Summary
Denne protokol skitserer båndmetoden til, hvordan man manuelt konstruerer et vævsmikroarray ved hjælp af FFPE-donorblokke med forskellige dybder.
Abstract
Vævsmikroarray (TMA) er et vigtigt forskningsværktøj, hvor mange formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) prøver kan repræsenteres i en enkelt paraffinblok. Dette opnås ved at anvende vævskerner ekstraheret fra interesseområdet for forskellige donor FFPE-blokke og arrangere dem i en enkelt TMA-paraffinblok. Når de er konstrueret, kan sektioner fra den færdige TMA bruges til at udføre immunohistokemi, kromogen, fluorescens in situ-hybridisering (FISH) og RNA ISH-undersøgelser til vurdering af proteinekspression samt genomiske og transkriptionelle ændringer i mange prøver samtidigt, hvilket minimerer vævsbrug og reducerer reagensomkostningerne. Der findes flere forskellige TMA konstruktionsteknikker. En af de mest almindelige konstruktionsmetoder er modtagermetoden, som fungerer bedst med kerner af samme længde, for hvilke der anbefales en minimumslængde på 4 mm. Desværre kan vævsblokke stærkt resekteres under diagnoseprocessen, hvilket ofte resulterer i "ikke-ideelle" donorbloktykkelser på mindre end 4 mm. Den aktuelle artikel og video fokuserer på den dobbeltsidede klæbebåndsmetode; en alternativ manuel, billig, nem at bruge og hurtig metode til at konstruere TMA'er med lav densitet (<50 kerner), der er yderst kompatible med disse ikke-ideelle donorblokke. Denne protokol giver en trinvis vejledning i, hvordan man konstruerer en TMA ved hjælp af denne metode med fokus på den kritiske betydning af patologisk gennemgang og validering efter konstruktion.
Introduction
Formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv anvendes i vid udstrækning i morfologiske og immunohistokemiske proteinekspressionsundersøgelser1. Opdagelsesforskning kræver dog ofte undersøgelse af flere markører på et stort antal væv, som kan udtømme dyrebare væv. Vævsmikroarray (TMA), der blev introduceret i 1980'erne, er et vigtigt forskningsværktøj, der samler små eksemplariske regioner af interesse fra mange forskellige FFPE-vævsblokke i en enkelt paraffinblok, hvilket muliggør undersøgelse af mange vævsprøver samtidigt2. TMA'er undgår således overdreven brug af meget dyrebare og ofte sjældne vævsprøver, samtidig med at omkostningerne forbundet med at udføre downstream-applikationer på mange individuelle prøverreduceres 3,4.
Der findes flere forskellige teknikker til konstruktion afTMA'er 5, herunder automatiserede og halvhåndbogs manuelle tilgange 6,7. Størstedelen af disse sidstnævnte tilgange anvender modtagermetoden, hvor vævskerner stanset fra donorblokke indsættes i en præfabrikeret form. Det anbefales dog, at der anvendes "ideelle" donorblokke, der er mindst 4 mm tykke, til denne metode 6,7. Desværre er donorblokke, især dem, der er blevet grundigt sektioneret til kliniske diagnostiske formål, inden de stilles til rådighed for forskning, ofte mindre end 4 mm tykke, hvilket kan udelukke dem fra anvendelse i TMA-konstruktion ved hjælp af modtagermetoden, hvis det ikke er muligt eller ønskeligt at genindlejrere for at opnå en dybde på 4 mm. Desuden kan disse procedurer ofte bruge en stationær manuel vævsmikroarrayer eller dyre automatiserede instrumenter, der ikke er let tilgængelige eller overkommelige for det gennemsnitlige forskningslaboratorium. I modsætning hertil er den dobbeltsidede klæbebåndsmetode eller båndmetode en manuel TMA-konstruktionsmetode, der er kompatibel med ikke-ideelle donorblokke, der bruger billige, bredt tilgængelige, genanvendelige eller engangs håndholdte vævsmikroarrayers 8,9,10. Denne metode vender byggeprocessen om ved at støbe blokken rundt omvendte opretstående kerner, der efter færdiggørelsen flugter med toppen af TMA, uanset kernelængden. Som et resultat er alle prøver til stede i TMA-sektioner, når de først sektioneres, hvilket gør det muligt for konstruktøren at få mest muligt ud af disse ikke-ideelle blokke fra starten. Båndmetoden repræsenterer således et omkostningseffektivt og gennemførligt alternativ for de ikke-specialiserede forskningslaboratorier.
TMA-konstruktionen er ikke uden udfordringer, og der skal udvises forsigtighed ved udvælgelsen af de vævsområder, der skal udtrækkes kernerne fra, hvilket gør patologisk gennemgang til en kritisk del af TMA-byggeprocessen11,12. Denne protokol har således til formål at understrege den dybe betydning af patologisk gennemgang i TMA-konstruktion ved at fremhæve nogle af de patologiske faldgruber forbundet med TMA-konstruktion, som personer, der konstruerer og bruger TMA'er, bør være opmærksomme på, og hvorfor patologisk gennemgang bør fortsætte gennem levetiden for en TMA-blok.
Denne protokol skitserer de skridt, der er taget på AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory for at konstruere TMA'er fra ikke-ideelle donorblokke ved hjælp af båndmetoden; hvor ACSR er et NIH-finansieret biorepositori dedikeret til indsamling og retfærdig fordeling af bioprøveemner fra hiv-kræftvæv med henblik på at fremme hiv-malignitetsforskning.
Protocol
Alle donorblokke blev afidentificeret under indsamlingen og anvendt til TMA-konstruktion i overensstemmelse med godkendte Mayo Clinic IRB-protokoller (PR16-000507 og PR2207-02).
1. Patologi gennemgang
- Hent FFPE-vævsdonorblokkene, der skal bruges i TMA-konstruktionen.
- Indsend et friskgenereret hæmatoxylin og eosin (H & E) farvet dias13 for hver FFPE-vævsdonorblok, der er valgt til histologisk gennemgang af en bestyrelsescertificeret patolog for at bekræfte diagnosen og kommentere vævet.
BEMÆRK: H & E-farvning kan udføres internt eller sendes til et patologisk kerneservicelaboratorium til farvning, som det var tilfældet i denne protokol. Et af de vigtigste begreber at huske, når man konstruerer TMA'er, er, at vævene i FFPE-donorblokkene er 3-dimensionelle (3D) strukturer, hvis form, tumorindhold og vævs levedygtighed kan ændre sig betydeligt med stigende blokdybde. Patologen skal på baggrund af gennemgangen af H&E-farvet vævssektionen, som er en 2-dimensionel repræsentation af 3D-vævet, bestemme den bedste region at udtrække vævskernen fra. - Under histologisk gennemgang skal du sikre dig, at patologen identificerer og kommenterer væv af interesse / ikke af interesse på H & E farvede dias. Følg nedenstående trin for at kommentere diaset.
- Brug en diasmarkeringspen til at cirkulere vævet af interesse.
- Brug den samme markeringspen til at udslette områder inden for det cirklede område, der bør undgås.
- Brug markeringspennen til at markere de områder, der anses for at være ideelle til kerneprøveudtagning og ekstraktion.
BEMÆRK: Det er vigtigt at huske, at vævets form og sammensætning kan ændre sig med vævsdybden i blokken. Således kan sammensætningen af vævskernen ændre sig afhængigt af hvor kernen blev ekstraheret, hvilket understreger behovet for fortsat patologisk vejledning. - Indsend yderligere væv til sygdomsspecifikke immunhistokemiske pletter sammen med H & Es, hvis det er nødvendigt, for at hjælpe den patologiske gennemgang. Eksempler på sådanne pletter omfatter ERBB2-farvning for HER2-positiv brystkræft14, HHV-8 for Kaposi-sarkom15, CD20 for B-cellelymfomer16, U6 som en global markør for RNA-kvalitet17, EBER for at bestemme Epstein-Barr-viruspositivitet18 og Vimentin som bekræftelse af mesenkymal oprindelse og vævskvalitetskontrolmarkør19,20.
2. Forberedelse til TMA-konstruktion
- Når patologigennemgangen er afsluttet, skal du udarbejde den endelige liste over donorblokke, der skal bruges i TMA-konstruktionen, og oprette et TMA-kort (figur 1A). TMA-kortet er en skematisk skitse, hvor kernerne vil være placeret i de færdige TMA- og diasmonterede vævsprøver opnået fra den resulterende TMA.
- Til orienteringsformål skal det sikres, at TMA-kortet undgår at placere kerner i en jævn matrix, såsom en 3 x 3 eller 4 x 4 matrix og indeholder mindst 1 orienteringsmarkør.
BEMÆRK: Orienteringskerner kan være kerner taget fra vævsfrie farvede orienteringsværktøjer21 eller vævsblokke, der indeholder tydeligt forskellige væv fra temaet for TMA. I modsætning til modtagermetoden, hvor opretstående kerner indsættes i en præstøbt voksform, skaber båndmetoden en TMA ved at hælde smeltet voks omkring omvendte, oprejste kerner. Denne inversion af byggeprocessen kræver et andet kort kendt som byggekortet. - Opret konstruktionskortet ved at oprette et spejlbillede af TMA-kortet (figur 1B). Konstruktionskortet viser, hvor hver kerne skal placeres under konstruktionen for at kunne vises på det rigtige sted i den færdige TMA. Gem byggekortet.
- Når kortene er oprettet, skal du forberede TMA-basisformen af metal. Brug et engangspapir ternet gitter til at styre kerneplacering og regulere kerneadskillelse.
BEMÆRK: Et skabelongitter på 6 x 7 (42 pletter) til højst 40 kerner (plus til to orienteringskerner/huller) til brug med kommercielt tilgængelige metalbasisforme med indvendige dimensioner på 26 mm x 20 mm findes i den supplerende pdf. Udskriv og klip papirgitteret ud. - Skær det ternede gitter i størrelse, og sæt et stykke dobbeltsidet pindebånd (DSST) på bagsiden af gitteret. Anbring gitteret og DSST-båndet i metalbakken, og tilsæt et andet stykke DSST oven på gitteret, dvs. oven på papirgitteret i metalbasideformen (figur 2A).
3. Kerneplacering
- Overlejr den patologisk gennemgåede H&E på dens tilsvarende vævsblok og brug patologens markeringer til at identificere, hvor vævsblokken skal stanses (figur 2B).
- Stans FFPE-donorblokken ved hjælp af en manuel kernestans (figur 2C) på det relevante sted.
BEMÆRK: Kernestanser fås i forskellige diametre. Denne metode anvender en håndholdt kernestans med en diameter på 2 mm.- Hvis du bruger en genanvendelig kernestans, skal du sørge for, at den rengøres før og efter hvert vævsslag.
- Skub kernen ud af kernestansen, og brug en nåleplukker til at placere den udslyngede kerne på trådkorset på det DSST-dækkede gitter (figur 2D). Sørg for, at når kernen er placeret på gitteret, er den omvendt og oprejst, således at vævsenden af kernen kommer i kontakt med DSST (væv med forsiden nedad). Sørg også for, at kernen er placeret på den passende position på nettet som angivet på konstruktionskortet.
- Gentag, indtil alle donorblokke er kernet, og kernerne er placeret på deres passende positioner.
4. Fuldførelse af TMA
- Tænd for bænkovnen, indstil til 78 °C, og giv tilstrækkelig tid til at komme til temperaturen.
- For hver TMA, der skal konstrueres, smeltes 45 g paraffinpiller i en ovnfast beholder.
- Mærk en plastkassette, og læg den oven på metalbasideformen, der indeholder kernerne (figur 2E). Kernernes højde må ikke overstige metalbakkens dybde, da høje kerner vippes eller væltes, når kassetten sættes på plads.
- Læg formen med kassetten på en bakke for at fange overløb og hæld forsigtigt den smeltede paraffin gennem kassetten i kernebakken (figur 2F).
- Lad den smeltede paraffin flyde over for at sikre, at der ikke er luftbobler i TMA's krop. Sørg for, at paraffinen fyldes til toppen af kassetten, så den er indlejret i og fast bundet til paraffinblokken, når paraffinen er størknet.
- Flyt eller forstyr ikke blokken, og lad den køle af ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter afkøles ved 4 ° C i yderligere 30 minutter for at størkne fuldstændigt.
- Når den er fuldstændig størknet, adskilles metalbaseformen forsigtigt fra den kassettebundne paraffinblok af kerner.
BEMÆRK: DSST bevarer sin klæbeevne gennem byggeprocessen og fastgøres ofte til den nydannede paraffinblok. Hvis det er relevant, skal du forsigtigt fjerne DSST og gitteret fra toppen af den nu færdige TMA-blok.
5. Validering af TMA
- Når TMA er konstrueret, skal du bruge et mikrotome til at sektionere den nyligt afsluttede TMA. Skær en eller flere fuld-facede vævssektioner.
- Overfør sektionerne til det forvarmede vandbad, og skub sektionerne.
BEMÆRK: Nykonstruerede blokke kræver ofte blokvending (væk af overskydende paraffin) for at opnå hele ansigtsvævssektioner, der indeholder alle kerner. - Når det er tørt, skal du indsende en friskskåret glidemonteret TMA-sektion til H&E-farvning13 og eventuel yderligere immunohistokemisk farvning, hvis det er nødvendigt.
- Indsend de farvede TMA H & E-sektioner til patologisk gennemgang.
BEMÆRK: Under TMA-patologigennemgang gennemgår en bestyrelsescertificeret patolog, helst den samme patolog, der gennemgik TMA-donorblokkene, TMA H & E-farvede kerner for at sikre, at de ønskede væv af interesse faktisk er til stede. Hvis der blev indsendt yderligere vævs- eller sygdomsspecifikke immunohistokemiske pletter til gennemgang af donorblokken i trin 1.3.4, skal disse pletter gentages på TMA-sektioner og indsendes sammen med TMA H&E til patologisk gennemgang. - Registrer resultaterne af TMA patologisk valideringsgennemgang.
Representative Results
Båndmetoden til TMA-konstruktion, der er beskrevet her, er den valgte metode, der anvendes på ACSR Technical Core Laboratory til at bevare væv, hvilket igen tillader sparsommelig og retfærdig fordeling af meget dyrebare væv til forskere.
En kritisk komponent i byggeprocessen er identifikation af det væv, der er af interesse i en given donorblok, hvorfra TMA-kernen skal udtages. Dette bestemmes af patologisk gennemgang, hvor en uddannet patolog gennemgår et nygenereret H & E-dias (figur 3). Ved hjælp af en markør cirkler patologen området på H & E-diaset, hvilket indikerer, at kernen skal opnås fra donorblokken inde i denne cirkel (figur 3). Patologen kan også markere yderligere områder såsom nekrotiske områder, som bør undgås, eller godartede områder, hvorfra yderligere vævskerner kan opnås (figur 3). Kerner stanses derefter fra de angivne områder og indgår i konstruktionen af TMA.
Der er to hovedmålinger for en vellykket gennemførelse af en TMA ved hjælp af båndmetoden. Den første er tilstedeværelsen af vævskerne prikker på de forventede positioner og afstande bortset fra hinanden, som vurderes ved visuel inspektion. Figur 4A,B viser to vellykkede TMA'er med fuldstændig tapemetode og deres tilsvarende H&E-dias. Visuel inspektion af TMA-blokkene viser, at kernerne er til stede og regelmæssigt fordelt i hver TMA. Nogle af de vigtigste konstruktionsproblemer, der kan opstå under konstruktionsprocessen for båndmetoden, omfatter adskillelse af blokken og kassetten på grund af for tidlig fjernelse af metalbasen inden voksstørkning (figur 4C). Et andet potentielt problem, der observeres med båndmetodekonstruerede TMA'er, er kernevæltning og eller placeringsdrift af de indlejrede kerner (figur 4D); et problem, der kan opstå som følge af overdreven turbulent hældning af den smeltede paraffin, som kan styrkes yderligere af dårligt klæbende DSST. Figur 5 viser H&E-billederne for kernerne i TMA1. Alle på nær én kerne (spot 1) er til stede i H&E i TMA1. Figur 5 viser også, at nogle kerner er til stede som komplette cirkulære vævspunkter (dvs. pletter 4, 6, 13, 17), mens andre ikke er helt til stede (dvs. pletter 3, 8, 9, 12). Det vævstab, der opleves i disse sidstnævnte tilfælde, er ikke ualmindeligt og kan skyldes utilstrækkelig sektionering, der er nødvendig for at afsløre alle kerner fuldt ud. Alternativt kan tilstedeværelsen af ufuldstændig eller det totale fravær af væv (dvs. plet 1) skyldes dårlig vævskvalitet af den pågældende kerne, hvilket kan resultere i vævstab under farvningsprocessen.
Den anden måling af succes vurderes i forhold til, om TMA-kernerne fangede vævet af interesse eller ej. Dette opnås ved patologisk gennemgang og validering af de enkelte TMA H&E-kerner (figur 5) sammenlignet med den forstansede donorblok H&Es (figur 3) og, hvor det er nødvendigt/udført, eventuelle andre yderligere immunhistokemiske pletter, der udføres. Figur 6 viser eksemplariske pletter udført på TMA1, herunder Vimentin, U6, EBER og CD20. Vimentin positivt væv (brun plet) indikerer, at alle væv er af mesenkymal oprindelse og er af god kvalitet, der kan farves. U6-positivitet (mørk lilla / blå plet) indikerer, at RNA-kvaliteten i vævet er god og komplimenterer RNA in situ-hybridiseringspletter (ISH) som EBER, der er målrettet mod gentranskripter. U6-resultaterne i figur 5 indikerer, at RNA-kvaliteten er høj i lymfomvævet (spot 9) og den normale tonsilvævsorienteringskontrol (plet 22), men ikke i det normale væv på stedet 19. Efterfølgende var denne EBER-farvning negativ i det normale væv og orienteringskontrollen, men stærkt positiv i lymfomvævet (plet 9). Som forventet for væv af lymfoid oprindelse farvede både pletter 9 og 22 positive for B-cellemarkøren CD20, men plet 19, der stammer fra normalt rygmarvsvæv, gjorde det ikke. Farvningsresultaterne for alle TMA-kerner er opsummeret i tabel 1 og bekræfter vævsannotationen for disse TMA-vævskerner.
Figur 1: TMA-kort. Når alle FFPE-blokke og orienteringskontroller er valgt, oprettes et detaljeret kort, kendt som et TMA-kort (A), der skitserer, hvor hver donorblokkerne vil være placeret i den færdige blok. Det er vigtigt at bemærke, at når man konstruerer en TMA ved hjælp af båndmetoden, er konstruktionskortet (B) et spejlbillede af TMA-kortet, fordi denne metode vender byggeprocessen om og hælder smeltet paraffin omkring opretstående vævskerner i stedet for at indsætte kernerne i en præfabrikeret form. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opbygning af TMA ved hjælp af båndmetoden. (A) Lag 2 stykker dobbeltsidet pindebånd (DSST) og et papirgitter i følgende rækkefølge i bunden af metalbundformen; Anbring det første stykke DSST (2A-indsats) efterfulgt af engangspapirgitteret og derefter det andet stykke DSST i bunden af metalbasideformen. (B) For hver donorblok genereres en ny H&E, som gennemgås af en patolog, der mærker H&E for at betegne det væv, der er af interesse, hvor blokken skal stanses, og hvis det er relevant, hvor man skal undgå stansning for at udtrække en vævskerne. (C) Stans donorblokken med en bortskaffelse eller genanvendelig håndholdt TMA-stans. (D) Ved hjælp af en nåleplukning placeres hver kerne stående oprejst, tumor med forsiden nedad på DSST, der dækker gitteret. (E) Anbring forsigtigt en formærket plastkassette oven på metalbakken, der indeholder de opretstående kerner. (F) Smeltet paraffin hældes forsigtigt i bakken gennem kassettegitteret for at omringe og nedsænke de opretstående kerner under kassetten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Donorblok H &E-plet. H & E farvede sektioner fra hver donorblok underkastes QC-gennemgang med en træningspatolog, der kommenterer H & E-farvet dias med en markør for at angive de områder / væv, der er af interesse (dvs. levedygtig kræft (CA) eller godartet (BN) væv) til kerneopsamling samt områder, der bør undgås (dvs. nekrotiske vævsområder). De relevante områder af vævsblokken, som angivet i den kommenterede H&E, identificeres, stanses og indarbejdes derefter i den TMA, der konstrueres. Den resulterende TMA-kernestans H&E kan derefter refereres tilbage til det ustansede område af donorblokken H&E for at bekræfte, at vævet af interesse blev fanget i kernestansen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater. (A,B) Vellykket gennemført båndmetode TMA'er og deres ledsagende H&Es til patologisk gennemgang. (C) Adskillelse af plastkassetten og paraffinblokken, når kassetten fjernes for tidligt fra metalbasisformen. D) Afsluttet båndmetode TMA, der viser væltede og migrerede kerner som følge af turbulent hældning af den smeltede paraffin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: TMA-kerne H&Es. H&E-farvet sektion for TMA1, der viser de enkelte H&Es for hver vævskerne, der bruges til at konstruere TMA (punkt 1-21) samt orienteringskernerne (punkt 22 og 23). De viste billeder blev opnået ved hjælp af et 4x mål, udstyret med et digitalt kamera forbundet til billedbehandlingssoftwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksemplarisk immunhistokemisk og RNA ISH. Fulde ansigtssektioner fra TMA1 blev vurderet af IHC for vimentin- og CD20-ekspression og af RNA ISH for at vurdere RNA-kvalitet (U6) og EBV-status via EBER ISH. Billeder viser eksemplariske billeder for tre kerner, herunder et tumorvæv (plet 9), et normalt væv (plet 19) samt en af de to orienteringskontroller (spot 22). Vimentin positivitet betegnes med brun farvning, U6 positivitet betegnes med blå / lilla farvning, EBER ved blå / lilla farvning og CD20 ved brun farvning. De viste billeder blev opnået ved hjælp af et 4x mål, udstyret med et digitalt kamera forbundet til billedbehandlingssoftwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Oversigt over udført konstrueret TMA-væv og -pletter: Tabellen viser, om (a) væv er til stede i hver af de repræsentative TMA-pletter (b) tumor er til stede i hver H & E-farvet vævsplet og (c) resultaterne af eventuelle yderligere immunhistologiske pletter udført på tilstødende TMA-sektioner: "-" angiver negativ, n / d = ikke udført. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende sagsmappe. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
En af de mest kritiske komponenter i TMA-byggeprocessen er patologisk gennemgang af FFPE-donorblokke, hvorfra TMA-kernerne vil blive opnået4. Under gennemgangen undersøger en bestyrelsescertificeret patolog en repræsentativ H & E-farvet vævssektion fra hver donorblok. Det er bydende nødvendigt, at H&E genereres ved hjælp af en friskskåret vævssektion, så den er den bedste repræsentation af den tilsvarende donorblok. Anvendelse af ældre H&Es anbefales ikke, da FFPE-væv er 3-dimensionelle strukturer, hvis vævsprofil kan ændre sig betydeligt med blokdybde og omfattende sektionering; dette kan være sket, siden H&E blev genereret, hvilket potentielt gør dets repræsentation af FFPE-blokken unøjagtig. Revisionsprocessen er afgørende for udvælgelsen af egnede tilfælde og identifikationen af vævsområder, hvorfra kerner bør udgå, samt identifikation af områder, der bør undgås ved indsamling af kerner. I mangel af patologisk gennemgang øges sandsynligheden for at inkludere uegnede væv betydeligt. Optagelse af sådanne væv har potentiale til at gøre den konstruerede TMA ineffektiv og uegnet til det tilsigtede formål. Det er vigtigt, at ubevidst brug af sådanne ineffektive TMA'er har et enormt potentiale til at resultere i falske og vildledende data. Dette kombineret med viden om, at profilen af FFPE-væv og dermed deres afledte kerner kan ændre sig markant med stigende dybde, understreger vigtigheden af fortsat patologisk gennemgang gennem hele levetiden for en konstrueret TMA-blok. Ideelt set bør H&Es genereres ved hjælp af hver 15. eller 20. sektion for at sikre, at eventuelle ændringer i kernernes vævsprofiler fanges og registreres. Som minimum bør H&Es genereres og revideres ved starten og slutningen af et projekt for at overvåge disse potentielle ændringer. I lyset af disse punkter og TMA's betydning som et forskningsværktøj er det bydende nødvendigt, at den patologiske gennemgang er fast forankret i TMA-byggeprocessen og i hele TMA-blokkens levetid.
FFPE-blokke sektionerer ofte i vid udstrækning under rutinemæssig diagnostisk behandling, inden de frigives til forskningsformål. Som følge heraf er donorblokdybden og dermed donorblokkens kernelængder ofte mindre end modtagermetodens ideal på 4 mm. Her har vi demonstreret, hvordan man konstruerer TMA'er ved hjælp af båndmetodekonstruktionsprotokollen, hvis største fordel er dens kompatibilitet med kerner fra ikke-ideelle FFPE-vævsblokke. Selvom båndmetoden er af stor forskningsværdi og tilbyder en billig, bekvem og tilgængelig metode til konstruktion af TMA-blokke, er den ikke uden udfordringer og begrænsninger. Sammenlignet med både automatiserede og manuelle modtagermetoder, som kan rumme 100-1.000-vis af kerner i en enkelt TMA-blok, anbefales maksimalt 40 kerner til TMA'er konstrueret ved hjælp af båndmetoden9. En anden begrænsning er med hensyn til den lette konstruktion. I modtagermetoden indsættes stansede kerner blot i en præfabrikeret form, som giver kernestabilitet ved at indkapsle hver kerne i sin egen individuelle brønd og derved forhindre kernemigration samt fremme meget regelmæssig kerneplacering og adskillelse22. Desuden tilbyder modtagermetoden den valgfri bekvemmelighed at være fuldt manuel, halvmanual og fuldt automatiseret. I modsætning hertil kræver den manuelle båndmetode omhyggelig, skånsom placering af hver kerne i hånden ved hjælp af en nåleplukker. Selvom fraværet af en præfabrikeret form i båndmetoden udelukker den meget regelmæssige placering og adskillelse, der opleves med modtagermetoden, overvindes denne mangel ved at inkludere et ternet gitter. Det er vigtigt, at det ternede gitter er fastgjort til midten af metalbakken for at undgå placering af blokkanter, hvilket øger risikoen for kernetab, hvis der ikke er tilstrækkelig paraffin, der holder kernen på plads. Det skal også bemærkes, at de små kerneadskillelser, der er mulige med modtagermetoden, ikke kan opnås med båndmetoden på grund af manuel kerneplacering og behovet for, at nålepluk passer mellem tilstødende kerner. Kerner placeres på en fritstående oprejst måde med det mindste overfladeareal eller fodaftryk af kernen, der kommer i kontakt med det DSST-dækkede gitter. Denne opsætning giver betydeligt mindre kernestabilitet end modtagermetoden og giver en øget risiko for kernepåståning og eller migration, når den smeltede paraffin hældes. Faktisk er et af de mest kritiske trin i protokollen at hælde den smeltede paraffin. Det er vigtigt, at dette gøres hurtigt ved fjernelse fra ovnen for at sikre, at paraffinen er helt flydende, og at hældningen udføres forsigtigt med minimal turbulens. Interessant nok udviklede Chen et al. en meget ny hjælpeanordning, beslægtet med en stencil med huller med en diameter på 7 x 11 jævnt fordelt 2 mm diameter, der placeres oven på en tom paraffinblok for at styre nåle, når modtagerblokken oprettes, og når donorblokkernerne indsættes23. Selvom den er designet til at hjælpe modtagerblokkonstruktionen, kunne en sådan enhed let tilpasses båndmetoden til at styre placeringen, regulere adskillelsen og øge kernestabiliteten under byggeprocessen.
En af de mest betydningsfulde effektorer af kernestabilitet er antallet af kerner, der indgår i en båndmetode TMA. Dette skyldes, at når antallet af kerner stiger, skal kernens diameter reduceres for at imødekomme det stigende antal kerner, hvilket igen reducerer kernefodaftrykket, der overholder DSST. En mindste kernediameter på 1 mm anbefales til båndmetode TMA-konstruktion, da vi har fundet ud af, at kerner med mindre diametre er særligt ustabile og tilbøjelige til at vælte selv med meget blid paraffinhældning. En nylig undersøgelse, der undersøgte to forskellige interne metoder, der brugte 16 G nåle (kernediameter på 1,1 mm) og en 4 mm diameter stans, oplevede betydelige vævstab med 1,1 mm (26,5%), men ikke 4 mm kernerne24. Dette tyder på, at små kerner kan være problematiske at arbejde med og ikke kun under konstruktionen. Desuden repræsenterer mindre diametre muligvis ikke den oprindelige donorblok såvel som større kerner, hvilket gør patologisk fortolkning vanskelig og øger sandsynligheden for unøjagtig repræsentation af donorvæv.
Inddragelse og placering af orienteringsblokke er af stor betydning i TMA-konstruktion. Dette er dog af særlig betydning for båndmetodekonstruerede TMA'er. Det skyldes, at båndmetoden vender byggeprocessen om og dermed øger risikoen for rumlig desorientering. Vi anbefaler, at du inkluderer op til tre orienteringskerner i hver blok, og at de placeres væk fra prøvekernerne for bedst muligt at orientere blokken. Orienteringskerner kan være kerner taget fra vævsblokke, der indeholder tydeligt forskellige væv fra temaet for de konstruerede TMA- eller vævsfrie orienteringsværktøjer21, hvor sidstnævnte er særlig nyttig for ikke-patologer. Kombineret med ikke-regelmæssig matrixmønstret kerneplacering minimerer orienteringskerner risikoen for desorientering.
Den markante forskel i kernelængde mellem TMA'er konstrueret ved hjælp af tape- og modtagermetoderne stammer fra inddragelse af donorblokdybde i beslutningsprocessen, når byggemetoden vælges. Den protokol, der er skitseret her, anvender en tærskel, hvor TMA'er konstrueres ved hjælp af tape- og modtagermetoderne, når donorblokkene har dybder på henholdsvis <4 mm og 4 mm. Det er vigtigt at bemærke, at inddragelse af donorblokdybde i valg af byggemetode ikke er universel. Selv om det er muligt for TMA'er at blive konstrueret ved hjælp af begge metoder uanset donorblokdybde, kan højere kerner forstyrre og eller væltes eller vippes af placeringen af plastkassetten under TMA-konstruktion ved hjælp af båndmetoden. Valget om at inkludere eller udelade kriterier i beslutningsprocessen afhænger af de faciliteter, der er tilgængelige for laboratoriet, omkostninger og det ønskede slutprodukt. Under parametrene i denne protokol er antallet af diasmonterede TMA-sektioner, der kan opnås ved hjælp af en båndmetode konstrueret TMA, betydeligt mindre end det, der opnås ved en modtagermetode konstrueret TMA. Selv om det er muligt at blokere FFPE-væv igen for at øge donorblokdybden og gøre dem kompatible med modtagermetoden, er sandsynligheden for at opnå den samme vævsorientering inden for reblokken lav. Til gengæld kan dette kræve omfattende blokvending for at opnå en fuld ansigtssektion, hvilket sandsynligvis vil omfatte betydeligt vævstab. Efter blokvending giver en båndmetode konstrueret TMA ca. 50 diasmonterede TMA-sektioner med alle kerner til stede. Det nøjagtige antal vil dog variere fra blok til blok og afhænger af længden af de kerner, der bruges til at konstruere TMA, og tykkelsen af de sektioner, der skæres (5 μm versus 4 μm). Desuden skal det også bemærkes, at kernerne på grund af deres forskellige kernelængder vil udtømme på forskellige tidspunkter, da TMA gradvist sektioneres; en egenskab, der understreger behovet for fortsat patologisk gennemgang.
Selvom modtagermetoden giver betydelige fordele og fordele i forhold til båndmetoden, herunder en mindre kedelig og hurtigere byggeprocesser, er båndmetoden ikke rettet mod erfarne laboratorier med høj kapacitet. Det er rettet mod det gennemsnitlige laboratorium, især dem i ressourcebegrænsede omgivelser, med adgang til donorblokke med variabel dybde, men ikke til TMA-byggetjenester. Fremtidige anvendelser kunne imidlertid se automatisering af denne metode for at forbedre puljen af støtteberettigede prøver i laboratorier med høj kapacitet og eliminere behovet for genblokering af donorblokke. Afslutningsvis kan den beskrevne TMA-båndmetodekonstruktionsprotokol let etableres på ikke-specialiserede laboratorier uden behov for dyrt udstyr. Det anbefales dog, at nye brugere anvender FFPE-vævsblokke uden værdi, vævsfrie farvede orienteringsværktøjer21 eller endda farvede paraffinblokke uden væv i starten for at gøre sig bekendt med båndmetodeteknikken, inden de går videre til TMA-konstruktion ved hjælp af dyrebare væv. Selvom deres konstruktion ikke er uden potentielle faldgruber, som både dem, der konstruerer og bruger TMA-blokke, bør være opmærksomme på, kan denne tilsyneladende upolerede "hjemmelavede" TMA-konstruktionsmetode give biologisk relevante TMA'er af høj kvalitet til forskning. Faktisk er TMA-sektioner, der stammer fra båndmetodekonstruerede TMA'er, blandt de mest efterspurgte vævsprøver i ACSR-biorepositoyet.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering til dette arbejde blev ydet af nih-finansieret AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
