlægning. og angiver den krystalstørrelse, der skal findes. Hvis brugeren ønsker at undgå mindre krystaller, kan bruges som afskæring ved at indstille et tal, der er større end størrelserne på uønskede små krystaller. er en vinkelværdi, der indstiller tolerancen for krystaller af uregelmæssig form. henviser til den direkte strålestørrelse, der opnås ved profilmonteringen ovenfor (trin 4.2; Figur 4). En nominel værdi kan også indstilles af brugerne for yderligere at placere målrettede skud. Disse nøgleparametre muliggør specifik krystaludvælgelse og målplanlægning (figur 6).
6. Røntgendiffraktion
- Fjern lyskilden, og installer strålestoppet. Indstil en passende detektorafstand. Følg strålelinjens sikkerhedsprotokol for at søge i røntgenhytten. Åbn røntgenlukkeren og laserlukkeren, hvis det er relevant.
- Kør dataindsamlingsprogrammet for seriel diffraktion:
collect.py.param -l
Denne kommando udløser dataindsamling, hvor alle planlagte skud besøges efter hinanden i henhold til en forprogrammeret sekvens. Hver målrettet krystal translokeres til strålepositionen (trin 4.2). Ved hvert stop tages røntgeneksponering med eller uden laserbelysning med en planlagt tidsforsinkelse. Film 1 viser en automatiseret dataindsamlingssekvens, der drives med en frekvens på 1 Hz. Rutinemæssigt indsamles titusinder til hundredvis af diffraktionsbilleder fra en enkelt krystalliseringsenhed (Film 2).
BEMÆRK: Sektion 4-kalibrering og sektion 5-optisk scanning er selvstændige i inSituX-platformen og kan derfor overføres fuldstændigt til en anden strålelinje. Afsnit 6 Røntgendiffraktion skal involvere nogle detaljer i strålelinjedrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere repræsentative datasæt er blevet offentliggjort I de sidste par år 10,12 sammen med de krystallografiske resultater og videnskabelige resultater fra en bred vifte af proteinprøver, herunder fotoreceptorproteiner og enzymer, for eksempel en plante UV-B fotoreceptor UVR8, en lysdrevet DNA-reparation fotolyase PhrB10, et nyt far-red-light sensing protein fra en multi-domæne sensorisk histidinkinase 14 , ligand/lys dual-sensor domæner og det fotosensoriske kernemodul i en bakteriophytochrom12. Som repræsentative resultater opregner vi on-chip krystallisationsbetingelserne for disse proteiner i tabel 1 og sammenligner dem direkte med de betingelser, der anvendes til dampdiffusionsmetoden. Her viser vi yderligere fire casestudier af on-chip krystallisering (figur 2) og en samling af in situ diffraktionsmønstre i en film (film 2). Repræsentative in situ-datasæt indsamlet ved hjælp af denne protokol er opsummeret i tabel 2.
I et repræsentativt tilfælde gav kryokrystallografi anledning til dårlig diffraktion for et far-rødt lysfølende fotoreceptorprotein, sandsynligvis på grund af lysfølsomhed og højt opløsningsmiddelindhold (~ 80%) af disse krystaller14. Elektrontæthederne opnået fra kryokrystallografidataene var for smurt til at løse kromoforkonformationen, som er i centrum for vores videnskabelige spørgsmål. Ved hjælp af in situ-protokollen var vi i stand til at undgå utilsigtet lysaktivering før diffraktion og opnåede et mørkt datasæt ved stuetemperatur fra mere end 800 krystaller. Dette mørke datasæt fra in situ seriel Laue-diffraktion resulterede i bedre opløste elektrontætheder, hvilket muliggjorde sikker modelbygning af en bilinkromofor, der udviser en hidtil ukendt all-Z,syn-konformation (figur 7A)12,14. Vores dynamiske krystallografieksperimenter har yderligere afsløret lysinducerede ændringer i dette far-røde fotoreceptorprotein ved at sammenligne data fra 4.352 krystaller i mørke og 8.287 krystaller efter lysbelysning (figur 7). En foreløbig analyse af de lysinducerede forskelskort har afsløret samordnede bevægelser i det centrale β ark, hvilket tyder på vigtigheden af π-π stabling mellem kromoforens pyrrolringe og flere aromatiske rester (figur 7B, C). En dybdegående analyse og videnskabelige resultater vil blive præsenteret andetsteds.
Figur 1: Samling af krystallisationsenhed. Hver samling anslås at koste US $ 30 med to monokrystallinske kvartsvafere eller US $ 10 med to glasdæksler. Hardwarekomponenter undtagen shim kan genbruges. (A) Den flade side af den ydre ring er mærket til identifikationsformål. (B) Den ydre ring placeres på hovedet på en ren overflade. (C) En kvartsskive på 1 tomme i diameter placeres omhyggeligt indeni. En glaschip kan også bruges i stedet under krystalliseringsforsøg, men er ikke kompatibel med røntgendiffraktion. (D) Begge sider af shim er olieret. (E) Den olierede shim placeres på den første kvartschip. (F) Protein- og krystallisationsopløsninger pipetteres til midten af chippen og blandes. (G) En anden kvarts- eller glaschip dækker dråben, så den spredes jævnt over chippen. (H) En fastholdelsesring skrues over den anden kvartsskive. (I) Der bruges et tilspændingsværktøj til at stramme holderringen forsigtigt. J) En fuldt monteret anordning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative proteinkrystaller dyrket på kvartsanordninger. (A) Det fotosensoriske kernemodul i en bakteriofytokrom (Pa497 i tabel 1). (B,C) Forskellige konstruktioner af det tredje GAF-domæne fra en sensorisk histidinkinase med flere domæner (2551g3 og 2551g3Δα1 i tabel 1). D) Tandemsensordomænerne fra en dobbeltsensor histidinkinase (RECGAF i tabel 1). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: inSituX diffraktometer . (A) En krystallisationsanordning er monteret i chipholderen. Selvom enheden er monteret lodret, vil krystaller dyrket på chip ikke falde, primært fordi væskelaget i en samlet enhed er meget tyndt, og krystaller er forankret til deres kerner, når de vokser. (B) Der er installeret en IR-lyskilde til den optiske scanning. Kameraet fanger inline-billedet af proteinkrystallerne langs røntgenstrålen gennem et prismespejl (ikke synligt på billedet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Montering af direkte stråleprofil. De røde, grønne og blå kanaler i røntgenfluorescensbilledet bruges til at passe til en todimensionel gaussisk funktion. Den venstre kolonne viser det rå billede af de røde, grønne og blå kanaler. Den midterste søjle er det passende resultat med den præcise stråleposition og størrelse. Den højre kolonne viser de passende rester. Hvis amplituden af de passende rester spænder over en lille brøkdel af det rå billede, er profiltilpasningen af den direkte stråle vellykket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Flisebelægning af billeder . (A) En række krystalmikrografer fanges under en optisk scanning. Den optiske scanning og dataoverførsel tager normalt 1-2 min. Tilstødende mikrografer deler en stribe overlappende område, vandret og lodret, som markeret med gule kasser. (B) Mikrografer sys sammen for at lave en montage med høj opløsning baseret på den optimale korrelation i de overlappende områder. Denne proces tager normalt et minut på en bærbar computer. Den gule boks skitserer det område, der er fanget af 2 x 2 mikrografer vist i (A). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Krystalgenkendelse og skudplanlægning. Hver lyserød cirkel markerer det primære skud af en krystal. De gule cirkler markerer yderligere skud, hvis en krystal er lang nok til at placere disse skud. De lyserøde linjer markerer en rute som en løsning på det rejsende sælgerproblem. Klyngede krystaller og mindre krystaller undgås stort set. Aggressiviteten af krystalfund kan justeres som en mulighed for at findX.py (trin 5.6). En brute force "overkill" -strategi ville ikke efterlade nogen krystal un-shot, men kunne producere masser af diffraktionsbilleder, men ikke behandlelige12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Elektrontæthedskort over det far-røde lysfølende domæne for en histidinkinase . (A) 2Fo-Fc-kortet kontureret ved 2,5σ viser elektrontæthederne forbundet med bilinkromoforen i en all-Z,syn-konformation 14. Pyrrolringe A til D er markeret. (B og C) Lys-mørke forskelskort kontureret ved ±2,5σ i henholdsvis grøn og rød fremhæver gevinsten og tabet af elektrontætheder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammenligning af krystallisationsbetingelser mellem dampdiffusion og on-chip batchmetode. Dampdiffusion og batchmetoder til krystallisation er stærkt korrelerede 10,14,15,16,17,18,19. Med udgangspunkt i en dampdiffusionstilstand kan en lignende tilstand optimeres til on-chip krystallisation. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Oversigt over in situ-datasæt indsamlet direkte fra kvartsenheder. Tusindvis af Laue diffraktionsmønstre kan indsamles fra flere krystallisationsanordninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Film 1: En mock dataindsamling. Målrettede krystaller translokeres til røntgenstrålen som markeret med en rød cirkel. Sekvensen af de målrettede krystaller i denne film følger ikke en løsning på det rejsende sælgerproblem. Laser- og røntgeneksponeringer affyres ved hvert stop med en programmeret forsinkelse. Diffraktionsbilleder indsamles. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Diffraktionsbilleder. Hundredvis af diffraktionsbilleder kan indsamles fra en enkelt krystallisationsenhed. Flere enheder er tilstrækkelige til at producere et komplet og meget redundant datasæt (tabel 2). Klik her for at downloade denne film.
Supplerende fil 1: Eksempel på
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinkrystallografi i de tidlige år udført ved stuetemperatur oplevede enorme vanskeligheder med at bekæmpe røntgenstrålingsskader. Således er det blevet erstattet af den mere robuste kryokrystallografimetode, da synkrotronrøntgenkilder blev let tilgængelige20. Med fremkomsten af røntgenfri elektronlasere er rumtemperaturproteinkrystallografi blevet genoplivet i de senere år, med mange nye udviklinger drevet af et ønske om at observere proteinstrukturdynamik ved en fysiologisk relevant temperatur 2,21. Udviklingen af inSituX-platformen baseret på krystal-på-krystal-enhederne har været motiveret af den samme ambition, det vil sige at etablere rutinemæssige og robuste dataindsamlingsmetoder til dynamiske krystallografiundersøgelser ved stuetemperatur. Denne automatiserede serielle røntgendiffraktionsmetode kan også anvendes til bestemmelse af statisk struktur for proteinkrystaller, der ikke kan fryses14. I denne protokol præsenterer vi vigtige tekniske overvejelser sammen med kritiske trin, der er nødvendige for at levere dataindsamling ved stuetemperatur ved hjælp af denne platform. Denne metode er særligt velegnet til skrøbelige proteinkrystaller, der er følsomme over for mekanisk håndtering, røntgenstrålingsskader eller lufteksponering.
Platformprototypen er blevet grundigt testet ved to proteinkrystallografistrålelinjer på Advanced Photon Source (APS) fra Argonne National Laboratory. Selvom det er ret ligetil at oprette on-chip-krystallisering i henhold til denne protokol, involverer dataindsamlingstrin flere specialfremstillede hardware- og softwarekomponenter. Som følge heraf kan dets anvendelse og implementering af projektspecifikke dataindsamlingsstrategier kræve et tæt samarbejde mellem brugere og strålelinjeforskere. Med andre ord er denne teknologi i sin nuværende form begrænset til de brugere, der har tilstrækkelig adgang til synkrotroner som APS. Ikke desto mindre vil den overordnede arbejdsgang og de vigtigste trin, der er beskrevet i denne protokol, tjene som reference eller vejledning for enhver forskningsgruppe, der er interesseret i proteinkrystallografi ved stuetemperatur.
Den væsentligste fordel ved denne platform er, at der ikke kræves krystalmanipulation såsom montering eller frysning, således at sarte proteinkrystaller diffrakteres under uberørte forhold. En anden stor fordel er, at brugen af det monokrystallinske kvartssubstrat giver anledning til meget lidt baggrundsspredning til proteindiffraktionsbilleder, samtidig med at der tilbydes stabile miljøer til proteinkrystallisation over lang tid (uger til måneder). Denne platform er dog ikke egnet til sparsom matrixkrystalscreening, da den er beregnet til krystalproduktion i stor skala. Som sådan kræves forudgående kendskab til krystallisationsbetingelser for at oprette indledende on-chip krystalliseringsforsøg for en given proteinprøve.
I praksis finder vi, at nogle enhedsmonteringstrin, såsom hvordan man olierer en shim (trin 1.2) og hvordan man forsegler en enhed (trin 2.3), så trivielle som de ser ud, ofte direkte påvirker resultaterne af krystallisation. En enhed kan tørre hurtigt ud, hvis oliering ikke udføres korrekt. Derudover kan overspænding af enheden i det sidste trin i samlingen deformere kvartsskiverne, mens underspænding fører til potentielle lækager og / eller ukontrolleret fordampning fra enheden. Et andet kritisk skridt er at planlægge røntgenbilleder. Man skal omhyggeligt håndtere grupperede eller overfyldte krystaller for at undgå overlappende diffraktionsmønstre, der ofte er vanskelige at behandle. Dette problem kan afhjælpes ved brug af en mikrofokuserende røntgenstråle. Potentielt kan et komplet datasæt være vanskeligt at opnå, hvis krystalmorfologien er en stor tynd plade, så de fleste plader er parallelle med kvartsvinduerne. Derudover kan enkeltkrystalkvartschips genbruges og genbruges efter en rengøringsprocedure, der involverer sæbe og organiske opløsningsmidler, der fjerner olie- og proteinrester. Normalt kan ca. 80-90% af disse sarte chips rengøres uden skader til de næste eksperimenter. I tilfælde af små krystaller på en mikrofokuseret strålelinje, når der skal opnås bedre præcision i krystalpositionering, kan flere hardwarekomponenter opgraderes, såsom finere motorer, bedre kamera og optik, større forstørrelse osv. Ingen af disse er dog tæt på de nyeste begrænsninger. Derfor er der masser af plads til forbedring uden meget besvær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZR er opfinderen af krystal-på-krystal-chips på det amerikanske patent 9632042 der er givet til Renz Research, Inc.
Acknowledgments
Brug af Advanced Photon Source, en Office of Science User Facility, der drives for US Department of Energy af Argonne National Laboratory, blev støttet af kontrakt DE-AC02-06CH11357. Brug af BioCARS blev støttet af National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health under tilskudsnummer R24GM111072. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Brug af LS-CAT Sector 21 blev støttet af Michigan Economic Development Corporation og Michigan Technology Tri-Corridor grant 085P1000817. Dette arbejde understøttes af tilskud fra University of Illinois i Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) og National Science Foundation (MCB 2017274) til XY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M.
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N.
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W.
- Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
