Summary
Detta protokoll beskriver tejpmetoden för hur man manuellt konstruerar en vävnadsmikroarray med FFPE-givarblock med olika djup.
Abstract
Vävnadsmikroarray (TMA) är ett viktigt forskningsverktyg där många formalin fixerade paraffininbäddade (FFPE) prover kan representeras i ett enda paraffinblock. Detta uppnås genom att använda vävnadskärnor extraherade från regionen av intresse för olika givar-FFPE-block och ordna dem i ett enda TMA-paraffinblock. När de väl har konstruerats kan sektioner från den färdiga TMA användas för att utföra immunohistokemi, kromogena, fluorescens in situ hybridisering (FISH) och RNA ISH-studier för att bedöma proteinuttryck samt genomiska och transkriptionella förändringar i många prover samtidigt, vilket minimerar vävnadsanvändningen och minskar reagenskostnaderna. Det finns flera olika TMA-konstruktionstekniker. En av de vanligaste konstruktionsmetoderna är mottagarmetoden, som fungerar bäst med kärnor av samma längd för vilka en minsta längd på 4 mm rekommenderas. Tyvärr kan vävnadsblock kraftigt resekeras under diagnosprocessen, vilket ofta resulterar i "icke-idealiska" givarblocktjocklekar på mindre än 4 mm. Den aktuella artikeln och videon fokuserar på den dubbelsidiga tejpmetoden; en alternativ manuell, låg kostnad, lätt att använda och snabb metod för att konstruera TMA med låg densitet (<50 kärnor) som är mycket kompatibel med dessa icke-idealiska givarblock. Detta protokoll ger en steg-för-steg-guide om hur man konstruerar en TMA med hjälp av denna metod, med fokus på den kritiska betydelsen av patologisk granskning och validering efter konstruktion.
Introduction
Formalin fixerade paraffin inbäddade (FFPE) vävnader används i stor utsträckning i morfologiska och immunohistokemiska proteinuttrycksstudier1. Upptäcktsforskning kräver emellertid ofta undersökning av flera markörer på ett stort antal vävnader, vilket kan uttömma värdefulla vävnader. Vävnadsmikroarrayen (TMA) introducerades på 1980-talet och är ett viktigt forskningsverktyg som samlar små exemplifierande regioner av intresse från många olika FFPE-vävnadsblock till ett enda paraffinblock, vilket möjliggör undersökning av många vävnadsprover samtidigt2. TMA undviker således överdriven användning av mycket värdefulla och ofta sällsynta vävnadsprover samtidigt som kostnaderna för att utföra nedströmsapplikationer på många enskilda prover 3,4 minskar.
Det finns flera olika tekniker för konstruktion av TMA5, inklusive automatiserade och halvmanuella metoder 6,7. Majoriteten av dessa senare metoder använder mottagarmetoden, där vävnadskäror stansade från givarblock sätts in i en prefabricerad form. Det rekommenderas dock att "idealiska" givarblock som är minst 4 mm tjocka används för denna metod 6,7. Tyvärr är givarblock, särskilt de som i stor utsträckning har sektionerats för kliniska diagnostiska ändamål innan de görs tillgängliga för forskning, ofta mindre än 4 mm tjocka, vilket kan utesluta dem från användning i TMA-konstruktion med mottagarmetoden, om ombäddning för att uppnå ett djup på 4 mm inte är möjligt eller önskvärt. Dessutom kan dessa procedurer ofta använda en bänkskiva manuell vävnadsmikroarrayer eller dyra automatiserade instrument som inte är lättillgängliga eller överkomliga för det genomsnittliga forskningslaboratoriet. Däremot är den dubbelsidiga tejpmetoden eller tejpmetoden en manuell TMA-konstruktionsmetod som är kompatibel med icke-idealiska givarblock som använder billiga, allmänt tillgängliga, återanvändbara eller engångshandhållna vävnadsmikroarrayer 8,9,10. Denna metod inverterar byggprocessen genom att gjuta blocket runt inverterade upprättstående kärnor som vid färdigställande är i linje med toppen av TMA, oavsett kärnlängd. Som ett resultat är alla prover närvarande i TMA-sektioner när de först sektioneras, vilket gör det möjligt för konstruktören att få ut det mesta av dessa icke-idealiska block från början. Således representerar bandmetoden ett kostnadseffektivt och genomförbart alternativ för de icke-specialiserade forskningslaboratorierna.
TMA-konstruktion är inte utan utmaningar, och försiktighet måste vidtas vid val av vävnadsregioner för att extrahera kärnorna från, vilket gör patologisk granskning till en kritisk del av TMA-byggprocessen11,12. Således syftar detta protokoll till att understryka den djupa betydelsen av patologisk granskning i TMA-konstruktion genom att lyfta fram några av de patologiska fallgroparna i samband med TMA-konstruktion som individer som konstruerar och använder TMA bör vara medvetna om, och varför patologigranskning bör fortsätta under livslängden för ett TMA-block.
Detta protokoll beskriver de steg som vidtagits vid AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory för att konstruera TMA från icke-idealiska givarblock med hjälp av tejpmetoden; där ACSR är ett NIH-finansierat biorepository som är dedikerat till insamling och rättvis fördelning av biospecimens från HIV-cancervävnader för att främja HIV-malignitetsforskning.
Protocol
Alla donatorblock avidentifierades under insamlingen och användes för TMA-konstruktion i enlighet med godkända Mayo Clinic IRB-protokoll (PR16-000507 och PR2207-02).
1. Patologi granskning
- Hämta FFPE-vävnadsdonatorblocken som ska användas i TMA-konstruktionen.
- Skicka in en nygenererad hematoxylin och eosin (H & E) färgad bild13 för varje FFPE-vävnadsdonatorblock som valts ut för histologisk granskning av en styrelsecertifierad patolog för att bekräfta diagnosen och kommentera vävnaden.
OBS: H & E-färgning kan utföras internt eller skickas till ett patologiskt kärntjänstlaboratorium för färgning, vilket var fallet i detta protokoll. Ett av de viktigaste begreppen att komma ihåg när man konstruerar TMA är att vävnaderna i FFPE-givarblocken är 3-dimensionella (3D) strukturer vars form, tumörinnehåll och vävnadsviabilitet kan förändras avsevärt med ökande blockdjup. Patologen måste bestämma, baserat på granskningen av H & E-färgad vävnadssektion, som är en 2-dimensionell representation av 3D-vävnaden, den bästa regionen att extrahera vävnadskärnan från. - Under histologisk granskning, se till att patologen identifierar och kommenterar vävnaderna av intresse / inte av intresse på H & E-färgade bilder. Följ stegen nedan för att kommentera bilden.
- Använd en glidmarkeringspenna för att cirkla vävnaden av intresse.
- Använd samma markeringspenna och torka ut områden inom det inringade området som bör undvikas.
- Använd märkningspennan för att markera de områden som anses vara idealiska för kärnprovtagning och extraktion.
OBS: Det är viktigt att komma ihåg att vävnadsformen och kompositionen kan förändras med vävnadsdjupet i blocket. Således kan vävnadskärnans sammansättning förändras beroende på var kärnan extraherades, vilket betonar behovet av fortsatt patologisk vägledning. - Skicka in ytterligare vävnad för sjukdomsspecifika immunohistokemiska fläckar tillsammans med H & Es, om det behövs, för att hjälpa den patologiska granskningen. Exempel på sådana fläckar inkluderar ERBB2-färgning för HER2-positiv bröstcancer14, HHV-8 för Kaposi sarkom15, CD20 för B-celllymfom16, U6 som en global markör för RNA-kvalitet17, EBER för att bestämma Epstein-Barr-viruspositivitet18 och Vimentin som bekräftelse på mesenkymalt ursprung och vävnadskvalitetskontrollmarkör19,20.
2. Förberedelse för TMA-konstruktion
- När patologigranskningen är klar, sammanställ den slutliga listan över givarblock som ska användas i TMA-konstruktionen och skapa en TMA-karta (figur 1A). TMA-kartan är en schematisk skissering där kärnorna kommer att ligga i de färdiga TMA- och glidmonterade vävnadsproverna erhållna från den resulterande TMA.
- För orienteringsändamål, se till att TMA-kartan undviker att placera kärnor i en jämn matris som en 3 x 3 eller 4 x 4 matris och innehåller minst 1 orienteringsmarkör.
OBS: Orienteringskärlor kan vara kärnor tagna från vävnadsfria färgade orienteringsverktyg21, eller vävnadsblock som innehåller tydligt olika vävnader från temat för TMA. Till skillnad från mottagarmetoden där upprättstående kärnor sätts in i en förgjuten vaxform, skapar tejpmetoden en TMA genom att hälla smält vax runt inverterade, upprätta kärnor. Denna inversion av byggprocessen kräver en andra karta som kallas byggkartan. - Skapa byggkartan genom att skapa en spegelbild av TMA-kartan (figur 1B). Konstruktionskartan visar var varje kärna måste placeras under konstruktionen för att visas på rätt plats i den färdiga TMA. Spara byggkartan.
- När kartorna har skapats, förbered metall TMA-basformen. Använd ett pappersrutigat rutnät för engångsbruk för att styra kärnplaceringen och reglera kärnseparationen.
OBS: Ett mallgaller på 6 x 7 (42 fläckar) för högst 40 kärnor (plus för två orienteringskärlor/luckor) för användning med kommersiellt tillgängliga metallbasformar med inre dimensioner på 26 mm x 20 mm finns i den kompletterande pdf:en. Skriv ut och klipp ut pappersrutnätet. - Klipp det rutiga gallret i storlek och fäst en bit dubbelsidig tejp (DSST) på baksidan av gallret. Placera gallret och DSST-tejpen i metallfacket och lägg till en andra bit DSST ovanpå gallret, dvs ovanpå pappersgallret i metallbasformen (Figur 2A).
3. Kärnplacering
- Överlägg den patologiskt granskade H&E på dess motsvarande vävnadsblock och använd patologens markeringar för att identifiera var vävnadsblocket ska stansas (Figur 2B).
- Stansa FFPE-givarblocket med en manuell kärnstans (figur 2C) på lämplig plats.
OBS: Kärnstansar finns i en mängd olika diametrar. Denna metod använder en handhållen kärnstans med en diameter på 2 mm.- Om du använder en återanvändbar kärnstans, se till att den rengörs före och efter varje vävnadsstans.
- Mata ut kärnan från kärnstansen och använd en nålplockning för att placera den utkastade kärnan på hårkorset i det DSST-täckta gallret (figur 2D). Se till att när kärnan placeras på gallret är den inverterad och upprätt så att vävnadsänden av kärnan kommer i kontakt med DSST (vävnad med framsidan nedåt). Se också till att kärnan placeras på lämplig plats på rutnätet som anges av konstruktionskartan.
- Upprepa tills alla givarblock är kärnade och kärnorna placeras på lämpliga positioner.
4. Slutföra TMA
- Slå på bänkugnen, ställ in på 78 ° C och ge tillräckligt med tid för att komma till temperaturen.
- Smält 45 g paraffinpellets i en ugnssäker behållare för varje TMA som ska konstrueras.
- Märk en plastkassett och placera den ovanpå metallbasformen som innehåller kärnorna (figur 2E). Kärnans höjd bör inte överstiga metallbrickans djup eftersom höga kärnor kommer att lutas eller vältas när kassetten sätts på plats.
- Placera formen med kassetten på en bricka för att fånga överflöde och häll försiktigt det smälta paraffinet genom kassetten i kärnfacket (Figur 2F).
- Låt det smälta paraffinet svämma över för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor i TMA: s kropp. Se till att paraffinet fylls till toppen av kassetten så att det är inbäddat i och ordentligt bundet till paraffinblocket när paraffinet har stelnat.
- Flytta eller stör inte blocket och låt det svalna i rumstemperatur i 30 minuter. Kyl sedan i 4 °C i ytterligare 30 minuter för att stelna helt.
- När den är helt stelnad, separera försiktigt metallbasformen från det kassettbundna paraffinblocket av kärnor.
OBS: DSST behåller sin vidhäftning genom byggprocessen och är ofta fäst vid det nybildade paraffinblocket. Om tillämpligt, ta försiktigt bort DSST och rutnätet från toppen av det nu slutförda TMA-blocket.
5. Validering av TMA
- När TMA är konstruerad, använd en mikrotom för att sektionera den nyligen färdiga TMA. Skär en eller flera vävnadssektioner med full ansikte.
- Överför sektionerna till det förvärmde vattenbadet och glidmontera sektionerna.
OBS: Nykonstruerade block kräver ofta blockvändning (skärning av överskott av paraffin) för att få fullständiga ansiktsvävnadssektioner som innehåller alla kärnor. - När det är torrt, skicka in en nyskuren glidmonterad TMA-sektion för H&E-färgning13 och eventuell ytterligare immunohistokemisk färgning, om det behövs.
- Skicka in de färgade TMA H &E-avsnitten för patologisk granskning.
OBS: Under TMA-patologigranskning granskar en styrelsecertifierad patolog, helst samma patolog som granskade TMA-givarblocken, TMA H & E-färgade kärnor för att säkerställa att de önskade vävnaderna av intresse verkligen är närvarande. Om ytterligare vävnads- eller sjukdomsspecifika immunohistokemiska fläckar lämnades in för granskning av donatorblock i steg 1.3.4, ska dessa fläckar upprepas på TMA-sektioner och lämnas in tillsammans med TMA H&E för patologisk granskning. - Registrera resultaten av TMA patologisk valideringsgranskning.
Representative Results
Tejpmetoden för TMA-konstruktion som beskrivs här är den valda metoden som används vid ACSR Technical Core Laboratory för att bevara vävnader, vilket i sin tur möjliggör sparsam och rättvis fördelning av mycket värdefulla vävnader till forskare.
En kritisk komponent i byggprocessen är identifiering av vävnaden av intresse i ett givet givarblock varifrån TMA-kärnan ska erhållas. Detta bestäms av patologisk granskning där en utbildad patolog granskar en nygenererad H & E-bild (figur 3). Med hjälp av en markör cirklar patologen området på H & E-bilden, vilket indikerar att kärnan ska erhållas från givarblocket inuti denna cirkel (Figur 3). Patologen kan också markera ytterligare områden som nekrotiska områden, som bör undvikas, eller godartade områden från vilka ytterligare vävnadskäror kan erhållas (figur 3). Kärnor stansas sedan från de angivna områdena och ingår i konstruktionen av TMA.
Det finns två huvudsakliga mått för framgångsrikt slutförande av en TMA med bandmetoden. Den första är närvaron av vävnadskärp prickar vid de förväntade positionerna och avstånden från varandra, vilket bedöms genom visuell inspektion. Figur 4A,B visar två framgångsrikt helt tejpade metod TMA och deras motsvarande H&E-bilder. Visuell inspektion av TMA-blocken visar att kärnorna är närvarande och regelbundet åtskilda i varje TMA. Några av de viktigaste konstruktionsproblemen som kan uppstå under bandmetodens konstruktionsprocess inkluderar separering av blocket och kassetten på grund av för tidigt avlägsnande av metallbasen före vaxstitning (figur 4C). Ett annat potentiellt problem som observerats med bandmetod konstruerade TMA är kärnvältning och eller placeringsdrift av de inbäddade kärnorna (figur 4D); ett problem som kan uppstå genom alltför turbulent hällning av det smälta paraffinet, vilket kan förstärkas ytterligare av dåligt vidhäftande DSST. Figur 5 visar H&E-bilderna för kärnorna i TMA1. Alla utom en kärna (plats 1) finns i H&E i TMA1. Figur 5 visar också att vissa kärnor är närvarande som kompletta cirkulära vävnadsppunkter (dvs. fläckar 4, 6, 13, 17) medan andra inte är helt närvarande (dvs fläckar 3, 8, 9, 12). Vävnadsförlusten som upplevs i dessa senare fall är inte ovanlig och kan bero på otillräcklig sektionering som behövs för att avslöja alla kärnor i sin helhet. Alternativt kan närvaron av ofullständig eller den totala frånvaron av vävnad (dvs. punkt 1) bero på dålig vävnadskvalitet hos den kärnan, vilket kan leda till vävnadsförlust under färgningsprocessen.
Det andra måttet på framgång bedöms i termer av huruvida TMA-kärnorna fångade vävnaden av intresse eller inte. Detta uppnås genom patologisk granskning och validering av de enskilda TMA H&E-kärnorna (figur 5) jämfört med det förstansade givarblocket H&Es (figur 3), och vid behov/utförde eventuella andra ytterligare immunhistokemiska fläckar som utförts. Figur 6 visar exemplifierande fläckar utförda på TMA1, inklusive Vimentin, U6, EBER och CD20. Vimentinpositiva vävnader (brun fläck) indikerar att alla vävnader är av mesenkymalt ursprung och är av god kvalitet som kan färgas. U6-positivitet (mörklila / blå fläck) indikerar att RNA-kvaliteten i vävnaden är bra och komplimangerar RNA in situ hybridisering (ISH) fläckar som EBER, som riktar sig mot gentranskriptioner. U6-resultaten i figur 5 indikerar att RNA-kvaliteten är hög i lymfomvävnaden (punkt 9) och den normala tonsillvävnadsorienteringskontrollen (plats 22) men inte i den normala vävnaden vid plats 19. Efter denna EBER-färgning var negativ i den normala vävnaden och orienteringskontrollen men starkt positiv i lymfomvävnaden (punkt 9). Som förväntat för vävnader av lymfoidt ursprung färgade både fläckarna 9 och 22 positivt för B-cellmarkören CD20, men plats 19, som härrör från normal ryggmärgsvävnad, gjorde det inte. Färgningsresultaten för alla TMA-kärnor sammanfattas i tabell 1 och bekräftar vävnadsannoteringen för dessa TMA-vävnadskärnor.
Figur 1: TMA-kartor. När alla FFPE-block och orienteringskontroller har valts skapas en detaljerad karta, känd som en TMA-karta (A), som beskriver var varje givarblockkärna kommer att ligga i det färdiga blocket. Det är viktigt att notera att när man konstruerar en TMA med tejpmetoden är konstruktionskartan (B) en spegelbild av TMA-kartan eftersom denna metod inverterar byggprocessen och häller smält paraffin runt upprättstående vävnadskärnor snarare än att sätta in kärnorna i en prefabricerad form. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bygga TMA med tejpmetoden. (A) Lager 2 bitar dubbelsidig sticktejp (DSST) och ett pappersgaller i följande ordning på botten av metallbasformen; placera den första biten av DSST (2A-insats), följt av engångspappersnätet och sedan den andra biten av DSST längst ner på metallbasformen. (B) För varje givarblock genereras och granskas ett nytt H&E av en patolog som markerar H&E för att beteckna vävnaden av intresse, var man ska stansa blocket och i förekommande fall var man ska undvika stansning för att extrahera en vävnadskärna. (C) Stansa givarblocket med en bortskaffande eller återanvändbar handhållen TMA-stans. (D) Med hjälp av en nålplockning placeras varje kärna stående upprätt, tumören med framsidan nedåt på DSST som täcker gallret. (E) Placera försiktigt en förmärkt plastkassett ovanpå metallbrickan som innehåller de upprättstående kärnorna. (F) Smält paraffin hälls försiktigt i brickan genom kassettgitteret för att omge och sänka ner de upprättstående kärnorna under kassetten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Givarblock H&E-fläck. H &E-färgade sektioner från varje givarblock utsätts för QC-granskning med en träningspatolog som kommenterar den H & E-färgade bilden med en markör för att indikera de områden / vävnader av intresse (dvs. livskraftig cancer (CA) eller godartade (BN) vävnader) för kärninsamling, liksom områden som bör undvikas (dvs. nekrotiska vävnadsområden). De lämpliga områdena i vävnadsblocket, som indikeras av den kommenterade H&E identifieras, stansas och införlivas i den TMA som konstrueras. Den resulterande TMA-kärnstansen H &E kan sedan refereras tillbaka till det ostansade området i givarblocket H & E för att bekräfta att vävnaden av intresse fångades i kärnstansen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat. (A,B) Framgångsrikt genomförda bandmetod-TMA och deras åtföljande H&Es för patologisk granskning. (C) Separering av plastkassetten och paraffinblocket när kassetten avlägsnas i förtid från metallbottenformen. (D) Färdig bandmetod TMA som visar välta och migrerade kärnor till följd av turbulent hällning av det smälta paraffinet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: TMA core H&Es. H&E-färgad sektion för TMA1, som visar de enskilda H&Es för varje vävnadskärna som används för att konstruera TMA (fläckarna 1-21) samt orienteringskärnorna (fläckarna 22 och 23). Bilder som visades erhölls med hjälp av ett 4x-mål, utrustat med en digitalkamera ansluten till bildprogramvaran. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exemplifierande immunohistokemisk och RNA ISH. Fullständiga ansiktssektioner från TMA1 bedömdes av IHC för vimentin- och CD20-uttryck och av RNA ISH för att bedöma RNA-kvalitet (U6) och EBV-status via EBER ISH. Bilder visar exemplifierande bilder för tre kärnor, inklusive en tumörvävnad (plats 9), en normal vävnad (plats 19), samt en av de två orienteringskontrollerna (plats 22). Vimentin positivitet betecknas med brun färgning, U6 positivitet betecknas med blå / lila färgning, EBER med blå / lila färgning och CD20 med brun färgning. Bilder som visades erhölls med hjälp av ett 4x-mål, utrustat med en digitalkamera ansluten till bildprogramvaran. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Översikt över konstruerade TMA-vävnader och fläckar som utförts: Tabellen beskriver huruvida (a) vävnad är närvarande i var och en av de representativa TMA-fläckarna (b) tumören är närvarande i varje H & E-färgad vävnadsfläck och (c) resultaten av eventuella ytterligare immunohistologiska fläckar utförda på intilliggande TMA-sektioner: "-" indikerar negativ, n / d = inte gjort. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande akt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
En av de mest kritiska komponenterna i TMA-byggprocessen är patologisk granskning av FFPE-givarblock från vilka TMA-kärnorna kommer att erhållas4. Under granskningen undersöker en styrelsecertifierad patolog en representativ H&E-färgad vävnadssektion från varje givarblock. Det är absolut nödvändigt att H&E genereras med hjälp av en nyskuren vävnadssektion så att den är den bästa representationen av motsvarande givarblock. Användning av äldre H&Es rekommenderas inte med tanke på att FFPE-vävnader är 3-dimensionella strukturer vars vävnadsprofil kan förändras avsevärt med blockdjup och omfattande sektionering. Detta kan ha inträffat sedan H&E genererades, vilket kan göra dess representation av FFPE-blocket felaktig. Översynsprocessen är avgörande för valet av lämpliga fall och identifiering av vävnadsområden från vilken kärnor bör erhållas, samt identifiering av områden som bör undvikas vid insamling av kärnor. I avsaknad av patologisk granskning ökar sannolikheten för att inkludera olämpliga vävnader signifikant. Införandet av sådana vävnader har potential att göra den konstruerade TMA ineffektiv och olämplig för sitt avsedda ändamål. Det är viktigt att omedvetet använda sådana ineffektiva TMA har en enorm potential att resultera i falska och vilseledande uppgifter. Detta i kombination med vetskapen om att profilen för FFPE-vävnader, och därmed deras derivatkärnor, kan förändras avsevärt med ökande djup belyser vikten av fortsatt patologigranskning under hela livslängden för ett konstruerat TMA-block. Helst bör H&Es genereras med hjälp av varje 15: e eller 20: e sektion för att säkerställa att eventuella förändringar i kärnornas vävnadsprofiler fångas upp och registreras. Som ett minimum bör H&Es genereras och granskas i början och slutet av ett projekt för att övervaka dessa potentiella förändringar. Mot bakgrund av dessa punkter och vikten av TMA som ett forskningsverktyg är det absolut nödvändigt att den patologiska granskningen är fast inbäddad i TMA-byggprocessen och under hela TMA-blockets livslängd.
FFPE-block är ofta i stor utsträckning sektionerade under rutinmässig diagnostisk bearbetning innan de släpps för forskningsändamål. Som ett resultat är givarblockdjupet och därmed givarblockkärnlängderna ofta mindre än mottagarmetodens ideal på 4 mm. Här har vi visat hur man konstruerar TMA med hjälp av konstruktionsprotokollet för bandmetoden, vars främsta fördel är dess kompatibilitet med kärnor från icke-idealiska FFPE-vävnadsblock. Även om bandmetoden är av stort forskningsvärde och erbjuder en billig, bekväm och tillgänglig metod för att konstruera TMA-block, är den inte utan utmaningar och begränsningar. Jämfört med både automatiserade och manuella mottagarmetoder, som rymmer 100-1000-tals kärnor i ett enda TMA-block, rekommenderas maximalt 40 kärnor för TMA konstruerade med bandmetod9. En annan begränsning är med avseende på enkel konstruktion. I mottagarmetoden sätts stansade kärnor bara in i en prefabricerad form, vilket ger kärnstabilitet genom att innesluta varje kärna i sin egen individuella brunn, vilket förhindrar kärnmigrering samt främjar mycket regelbunden kärnplacering och separation22. Dessutom erbjuder mottagarmetoden den valfria bekvämligheten att vara helt manuell, halvmanuell och helt automatiserad. Däremot kräver den manuella tejpmetoden noggrann, skonsam placering av varje kärna för hand med hjälp av en nålplockning. Även om frånvaron av en prefabricerad form i tejpmetoden utesluter den mycket regelbundna placeringen och separationen som upplevs med mottagarmetoden, övervinns denna brist genom införandet av ett rutigt rutnät. Det är viktigt att det rutiga gallret fästs i mitten av metallbrickan för att undvika blockkantsplacering, vilket ökar risken för kärnförlust om det inte finns tillräckligt med paraffin som håller kärnan på plats. Det måste också noteras att de små kärnseparationer som är möjliga med mottagarmetoden inte kan uppnås med tejpmetoden på grund av manuell kärnplacering och behovet av att nålplockningen passar mellan intilliggande kärnor. Kärnor placeras på ett fristående upprätt sätt med den minsta ytan eller fotavtrycket av kärnan som kommer i kontakt med det DSST-täckta gallret. Denna inställning ger betydligt mindre kärnstabilitet än mottagarmetoden och ger en ökad risk för kärnstoppning och/eller migrering vid hällning av det smälta paraffinet. Faktum är att ett av de mest kritiska stegen i protokollet häller det smälta paraffinet. Det är viktigt att detta görs snabbt vid borttagning från ugnen för att säkerställa att paraffinet är helt flytande och att hällen utförs försiktigt med minimal turbulens. Intressant nog utvecklade Chen et al. en mycket ny hjälpanordning, besläktad med en stencil med 7 x 11 jämnt fördelade hål med en diameter på 2 mm, som placeras ovanpå ett tomt paraffinblock för att styra nålar när man skapar mottagarblocket och när man sätter in givarblockkärnorna23. Även om den är utformad för att underlätta konstruktionen av mottagarblock, kan en sådan anordning enkelt anpassas till tejpmetoden för att styra placeringen, reglera separationen och öka kärnstabiliteten under byggprocessen.
En av de viktigaste effektorerna av kärnstabilitet är antalet kärnor som ingår i en bandmetod TMA. Detta beror på att när antalet kärnor ökar måste kärnans diameter minska för att rymma det ökande antalet kärnor, vilket i sin tur minskar kärnavtrycket som följer DSST. En minsta kärndiameter på 1 mm rekommenderas för tejpmetod TMA-konstruktion, eftersom vi har funnit att kärnor med mindre diametrar är särskilt instabila och benägna att välta även med mycket mild paraffinhällning. En nyligen genomförd studie som undersökte två olika interna metoder som använde 16 G-nålar (kärndiameter på 1,1 mm) och en stans med en diameter på 4 mm upplevde betydande vävnadsförluster med 1,1 mm (26,5%) men inte 4 mm-kärnorna24. Detta verkar tyda på att små kärnor kan vara problematiska att arbeta med och inte bara under konstruktionen. Dessutom kan mindre diametrar inte representera det ursprungliga givarblocket såväl som större kärnor, vilket gör patologisk tolkning svår och ökar sannolikheten för felaktig donatorvävnadsrepresentation.
Inkludering och placering av orienteringsblock är av stor betydelse vid TMA-konstruktion. Detta är dock av särskild betydelse för bandmetodkonstruerade TMA. Detta härrör från det faktum att tejpmetoden inverterar byggprocessen och därmed ökar risken för rumslig desorientering. Vi rekommenderar att du inkluderar upp till tre orienteringskärlor i varje block och att de placeras bort från provkärnorna för att bäst orientera blocket. Orienteringskärlor kan vara kärnor hämtade från vävnadsblock som innehåller tydligt olika vävnader från temat för de konstruerade TMA- eller vävnadsfria färgade orienteringsverktygen21, där det senare är särskilt användbart för icke-patologer. I kombination med icke-regelbunden matrismönstrad kärnplacering minimerar orienteringskärnor risken för desorientering.
Den uttalade skillnaden i kärnlängd mellan TMA konstruerade med tejp- och mottagarmetoder härrör från inkludering av givarblockdjup i beslutsprocessen vid val av konstruktionsmetod. Protokollet som beskrivs här använder ett tröskelvärde där TMA konstrueras med hjälp av tejp- och mottagarmetoderna när givarblocken har djup på <4 mm respektive 4 mm. Det är viktigt att notera att inkludering av givarblockdjup i valet av konstruktionsmetod inte är universellt. Även om det är möjligt för TMA att konstrueras med endera metoden oavsett givarblockdjup, kan högre kärnor störa och eller vältas eller lutas av placeringen av plastkassetten under TMA-konstruktion med tejpmetoden. Valet att inkludera eller utelämna kriterier i beslutsprocessen beror på de bekvämligheter som är tillgängliga för laboratoriet, kostnaden och den önskade slutprodukten. Enligt parametrarna i detta protokoll är antalet glidmonterade TMA-sektioner som kan erhållas från en bandmetod konstruerad TMA betydligt mindre än det som erhålls från en mottagarmetod konstruerad TMA. Även om det är möjligt att återblockera FFPE-vävnader för att öka givarblockdjupet och göra dem kompatibla med mottagarmetoden, är sannolikheten för att uppnå samma vävnadsorientering inom reblocket låg. I sin tur kan detta kräva omfattande blockvändning för att få en full-face sektion, vilket sannolikt skulle innefatta betydande vävnadsförlust. Efter blockvändning ger en tejpmetod konstruerad TMA cirka 50 glidmonterade TMA-sektioner med alla kärnor närvarande. Det exakta antalet varierar dock från block till block och beror på längden på kärnorna som används för att konstruera TMA och tjockleken på sektionerna som skärs (5 μm mot 4 μm). Dessutom måste det också noteras att på grund av deras olika kärnlängder kommer kärnorna att tömmas vid olika tidpunkter när TMA gradvis delas upp; ett attribut som på ett återbetonar behovet av fortsatt patologisk granskning.
Även om mottagarmetoden erbjuder betydande fördelar och fördelar jämfört med bandmetoden, inklusive en mindre tråkig och snabbare byggprocesser, riktar sig bandmetoden inte till erfarna laboratorier med hög genomströmning. Det riktar sig till det genomsnittliga laboratoriet, särskilt de i resursbegränsade miljöer, med tillgång till givarblock med varierande djup men inte till TMA-byggtjänster. Framtida tillämpningar skulle dock kunna leda till automatisering av denna metod för att förbättra poolen av stödberättigande prover i laboratorier med hög genomströmning och eliminera behovet av att återblockera givarblock. Sammanfattningsvis kan TMA-bandmetodens konstruktionsprotokoll enkelt upprättas vid icke-specialiserade laboratorier utan behov av dyr utrustning. Det rekommenderas dock att nya användare bör använda FFPE-vävnadsblock utan värde, vävnadsfria färgade orienteringsverktyg21 eller till och med färgade paraffinblock utan vävnad först för att bekanta sig med tejpmetodtekniken innan de går vidare till TMA-konstruktion med hjälp av dyrbara vävnader. Även om deras konstruktion inte är utan potentiella fallgropar, vilket både de som konstruerar och använder TMA-block bör vara medvetna om, kan denna till synes opolerade "hemlagade" TMA-konstruktionsmetod ge högkvalitativa, biologiskt relevanta TMA för forskning. Faktum är att TMA-sektioner som härrör från bandmetod konstruerade TMA är bland ett av de mest efterfrågade vävnadsproverna i ACSR-biorepositoriet.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering för detta arbete tillhandahölls av NIH-finansierade AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
