Summary
Denne protokollen skisserer båndmetoden for hvordan man manuelt konstruerer en vevmikroarray ved hjelp av FFPE-donorblokker av forskjellige dybder.
Abstract
Vevsmikroarray (TMA) er et viktig forskningsverktøy der mange formalinfaste parafin innebygde (FFPE) prøver kan representeres i en enkelt parafinblokk. Dette oppnås ved å bruke vevskjerner hentet fra interesseområdet til forskjellige donor FFPE-blokker og arrangere dem i en enkelt TMA-parafinblokk. Når de er konstruert, kan seksjoner fra den ferdige TMA brukes til å utføre immunhiokjemi, kromogene, fluorescens in situ hybridisering (FISH) og RNA ISH-studier for å vurdere proteinuttrykk samt genomiske og transkripsjonelle endringer i mange prøver samtidig, og dermed minimere vevsbruk og redusere reagenskostnader. Det finnes flere forskjellige TMA-konstruksjonsteknikker. En av de vanligste konstruksjonsmetodene er mottakermetoden, som fungerer best med kjerner av samme lengde som en minimumslengde på 4 mm anbefales for. Dessverre kan vevsblokker bli sterkt oppdaget under diagnostiseringsprosessen, noe som ofte resulterer i "ikke-ideelle" donorblokktykkelser på mindre enn 4 mm. Den nåværende artikkelen og videoen fokuserer på den dobbeltsidige tapemetoden; en alternativ manuell, rimelig, enkel å bruke og rask metode for å konstruere TMAer med lav tetthet (<50 kjerner) som er svært kompatible med disse ikke-ideelle giverblokkene. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning om hvordan du konstruerer en TMA ved hjelp av denne metoden, med fokus på den kritiske betydningen av patologisk gjennomgang og validering etter konstruksjon.
Introduction
Formalin fast parafin innebygd (FFPE) vev brukes mye i morfologiske og immunhiistokjemiske proteinuttrykksstudier1. Imidlertid krever oppdagelsesforskning ofte undersøkelse av flere markører på et stort antall vev, som kan utmatte dyrebare vev. Vevmikroarray (TMA) ble introdusert på 1980-tallet, og er et viktig forskningsverktøy som samler små eksemplariske interesseregioner fra mange forskjellige FFPE-vevsblokker i en enkelt parafinblokk, slik at undersøkelse av mange vevsprøver samtidig2. Dermed unngår TMAer overdreven bruk av svært dyrebare, og ofte sjeldne vevsprøver, samtidig som kostnadene forbundet med å utføre nedstrømsapplikasjoner på mange individuelle prøver 3,4 reduseres.
Det finnes flere ulike teknikker for bygging av TMAer5, inkludert automatiserte og semi-manuelle tilnærminger 6,7. De fleste av disse sistnevnte tilnærmingene bruker mottakermetoden, hvor vevskjerner som slås fra donorblokker settes inn i en prefabrikkert form. Det anbefales imidlertid at "ideelle" donorblokker som er minst 4 mm tykke, brukes til denne metoden 6,7. Dessverre er donorblokker, spesielt de som har blitt grundig seksjonert for kliniske diagnostiske formål før de blir gjort tilgjengelig for forskning, ofte mindre enn 4 mm tykke, noe som kan utelukke dem fra bruk i TMA-konstruksjon ved hjelp av mottakermetoden, hvis re-embedding for å oppnå en dybde på 4 mm ikke er mulig eller ønskelig. Videre kan disse prosedyrene ofte bruke en benktop manuell vev mikroarrayer eller dyre automatiserte instrumenter som ikke er lett tilgjengelige eller rimelige for det gjennomsnittlige forskningslaboratoriet. Derimot er den dobbeltsidige tapemetoden eller tapemetoden en manuell TMA-konstruksjonsmetode som er kompatibel med ikke-ideelle donorblokker som bruker billige, allment tilgjengelige, gjenbrukbare eller engangs håndholdte vevmikroarrayer 8,9,10. Denne metoden inverterer byggeprosessen ved å kaste blokken rundt inverterte oppreiste kjerner som ved ferdigstillelse er flush med toppen av TMA, uavhengig av kjernelengde. Som et resultat er alle prøver til stede i TMA-seksjoner når de først seksjoneres, noe som gjør at konstruktøren kan få mest mulig ut av disse ikke-ideelle blokkene fra starten. Dermed representerer båndmetoden et kostnadseffektivt og gjennomførbart alternativ for de ikke-spesialiserte forskningslaboratoriene.
TMA-konstruksjon er ikke uten utfordringer, og det må utvises forsiktighet ved valg av vevsregioner å trekke ut kjernene fra, noe som gjør patologisk gjennomgang til en kritisk del av TMA-byggeprosessen11,12. Dermed tar denne protokollen sikte på å understreke den dype betydningen av patologisk gjennomgang i TMA-konstruksjon ved å fremheve noen av de patologiske fallgruvene forbundet med TMA-konstruksjon som enkeltpersoner som konstruerer og bruker TMAer bør være klar over, og hvorfor patologigjennomgang bør fortsette gjennom levetiden til en TMA-blokk.
Denne protokollen skisserer trinnene som er tatt ved AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory for å konstruere TMAer fra ikke-ideelle donorblokker ved hjelp av båndmetoden; der ACSR er en NIH-finansiert biorepositori dedikert til innsamling og rettferdig fordeling av biopecimens fra HIV-kreftvev for å fremme HIV-malignitetsforskning.
Protocol
Alle donorblokker ble deidentifisert under innsamling og brukt til TMA-konstruksjon i samsvar med godkjente Mayo Clinic IRB-protokoller (PR16-000507 og PR2207-02).
1. Patologi gjennomgang
- Hent FFPE vevsdonorblokkene som skal brukes i TMA-konstruksjonen.
- Send inn en nygenerert hematoksylin og eosin (H&E) farget lysbilde13 for hver FFPE vev donor blokk valgt for histologisk gjennomgang av en styresertifisert patolog for å bekrefte diagnosen og kommentere vevet.
MERK: H&E-farging kan utføres internt eller sendes til et patologisk kjernetjenestelaboratorium for farging, slik tilfellet var i denne protokollen. Et av de viktigste konseptene å huske når du konstruerer TMAer er at vevet i FFPE-donorblokkene er 3-dimensjonale (3D) strukturer hvis form, tumorinnhold og vev levedyktighet kan endres betydelig med økende blokkdybde. Patologen må bestemme, basert på gjennomgangen av H&E farget vevsseksjon, som er en 2-dimensjonal representasjon av 3D-vevet, den beste regionen å trekke ut vevskjernen fra. - Under histologisk gjennomgang, sørg for at patologen identifiserer og kommenterer vev av interesse / ikke av interesse på H &E farget lysbilder. Hvis du vil sette inn merknader i lysbildet, følger du fremgangsmåten nedenfor.
- Bruk en glidepenn til å sirkle inn vevet av interesse.
- Bruk samme markeringspenn, flekk ut områder innenfor det sirklede området som bør unngås.
- Bruk merkepennen til å merke områdene som anses å være ideelle for kjerneprøvetaking og ekstraksjon.
MERK: Det er viktig å huske at vevsformen og sammensetningen kan endres med vevsdybde i blokken. Dermed kan sammensetningen av vevskjernen endres avhengig av hvor kjernen ble ekstrahert, noe som understreker behovet for fortsatt patologisk veiledning. - Send inn ekstra vev for sykdomsspesifikke immunhistokjemiske flekker sammen med H&Es, om nødvendig, for å hjelpe den patologiske gjennomgangen. Eksempler på slike flekker inkluderer ERBB2 farging for HER2 positiv brystkreft14, HHV-8 for Kaposi sarkom15, CD20 for B-cellelymfomer 16, U6 som en global markør for RNA kvalitet17, EBER for å bestemme Epstein-Barr virus positivitet18, og Vimentin som bekreftelse av mesenchymal opprinnelse og vev kvalitet markør kontroll19,20.
2. Forberedelse for TMA-konstruksjon
- Når patologigjennomgangen er fullført, kompilerer du den endelige listen over donorblokker som skal brukes i TMA-konstruksjonen og oppretter et TMA-kart (figur 1A). TMA-kartet er en skjematisk disposisjon der kjernene vil bli plassert i den ferdige TMA og lysbildemonterte vevsprøver hentet fra den resulterende TMA.
- For orienteringsformål må du sørge for at TMA-kartet unngår å plassere kjerner i en jevn matrise, for eksempel en 3 x 3 eller 4 x 4 matrise og inkluderer minst 1 orienteringsmarkør.
MERK: Orienteringskjerner kan være kjerner hentet fra vevsfrie fargede orienteringsverktøy21, eller vevsblokker som inneholder tydelig forskjellige vev fra temaet TMA. I motsetning til mottakermetoden der oppreiste kjerner settes inn i en pre-støpt voksform, skaper tapemetoden en TMA ved å helle smeltet voks rundt inverterte, oppreiste kjerner. Denne inversjon av byggeprosessen krever et annet kart kjent som byggekartet. - Opprett konstruksjonskartet ved å opprette et speilbilde av TMA-kartet (figur 1B). Konstruksjonskartet viser hvor hver kjerne må plasseres under bygging for å vises på riktig sted i den fullførte TMA. Lagre byggekartet.
- Når kartene er opprettet, klargjør du metall-TMA-baseformen. Bruk et engangspapir rutet rutenett for å lede kjerneplassering og regulere kjerneseparasjon.
MERK: Et malrutenett på 6 x 7 (42 spot) for maksimalt 40 kjerner (pluss for to orienteringskjerner/hull) for bruk med kommersielt tilgjengelige metallbaseformer med innvendige dimensjoner på 26 mm x 20 mm er gitt i tilleggs-PDF-filen. Skriv ut og klipp ut papirrutenettet. - Klipp det rutete rutenettet i størrelse og fest et stykke dobbeltsidig pinnetape (DSST) på baksiden av rutenettet. Plasser rutenettet og DSST-båndet i metallbrettet og legg til et ekstra stykke DSST på toppen av rutenettet, det vil si på toppen av papirgitteret i metallbaseformen (figur 2A).
3. Kjerneplassering
- Overlegg den patologisk gjennomgåtte H&E på den tilsvarende vevsblokken og bruk patologmarkeringene til å identifisere hvor vevsblokken skal stanses (figur 2B).
- Stans FFPE-donorblokken ved hjelp av en manuell kjernestansing (figur 2C) på riktig sted.
MERK: Kjernestanser er tilgjengelige i en rekke diametre. Denne metoden bruker en 2 mm diameter håndholdt kjernestans.- Hvis du bruker en gjenbrukbar kjernestans, må du sørge for at den rengjøres før og etter hvert vevsstans.
- Løs ut kjernen fra kjernestansen og bruk et nåleplukk for å plassere den utkastede kjernen på trådkorset på det DSST-dekkede rutenettet (figur 2D). Pass på at når kjernen er plassert på rutenettet, er den invertert og oppreist slik at vevsenden av kjernen kontakter DSST (vev-med forsiden ned). Sørg også for at kjernen er plassert i riktig posisjon på rutenettet som angitt av konstruksjonskartet.
- Gjenta til alle donorblokker er kjerne og kjernene er plassert i deres passende posisjoner.
4. Fullføre TMA
- Slå på ovnen på benken, sett den til 78 °C, og la det være tilstrekkelig tid til å komme til temperatur.
- For hver TMA som skal konstrueres, smelt 45 g parafinpellets i en ovnssikker beholder.
- Merk en plastkassett og legg den på toppen av metallbaseformen som inneholder kjernene (figur 2E). Høyden på kjernene bør ikke overstige dybden på metallbrettet, da høye kjerner vil bli vippet eller veltet når kassetten er satt på plass.
- Plasser formen med kassetten på et brett for å fange overløp og hell forsiktig den smeltede parafinen gjennom kassetten i kjernebrettet (figur 2F).
- La den smeltede parafinen overløpe for å sikre at det ikke er luftbobler i TMA-kroppen. Pass på at parafinen fylles til toppen av kassetten slik at den er innebygd i og godt bundet til parafinblokken når parafinen har størknet.
- Ikke flytt eller forstyrr blokken og la den avkjøles ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter kjøles ved 4 °C i ytterligere 30 minutter for å størkne helt.
- Når den er fullstendig størknet, skiller du metallbaseformen forsiktig fra den kassettbundne parafinblokken av kjerner.
MERK: DSST beholder sin klebeevne gjennom byggeprosessen og festes ofte til den nyopprettede parafinblokken. Hvis det er aktuelt, fjerner du DSST og rutenettet forsiktig fra toppen av den nå fullførte TMA-blokken.
5. Validering av TMA
- Når TMA er konstruert, bruker du en mikrotom til å seksjonere den nylig fullførte TMA. Klipp en eller flere full-faced vev seksjon.
- Overfør seksjonene til det forhåndsvarsmede vannbadet og skyv seksjonene.
MERK: Nybygde blokker krever ofte blokkvendt (kutting av overflødig parafin) for å oppnå full ansiktsvevsseksjoner som inneholder alle kjerner. - Når den er tørr, send inn en nykuttet skyvemontert TMA-seksjon for H&E-farging13 og eventuell ekstra immunhiistokjemisk farging om nødvendig.
- Send inn de fargede TMA H&E-seksjonene for patologisk gjennomgang.
MERK: Under TMA-patologigjennomgang gjennomgår en styresertifisert patolog, helst den samme patologen som gjennomgikk TMA-donorblokkene, TMA H&E-fargede kjerner for å sikre at ønsket vev av interesse faktisk er til stede. Hvis ytterligere vev eller sykdomsspesifikke immunhiistokjemiske flekker ble sendt inn til donorblokkgjennomgang i trinn 1.3.4, bør disse flekkene gjentas på TMA-seksjoner og sendes inn sammen med TMA H&E for patologisk gjennomgang. - Registrer resultatene av TMA patologisk valideringsgjennomgang.
Representative Results
Båndmetoden for TMA-konstruksjon beskrevet her er metoden for valg som brukes ved ACSR Technical Core Laboratory for å bevare vev, noe som igjen tillater nøysom og rettferdig fordeling av svært dyrebare vev til forskere.
En kritisk komponent i byggeprosessen er identifisering av vevet av interesse i en gitt donorblokk hvorfra TMA-kjernen skal oppnås. Dette bestemmes av patologisk gjennomgang der en utdannet patolog gjennomgår et nygenerert H&E-lysbilde (figur 3). Ved hjelp av en markør sirkler patologen området på H&E-lysbildet, noe som indikerer at kjernen skal hentes fra donorblokken inne i denne sirkelen (figur 3). Patologen kan også markere flere områder som nekrotiske områder, som bør unngås, eller godartede områder hvorfra ytterligere vevskjerner kan oppnås (figur 3). Kjerner blir deretter stanset fra de angitte områdene og inkludert i byggingen av TMA.
Det er to hovedmålinger for vellykket fullføring av en TMA ved hjelp av båndmetoden. Den første er tilstedeværelsen av vevskjerne prikker i forventede posisjoner og avstander bortsett fra hverandre, som vurderes ved visuell inspeksjon. Figur 4A,B viser to fullstendig båndmetode TMAer og tilhørende H&E-lysbilder. Visuell inspeksjon av TMA-blokkene viser at kjernene er til stede og regelmessig fordelt i hver TMA. Noen av de viktigste konstruksjonsproblemene som kan oppstå under båndmetodekonstruksjonsprosessen inkluderer separasjon av blokken og kassetten på grunn av for tidlig fjerning av metallbasen før voksstørkning (figur 4C). Et annet potensielt problem som observeres med båndmetode konstruert tMAer er kjerne topping og eller plassering drift av de innebygde kjernene (figur 4D); et problem som kan oppstå ved overdreven turbulent helling av den smeltede parafinen, som kan forsterkes ytterligere av dårlig lim DSST. Figur 5 viser H&E-bildene for kjernene i TMA1. Alle unntatt en kjerne (spot 1) er til stede i H&E av TMA1. Figur 5 viser også at noen kjerner er til stede som komplette sirkulære vevspunkter (dvs. flekker 4, 6, 13, 17) mens andre ikke er helt til stede (dvs. flekker 3, 8, 9, 12). Vevstapet som oppleves i disse sistnevnte tilfellene er ikke uvanlig og kan skyldes utilstrekkelig seksjonering som trengs for å avsløre alle kjerner i sin helhet. Alternativt kan tilstedeværelsen av ufullstendig, eller det totale fraværet av vev (dvs. spot 1), stamme fra dårlig vevskvalitet i den kjernen, noe som kan føre til vevstap under fargingsprosessen.
Den andre målingen av suksess vurderes i forhold til om TMA-kjernene fanget opp interessevevet eller ikke. Dette oppnås via patologisk gjennomgang og validering av de enkelte TMA H&E-kjernene (figur 5) sammenlignet med den forhåndsstansede donorblokken H&Es (figur 3), og der det er nødvendig/utførte andre ekstra immunhiistokjemiske flekker utført. Figur 6 viser eksemplariske flekker utført på TMA1, inkludert Vimentin, U6, EBER og CD20. Vimentin positive vev (brun flekk) indikerer at alle vev er av mesenchymal opprinnelse og er god kvalitet som kan farges. U6 positivitet (mørk lilla / blå flekk) indikerer at RNA-kvaliteten i vevet er god og komplimenterer RNA in situ hybridisering (ISH) flekker som EBER, som retter seg mot gentranskripsjoner. U6-resultatene i figur 5 indikerer at RNA-kvaliteten er høy i lymfomvevet (spot 9) og den normale mandlene vev orienteringskontroll (spot 22), men ikke i det normale vevet på punkt 19. Følgende fra denne EBER-fargingen var negativ i det normale vevet og orienteringskontrollen, men sterkt positiv i lymfomvevet (spot 9). Som forventet for vev av lymfoid opprinnelse, både flekker 9 og 22 farget positivt for B-cellemarkøren CD20, men spot 19, som stammer fra normalt ryggmargsvev, gjorde det ikke. Fargeresultatene for alle TMA-kjerner er oppsummert i tabell 1 og bekrefter vevsmerknaden for disse TMA-vevskjernene.
Figur 1: TMA-kart. Når alle FFPE-blokkene og orienteringskontrollene er valgt, opprettes et detaljert kart, kjent som et TMA-kart (A), som skisserer hvor hver donorblokkkjerne vil bli plassert i den ferdige blokken. Det er viktig å merke seg at når du konstruerer en TMA ved hjelp av båndmetoden, er konstruksjonskartet (B) et speilbilde av TMA-kartet fordi denne metoden inverterer byggeprosessen, og heller smeltet paraffin rundt oppreist vevskjerner i stedet for å sette kjernene inn i en prefabrikkert form. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bygge TMA ved hjelp av båndmetoden. (A) Lag 2 stykker dobbeltsidig pinnetape (DSST) og et papirgitter i rekkefølge på bunnen av metallbaseformen; plasser det første DSST-stykket (2A-innsats), etterfulgt av engangspapirgitteret, og deretter det andre stykke DSST på bunnen av metallbaseformen. (B) For hver donorblokk genereres og gjennomgås en fersk H&E av en patolog som markerer H&E for å betegne vevet av interesse, hvor du skal slå blokken og om aktuelt hvor du kan unngå å slå for å trekke ut en vevskjerne. (C) Stans donorblokken med en avhending eller gjenbrukbar håndholdt TMA-punch. (D) Ved hjelp av et nåleplukk plasseres hver kjerne stående oppreist, svulst med forsiden ned på DSST som dekker rutenettet. (E) Plasser forsiktig en forhåndsmerket plastkassett på toppen av metallbrettet som inneholder de oppreiste kjernene. (F) Smeltet parafin helles forsiktig i brettet gjennom kassettgitteret for å omgi og senke de oppreiste kjernene under kassetten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Donorblokk H&E-flekk. H&E-fargede seksjoner fra hver donorblokk blir utsatt for QC-gjennomgang med en treningspatolog som kommenterer H&E-farget lysbilde med en markør for å indikere interesseområdene/vevene (dvs. levedyktig kreft (CA) eller godartet (BN) vev) for kjerneinnsamling, samt områder som bør unngås (dvs. nekrotiske vevsområder). De aktuelle områdene av vevsblokken, som angitt av den kommenterte H&E, blir deretter identifisert, stanset og innlemmet i TMA som bygges. Den resulterende TMA-kjernestansen H&E kan deretter refereres tilbake til det upunched området av donorblokken H&E for å bekrefte at vevet av interesse ble fanget i kjernestansen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative Results. (A,B) Fullførte båndmetodeN TMAer og deres medfølgende H&Es for patologisk gjennomgang. (C) Separasjon av plastkassetten og parafinblokken når kassetten fjernes for tidlig fra metallbaseformen. (D) Fullført tape metode TMA viser veltet og migrert kjerner som følge av turbulent helling av smeltet paraffin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: TMA-kjerne H&Es. H&E farget seksjon for TMA1, som viser de enkelte H&Es for hver vevskjerne som brukes til å konstruere TMA (flekker 1-21) samt orienteringskjerner (flekker 22 og 23). Bilder som ble vist ble oppnådd ved hjelp av en 4x målsetting, utstyrt med et digitalt kamera koblet til bildeprogramvaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksemplarisk immunhiistokjemisk og RNA ISH. Full ansiktsseksjoner fra TMA1 ble vurdert av IHC for vimentin- og CD20-uttrykk og av RNA ISH for å vurdere RNA-kvalitet (U6) og EBV-status via EBER ISH. Bilder viser eksemplariske bilder for tre kjerner, inkludert ett tumorvev (spot 9), ett normalt vev (spot 19), samt en av de to orienteringskontrollene (spot 22). Vimentin positivitet er betegnet med brun farging, U6 positivitet er betegnet med blå / lilla farging, EBER ved blå / lilla farging og CD20 ved brun farging. Bilder som ble vist ble oppnådd ved hjelp av en 4x målsetting, utstyrt med et digitalt kamera koblet til bildeprogramvaren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Oversikt over konstruertE TMA-vev og flekker utført: Tabellen skisserer om (a) vev er til stede i hver av de representative TMA-flekkene (b) svulsten er til stede i hver H&E farget vevsflekk og (c) resultatene av eventuelle ekstra immunhitologiske flekker utført på tilstøtende TMA-seksjoner: "-" indikerer negativ, n / d = ikke gjort. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
En av de mest kritiske komponentene i TMA-byggeprosessen er patologigjennomgang av FFPE-donorblokker som TMA-kjernene vil bli hentet fra4. Under gjennomgangen undersøker en styresertifisert patolog en representativ H&E farget vevsseksjon fra hver donorblokk. Det er viktig at H&E genereres ved hjelp av en nykuttet vevsseksjon slik at det er den beste representasjonen av den tilsvarende donorblokken. Bruk av eldre H&Es anbefales ikke gitt at FFPE vev er 3-dimensjonale strukturer hvis vevsprofil kan endres betydelig med blokkdybde og omfattende seksjonering; Dette kan ha skjedd siden H&E ble generert, noe som potensielt kan gjøre representasjonen av FFPE-blokken unøyaktig. Gjennomgangsprosessen er avgjørende for valg av egnede tilfeller og identifisering av vevsområder hvor kjerner skal oppnås, samt identifisering av områder som bør unngås ved innsamling av kjerner. I fravær av patologisk gjennomgang øker sannsynligheten for å inkludere uegnet vev betydelig. Inkludering av slike vev har potensial til å gjøre den konstruerte TMA ineffektiv og uegnet til det tiltenkte formål. Viktigst, uvitende å bruke slike ineffektive TMAer har et enormt potensial til å resultere i falske og villedende data. Dette kombinert med kunnskapen om at profilen til FFPE-vev, og dermed deres derivatkjerner, kan endres betydelig med økende dybde fremhever viktigheten av fortsatt patologigjennomgang gjennom levetiden til en konstruert TMA-blokk. Ideelt sett bør H&Es genereres ved hjelp av hver 15eller 20seksjon for å sikre at eventuelle endringer i vevsprofilene til kjernene fanges og registreres. Som et minimum bør H&Es genereres og gjennomgås ved starten og slutten av et prosjekt for å overvåke disse potensielle endringene. I lys av disse punktene og TMA-ens betydning som forskningsverktøy, er det viktig at den patologiske gjennomgangen er godt innebygd i TMA-byggeprosessen og gjennom hele TMA-blokkens levetid.
FFPE-blokker er ofte grundig seksjonert under rutinemessig diagnostisk behandling før de slippes ut til forskningsformål. Som et resultat er donorblokkdybden og dermed donorblokkkjernelengdene ofte mindre enn mottakermetoden ideal på 4 mm. Her har vi demonstrert hvordan man konstruerer TMAer ved hjelp av båndmetodekonstruksjonsprotokollen, hvis viktigste fordel er kompatibiliteten med kjerner fra ikke-ideelle FFPE-vevsblokker. Selv om båndmetoden er av stor forskningsverdi og tilbyr en billig, praktisk og tilgjengelig metode for å konstruere TMA-blokker, er den ikke uten sine utfordringer og begrensninger. Sammenlignet med både automatiserte og manuelle mottakermetoder, som kan romme 100-1000 kjerner i en enkelt TMA-blokk, anbefales maksimalt 40 kjerner for TMAer konstruert ved hjelp av båndmetode9. En annen begrensning er med hensyn til enkel konstruksjon. I mottakermetoden settes stansede kjerner bare inn i en prefabrikkert form, noe som gir kjernestabilitet ved å omslutte hver kjerne i sin egen individuelle brønn, og dermed forhindre kjernemigrering samt fremme svært vanlig kjerneplassering og separasjon22. Videre tilbyr mottakermetoden den valgfrie bekvemmeligheten av å være fullt manuell, semi-manuell og helautomatisk. I motsetning krever den manuelle tapemetoden forsiktig, skånsom plassering av hver kjerne for hånd ved hjelp av et nåleplukk. Selv om fraværet av en prefabrikkert mugg i båndmetoden utelukker den svært vanlige plasseringen og separasjonen som oppleves med mottakermetoden, overvinnes denne mangelen gjennom inkludering av et rutete rutenett. Det er viktig at det rutete rutenettet festes til midten av metallbrettet for å unngå plassering av blokkkanten, noe som øker risikoen for kjernetap hvis det ikke er tilstrekkelig parafin som holder kjernen på plass. Det må også bemerkes at de små kjerneseparasjonene som er mulig med mottakermetoden ikke kan oppnås med tapemetoden på grunn av manuell kjerneplassering og behovet for nåleplukking for å passe mellom tilstøtende kjerner. Kjerner er plassert på en frittstående oppreist måte med det minste overflatearealet eller fotavtrykket til kjernen som kontakter det DSST-dekkede rutenettet. Dette oppsettet gir betydelig mindre kjernestabilitet enn mottakermetoden og gir en forbedret risiko for kjernepålegg og eller migrasjon når du heller den smeltede parafinen. Faktisk er et av de mest kritiske trinnene i protokollen å helle den smeltede parafinen. Det er viktig at dette gjøres raskt ved fjerning fra ovnen for å sikre at parafinen er helt flytende og at hellingen utføres forsiktig med minimal turbulens. Interessant nok utviklet Chen et al. en svært ny hjelpeenhet, i likhet med en sjablong med 7 x 11 jevnt fordelte hull med 2 mm diameter, som er plassert på toppen av en tom parafinblokk for å lede nåler når du oppretter mottakerblokken og når du setter inn donorblokkkjernene23. Selv om den er designet for å hjelpe mottakerblokkkonstruksjon, kan en slik enhet enkelt tilpasses båndmetoden for å lede plassering, regulere separasjon og øke kjernestabiliteten under byggeprosessen.
En av de viktigste effektorene for kjernestabilitet er antall kjerner som er inkludert i en båndmetode TMA. Dette skyldes at etter hvert som antallet kjerner øker, må diameteren på kjernen reduseres for å imøtekomme det økende antallet kjerner, noe som igjen reduserer kjernefotavtrykket ved å overholde sommertid. En minimum kjernediameter på 1 mm anbefales for TMA-konstruksjon for båndmetode, da vi har funnet ut at kjerner med mindre diametre er spesielt ustabile og tilbøyelige til å velte selv med veldig mild parafin helling. En nylig studie som undersøkte to forskjellige interne metoder som brukte 16 G nåler (kjernediameter på 1,1 mm) og en 4 mm diameter slag opplevde betydelige vevstap med 1,1 mm (26,5%), men ikke 4 mm kjerner24. Dette ser ut til å indikere at små kjerner kan være problematiske å jobbe med og ikke bare under bygging. Dessuten kan mindre diametre ikke representere den opprinnelige donorblokken så vel som større kjerner, noe som gjør patologisk tolkning vanskelig og øker sannsynligheten for unøyaktig donorvevsrepresentasjon.
Inkludering og plassering av orienteringsblokker er av stor betydning i TMA-konstruksjon. Dette er imidlertid spesielt viktig for båndmetode konstruert av TMAer. Dette stammer fra det faktum at båndmetoden inverterer byggeprosessen og dermed øker risikoen for romlig desorientering. Vi anbefaler å inkludere opptil tre orienteringskjerner i hver blokk, og at de plasseres vekk fra prøvekjernene for best å orientere blokken. Orienteringskjerner kan være kjerner hentet fra vevsblokker som inneholder tydelig forskjellige vev fra temaet for de konstruerte TMA- eller vevsfrie orienteringsverktøyene21, hvor sistnevnte er spesielt nyttig for ikke-patologer. Kombinert med ikke-vanlig matrisemønstret kjerneplassering minimerer orienteringskjerner risikoen for desorientering.
Den markerte forskjellen i kjernelengde mellom TMAer konstruert ved hjelp av bånd- og mottakermetodene stammer fra inkludering av donorblokkdybde i beslutningsprosessen ved valg av byggemetode. Protokollen som er skissert her, bruker en terskel der TMAer konstrueres ved hjelp av tape- og mottakermetodene når donorblokkene har dybder på henholdsvis <4 mm og 4 mm. Det er viktig å merke seg at inkludering av donorblokkdybde i valg av konstruksjonsmetode ikke er universelt. Selv om det er mulig for TMAer å konstrueres ved hjelp av en av metodene uavhengig av donorblokkdybde, kan høyere kjerner forstyrre, og eller veltes eller vippes av, plasseringen av plastkassetten under TMA-konstruksjon ved hjelp av tapemetoden. Valget om å inkludere eller utelate kriterier i beslutningsprosessen avhenger av fasilitetene som er tilgjengelige for laboratoriet, kostnaden og ønsket sluttprodukt. Under parametrene for denne protokollen er antall lysbildemonterte TMA-seksjoner som kan hentes fra en båndmetode konstruert TMA betydelig mindre enn det som er hentet fra en mottakermetode konstruert TMA. Selv om det er mulig å re-blokkere FFPE-vev for å øke donorblokkdybden og gjøre dem kompatible med mottakermetoden, er sannsynligheten for å oppnå samme vevsorientering i re-blokken lav. I sin tur kan dette kreve omfattende blokk som vender mot for å oppnå en full-face seksjon, som sannsynligvis vil inkludere betydelig vevstap. Etter blokkvendt gir en båndmetode konstruert TMA omtrent 50 skyvemonterte TMA-seksjoner med alle kjerner til stede. Det nøyaktige tallet vil imidlertid variere fra blokk til blokk og avhenger av lengden på kjernene som brukes til å konstruere TMA og tykkelsen på seksjonene som kuttes (5 μm versus 4 μm). Videre må det også bemerkes at på grunn av deres forskjellige kjernelengder, vil kjernene eksos på forskjellige tidspunkter som TMA er gradvis seksjonert; en egenskap som reemphasizes behovet for fortsatt patologisk gjennomgang.
Selv om mottakermetoden gir betydelige fordeler og fordeler i forhold til båndmetoden, inkludert en mindre kjedelig og mer rask konstruksjonsprosess, er båndmetoden ikke rettet mot erfarne laboratorier med høy gjennomstrømning. Det er rettet mot det gjennomsnittlige laboratoriet, spesielt de i ressursbegrensede omgivelser, med tilgang til donorblokker med variabel dybde, men ikke til TMA-byggetjenester. Fremtidige applikasjoner kan imidlertid se automatisering av denne metoden for å forbedre utvalget av kvalifiserte prøver i laboratorier med høy gjennomstrømning og eliminere behovet for reblokkering av donorblokker. Til slutt kan den beskrevne TMA-båndmetodekonstruksjonsprotokollen enkelt etableres ved ikke-spesialiserte laboratorier uten behov for dyrt utstyr. Det anbefales imidlertid at nye brukere bør bruke FFPE vevsblokker uten verdi, vevsfrie fargede orienteringsverktøy21 eller til og med fargede parafinblokker uten vev i begynnelsen for å gjøre seg kjent med båndmetodeteknikken før de går videre til TMA-konstruksjon ved hjelp av dyrebart vev. Selv om deres konstruksjon ikke er uten potensielle fallgruver, som både de som konstruerer og bruker TMA-blokker bør være klar over, kan denne tilsynelatende upolerte "hjemmelagde" TMA-konstruksjonsmetoden gi høy kvalitet, biologisk relevante TMAer for forskning. Faktisk er TMA-seksjoner som stammer fra båndmetode konstruerte TMAer blant en av de mest etterspurte vevsprøvene i ACSR-biorepositoriet.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Støtten til dette arbeidet ble gitt av den NIH-finansierte aids- og kreftprøveressursen (ACSR) biorepositori (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
