Summary
기본 및 응용 연구에 널리 사용되는 전형적인 미세 소관 억제제는 세포에 광범위한 영향을 미칩니다. 최근에, 포토스타틴은 미세소관의 순간적, 가역적, 공간적으로 정밀하게 조작할 수 있는 광전환 가능한 미세소관 억제제의 부류로 부상하였다. 이 단계별 프로토콜은 3D 라이브 이식 전 마우스 배아에서 포토스타틴의 적용을 자세히 설명합니다.
Abstract
미세 소관 세포 골격은 세포의 틀을 형성하며 세포 내 수송, 세포 분열 및 신호 전달의 기본입니다. 예를 들어, 노코다졸을 사용하는 유비쿼터스 미세 소관 네트워크의 전통적인 약리학적 파괴는 모든 세포에 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 가역적으로 광전환가능한 미세소관 억제제는 약물 효과가 시공간적으로 조절된 방식으로 구현될 수 있게 함으로써 한계를 극복할 수 있는 잠재력을 갖는다. 이러한 약물 계열 중 하나는 아조 벤젠 기반 포토스타틴 (PSTs)입니다. 이들 화합물은 어두운 조건에서 비활성이며, 자외선으로 조명될 때, 이들은 β-튜불린의 콜히친-결합 부위에 결합하고 미세소관 중합 및 동적 턴오버를 차단한다. 여기서, 3차원(3D) 생이식 전 마우스 배아에 PSTs의 적용은 세포하 수준에서 미세소관 네트워크를 교란시키는 것으로 개시된다. 이 프로토콜은 실험 설정에 대한 지침뿐만 아니라 라이브 셀 공초점 현미경을 사용하는 PST에 대한 광 활성화 및 비활성화 매개 변수를 제공합니다. 이것은 재현성을 보장하고 다른 사람들이이 절차를 연구 질문에 적용 할 수있게합니다. PST와 같은 혁신적인 광 스위치는 동적 세포 내 미세 소관 네트워크에 대한 이해를 높이고 실시간으로 세포 골격을 비 침습적으로 조작하는 강력한 도구로 진화 할 수 있습니다. 또한, PST는 오가노이드, 블라스토이드 또는 다른 종의 배아와 같은 다른 3D 구조에서 유용하다는 것을 입증 할 수 있습니다.
Introduction
미세소관 구조는 다양한 기능(1,2)을 지원하기 위해 다양한 세포 유형에 따라 크게 다릅니다. 성장과 수축의 역동적 인 특성은 세포 외 및 세포 내 단서에 신속하게 적응하고 끊임없이 변화하는 세포의 요구에 대응할 수있게합니다. 따라서, 그것은 세포 정체성에서 중요한 역할을하는 "형태 학적 지문"으로 간주 될 수 있습니다.
소분자 억제제를 이용한 미세소관 세포골격의 약리학적 표적화는 발달생물학, 줄기세포생물학, 암생물학 및 신경생물학 3,4,5,6,7에서 많은 근본적인 발견을 가져왔다. 이 접근법은 필수 불가결하지만 독성 및 오프 타겟 효과와 같은 다양한 한계를 제시합니다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 미세소관 표적화 제제 중 하나인 노코다졸은 강력한 미세소관-탈중합 약물(8)이다. 그러나, 노코다졸과 같은 소분자 억제제는 적용 시부터 활성이며, 많은 중요한 세포 기능에 미세소관 세포골격의 본질적인 성질을 고려할 때, 미세소관의 글로벌 탈중합은 오프 타겟 효과를 생성할 수 있으며, 이는 많은 응용에 부적합할 수 있다. 또한, 노코다졸 처리는 샘플이 약물로부터 세척되지 않는 한 돌이킬 수 없으며, 따라서 지속적인 라이브 이미징을 방지하고, 따라서 개별 미세소관 필라멘트의 정확한 추적을 방지한다.
광활성화 화합물의 개발은 광미적 분자의 생성과 함께 시작되었으며, 미세소관 성장 억제의 효과를 정밀하고 시공간적으로 제어되는 방식으로 표적화하고 모니터링하는 새로운 시대를 예고했다. 가역적으로 광전환 가능한 약물의 한 군인 포토스타틴(PSTs)은 콤브레타스타틴 A-4의 스틸벤 성분을 아조벤젠9로 대체하여 개발되었다. PST는 자외선으로 조명될 때까지 비활성이며, 이에 의해 비활성 트랜스-구성은 가역적 이성체화에 의해 활성 시스-구성으로 변환 된다. Cis-PST는 β-튜불린의 콜히친 결합 부위에 결합하여 미세소관 중합을 억제하고, β-튜불린과의 계면을 차단하고, 미세소관 성장(10)에 필요한 이량체화를 방지한다. PST의 코호트 중에서, PST-1P는 가장 높은 효능을 가지며, 완전히 수용성이며, 조명 후 생체 활성의 빠른 발병을 보여주기 때문에 납 화합물로 부상했다.
PST의 가장 효과적인 트랜스- 시스-이성체화는 360-420 nm 사이의 파장에서 발생하며, 이는 PST 활성화를 위한 이중 옵션을 가능하게 한다. 전형적인 공초점 현미경 상의 405nm 레이저 라인은 미세소관 성장 억제의 최적의 공간 표적화를 위해 투여될 수 있다. 405nm 레이저 조명을 통해 PST 활성화의 위치와 타이밍을 정확히 파악할 수 있는 기능은 정밀한 시간 및 공간 제어를 용이하게 하여 초 미만의 응답 시간(9) 내에 세포 이하 수준에서 미세소관 역학의 붕괴를 허용한다. 대안으로, 저렴한 LED UV 광은 전체 유기체 조명이 미세 소관 구조의 유기체 전체 파괴를 유도하도록 허용합니다. 이것은 공간 타겟팅보다는 정확한 시간 억제의 발병이 목표인 연구자들에게 비용 효율적인 대안이 될 수 있습니다. PST의 또 다른 특징은 510-540 nm 범위9에서 파장의 녹색 빛을 적용하여 주문형 불활성화입니다. 이는 PST 매개 성장 억제 전, 도중, 및 후에 미세소관 필라멘트의 추적을 가능하게 한다.
PST는 여전히 비교적 최근의 설계이지만, 아메보이드(12)에서의 세포 이동의 새로운 메카니즘 조사, 신생아 마우스(13)의 뇌로부터 분리된 뉴런, 초파리 멜라노가스터(14)에서의 날개 상피 발달 등을 포함하여 다양한 연구 분야(11)에 걸친 수많은 시험관내 응용에 사용되어 왔다. . 다른 빛 반응성 약물은 세포 기능의 표적 파괴에 유용한 도구임이 입증되었습니다. 예를 들어, 블레비스타틴의 유사체인 아지도블레비스타틴이 조명15,16 하에서 향상된 미오신 억제를 위해 사용되었다. 이것은 시공간 적으로 조절 된 세포 기능 억제 능력 때문에 새로운 발견의 잠재력을 강조합니다.
살아있는 3D 유기체는 생리적 조건 하에서 전체 동물, 단일 세포 또는 세포 이하 수준에서 미세 소관 역학을 조작하는 탁월하면서도 섬세한 시스템을 제공합니다. 특히, 이식 전 마우스 배아는 유기체(17) 내의 세포간 관계뿐만 아니라 세포의 내부 작용에 대한 탁월한 통찰력을 제공한다. PSTs의 활성화 및 비활성화의 시간적 및 공간적으로 표적화된 연속적인 사이클은 이식 전 마우스 배아(16)에서 비중심성 미세소관-조직화 중심으로서 세포간 사이토카인증 구조인 상간 브릿지의 특성화에 기여하였다. 유사한 실험 셋업은 배반포 형성 18을 허용하기 위해 마우스 배아의 밀봉에서 성장하는 미세 소관의 관여를 입증하였다18. 또한, PSTs는 또한 뒷뇌19에서 세포의 서브세트에서 미세 소관 성장을 억제함으로써 신경 세포 이동을 조사하기 위해 전체 제브라 피쉬 배아에 사용되었다.
이 프로토콜은 이식 전 마우스 배아에서 PST-1P의 실험 설정 및 사용을 설명합니다. 여기에 제시된 지침은 또한 염색체 분리 및 세포 분열 연구, 세포 내화물의 밀매, 세포 형태 형성 및 이동과 같은 광범위한 목표에 대한 PST의 적용을 안내 할 수 있습니다. 또한, 이러한 연구는 오가노이드 시스템, 블라스토이드 및 Caenorhabditis elegans 및 Xenopus laevis와 같은 다른 배아 모델에서 PST의 구현을 돕고 잠재적으로 시험관 내 수정 기술에 대한 PST의 사용을 확대 할 것입니다.
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Protocol
실험은 동물 윤리 번호 19143에 따라 Monash 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 동물들은 윤리 지침에 엄격히 따라 동물 시설(Monash Animal Research Platform)에서 특정 병원균이 없는 동물 집 조건에 수용되었다.
1. 이식 전 마우스 배아 수집
- 제도적 동물 윤리 지침에 따라 앞서16,18에서 설명한 바와 같이 마우스를 Superovulate 및 짝짓기한다.
참고: 살아있는 배아 수집을 위해 가장 일반적으로 사용되는 균주는 C57BL/6 또는 FVB/N 마우스입니다. 여기에 표시된 모든 데이터는 FVB/N 마우스를 사용하여 생성되었다. - 짝짓기 후 아침에, 도20에 기재된 바와 같은 M2 배지 또는 인간 튜벌 유체 (HTF) 배지를 사용하여 난관으로부터 접합체를 플러시한다. 21,22에 기재된 바와 같은 구강 피펫 장치를 사용하여, 효소고트를 신선한 심플렉스 칼륨 최적화 배지(KSOM) 액적으로 옮기고, 37°C로 예열하고, 5%CO2로 평형화시키고, 배지 커버리지를 보장하기 위해 충분한 부피의 미네랄 오일로 오버레이된 35 mm 배양 접시에 담았다.
- 도 20에 기재된 바와 같은 미세주입 효소는 적색 형광 태깅된 미세소관 플러스 말단 마커를 암호화하는 cRNA를 포함한다. 여기서, 최종 결합 단백질 3 (EB3)-dTomato에 대한 cRNA는16,18에 기재된 바와 같이 제조 및 정제하고 미세주입 완충액으로 희석한 후 30 ng/μL 농도로 사용하였다.
참고: cRNA를 미리 준비하고 필요할 때까지 -20°C에 보관하는 것이 좋습니다. - 배아가 PST-1P 처리를 위해 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 37°C 및 5%CO2 에서 암흑에서 배아를 배양한다.
참고 : 다른 배아 단계에 필요한 배양 시간에 대한 포괄적 인 자료는23을 참조하십시오. 여기에 사용된 16-세포 단계 배아의 경우, 수정 후 배아 3일째(E3)로 배양한다.
2. 약물 및 이미징 접시 준비
참고: 2.1-2.10단계의 경우 의도하지 않은 PST-1P 활성화를 방지하기 위해 어두운 색 또는 빨간색 표시등 조건에서만 독점적으로 작업하십시오. 알루미늄 호일 또는 어두운 덮개는 PST가 포함 된 모든 튜브 및 접시에 사용해야합니다.
- 초순수에서 50 mM PST-1P의 스톡 농도를 준비한다.
참고 : PST-1P의 분자량은 440 g / mol입니다. 원액은 -20°C에서 최대 1년 동안 안정하다. PST-1P는 물 또는 수성 완충액에 용해되지만 DMSO에 쉽게 용해되지는 않습니다. - 단계 2.1로부터, 초순수에서 800 μM PST-1P의 중간 작동 농도를 제조하였다.
- PST-1P를 신선한 KSOM에서 40 μM의 최종 농도로 희석한다. 전형적인 실험은 약 20 μL의 PST-1P 처리된 KSOM을 필요로 하며, 19 μL의 KSOM에 800 μM PST-1P의 1 μL를 희석하여 20 μL의 최종 부피를 확보하여 가시성을 위해 적색광만을 사용하여 충분한 배지가 미리 준비되도록 한다.
참고: PST-1P 희석액의 농도 및 활성화 상태는 분석 확립 중에 수행되어야 하는 분광광도계를 사용하여 UV-Vis 흡광도 스펙트럼을 취하여 확인할 수 있습니다. 1 cm 큐벳에서 완전히 트랜스 40 μM 희석된 380 nm(A380)에서의 흡광도는 대략 0.8이어야 한다. 시스- 및 트랜스-형태 둘 다 455 nm에서 동일한 흡광도를 갖는다(A455). A380 대A455의 비율이 대략 9:1일 때, 희석은 비활성(완전 트랜스)이다. 비율A380:A455가 1:2일 때, 희석은 완전히 활성화된다(완전 시스). 중간 비율은 중간 활성화 상태를 반영합니다. - 라이브 이미징용 챔버 슬라이드를 제조하기 위해, 10 μL의 PST-1P 처리된 KSOM을 피펫 1웰의 중앙에 넣고 반구형 액적을 형성하였다(도 1A).
- 물방울을 덮기에 충분한 미네랄 오일을 부드럽게 첨가하여 매체가 분산되지 않도록하십시오. 이렇게하면 물방울이 증발하지 않습니다.
- 챔버 슬라이드 디쉬를 예비-온하고 CO2-평형화시키고 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 최소 3시간 또는 기껏해야 하룻밤 동안 평형화시킨다.
- 단계 2.6에서 평형화 기간의 끝에서, 세척 단계로서 PST-1P-처리, 예열 및 평형화된 KSOM의 10 μL 액적을 갖는 35 mm 배양 접시를 제조하였다. 기름으로 겹치지 마십시오.
- 단계 2.7로부터 PST-1P-처리된 KSOM 액적 내로 구강 피펫팅에 의해 배아를 옮긴다.
참고: 단계 2.7 및 2.8은 배아의 구강 피펫팅에 권장되지만 선택 사항입니다. - 입 피펫팅에 의해 배아를 PST-1P 처리된 KSOM 액적의 중심으로 즉시 단계 2.4-2.6에서 제조된 이미징 챔버 슬라이드로 옮긴다(도 1A).
- 영상화 전에 PST-1P로 처리된 KSOM 중의 배아를 이미징 챔버 슬라이드에서 37°C 및 5%CO2 에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 가능하다면, 챔버 슬라이드를 37°C 및 5%CO2 의 환경 챔버 내부의 현미경에 장착하고, 완전한 어둠 속에서 모든 PST-1P가 비활성 트랜스-구성에 있고 배아가 접시의 바닥에 가라앉을 수 있도록 한다.
3. 라이브 이미징 및 PST-1P 광활성화
참고: 3.1-3.13단계는 눈사태 광 다이오드 검출기(APD) 및 어두운 환경 챔버가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 수행됩니다. 이러한 지침은 구체적으로 재료 표에 설명된 수집 소프트웨어를 사용한 이미징 설정을 참조합니다. 그러나, 그들은 또한 다른 공초점 현미경 시스템에 적용될 수 있습니다.
- 규정된 침지 매체로 63x/1.2 NA 수유 침지 목표를 준비합니다.
- 적색광 토치를 사용하여 위치 지정을 안내하고, 목표를 전진시켜 침지 매체에 접촉시킨다. 이 단계에서 배아를 찾기 위해 흰색 또는 밝은 필드 빛을 사용하지 마십시오.이 배아는 PST-1P를 조숙하게 활성화 할 수 있습니다.
- 아이피스를 사용하고 적색 조명 아래에있는 동안 매체 물방울의 가장자리를 위치시키고이 위치 바로 위에 목표를 배치하십시오. 이것은 사용자가 방향을 설정하고 초점 평면을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 다음으로, 아이피스를 통해 또는 소프트웨어 지원 라이브 모드 스캐닝에서 적색 파장 필터 또는 561nm 레이저를 사용하여 액적 내에서 배아를 찾습니다.
- 스테이지 컨트롤러와 라이브 스캐닝 모드를 사용하여 전체 배아의 z-스택을 획득하기 위한 시작점과 끝점을 설정합니다.
- 레이저 전력 설정(일반적으로 APD와 같은 고감도 검출기의 경우 5% 미만의 561nm 레이저 전력으로 충분함), 디지털 오프셋(일반적으로 -0.900)을 조정하여 EB3-dTomato 혜성의 출현을 최적화하고 배경 잡음, 2μm의 핀홀, 512 x 512의 픽셀 분해능 및 3.15μs의 픽셀 유지 시간을 최소화합니다.
- 전체 배아의 z-스택을 1 μm 섹션 간격으로 획득하여 전체 유기체에서 미세소관 성장 영역을 평가한다(도 1B).
- 3.7단계의 3D z-스택 이미지를 사용하여 EB3-dTomato 추적 실험에 대한 관심 영역(ROI)을 식별합니다. 확대/축소를 3배로 늘리고 관심 있는 특정 하위 영역 주위에 직사각형 ROI를 그립니다.
- 이미징 파라미터의 일반적인 값인 561nm 레이저 파워, -0.900의 디지털 오프셋, 512 x 512의 픽셀 해상도, 3μm의 핀홀, 3.15μs의 픽셀 드웰 시간, 3배의 줌, 500ms의 시간 간격 등 이미징 파라미터의 일반적인 값을 사용하여 단일 z-평면의 타임랩스 동영상을 획득합니다.
참고: 120개의 시간 프레임은 1분의 추적 동영상을 제공하며 데이터 분석에 충분해야 합니다. 형광단의 표백이 최소화되는 한 획득은 더 오래 지속될 수 있습니다 (그림 1C). - PST-1P를 활성화하려면 405nm 레이저로 전환하고 405nm 레이저를 10% 전력으로 설정하고, 픽셀 해상도 512 x 512, 핀홀이 최대로 열렸으며, 픽셀 유지 시간이 3.15μs, 3배 확대, 500ms의 시간 간격 및 총 20프레임으로 설정된 다른 타임랩스 동영상을 획득합니다(그림 1D).
- PST-1P의 활성화 후 EB3-dTomato 혜성의 손실을 확인하기 위해 단계 3.9에서와 같이 561nm 레이저로 다시 전환하고 획득을 반복한다(도 1E). 활성화 후 가능한 한 빨리 이 인수가 수행되는지 확인합니다.
참고: 3.10 단계는 EB3-dTomato 혜성의 더 긴 억제를 위해 반복적으로 수행 할 수 있습니다. 그러나 배아는 자외선으로 인한 피해를 피하기 위해주의 깊게 모니터링해야합니다. - PST-1P를 비활성 트랜스 상태로 되돌리려면 10% 전력에서 514nm 레이저를 사용합니다. 514nm 레이저가 10% 전력으로 설정되고, 픽셀 해상도가 512 x 512이고, 핀홀이 최대로 열렸으며, 픽셀 유지 시간이 3.15μs, 3배의 줌, 500ms의 시간 간격 및 총 20시간 프레임으로 설정된 타임랩스 동영상을 획득합니다(그림 1F).
- 3.11단계를 반복하여 EB3-dTomato 혜성의 회복을 시각화합니다(그림 1G).
4. 이미지 데이터 분석
- PST에 의한 미세 소관 중합 억제를 분석하고 정량화하려면 연구자가 특정 요구에 맞게 사용할 수있는 소프트웨어 프로그램을 사용하십시오. 사용을 권장하는 사람들은 EB3-dTomato 혜성16,18의 움직임, 방향 및 속도를 수동 또는 자동으로 추적 할 수있는 추적 도구를 보유하게됩니다.
도 1: PST-1P 이식 전 마우스 배아에서의 광활성화 및 비활성화의 개략적인 표현. 모든 실험은 완전한 어둠 (검은 배경) 또는 적색 조명 조명에 의해서만 수행됩니다. (a) EB3-dTomato를 발현하는 생이식 전 마우스 배아를 16-세포 단계로 배양한 다음, 이미징 챔버 슬라이드에서 40 μM PST-1P를 함유하는 KSOM의 액적으로 옮긴다. (B) 전체 배아의 3D 이미지는 EB3-dTomato 혜성의 분포를 시각화하여 미세 소관 성장을 평가할 수 있습니다. (c) 실험을 시작하기 위해, EB3-dTomato 혜성은 타임랩스 이미징을 사용하여 세포하 영역에서 추적된다. (d) 405 nm 레이저를 이용한 동일한 아세포 영역에서의 후속 PST-1P 광활성화는 EB3-dTomato 혜성(E)의 손실을 초래한다. 강화된 PST-1P 활성화는 필요한 경우 순차적 405nm 광 조명에 의해 구현될 수 있다. (F-G) PST-1P를 비활성 상태로 되돌리고 EB3-dTomato 혜성을 복원하기 위해 514nm 레이저를 동일한 세포 하위 영역에 적용합니다. 필요한 경우 여러 차례의 광활성화 및 비활성화를 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
프로토콜에 따라, 이식 전 마우스 배아에 EB3용 cRNA를 미세주입하였고, 적색 형광 dTomato(EB3-dTomato)로 태그하였다. 이것은 EB3가 미세 소관 플러스 말단24를 중합하는 데 결합함에 따라 성장하는 미세 소관의 시각화를 가능하게합니다.
실험은 마우스 배아가 16개의 세포로 구성된 경우 수정 후 3일(E3)을 수행하였다. 다른 이식 전 발달 단계는 조사 할 과학적 질문에 따라 사용할 수 있습니다. 405 nm 레이저 광 활성화 프로토콜을 이용한 최소 광표백을 입증하기 위해, 처리되지 않은 배아를 사용한 대조군 실험이 도시된다(도 2A i). EB3-dTomato 밀도가 뛰어난 ROI는 배아의 획득 된 3D 이미지를 기반으로 선택됩니다. 이 예에서는 전체 셀의 단일 z-평면이 EB3-dTomato 고해상도 이미징에 사용됩니다. 그러나, 배아의 상이한 영역(예를 들어, 피질 영역, 핵주위 영역, 유사분열 세포, 내부 또는 외부 세포)은 필요에 따라 선택될 수 있다. 405 nm 레이저 광 조명 전의 EB3-dTomato 발현 이미지의 이미지는 핵 영역을 제외한 세포의 전체 세포질 내에서 고밀도 EB3-dTomato 신호를 보여준다 (도 2A ii). EB3-dTomato 밀도의 변화는 405 nm 레이저 광 조명 후에 관찰되지 않았다 (도 2A iii 및 iv). 따라서, 405 nm 레이저 광 자체는 배아 또는 미세 소관 역학에 어떠한 광손상도 일으키지 않는다.
다음에, 16-세포 단계 배아를 라이브 이미징 3시간 전에 40 μM PST-1P로 처리하고 어둠 속에 보관하였다. 살아있는 3D 유기체에 대한 PST 실험을 성공적으로 수행하기 위해서는 PST 농도, 배양 시간 및 유해한 영향을 피하기 위해 필요한 레이저 파워의 최적 평형을 찾는 것이 중요합니다11. 엄격한 암흑 조건 하에서, 강한 EB3-dTomato 발현은 대조군 배아와 유사한 3D 이미지(도 2Bi)에서 검출될 수 있다(도 2Ai). 따라서, PST-1P는 어두운 조건하에서 미세소관 중합의 억제를 유도하지 않는다. 단일 z-평면의 타임랩스 이미징은 405nm 레이저 광 조명 전에 강한 EB3-dTomato 발현 및 미세소관 중합을 확인하였다(도 2B ii). 초 이내에, PST-1P의 405 nm 레이저 광 활성화 후에 EB3-dTomato 신호의 감소가 관찰되었다 (도 2B iii). 이러한 손실은 약 2 내지 20분 동안 지속되어 열 이완 또는 주변 영역(11)으로의 확산으로 인해 점진적으로 되돌아가는 것으로 보고된다. 따라서 반복적 인 405nm 레이저 광 활성화는 EB3-dTomato 손실의 지속 시간을 연장시킬 수 있습니다 (그림 1E-D). 중요하게도, EB3-dTomato를 미세주사하고 PST-1P와 함께 인큐베이션한 배아는 정상적인 배아 잠재력을 보여주며, 배반포 단계(도 3 및 보충 그림 1)로 발전하고, 예를 들어 유사분열 동안 정상적인 미세소관 역학(보충 그림 2)으로 발전한다. 따라서, 비활성 PST-1P는 배아에 어떠한 독성도 나타내지 않는다.
제어된 PST-1P 비활성화는 514nm 레이저 광 조명에 의해 달성될 수 있다(그림 2B iv). 이러한 접근법은 PST-1P 유도 성장 억제 후 미세소관 성장의 기원을 결정하는데 유용할 수 있는 반면, 라이브 이미징을 위한 녹색 형광 단백질의 사용은 배제한다. 어두운 조건에서 작업하는 것이 좋지만 PST가 실수로 활성화되면 녹색 조명 조명을 사용하면 PST를 비활성 트랜스 상태로 되돌릴 수 있습니다. 이러한 상황에서, 세포가 그들의 사전 활성화 상태로 돌아갈 수 있도록 보장하기 위한 예방 조치로서 세포에 대한 적절한 회복 기간이 요구된다. 시간이 허락한다면, 이상적으로는 최소 몇 시간이 될 것입니다.
도 2: 살아있는 마우스 배아에서 PST-1P의 UV 광 활성화 및 비활성화 전후의 EB3-dTomato의 라이브 이미징. (Ai) EB3-dTomato에 대해 표지된 처리되지 않은 대조군 16-세포 단계 마우스 배아의 최대 돌출 3D z-스택. 사이토카네틱 미세소관 다리는 여러 개의 상간 교량 (노란색 화살촉으로 표시됨)과 함께 존재합니다 (회색 화살촉으로 표시됨). (A ii) 405nm 레이저 노출 전에 이미징된 한 세포의 단일 z-평면. (A iii-iv) 405 nm 레이저 광 노출 후 즉시 이미징 된 한 세포의 단일 z 평면 (A iii) 및 4 분 (A iv) (보라색 번개 섬광으로 표시됨)은 EB3-dTomato 신호의 변화가 없음을 보여줍니다. (바이) EB3-dTomato에 대해 표지된 16-세포 단계 배아의 최대 돌출부 3D z-스택은 40 μM PST-1P로 처리되고 어둠 속에 유지된다. 위상 간 다리는 노란색 화살촉으로 표시됩니다. (B ii) 한 셀의 단일 z-평면은 사전 활성화를 이미지화했습니다. (B iii) 405nm 레이저 광 노출 직후에 이미징된 한 셀의 단일 z-평면(보라색 번개 섬광으로 표시됨)은 EB3-dTomato 신호의 현저한 감소를 보여줍니다. (B iv) 514nm 레이저 광 노출 직후 이미지화된 한 셀의 단일 z-평면(녹색 번개 섬광으로 표시됨)은 EB3-dTomato 신호의 회복을 보여줍니다. 핵은 파란 선으로 표시됩니다. 스케일 바: 전체 3D 배아에 대해 15 μm; 인셋에서 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 비활성 PST-1P 배양 조건은 배반포 단계까지 정상적인 배아 발달을 허용한다. (A) 어둠 속에서 40 μM PST-1P에서 배양한 후 배반포 단계 (E4.5)에서 배아의 단일 미분 간섭 대조 (DIC) z-평면. (b) (A)에 나타낸 배아의 최대 돌기 3D z-스택은, EB3-dTomato 발현을 나타낸다. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
획득한 타임랩스 영화에서 EB3-dTomato 라벨링은 "혜성과 같은" 구조로 나타나며 성장하는 미세소관 필라멘트를 추적할 수 있습니다(그림 4). 암흑 조건에서 유지된 PST-1P 처리된 배아에서(도 4A), 개별 EB3-dTomato 혜성(도 4B에서 백색 및 황색 화살촉으로 표시됨)은 초기 마우스 배아16에서 비중심형 미세소관 조직 중심으로서 작용하는 상간 브릿지로부터 방출됨을 알 수 있다(도 4B). 시점(t-stack)의 투영은 EB3-dTomato 혜성이 이동한 전체 수와 거리를 나타내며(그림 4B), 위상 간 브리지 영역에서 EB3-dTomato의 최고 밀도를 보여줍니다. 405nm 레이저 광으로 PST-1P가 활성화된 후, EB3-dTomato 혜성은 더 이상 위상 간 브리지의 기저부에서 볼 수 없으며 t-스택에도 존재하지 않습니다(그림 4C).
도 4: 살아있는 마우스 배아에서 PST-1P의 세포하 UV 광 활성화 전후의 EB3-dTomato 혜성의 추적. (A) EB3-dTomato에 대해 표지된 16-세포 단계 마우스 배아의 최대 돌기 3D z-스택은, 40 μM PST-1P로 처리되고 어둠 속에 유지되었다. (B) 405nm 레이저 조명 전에 4개의 선택된 단일 z-평면과 ROI의 상응하는 t-스택(*로 표시됨)은 시간에 따른 EB3-dTomato 혜성을 보여줍니다. 개별 혜성의 움직임은 노란색과 흰색 화살촉으로 표시되며 색상과 일치하는 점선 화살촉은 이전 시점에서 혜성 위치를 보여줍니다. 표시된 시간은 초 단위입니다. (c) 405nm 레이저 광 노출 직후에 이미지화된 4개의 선택된 단일 z-평면 및 상응하는 t-스택(보라색 번개 섬광으로 나타냄)은 EB3-dTomato 혜성의 손실을 나타낸다. 스케일 바: 완전한 3D 배아를 위한 10 μm; 단일 z-평면의 경우 2 μm; t-스택의 경우 1.5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
종합하면, 이들 결과는 살아있는 이식 전 마우스 배아에서 PST-1P의 적용을 입증한다. PST-1P는 405nm 레이저로 활성화 된 후 미세 소관 중합을 효과적으로 억제하며,이 억제는 세포 및 아세포 수준에서 514nm 레이저 광 조명시 가역적입니다.
보충 그림 1: 비활성 PST-1P에서 배양된 이식 전 배아는 배반포 단계에 대한 정상적인 발달 잠재력을 입증합니다. (A) 처리되지 않은 대조군 및 (B) 배반포 단계로의 발달 속도를 나타내는 PST-1P 처리된 배아. 모든 배아는 PST-1P의 비활성을 보장하기 위해 발달 전반에 걸쳐 어두운 조건에서 유지되었다. 배반포 단계로의 발달 속도는 대조군 (100 %, n = 13)과 PST-1P 처리 된 배아 (91.3 %, n = 23) 사이에서 필적했다. 배율 막대는 20μm입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 비활성 PST-1P에서 배양된 이식 전 배아는 유사분열 동안 정상적인 스핀들 역학을 입증한다. (A) 처리되지 않은 대조군 및 (B) PST-1P 처리된 배아를 8-세포에서 16-세포 단계로 나누고, EB3-dTomato 및 히스톤 2B (H2B)-GFP를 주입하였다. 모든 배아는 PST-1P의 비활성을 보장하기 위해 발달 전반에 걸쳐 어두운 조건에서 유지되었다. 염색체의 정렬은 결함없이 초기 아나상 (A i 및 B ii), 후기 아나 페이즈 (A iii 및 B iii), 및 사이토카인증 (A iv 및 Biv)이 뒤 따른다. 스케일 바는 3D 이미지에서 10μm, 인셋에서 5μm입니다. (c) 아나페이즈는 텔로페이즈 동안 탈응축된 PST-1P 처리된 배아에서 대조군에서 8분 53초, 8분 40초의 평균을 지속하였고(p-값 = 0.8241) 및 (D) 염색체는 PST-1P 처리된 배아에서 아나페이즈 개시 후 대조군에서 19분 38초 및 18분 51초의 평균을 가졌다(p-값 = 0.2743). 분석을 위해, 대조군에서 n = 10이고 PST-1P 치료에서 n = 12이다. 또한, 모든 셀은 예상대로 하나의 동기파로 나뉘어집니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세 소관 네트워크는 세포의 근본적인 내부 작동에 필수적입니다. 결과적으로, 이것은 살아있는 유기체에서 미세 소관 역학을 조작하는 데 어려움을 겪는데, 네트워크에 대한 교란은 세포 기능의 모든 측면에 광범위한 영향을 미치는 경향이 있기 때문입니다. 광전환 가능한 미세소관-표적화 화합물의 출현은 미세소관 성장 억제의 유도 및 역전에 대한 우수한 제어와 함께 세포 골격을 아세포 수준에서 정밀하게 조작하는 방법을 제시한다9. 이 프로토콜은 미세소관 중합이 어떻게 세포 하부 규모에서 광활성화된 PST-1P에 의해 이식 전 마우스 배아에서 그리고 시간적으로 정확한 방식으로 억제될 수 있는지를 입증한다. 추가적으로, 이러한 억제는 미세소관 네트워크의 단기간의 교란에 대한 조사를 허용하도록 역전될 수 있다.
제시된 프로토콜은 살아있는 이식 전 마우스 배아에 PST를 적용하는 데 최적화되어 있으며 다양한 다른 배양 시스템으로 사용을 확장하기위한 기초로 사용될 수 있습니다. PST의 새로운 사용자는 응용 프로그램에서 문제 해결이 필요한 몇 가지 지점이 발생할 수 있으며, 이에 대해 몇 가지 문제 해결 단계가 제시됩니다.
PST의 세포 독성을 평가해야하며 세포에 대한 독성을 최소화하면서 미세 소관 성장의 강력한 억제를 유도하는 작동 농도를 선택해야합니다. PST 및 기타 광스위치의 작동 농도를 최적화하기 위한 광범위한 프로토콜은 최근 사전 인쇄11에서 자세히 설명되었습니다. 요컨대, PST의 새로운 사용자는 약물의 연속 희석으로 어두운 조건에서 세포 독성을 평가할 수 있습니다. 이 설정에서는 EB3-dTomato 혜성에 측정 가능한 효과가 없어야하며 세포에 대한 독성이 없어야합니다. 이는 조명 조건 하에서 비세포독성 농도를 시험하기 위한 출발점을 제공한다. 추가 실험을 위해, EB3-dTomato 혜성의 감소를 유도하는 가장 낮은 농도가 권장됩니다.
어떤 약물 치료와 마찬가지로, PST는 세포에 의해 대사 될 수 있습니다. 그러나, 실용적인 관점에서, 이것은 PST-1P에서 C. elegans 배아를 150분 동안 인큐베이션하고 후속 효과적인 이성체화9에 의해 입증된 바와 같이 무시할 수 있을 것이다. 고도로 대사적으로 활성인 시스템의 경우, PST-1P의 증가된 농도가 요구될 수 있다. PST는 또한 배양 배지를 통해 확산되어 ROI 내에서 활성 PST의 부하를 줄일 수 있습니다. 이를 완화하기 위해, 반복적인 광활성화가 필요할 수 있으며, 일부 시스템이 광독성에 취약할 수 있기 때문에 세포독성은 개별 세포 유형 기준으로 평가될 필요가 있을 것이다. 마찬가지로, 활성화된 PST는 광-활성화된 ROI로부터 확산될 수 있고 주변 미세소관에 영향을 미칠 수 있다. 그러나 비활성 트랜스 상태로 되돌아가는 고유 한 경향으로 인해 주변 지역에 미치는 영향은 무시할 수 있어야합니다.
PST의 사용에 대한 또 다른 잠재적 장애물은 이들 조직의 제한된 광 침투성의 특성으로 인해 오가노이드 또는 더 큰 유기체에서의 그들의 적용과 관련된다. 더 큰 조직은 더 깊은 세포의 광활성화를 위해 접근가능하지 않을 수 있다. 이식 전 마우스 배아는 외부 코팅, 조나 펠루시다로 둘러싸여 있다는 점에서 독특한 도전을 제시하며, 이는 배지에 첨가 된 약물의 투과성을 방해 할 수 있습니다. 이를 완화하기 위해, 배아는 영상화 전에 PST-1P에서 적어도 1시간 동안 사전 인큐베이션된다. 유사한 최적화 접근법은 PSTs(9)의 세포 흡수를 돕기 위해 아세토니트릴의 첨가와 같은 전체 유기체 또는 오가노이드 시스템에서 PST를 사용할 때 약물의 침투를 향상시키기 위해 적용될 수 있다.
PST의 녹색 빛 가역성으로 인해, 이들 화합물은 530nm 이하(예: GFP)의 여기가 필요한 형광단의 이미징과 호환되지 않습니다. 그러나 사용자는 530nm 이상의 여기가 필요한 형광단(예: RFP, mCherry 또는 mPlum)으로 형광단 추적을 구현할 수 있습니다. 아세포 구조의 이중 라벨링이 필요한 경우, 사용자는 적색 및 원-적색 기반 형광단을 사용할 수 있다. GFP 호환성이 필수적이라면, 새로운 종류의 광스위치인 SBTubs가 흥미로울 수 있다(25). 이들 화합물은 또한 자외선에 의해 활성화되고; 그러나 녹색 빛에 반응하지 않아 확산에 의해서만 기능적으로 가역적 일 수 있지만 여기 파장이 488nm 이상인 모든 형광단과 호환됩니다. 가역성을 제공하지만 GFP 이미징과 호환되지 않는 PST와 함께이 화합물은 사용자에게 맞춤형 접근 방식을 취하고 사용 가능한 광 스위치를 연구 질문에 적용 할 수있는 유연성을 제공합니다.
종래의 소분자 억제, 녹아웃 및 녹다운 접근법은 미세소관 작용을 특성화하기 위해 전체 세포 또는 전체 유기체 스케일에서 구현될 수 있다. 이러한 접근법은 쉽게 가역적이지 않고 종종 세포 내 또는 시간적으로 조절 된 방식으로 표적화하기 어려운 미세 소관에 강력하지만 광범위하고 파괴적인 효과를 제공합니다. 이러한 한계를 우회하는 한 가지 전략은 광유도성 광유전학 시스템의 유전 공학을 통해서이다. 이들 시스템의 적용은 광범위하게 다양하며, 광-유도된 이종이량체화, 동종이량체화, 및 단백질 또는 단백질 도메인(26)의 해리를 포함한다. 최근에, 광유전학적으로 조절된 말단 결합 단백질 1 (EB1) 구축물이 설계되었고, 여기서 광-유도성 스위치는 미세소관 플러스 말단 결합 파트너 EB1의 아미노- 및 카르복실-말단의 분리를 가능하게 하였다. 이것은 단백질을 서브초 반응 시간으로 기능적으로 비활성으로 만들었고, 인간 폐 암종 세포주(27)에서 미세소관의 성장을 차단하였다. 유사하게, 광유전학적 스위치가 D. melanogaster 에서 미세소관 및 액틴 필라멘트를 가교결합시켜 세포(28)에 대한 형태학적 변화에 대한 세포골격 가교결합의 영향을 이해하는데 사용되었다. 초기 배아를 조작하기 위해 광유전학 도구를 사용하는 것은 매우 화제적인 연구 분야이며 최근의 진보를 보았습니다1. 핵 단백질의 잘못된 국재화를 유도하기 위해 광유전학적으로 변형된 핵 수출 시스템이 개발되었다. 이것은 기능 상실 유전 모델을 모방 할 수 있으며, D. melanogaster 배아29의 정확한 발달 시점에서 수행 할 수있는 유연성이 추가되었습니다. 광유전학적 접근은 미세소관 역학의 시공간 조절을 위한 강력한 도구이다; 그러나 엔지니어링하기가 어렵고 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 반면, PST는 유사한 반응 시간, 특이성 및 가역성을 자랑하는 복잡한 유전자 조작에 대한 화학적 대안을 제공하며 사용 및 접근성이 추가 된 이점을 제공합니다.
미세 소관 필라멘트를 기계적으로 파괴하는 또 다른 표적 접근법은 이광자 레이저를 이용한 레이저 절제입니다. 이것은 이식 전 마우스 배아16에서 상간 다리를 절제하기 위해 성공적으로 적용되었다. 잘 구현되면 사용자는 높은 보수를 얻을 수 있습니다. 그러나이 기술을 실행하는 것은 어렵고 주변 구조 또는 세포 자체의 파괴 또는 용해를 피하기 위해 높은 수준의 정밀도가 필요합니다. 또한, 사용자는 미세소관이 빠르게 재성장할 수 있기 때문에 의도된 효과를 달성하기 위해 샘플을 반복적으로 절제해야 할 수도 있다(30). 대조적으로, PST는 미세소관 중합(31 )을 직접적으로 억제하고, β-튜불린에 결합하기 위한 그들의 특이성 때문에 레이저 절제술로 인해 발생할 수 있는 바람직하지 않은 효과를 피한다. 또한 PST는 전체 유기체에 적용 할 수 있지만 자연에 의한 레이저 절제는 특정 영역에만 타겟팅 될 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하면 PST 적용 가능성이 광범위하고 매력적입니다. PSTs는 유사분열 또는 meiotic 세포 분열 동안 염색체 분리의 양상을 연구하기 위해 서브초 반응 시간 내에 미세소관 성장의 정밀한, 아세포 억제를 허용할 수 있다. 세포 내화물의 밀매는 엔도솜 밀매, 미토콘드리아의 이동 또는 핵 포지셔닝을 연구하기 위해 미세 소관 네트워크에 의해 제공되는 운송 경로를 억제함으로써 중단 될 수 있습니다. PSTs는 또한 인간 흑색종 세포주32,33으로부터 성장한 3D 다세포 구상체에서 미세소관 성장을 성공적으로 억제하는데 사용되었다. PST 활성화의 유연성과 뛰어난 반응 시간을 결합하면 연구원은 미세 소관 역학을 조사하고 세포 기능을 조작 할 수있는 동적 도구를 제공합니다. 또한, PST의 가역성은 단일 세포 또는 조직 또는 유기체 내의 선택된 세포에 대한 미세 소관 억제의 단기 및 장기 결과에 대한 연구에 이상적입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 또는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 Oliver Thorn-Seshold 박사와 Li Gao 박사에게 포토스타틴과 원고 준비에 대한 조언, 촬영 지원을위한 Monash Production 및 현미경 지원을위한 Monash Micro Imaging 박사에게 감사드립니다.
이 연구는 National Health and Medical Research Council (NHMRC) 프로젝트 보조금 APP2002507을 J.Z.에 지원하고 캐나다 고급 연구 연구소 (CIFAR) Azrieli 장학금을 J.Z.에 지원했습니다. Australian Regenerative Medicine Institute는 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
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