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Developmental Biology

Spatiotemporal Subcellular हेरफेर सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन में जीवित प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में फोटोस्टैटिन का उपयोग करके

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63290
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

Summary

विशिष्ट सूक्ष्मनलिकाएं अवरोधक, जो बुनियादी और लागू अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, कोशिकाओं पर दूरगामी प्रभाव डालते हैं। हाल ही में, फोटोस्टेटिन फोटोस्विचेबल माइक्रोट्यूबुल इनहिबिटर के एक वर्ग के रूप में उभरा, जो सूक्ष्मनलिकाएं के तात्कालिक, प्रतिवर्ती, स्पैटिओटेम्पोरल रूप से सटीक हेरफेर में सक्षम है। यह चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल एक 3 डी लाइव प्रीइंप्लांटेशन माउस भ्रूण में फोटोस्टैटिन के आवेदन का विवरण देता है।

Abstract

सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन एक सेल की रूपरेखा बनाती हैं और इंट्रासेल्युलर परिवहन, सेल विभाजन और सिग्नल ट्रांसडक्शन के लिए मौलिक हैं। उदाहरण के लिए, सर्वव्यापी सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क के पारंपरिक औषधीय विघटन का उपयोग करके, नोकोडाज़ोल किसी भी सेल के लिए विनाशकारी परिणाम हो सकता है। प्रतिवर्ती फोटोस्विचेबल सूक्ष्मनलिकाएं अवरोधकों में दवा के प्रभावों को सक्षम करके सीमाओं को दूर करने की क्षमता होती है, जिसे स्पैटिओटेम्पोरली-नियंत्रित तरीके से लागू किया जा सकता है। दवाओं का ऐसा ही एक परिवार एज़ोबेंजीन-आधारित फोटोस्टेटिन (पीएसटी) है। ये यौगिक अंधेरे परिस्थितियों में निष्क्रिय होते हैं, और यूवी प्रकाश के साथ रोशनी पर, वे β-ट्यूबुलिन की कोल्चिसिन-बाइंडिंग साइट से जुड़ते हैं और सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन और गतिशील टर्नओवर को अवरुद्ध करते हैं। यहां, 3-आयामी (3 डी) लाइव प्रीइंप्लांटेशन माउस भ्रूण में पीएसटी का आवेदन एक उपकोशिकीय स्तर पर सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क को बाधित करने के लिए निर्धारित किया गया है। यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सेटअप के लिए निर्देश प्रदान करता है, साथ ही लाइव-सेल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पीएसटी के लिए प्रकाश सक्रियण और निष्क्रियता पैरामीटर भी प्रदान करता है। यह पुनरुत्पादन सुनिश्चित करता है और दूसरों को अपने शोध प्रश्नों पर इस प्रक्रिया को लागू करने में सक्षम बनाता है। पीएसटी जैसे अभिनव फोटोस्विच गतिशील इंट्रासेल्युलर सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क की समझ को आगे बढ़ाने और वास्तविक समय में साइटोस्केलेटन में गैर-आक्रामक रूप से हेरफेर करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित हो सकते हैं। इसके अलावा, पीएसटी अन्य 3 डी संरचनाओं जैसे ऑर्गेनोइड्स, ब्लास्टोइड्स, या अन्य प्रजातियों के भ्रूण में उपयोगी साबित हो सकते हैं।

Introduction

सूक्ष्मनलिकाएं आर्किटेक्चर विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में व्यापक रूप से भिन्न होती है ताकि विभिन्न कार्यों का समर्थन किया जा सके 1,2। विकास और संकुचन की इसकी गतिशील प्रकृति अतिरिक्त और इंट्रासेल्युलर संकेतों के लिए तेजी से अनुकूलन की अनुमति देती है और एक सेल की कभी-कभी बदलती जरूरतों का जवाब देती है। इसलिए, इसे "रूपात्मक फिंगरप्रिंट" के रूप में माना जा सकता है जो सेलुलर पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन के औषधीय लक्ष्यीकरण ने विकासात्मक जीव विज्ञान, स्टेम सेल जीव विज्ञान, कैंसर जीव विज्ञान और न्यूरोबायोलॉजी 3,4,5,6,7 में मौलिक खोजों की अधिकता को जन्म दिया है। यह दृष्टिकोण, जबकि अपरिहार्य है, विषाक्तता और ऑफ-टारगेट प्रभाव जैसी विभिन्न सीमाओं को प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सूक्ष्मनलिकाएं-लक्ष्यीकरण एजेंटों में से एक, नोकोडाज़ोल, एक शक्तिशाली सूक्ष्मनलिकाएं-डीपोलीमराइजिंग दवा8 है। हालांकि, छोटे-अणु अवरोधक जैसे कि नोकोडाज़ोल आवेदन के समय से सक्रिय होते हैं और, कई महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों के लिए सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन की आवश्यक प्रकृति को देखते हुए, सूक्ष्मनलिकाएं का वैश्विक डीपोलीमराइजेशन ऑफ-टारगेट प्रभाव पैदा कर सकता है, जो कई अनुप्रयोगों के लिए अनुपयुक्त हो सकता है। इसके अतिरिक्त, nocodazole उपचार अपरिवर्तनीय है जब तक कि नमूनों को दवा से मुक्त नहीं किया जाता है, निरंतर लाइव इमेजिंग को रोकता है और इस प्रकार, व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स की सटीक ट्रैकिंग को रोकता है।

प्रकाश-सक्रिय यौगिकों का विकास फोटोअनकेड अणुओं के निर्माण के साथ शुरू हुआ और एक सटीक और स्पैटिओटेम्पोरल रूप से नियंत्रित तरीके से सूक्ष्मनलिकाएं विकास निषेध के प्रभावों को लक्षित करने और निगरानी करने में एक नए युग की शुरुआत की है। प्रतिवर्ती फोटोस्विचेबल दवाओं, फोटोस्टैटिन (पीएसटी) का एक परिवार, एज़ोबेंजीन 9 के साथ कोम्ब्रेटास्टेटिन ए -4 के स्टिलबेन घटक को बदलकर विकसितकिया गया था। पीएसटी यूवी प्रकाश के साथ रोशनी तक निष्क्रिय होते हैं, जिससे निष्क्रिय ट्रांस-कॉन्फ़िगरेशन प्रतिवर्ती आइसोमेराइजेशन द्वारा सक्रिय सीआईएस-कॉन्फ़िगरेशन में परिवर्तित हो जाता है। सीआईएस-पीएसटी β-ट्यूबुलिन की कोलचिसिन बाइंडिंग साइट को बाध्य करके सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन को बाधित करते हैं, β-ट्यूबुलिन के साथ अपने इंटरफ़ेस को अवरुद्ध करते हैं और सूक्ष्मनलिकाएं विकास के लिए आवश्यक dimerization को रोकतेहैं। पीएसटी के एक समूह के बीच, पीएसटी -1 पी एक लीड यौगिक के रूप में उभरा है क्योंकि इसमें उच्चतम शक्ति है, पूरी तरह से पानी में घुलनशील है, और रोशनी के बाद बायोएक्टिविटी की तेजी से शुरुआत दिखाता है।

पीएसटी का सबसे प्रभावी ट्रांस-टू-सीआईएस-आइसोमेराइजेशन 360-420 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य पर होता है, जो पीएसटी सक्रियण के लिए दोहरे विकल्पों को सक्षम बनाता है। एक ठेठ confocal माइक्रोस्कोप पर एक 405 एनएम लेजर लाइन सूक्ष्मनलिकाएं विकास निषेध के इष्टतम स्थानिक लक्ष्यीकरण के लिए प्रशासित किया जा सकता है। 405 एनएम लेजर रोशनी के माध्यम से पीएसटी सक्रियण के स्थान और समय को इंगित करने की क्षमता सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण की सुविधा प्रदान करती है, जिससे उप-द्वितीय प्रतिक्रिया समय 9 के भीतर उपकोशिकीय स्तर पर सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता का विघटनहोता है। वैकल्पिक रूप से, एक सस्ती एलईडी यूवी प्रकाश पूरे जीव रोशनी को सूक्ष्मनलिकाएं वास्तुकला के जीव-व्यापी व्यवधान को प्रेरित करने की अनुमति देता है। यह शोधकर्ताओं के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प हो सकता है, जिनके लिए स्थानिक लक्ष्यीकरण के बजाय निषेध की सटीक समय पर शुरुआत, लक्ष्य है। पीएसटी की एक और विशेषता 510-540 एनएम रेंज9 में तरंग दैर्ध्य के हरे रंग की रोशनी को लागू करके उनकी ऑन-डिमांड निष्क्रियता है। यह पीएसटी-मध्यस्थता विकास निषेध से पहले, दौरान, और बाद में सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स का पता लगाने में सक्षम बनाता है।

PSTs, जबकि अभी भी एक अपेक्षाकृत हाल के डिजाइन, विविध अनुसंधान क्षेत्रों में कई इन विट्रो अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गयाहै 11, amoeboids12 में सेल माइग्रेशन के नए तंत्र की जांच सहित, नवजात माउस13 के मस्तिष्क से अलग न्यूरॉन्स में, और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर14 में विंग उपकला विकास . अन्य प्रकाश-प्रतिक्रियाशील दवाएं सेलुलर फ़ंक्शन के लक्षित व्यवधान में मूल्यवान उपकरण साबित हुई हैं। उदाहरण के लिए, ब्लेबिस्टाटिन का एक एनालॉग, azidoblebbistatin, रोशनी15,16 के तहत बढ़े हुए मायोसिन निषेध के लिए उपयोग किया गया था। यह सेलुलर फ़ंक्शन के स्पैटिओटेम्पोरल रूप से नियंत्रित निषेध की क्षमता के कारण नई खोजों की क्षमता पर प्रकाश डालता है।

लाइव 3 डी जीव शारीरिक परिस्थितियों में एक पूरे जानवर, एकल-कोशिका, या उपकोशिकीय स्तर पर सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता में हेरफेर करने के लिए शानदार अभी तक अधिक नाजुक प्रणालियों को प्रस्तुत करते हैं। विशेष रूप से, प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण सेल के आंतरिक कामकाज के साथ-साथ एक जीव17 के भीतर अंतरकोशिकीय संबंधों में असाधारण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। अस्थायी और स्थानिक रूप से पीएसटी के सक्रियण और निष्क्रियता के लगातार चक्रों को लक्षित करने में योगदान दिया इंटरफेज ब्रिज, कोशिकाओं के बीच एक पोस्ट-साइटोकाइनेटिक संरचना, प्रीइंप्लांटेशन माउस भ्रूण16 में एक गैर-सेंट्रोसोमल सूक्ष्मनलिकाएं-आयोजन केंद्र के रूप में। एक समान प्रयोगात्मक सेटअप ने ब्लास्टोसिस्टगठन की अनुमति देने के लिए माउस भ्रूण की सीलिंग में बढ़ती सूक्ष्मनलिकाएं की भागीदारी का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, पीएसटी का उपयोग पूरे ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में भी किया गया था ताकि हिंडब्रेन19 में कोशिकाओं के सबसेट में सूक्ष्मनलिकाएं विकास को रोककर न्यूरोनल सेल माइग्रेशन की जांच की जा सके।

यह प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सेटअप और प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में पीएसटी -1 पी के उपयोग का वर्णन करता है। यहां प्रस्तुत निर्देश भी उद्देश्यों की एक विस्तृत सरणी के लिए पीएसटी के आवेदन का मार्गदर्शन कर सकते हैं जैसे कि गुणसूत्र अलगाव और सेल विभाजन का अध्ययन, इंट्रासेल्युलर कार्गो की तस्करी, और सेल मॉर्फोजेनेसिस और माइग्रेशन। इसके अलावा, इस तरह के अध्ययन ऑर्गेनोइड सिस्टम, ब्लास्टोइड्स और अन्य भ्रूण मॉडल जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगेंस और ज़ेनोफस लेविस में पीएसटी के कार्यान्वयन में सहायता करेंगे, साथ ही संभावित रूप से इन विट्रो निषेचन प्रौद्योगिकियों के लिए पीएसटी के उपयोग का विस्तार करेंगे।

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Protocol

प्रयोगों को मोनाश पशु नैतिकता समिति द्वारा पशु नैतिकता संख्या 19143 के तहत अनुमोदित किया गया था। जानवरों को नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार सख्ती से पशु सुविधा (मोनाश पशु अनुसंधान मंच) में विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त पशु घर की स्थिति में रखा गया था।

1. प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण संग्रह

  1. संस्थागत पशु नैतिकता दिशानिर्देशों के अनुपालन में पहले16,18 वर्णित सुपरोवुलेट और साथी चूहों के रूप में।
    नोट: जीवित भ्रूण संग्रह के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उपभेद C57BL / 6 या FVB / N चूहे हैं। यहां दिखाए गए सभी डेटा एफवीबी / एन चूहों का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे।
  2. संभोग के बाद सुबह, एम 2 माध्यम का उपयोग करके ओविडक्ट से युग्मनज फ्लश करें जैसा किवर्णित 20, या मानव ट्यूबल द्रव (एचटीएफ) माध्यम है। 21,22 वर्णित के रूप में एक मुंह पिपेट उपकरण का उपयोग करते हुए, ताजा पोटेशियम सिम्प्लेक्स अनुकूलित मध्यम (केएसओएम) बूंदों में युग्मनज को स्थानांतरित करें, 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवर्म्ड और 5% सीओ2 तक संतुलित, 35 मिमी संस्कृति पकवान में मीडिया कवरेज सुनिश्चित करने के लिए खनिज तेल की पर्याप्त मात्रा के साथ ओवरलेड।
  3. Microinject युग्मनज के रूप में एक लाल फ्लोरोसेंट-टैग किए गए सूक्ष्मनलिकाएं प्लस अंत मार्कर के लिए cRNA एन्कोडिंग के साथ20 वर्णित के रूप में. यहां, एंड बाइंडिंग प्रोटीन 3 (ईबी 3) के लिए सीआरएनए -डीटोमेटो का उपयोग16,18 के रूप में वर्णित और माइक्रोइंजेक्शन बफर में पतला करने के बाद 30 एनजी / μL एकाग्रता पर किया गया था।
    नोट: समय से पहले cRNA तैयार करने और इसे -20 °C पर आवश्यक होने तक संग्रहीत करने की सिफारिश की जाती है।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर अंधेरे में संस्कृति भ्रूण जब तक भ्रूण पीएसटी -1 पी उपचार के लिए वांछित विकास के चरण तक नहीं पहुंच गए हैं।
    नोट: विभिन्न भ्रूण चरणों के लिए आवश्यक संस्कृति समय के एक व्यापक संसाधन के लिए23 देखें। यहां उपयोग किए जाने वाले 16-सेल चरण भ्रूण के लिए, भ्रूण दिवस 3 (ई 3) पोस्ट-निषेचन के लिए संस्कृति।

2. दवा और इमेजिंग पकवान की तैयारी

नोट:: चरण 2.1-2.10 के लिए, अनपेक्षित पीएसटी-1P सक्रियण से बचने के लिए विशेष रूप से अंधेरे या लाल बत्ती की स्थिति में काम करें। एल्यूमीनियम पन्नी या अंधेरे कवर सभी ट्यूबों और PSTs युक्त व्यंजनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

  1. अल्ट्राप्योर पानी में 50 एमएम पीएसटी -1 पी का स्टॉक एकाग्रता तैयार करें।
    नोट: पीएसटी -1 पी का आणविक वजन 440 ग्राम / मोल है। स्टॉक समाधान 1 वर्ष तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है। पीएसटी -1 पी पानी या जलीय बफर में घुलनशील है लेकिन डीएमएसओ में आसानी से भंग नहीं होता है।
  2. चरण 2.1 से, अल्ट्राप्योर पानी में 800 μM PST-1P की एक मध्यवर्ती कार्य एकाग्रता तैयार करें।
  3. ताजा KSOM में 40 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए पीएसटी-1P पतला. एक विशिष्ट प्रयोग के रूप में पीएसटी-1P-उपचारित KSOM के लगभग 20 μL की आवश्यकता होती है, 20 μL की अंतिम मात्रा के लिए KSOM के 19 μL में 800 μM PST-1P के 1 μL को पतला करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पर्याप्त माध्यम अग्रिम में तैयार किया गया है, दृश्यता के लिए केवल लाल प्रकाश का उपयोग करके।
    नोट: दोनों एकाग्रता और एक PST-1P कमजोर पड़ने की सक्रियण स्थिति एक यूवी-विस absorbance स्पेक्ट्रम एक spectrophotometer जो परख स्थापना के दौरान किया जाना चाहिए का उपयोग करके की जाँच की जा सकती है. 1 सेमी क्यूवेट में पूरी तरह से ट्रांस 40 μM कमजोर पड़ने के380 एनएम (ए 380) पर अवशोषण लगभग 0.8 होना चाहिए। सीआईएस- और ट्रांस-रूपों दोनों में 455 एनएम (ए455) पर एक ही अवशोषण होता है। जब ए380 से ए455 का अनुपात लगभग 9: 1 होता है, तो कमजोर पड़ने वाला निष्क्रिय (पूरी तरह से ट्रांस) होता है। जब अनुपात A380: A455 1: 2 है, तो कमजोर पड़ने पूरी तरह से सक्रिय हो जाता है (पूरी तरह से सीआईएस)। मध्यवर्ती अनुपात सक्रियण की मध्यवर्ती अवस्थाओं को दर्शाते हैं.
  4. लाइव इमेजिंग के लिए चैंबर स्लाइड तैयार करने के लिए, पीसेट 10 μL पीएसटी -1P-उपचारित KSOM के एक अच्छी तरह से एक अर्धगोलाकार बूंद (चित्रा 1A) बनाने के लिए के केंद्र में इलाज किया।
  5. धीरे से बूंद को कवर करने के लिए पर्याप्त खनिज तेल जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह मीडिया को तितर-बितर नहीं करता है। यह सुनिश्चित करेगा कि बूंद वाष्पित न हो।
  6. पूर्व गर्म और सीओ2-37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कक्ष स्लाइड डिश को संतुलित करें और कम से कम 3 घंटे या अधिक से अधिक, रात भर के लिए 5% सीओ2 ।
  7. चरण 2.6 में संतुलन अवधि के अंत में, पीएसटी -1 पी-उपचारित, पूर्वव्यापी, और एक धोने के कदम के रूप में संतुलित केसोम की 10 μL बूंद के साथ एक 35 मिमी संस्कृति पकवान तैयार करें। तेल के साथ ओवरले न करें।
  8. पीएसटी-1P-उपचारित KSOM ड्रॉपलेट में चरण 2.7 से मुंह pipetting द्वारा भ्रूण स्थानांतरण.
    नोट: चरण 2.7 और 2.8 भ्रूण के मुंह pipetting के लिए अनुशंसित हैं, लेकिन वैकल्पिक हैं।
  9. तुरंत पीएसटी-1P के केंद्र में मुंह pipetting द्वारा भ्रूण हस्तांतरण-2.4-2.6 कदम (चित्रा 1A) में तैयार इमेजिंग कक्ष स्लाइड में KSOM बूंद इलाज किया.
  10. इमेजिंग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए इमेजिंग चैंबर स्लाइड में पीएसटी -1 पी-उपचारित केएसओएम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर भ्रूण को इनक्यूबेट करें। यदि संभव हो, तो 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक पर्यावरण कक्ष के अंदर माइक्रोस्कोप पर चैंबर स्लाइड को माउंट करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण अंधेरे में कि सभी पीएसटी -1 पी निष्क्रिय ट्रांस-कॉन्फ़िगरेशन में हैं और भ्रूण डिश के नीचे डूब सकते हैं।

3. लाइव इमेजिंग और पीएसटी-1P photoactivation

नोट: चरण 3.1-3.13 एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप हिमस्खलन फोटोडायोड डिटेक्टरों (APDs) और एक अंधेरे पर्यावरण कक्ष के साथ फिट पर प्रदर्शन कर रहे हैं। ये निर्देश विशेष रूप से सामग्री की तालिका में वर्णित अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग सेटअप को संदर्भित करते हैं; हालांकि, उन्हें अन्य कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर भी लागू किया जा सकता है।

  1. निर्धारित विसर्जन माध्यम के साथ एक 63x / 1.2 एनए पानी के तेल विसर्जन उद्देश्य तैयार करें।
  2. स्थिति का मार्गदर्शन करने के लिए एक लाल बत्ती मशाल का उपयोग करना, विसर्जन माध्यम से संपर्क करने के उद्देश्य को आगे बढ़ाना। इस स्तर पर, भ्रूण को खोजने के लिए सफेद या ब्राइटफील्ड प्रकाश का उपयोग करने से बचें क्योंकि यह पीएसटी -1 पी को सक्रिय कर सकता है।
  3. आईपीस का उपयोग करते हुए और लाल प्रकाश रोशनी के तहत रहते हुए, माध्यम की बूंद के किनारे का पता लगाएं और इस स्थान पर सीधे उद्देश्य की स्थिति बनाएं। यह उपयोगकर्ता को अभिविन्यास स्थापित करने और फोकल प्लेन खोजने में सहायता कर सकता है।
  4. अगला, आईपीस के माध्यम से या सॉफ़्टवेयर-सक्षम लाइव-मोड स्कैनिंग पर, बूंद के भीतर भ्रूण का पता लगाने के लिए एक लाल तरंग दैर्ध्य फ़िल्टर या 561 एनएम लेजर का उपयोग करें।
  5. पूरे भ्रूण के जेड-स्टैक को प्राप्त करने के लिए स्टार्ट- और एंड-पॉइंट्स सेट करने के लिए स्टेज कंट्रोलर और लाइव-स्कैनिंग मोड का उपयोग करें।
  6. लेजर पावर सेटिंग्स को समायोजित करें (आमतौर पर, अत्यधिक संवेदनशील डिटेक्टरों जैसे कि एपीडी के साथ, 5% से कम की 561 एनएम लेजर शक्ति पर्याप्त है), डिजिटल ऑफसेट (आमतौर पर -0.900 पर) ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं की उपस्थिति को अनुकूलित करने और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए, 2 μm पर पिनहोल, 512 x 512 का पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन, और 3.15 μs का पिक्सेल रहने का समय।
  7. पूरे जीव में सूक्ष्मनलिकाएं विकास के क्षेत्रों का आकलन करने के लिए 1 μm अनुभाग अंतराल के साथ पूरे भ्रूण का एक z-स्टैक प्राप्त करें (चित्रा 1 B)।
  8. EB3-dTomato ट्रैकिंग प्रयोगों के लिए रुचि के क्षेत्रों (ROIs) की पहचान करने के लिए चरण 3.7 से 3D z-स्टैक छवि का उपयोग करें। ज़ूम को 3x तक बढ़ाएं और ब्याज के विशिष्ट उपकोशिकीय क्षेत्र के चारों ओर एक आयताकार ROI खींचें।
  9. इमेजिंग पैरामीटर के विशिष्ट मूल्यों का उपयोग करके एक एकल जेड-प्लेन की एक टाइम-लैप्स मूवी प्राप्त करें: 5% पर 561 एनएम लेजर पावर, -0.900 का डिजिटल ऑफसेट, 512 x 512 का पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन, 3 μm पर पिनहोल, 3.15 μs का पिक्सेल रहने का समय, 3x का ज़ूम, 500 एमएस का समय अंतराल।
    नोट: 120 समय फ्रेम 1 मिनट की ट्रैकिंग मूवी प्रदान करेगा और डेटा विश्लेषण के लिए पर्याप्त होना चाहिए। अधिग्रहण लंबे समय तक जारी रह सकता है, बशर्ते कि फ्लोरोफोर का ब्लीचिंग न्यूनतम हो (चित्रा 1 सी)।
  10. पीएसटी -1 पी को सक्रिय करने के लिए, 405 एनएम लेजर पर स्विच करें और 405 एनएम लेजर सेट के साथ एक और टाइम-लैप्स फिल्म प्राप्त करें 10% शक्ति, 512 x 512 का पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन, पिनहोल अधिकतम खोला गया, पिक्सेल 3.15 μs का रहने का समय, 3x का ज़ूम, 500 एमएस का समय अंतराल, और कुल 20 फ्रेम (चित्रा 1 डी)।
  11. 561 एनएम लेजर पर वापस स्विच करें और पीएसटी -1 पी (चित्रा 1 ई) के सक्रियण के बाद ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं के नुकसान की पुष्टि करने के लिए चरण 3.9 के रूप में अधिग्रहण को दोहराएं। सुनिश्चित करें कि यह अधिग्रहण सक्रियण के बाद जितनी जल्दी हो सके होता है।
    नोट: चरण 3.10 EB3-dTomato धूमकेतु के लंबे समय तक निषेध के लिए दोहराया जा सकता है। हालांकि, यूवी प्रकाश के कारण होने वाले किसी भी नुकसान से बचने के लिए भ्रूण की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए।
  12. पीएसटी -1 पी को अपने निष्क्रिय ट्रांस-स्टेट में वापस रिवर्स करने के लिए, 10% शक्ति पर 514 एनएम लेजर संलग्न करें। 514 एनएम लेजर सेट के साथ एक टाइम-लैप्स फिल्म प्राप्त करें 10% शक्ति, 512 x 512 का पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन, पिनहोल अधिकतम खोला गया, 3.15 μs का पिक्सेल रहने का समय, 3x का ज़ूम, 500 एमएस का समय अंतराल, और कुल 20 समय फ्रेम (चित्रा 1 एफ)।
  13. EB3-dTomato धूमकेतुओं (चित्रा 1G) की वसूली की कल्पना करने के लिए चरण 3.11 को दोहराएँ।

4. छवि डेटा विश्लेषण

  1. पीएसटी द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन के निषेध का विश्लेषण और परिमाणित करने के लिए, शोधकर्ताओं को उनकी विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप उपलब्ध सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों का उपयोग करें। उपयोग के लिए अनुशंसित लोगों के पास एक ट्रैकिंग टूल होगा, जो मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतु16,18 के आंदोलन, दिशा और गति को ट्रैक कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: पीएसटी-1P photoactivation और लाइव 3 डी preimplantation माउस भ्रूण में निष्क्रियता के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. सभी प्रयोगों को पूर्ण अंधेरे (काली पृष्ठभूमि) या केवल लाल प्रकाश रोशनी द्वारा किया जाता है। (ए) ईबी 3-डीटोमेटो को व्यक्त करने वाले लाइव प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण को 16-सेल चरण में सुसंस्कृत किया जाता है और फिर एक इमेजिंग चैंबर स्लाइड में 40 μM PST-1P युक्त KSOM की एक बूंद में स्थानांतरित किया जाता है। (बी) पूरे भ्रूण की एक 3 डी छवि ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं के वितरण की कल्पना करके सूक्ष्मनलिकाएं विकास के मूल्यांकन की अनुमति देती है। (सी) प्रयोग शुरू करने के लिए, ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं को समय-अंतराल इमेजिंग का उपयोग करके एक उपकोशिकीय क्षेत्र में ट्रैक किया जाता है। (डी) एक ही उपकोशिकीय क्षेत्र में बाद के पीएसटी -1 पी फोटोएक्टिवेशन एक 405 एनएम लेजर का उपयोग करके ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतु (ई) के नुकसान में परिणाम देता है। तीव्र पीएसटी -1P सक्रियण लागू किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो, अनुक्रमिक 405 एनएम प्रकाश रोशनी द्वारा। (F-G) पीएसटी -1 पी को अपनी निष्क्रिय स्थिति में वापस लाने और ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं को बहाल करने के लिए, एक 514 एनएम लेजर को एक ही उपकोशिकीय क्षेत्र में लागू किया जाता है। यदि आवश्यक हो, तो फोटोएक्टिवेशन और निष्क्रियता के कई दौर किए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रोटोकॉल के अनुरूप, प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण को ईबी 3 के लिए सीआरएनए के साथ माइक्रोइंजेक्टेड किया गया था, जिसे लाल फ्लोरोसेंट डीटोमेटो (ईबी 3-डीटोमेटो) के साथ टैग किया गया था। यह बढ़ती सूक्ष्मनलिकाएं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है क्योंकि ईबी 3 सूक्ष्मनलिकाएं प्लस24 को पॉलिमराइज़ करने के लिए बांधता है।

प्रयोगों को निषेचन (ई 3) के 3 दिन बाद किया गया था जब माउस भ्रूण में 16 कोशिकाएं शामिल होती हैं। किसी भी अन्य preimplantation विकास चरण का उपयोग किया जा सकता है, वैज्ञानिक प्रश्न की जांच के आधार पर। 405 एनएम लेजर प्रकाश सक्रियण प्रोटोकॉल का उपयोग करके न्यूनतम फोटोब्लीचिंग प्रदर्शित करने के लिए, एक अनुपचारित भ्रूण के साथ एक नियंत्रण प्रयोग दिखाया गया है (चित्रा 2 ए आई)। हड़ताली EB3-dTomato घनत्व के साथ एक ROI भ्रूण की अधिग्रहीत 3 डी छवि के आधार पर चुना जाता है। इस उदाहरण में, EB3-dTomato उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक पूरे सेल के एक एकल z-plane का उपयोग किया जाता है। हालांकि, भ्रूण के विभिन्न क्षेत्रों को आवश्यकतानुसार चुना जा सकता है (उदाहरण के लिए, कॉर्टिकल क्षेत्र, पेरिन्यूक्लियर क्षेत्र, एक माइटोटिक सेल, एक आंतरिक या बाहरी कोशिका)। 405 एनएम लेजर प्रकाश रोशनी से पहले EB3-dTomato अभिव्यक्ति की एक छवि परमाणु क्षेत्र को छोड़कर सेल के पूरे साइटोप्लाज्म के भीतर एक अत्यधिक घने EB3-dTomato संकेत दिखाती है (चित्रा 2A ii)। 405 एनएम लेजर प्रकाश रोशनी (चित्रा 2 ए iii और iv) के बाद ईबी 3-डीटोमेटो घनत्व में कोई बदलाव नहीं देखा गया था। इस प्रकार, प्रति से 405 एनएम लेजर प्रकाश भ्रूण या सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के लिए किसी भी फोटोडैमेज का कारण नहीं बनता है।

इसके बाद, 16-सेल चरण भ्रूण को लाइव इमेजिंग से पहले 40 μM PST-1P 3 h के साथ इलाज किया गया था और अंधेरे में रखा गया था। जीवित 3 डी जीवों पर पीएसटी प्रयोगों को सफलतापूर्वक करने के लिए, पीएसटी एकाग्रता के इष्टतम संतुलन को ढूंढना महत्वपूर्ण है, समय इनक्यूबेशन, और हानिकारक प्रभावों से बचने के लिए आवश्यक लेजर शक्ति11। सख्त अंधेरे परिस्थितियों के तहत, मजबूत EB3-dTomato अभिव्यक्ति को 3 D छवि (चित्रा 2B i) में पाया जा सकता है, जो भ्रूण को नियंत्रित करने के समान है (चित्रा 2A i)। इस प्रकार, पीएसटी -1 पी अंधेरे परिस्थितियों में सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन के निषेध को प्राप्त नहीं करता है। एक एकल जेड-प्लेन की टाइम-लैप्स इमेजिंग ने 405 एनएम लेजर लाइट रोशनी (चित्रा 2 बी ii) से पहले मजबूत ईबी 3-डीटोमेटो अभिव्यक्ति और सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन की पुष्टि की। सेकंड के भीतर, पीएसटी -1 पीएसटी (चित्रा 2 बी iii) के 405 एनएम लेजर प्रकाश सक्रियण के बाद ईबी 3-डीटोमेटो सिग्नल की कमी देखी गई थी। यह नुकसान लगभग 2 से 20 मिनट तक चलने की सूचना है, इससे पहले कि थर्मल विश्राम या आसपास के क्षेत्रों में प्रसारके कारण धीरे-धीरे वापस आ जाए। इस प्रकार, एक दोहरावदार 405 एनएम लेजर प्रकाश सक्रियण EB3-dTomato हानि (चित्रा 1E-D) की अवधि को लम्बा खींच सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, भ्रूण EB3-dTomato के साथ microinjected और पीएसटी -1P के साथ incubated सामान्य भ्रूण क्षमता दिखाते हैं, ब्लास्टोसिस्ट चरण (चित्रा 3, और पूरक चित्रा 1) के लिए विकसित, और सामान्य सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता, उदाहरण के लिए, माइटोसिस के दौरान (पूरक चित्रा 2)। इसलिए, निष्क्रिय पीएसटी -1 पी भ्रूण को कोई विषाक्तता नहीं दिखाता है।

नियंत्रित पीएसटी -1 पी निष्क्रियता 514 एनएम लेजर प्रकाश रोशनी (चित्रा 2 बी iv) द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। जबकि यह दृष्टिकोण पीएसटी -1 पी-प्रेरित विकास निषेध के बाद सूक्ष्मनलिकाएं विकास की उत्पत्ति को निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है, यह लाइव इमेजिंग के लिए हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग को बाहर करता है। जबकि अंधेरे परिस्थितियों में काम करने के लिए दृढ़ता से सिफारिश की जाती है, यदि पीएसटी अनजाने में सक्रिय होते हैं, तो हरी रोशनी एक निष्क्रिय ट्रांस-स्टेट में पीएसटी रिवर्सन को सक्षम बनाती है। इस परिस्थिति में, कोशिकाओं के लिए वसूली की पर्याप्त अवधि एक एहतियाती उपाय के रूप में आवश्यक है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं अपनी पूर्व-सक्रियण स्थिति में वापस आ सकती हैं। यदि समय अनुमति देता है, तो यह आदर्श रूप से कुछ घंटों का न्यूनतम होगा।

Figure 2
चित्रा 2: यूवी प्रकाश सक्रियण और जीवित माउस भ्रूण में PST-1P की निष्क्रियता से पहले और बाद में EB3-dTomato की लाइव इमेजिंग। (A i) एक अनुपचारित नियंत्रण 16-सेल चरण माउस भ्रूण का अधिकतम प्रक्षेपण 3D z-स्टैक EB3-dTomato के लिए लेबल किया गया। एक साइटोकाइनेटिक सूक्ष्मनलिकाएं पुल मौजूद है (ग्रे एरोहेड द्वारा दर्शाया गया है) कई इंटरफेज पुलों (पीले एरोहेड्स द्वारा दर्शाया गया) के साथ। (A ii) 405 एनएम लेजर एक्सपोजर से पहले एक सेल के एकल जेड-प्लेन की छवि बनाई गई। (A iii-iv) एक सेल का एकल जेड-प्लेन तुरंत (ए iii) और 4 मिनट (ए iv) 405 एनएम लेजर लाइट एक्सपोजर (एक बैंगनी बिजली बोल्ट द्वारा इंगित) के बाद चित्रित किया गया है, जो ईबी 3-डीटोमेटो सिग्नल में कोई बदलाव नहीं दिखाता है। (B i) EB3-dTomato के लिए लेबल किए गए 16-सेल चरण भ्रूण का अधिकतम प्रक्षेपण 3 D z-स्टैक, जिसे 40 μM PST-1P के साथ इलाज किया जाता है और अंधेरे में रखा जाता है। इंटरफेज पुलों को पीले एरोहेड्स द्वारा इंगित किया जाता है। (B ii) एक सेल के एकल z-विमान पूर्व सक्रियण imaged. (B iii) 405 एनएम लेजर लाइट एक्सपोजर (एक बैंगनी बिजली बोल्ट द्वारा इंगित) के तुरंत बाद एक सेल का एकल जेड-प्लेन चित्रित किया गया है, जो ईबी 3-डीटोमेटो सिग्नल में उल्लेखनीय कमी दिखाता है। (B iv) एक सेल का एकल जेड-प्लेन 514 एनएम लेजर लाइट एक्सपोजर (एक हरे रंग की बिजली बोल्ट द्वारा इंगित) के तुरंत बाद चित्रित किया गया है, जो ईबी 3-डीटोमेटो सिग्नल की वसूली दिखाता है। नाभिक धराशायी नीली रेखा द्वारा इंगित किए जाते हैं। स्केल सलाखों: पूरे 3 डी भ्रूण के लिए 15 μm; इनसेट में 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: निष्क्रिय PST-1P संस्कृति की स्थिति ब्लास्टोसिस्ट चरण में सामान्य भ्रूण विकास की अनुमति देती है। (A) ब्लास्टोसिस्ट चरण (E4.5) में भ्रूण के एकल विभेदक हस्तक्षेप विपरीत (DIC) z-plane अंधेरे में 40 μM PST-1P में संस्कृति का अनुसरण करते हैं। (बी) (ए) में दिखाए गए भ्रूण का अधिकतम प्रक्षेपण 3 डी जेड-स्टैक, ईबी 3-डीटोमेटो अभिव्यक्ति दिखाता है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अधिग्रहित समय-चूक फिल्मों में, EB3-dTomato लेबलिंग "धूमकेतु जैसी" संरचनाओं के रूप में दिखाई देती है और बढ़ती सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स (चित्रा 4) की ट्रैकिंग को सक्षम बनाती है। पीएसटी -1 पी में अंधेरे परिस्थितियों में रखे गए भ्रूण का इलाज किया गया (चित्रा 4 ए), व्यक्तिगत ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतु ( चित्रा 4 बी में सफेद और पीले एरोहेड्स द्वारा दर्शाया गया) को इंटरफेज ब्रिज से निकलते हुए देखा जा सकता है, जो प्रारंभिक माउस भ्रूण16 (चित्रा 4 बी) में एक गैर-सेंट्रोसोमल सूक्ष्मनलिकाएं-आयोजन केंद्र के रूप में कार्य करता है। समय बिंदुओं (टी-स्टैक) का एक प्रक्षेपण ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं (चित्रा 4 बी) द्वारा यात्रा की गई समग्र संख्या और दूरी को दर्शाता है, जो इंटरफेज पुल के क्षेत्र में ईबी 3-डीटोमेटो के उच्चतम घनत्व को दर्शाता है। 405 एनएम लेजर लाइट के साथ पीएसटी -1 पी के सक्रियण के बाद, ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं को अब इंटरफेज ब्रिज के आधार पर नहीं देखा जा सकता है और टी-स्टैक (चित्रा 4 सी) में भी अनुपस्थित हैं।

Figure 4
चित्रा 4: जीवित माउस भ्रूण में PST-1P के उपकोशिकीय यूवी प्रकाश सक्रियण से पहले और बाद में EB3-dTomato धूमकेतुओं की ट्रैकिंग। (A) EB3-dTomato के लिए लेबल किए गए 16-सेल चरण माउस भ्रूण का अधिकतम प्रक्षेपण 3D z-स्टैक, 40 μM PST-1P के साथ इलाज किया जाता है और अंधेरे में रखा जाता है। (बी) चार चयनित एकल जेड-विमान और 405 एनएम लेजर रोशनी से पहले इंटरफेज ब्रिज (*द्वारा इंगित) पर एक आरओआई के संबंधित टी-स्टैक, समय के साथ ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं को दिखाते हैं। अलग-अलग धूमकेतुओं के आंदोलन को पीले और सफेद एरोहेड्स द्वारा इंगित किया जाता है, जबकि रंग-मिलान वाले डैश्ड एरोहेड्स पिछले समय बिंदुओं पर धूमकेतु की स्थिति दिखाते हैं। दिखाए गए समय सेकंड (सेकंड) में हैं। (सी) चार चयनित एकल जेड-प्लेन और इंटरफेज ब्रिज के संबंधित टी-स्टैक को 405 एनएम लेजर लाइट एक्सपोजर (एक बैंगनी बिजली बोल्ट द्वारा इंगित) के तुरंत बाद चित्रित किया गया है, जो ईबी 3-डीटोमेटो धूमकेतुओं का नुकसान दिखाता है। स्केल सलाखों: पूर्ण 3 डी भ्रूण के लिए 10 μm; एकल z-विमानों के लिए 2 μm; टी-स्टैक के लिए 1.5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक साथ लिया गया, ये परिणाम जीवित प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में पीएसटी -1 पी के आवेदन को प्रदर्शित करते हैं। पीएसटी -1 पी प्रभावी रूप से एक 405 एनएम लेजर के साथ सक्रियण के बाद सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन को रोकता है और यह निषेध सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर पर 514 एनएम लेजर प्रकाश रोशनी पर प्रतिवर्ती है।

अनुपूरक चित्रा 1: निष्क्रिय पीएसटी -1 पी में सुसंस्कृत प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए सामान्य विकास क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। (ए) अनुपचारित नियंत्रण और (बी) पीएसटी -1 पी उपचारित भ्रूण ब्लास्टोसिस्ट चरण में विकास की दर दिखाते हैं। पीएसटी -1 पी की निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए सभी भ्रूणों को पूरे विकास के दौरान अंधेरे परिस्थितियों में रखा गया था। ब्लास्टोसिस्ट चरण के विकास की दर नियंत्रण (100%, n = 13) और PST-1P उपचारित भ्रूण (91.3%, n = 23) के बीच तुलनीय थी। स्केल बार 20 μm हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: निष्क्रिय पीएसटी -1 पी में सुसंस्कृत प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण माइटोसिस के दौरान सामान्य स्पिंडल गतिशीलता का प्रदर्शन करते हैं। (ए) अनुपचारित नियंत्रण और (बी) पीएसटी -1 पी उपचारित भ्रूण 8-सेल से 16-सेल चरण में विभाजित होते हैं, जिन्हें ईबी 3-डीटोमेटो और हिस्टोन 2 बी (एच 2 बी) -जीएफपी के साथ इंजेक्ट किया जाता है। पीएसटी -1 पी की निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए सभी भ्रूणों को पूरे विकास के दौरान अंधेरे परिस्थितियों में रखा गया था। गुणसूत्रों के संरेखण को देखा जा सकता है (ए आई और बी आई), इसके बाद शुरुआती एनाफेज (ए ii और बी ii), लेट एनाफेज (ए iii और बी iii), और साइटोकिनेसिस (ए iv और बी iv) दोषों के बिना। स्केल सलाखों 3 डी छवियों में 10 μm और इनसेट में 5 μm कर रहे हैं. (सी) एनाफेज़ नियंत्रण में 8 मिनट 53 सेकंड और पीएसटी -1 पी उपचारित भ्रूण (पी-मान = 0.8241) और (डी) क्रोमोसोम टेलोफेज के दौरान 19 मिनट 38 सेकंड के औसत को नियंत्रण में और 18 मिनट 51 सेकंड पीएसटी -1 पी उपचारित भ्रूण (पी-मान = 0.2743) में एनाफेज दीक्षा के बाद 18 मिनट 51 सेकंड का औसत रहा। विश्लेषण के लिए, एन = 10 नियंत्रण में और एन = 12 पीएसटी -1 पी उपचार में। इसके अलावा, सभी कोशिकाओं को एक तुल्यकालिक तरंग में विभाजित किया जाता है, जैसा कि अपेक्षित था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क एक सेल के मौलिक आंतरिक कामकाज के लिए अभिन्न अंग है। नतीजतन, यह जीवित जीवों में सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता में हेरफेर करने में चुनौतियों को प्रस्तुत करता है, क्योंकि नेटवर्क के लिए किसी भी गड़बड़ी के सेलुलर फ़ंक्शन के सभी पहलुओं के लिए व्यापक परिणाम होते हैं। फोटोस्विचेबल सूक्ष्मनलिकाएं-लक्ष्यीकरण यौगिकों का उद्भव एक उपकोशिकीय स्तर पर साइटोस्केलेटन में ठीक से हेरफेर करने का एक तरीका प्रस्तुत करता है, जिसमें सूक्ष्मनलिकाएं विकास निषेध9 के प्रेरण और उत्क्रमण के लिए बेहतर नियंत्रण होता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन को एक उपकोशिकीय पैमाने पर प्रकाश-सक्रिय पीएसटी -1 पी द्वारा प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में बाधित किया जा सकता है, और अस्थायी रूप से सटीक तरीके से। इसके अतिरिक्त, इस निषेध को सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क के अल्पकालिक क्षोभ की जांच की अनुमति देने के लिए उलटा किया जा सकता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल लाइव प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण पर पीएसटी के आवेदन के लिए अनुकूलित किया गया है और विभिन्न अन्य संस्कृति प्रणालियों के लिए उनके उपयोग का विस्तार करने के लिए एक नींव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। PSTs के नए उपयोगकर्ताओं को समस्या निवारण की आवश्यकता वाले अपने अनुप्रयोगों में कुछ बिंदुओं का सामना करना पड़ सकता है, जिसके लिए कई समस्या-समाधान चरण प्रस्तुत किए जाते हैं।

पीएसटी की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन किया जाना चाहिए और एक कामकाजी एकाग्रता जो कोशिकाओं के लिए न्यूनतम विषाक्तता के साथ सूक्ष्मनलिकाएं विकास के मजबूत निषेध को प्राप्त करती है, का चयन किया जाना चाहिए। PSTs और अन्य photoswitches के काम की सांद्रता को अनुकूलित करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल हाल ही में पूर्व-प्रिंट11 में विस्तृत किया गया था। संक्षेप में, पीएसटी के नए उपयोगकर्ता दवा के सीरियल कमजोर पड़ने के साथ अंधेरे स्थितियों में साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन कर सकते हैं। इस सेटिंग में, EB3-dTomato धूमकेतुओं पर कोई औसत दर्जे का प्रभाव नहीं होना चाहिए और कोशिकाओं के लिए कोई विषाक्तता नहीं होनी चाहिए। यह जलाया परिस्थितियों के तहत एक गैर-साइटोटोक्सिक एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। आगे के प्रयोग के लिए, सबसे कम एकाग्रता जो EB3-dTomato धूमकेतुओं में कमी लाती है, की सिफारिश की जाती है।

किसी भी दवा उपचार के साथ, पीएसटी सेल द्वारा चयापचय किए जाने में सक्षम हैं; हालांकि, एक व्यावहारिक परिप्रेक्ष्य से, यह नगण्य होने की संभावना है जैसा कि 150 मिनट के लिए पीएसटी -1 पी में सी एलिगेंस भ्रूण के इनक्यूबेशन और बाद में प्रभावी आइसोमेराइजेशन9 द्वारा प्रदर्शित किया गया है। अत्यधिक चयापचय सक्रिय प्रणालियों के लिए, पीएसटी -1 पी की बढ़ी हुई एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है। पीएसटी भी संस्कृति माध्यम के माध्यम से फैल सकते हैं, आरओआई के भीतर सक्रिय पीएसटी के भार को कम कर सकते हैं। इसे कम करने के लिए, बार-बार फोटोएक्टिवेशन आवश्यक हो सकता है, जिसकी साइटोटॉक्सिसिटी को व्यक्तिगत सेल-प्रकार के आधार पर मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी क्योंकि कुछ सिस्टम फोटोटॉक्सिसिटी के लिए अतिसंवेदनशील हो सकते हैं। इसी तरह, सक्रिय पीएसटी प्रकाश-सक्रिय आरओआई से बाहर फैल सकते हैं और आसपास के सूक्ष्मनलिकाएं को प्रभावित कर सकते हैं। हालांकि, निष्क्रिय ट्रांस-स्टेट में वापस आराम करने की उनकी अंतर्निहित प्रवृत्ति के कारण, आसपास के क्षेत्रों पर प्रभाव नगण्य होना चाहिए।

पीएसटी के उपयोग के लिए एक और संभावित बाधा इन ऊतकों की सीमित प्रकाश पेनिट्रेबिलिटी की प्रकृति के कारण ऑर्गेनोइड्स या बड़े जीवों में उनके आवेदन से संबंधित है। गहरे कोशिकाओं के फोटोएक्टिवेशन के लिए बड़े ऊतक सुलभ नहीं हो सकते हैं। प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण एक अनूठी चुनौती प्रस्तुत करता है जिसमें यह एक बाहरी कोटिंग से घिरा हुआ है, ज़ोना पेलुसिडा, जो मीडिया में जोड़े गए दवाओं की पारगम्यता में बाधा डाल सकता है। इसे कम करने के लिए, भ्रूण इमेजिंग से पहले पीएसटी -1 पी में कम से कम 1 घंटे के लिए पूर्व-ऊष्मायन कर रहे हैं। पूरे जीव या ऑर्गेनोइड सिस्टम में पीएसटी का उपयोग करते समय दवा के प्रवेश को बढ़ाने के लिए इसी तरह के अनुकूलन दृष्टिकोण लागू हो सकते हैं, जैसे कि पीएसटी9 के सेलुलर अपटेक की सहायता के लिए एसिटोनिट्राइल के अलावा।

PSTs के हरे रंग की प्रकाश उत्क्रमणता के कारण, ये यौगिक 530 एनएम (जैसे GFP) से नीचे उत्तेजना की आवश्यकता वाले फ्लोरोफोरस की इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं। हालांकि, उपयोगकर्ता किसी भी फ्लोरोफोर के साथ फ्लोरोफोर ट्रैकिंग को लागू कर सकते हैं, जिसके लिए 530 एनएम से ऊपर उत्तेजना की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, आरएफपी, एमचेरी, या एमप्लम। यदि उपकोशिकीय संरचनाओं के डबल-लेबलिंग की आवश्यकता होती है, तो उपयोगकर्ता लाल और दूर-लाल आधारित फ्लोरोफोर को नियोजित कर सकते हैं। यदि GFP संगतता आवश्यक है, तो photoswitches, SBTubs का एक नया वर्ग, ब्याज25 का हो सकता है। इन यौगिकों को यूवी प्रकाश द्वारा भी सक्रिय किया जाता है; हालांकि, वे हरे रंग की रोशनी के लिए अनुत्तरदायी हैं, उन्हें केवल प्रसार द्वारा कार्यात्मक रूप से प्रतिवर्ती प्रदान करते हैं, लेकिन 488 एनएम या उससे अधिक की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ सभी फ्लोरोफोर के साथ भी संगत हैं। पीएसटी के साथ, जो उलटापन प्रदान करते हैं लेकिन जीएफपी की इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं, ये यौगिक उपयोगकर्ता को एक अनुकूलित दृष्टिकोण लेने और उपलब्ध फोटोस्विच को अपने शोध प्रश्न के अनुकूल बनाने के लिए लचीलापन प्रदान करते हैं।

पारंपरिक छोटे-अणु निषेध, नॉकआउट और नॉकडाउन दृष्टिकोण को सूक्ष्मनलिकाएं कार्रवाई को चिह्नित करने के लिए पूरे-सेल या पूरे-जीव तराजू पर लागू किया जा सकता है। ये दृष्टिकोण सूक्ष्मनलिकाएं पर शक्तिशाली, अभी तक व्यापक और विनाशकारी प्रभाव प्रदान करते हैं जो आसानी से प्रतिवर्ती नहीं होते हैं और अक्सर उपकोशिकीय या अस्थायी रूप से नियंत्रित तरीके से लक्षित करना मुश्किल होता है। इन सीमाओं को दरकिनार करने की एक रणनीति एक प्रकाश-अपरिवर्तनीय ऑप्टोजेनेटिक प्रणाली की आनुवंशिक इंजीनियरिंग के माध्यम से है। इन प्रणालियों के अनुप्रयोग व्यापक रूप से भिन्न होते हैं और इसमें प्रकाश-प्रेरित हेटरोडिमराइजेशन, होमोडिमराइजेशन, और प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन का पृथक्करणशामिल है। हाल ही में, एक ऑप्टोजेनेटिक रूप से नियंत्रित अंत बाइंडिंग प्रोटीन 1 (ईबी 1) निर्माण को डिज़ाइन किया गया था, जहां एक प्रकाश-अपरिवर्तनीय स्विच ने सूक्ष्मनलिकाएं प्लस एंड बाइंडिंग पार्टनर ईबी 1 के अमीनो- और कार्बोक्सिल-टर्मिनलों के विघटन को सक्षम किया। इसने प्रोटीन को उप-दूसरे प्रतिक्रिया समय के साथ कार्यात्मक रूप से निष्क्रिय कर दिया, जिससे मानव फेफड़े के कार्सिनोमा सेल लाइन27 में सूक्ष्मनलिकाएं के विकास को अवरुद्ध किया गया। इसी तरह, सेल28 में रूपात्मक परिवर्तनों पर साइटोस्केलेटल क्रॉस-लिंकिंग के प्रभाव को समझने के लिए डी मेलानोगास्टर में सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन फिलामेंट्स को क्रॉस-लिंक करने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक स्विच का उपयोग किया गया था। प्रारंभिक भ्रूण में हेरफेर करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग अनुसंधान का एक अत्यधिक सामयिक क्षेत्र है और हाल ही में कुछ प्रगतिदेखी गई है। परमाणु प्रोटीन के गलत स्थानीयकरण को प्रेरित करने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक रूप से संशोधित परमाणु निर्यात प्रणाली विकसित की गई थी। यह हानि-के-फ़ंक्शन आनुवंशिक मॉडल की नकल कर सकता है, जिसमें डी मेलानोगास्टर भ्रूण29 में सटीक विकास समय बिंदुओं पर आयोजित किए जाने वाले अतिरिक्त लचीलेपन के साथ। Optogenetic दृष्टिकोण सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के spatiotemporal नियंत्रण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं; हालांकि, वे इंजीनियर, समय लेने वाले, और महंगे के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके विपरीत, पीएसटी जटिल आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक रासायनिक विकल्प प्रदान करते हैं जो आसान उपयोग और पहुंच के अतिरिक्त लाभ के साथ समान प्रतिक्रिया समय, विशिष्टता और उत्क्रमण का दावा करता है।

सूक्ष्मनलिकाएं फिलामेंट्स को यांत्रिक रूप से बाधित करने के लिए एक और लक्षित दृष्टिकोण दो फोटॉन लेजर का उपयोग करके लेजर एब्लेशन है। यह सफलतापूर्वक preimplantation माउस भ्रूण16 में interphase पुल ablate करने के लिए लागू किया गया था। जब अच्छी तरह से लागू किया जाता है, तो उपयोगकर्ता एक उच्च भुगतान प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, इस तकनीक को निष्पादित करना चुनौतीपूर्ण है और किसी भी आसपास की संरचनाओं या कोशिकाओं के विनाश या लाइसिस से बचने के लिए उच्च स्तर की सटीकता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को इच्छित प्रभाव प्राप्त करने के लिए अपने नमूनों को बार-बार कम करने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं जल्दी से30 को फिर से विकसित कर सकती हैं। इसके विपरीत, पीएसटी सीधे सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन31 को रोकते हैं और अवांछित प्रभावों से बचते हैं जो लेजर एब्लेशन के साथ उत्पन्न हो सकते हैं, β-ट्यूबुलिन के लिए बाध्यकारी के लिए उनकी विशिष्टता के कारण। इसके अलावा, पीएसटी को पूरे जीव पर लागू किया जा सकता है, जबकि प्रकृति द्वारा लेजर एब्लेशन को केवल एक विशिष्ट क्षेत्र में लक्षित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, PSTs के आवेदन के लिए संभावनाएं व्यापक और सम्मोहक हैं। पीएसटी माइटोटिक या अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान गुणसूत्र अलगाव के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए उप-दूसरे प्रतिक्रिया समय के भीतर सूक्ष्मनलिकाएं विकास के सटीक, उपकोशिकीय निषेध की अनुमति दे सकते हैं। इंट्रासेल्युलर कार्गो की तस्करी को एंडोसोमल तस्करी, माइटोकॉन्ड्रिया के आंदोलन, या परमाणु स्थिति का अध्ययन करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क द्वारा प्रदान किए गए परिवहन के लिए मार्गों को बाधित करके बाधित किया जा सकता है। पीएसटी का उपयोग मानव मेलेनोमा सेल लाइनों32,33 से उगाए गए 3 डी बहुकोशिकीय गोलाकार में सूक्ष्मनलिकाएं विकास को सफलतापूर्वक बाधित करने के लिए भी किया गया था। अपने शानदार प्रतिक्रिया समय के साथ पीएसटी सक्रियण के लचीलेपन युग्मन शोधकर्ताओं को सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता की जांच करने और सेलुलर फ़ंक्शन में हेरफेर करने के लिए एक गतिशील उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, पीएसटी की उत्क्रमणता ऊतक या जीव के भीतर एक एकल कोशिका या चयनित कोशिकाओं पर सूक्ष्मनलिकाएं निषेध के अल्पकालिक और दीर्घकालिक परिणामों दोनों के अध्ययन के लिए उनके आवेदन को आदर्श बनाती है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी या वित्तीय हित की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकों को धन्यवाद देना चाहते हैं डॉ ओलिवर थॉर्न-Seshold और ली गाओ हमें photostatins और पांडुलिपि की तैयारी पर सलाह के साथ प्रदान करने के लिए, फिल्मांकन समर्थन के लिए मोनाश उत्पादन, और माइक्रोस्कोपी समर्थन के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग.

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान APP2002507 द्वारा J.Z. और कनाडाई उन्नत अनुसंधान संस्थान (CIFAR) Azrieli छात्रवृत्ति J.Z. के लिए द्वारा समर्थित किया गया था। ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया की राज्य सरकार और ऑस्ट्रेलियाई सरकार से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177 For mouth aspiration apparatus
Chamber slides - LabTek Thermo Fisher Scientific NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato N/A N/A Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes - 35mm Thermo Fisher Scientific 150560
Human chorionic growth hormone Sigma-Aldrich C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium Cosmo-Bio CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software Bitplane
Immersion Oil W 2010 Carl Zeiss 444969-0000-000 For use with microscope immersion objective
LED torch - Red light Celestron 93588
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Mice - wild-type FVB/N, males and females N/A N/A Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes - Kimble Sigma-Aldrich Z543306 For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer N/A N/A 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil Origio ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1340
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium Cosmo-Bio CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin Prospec Bio HOR-272
PST-1P N/A N/A Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit Sangon B511361-0100
Ultrapure water Sigma-Aldrich W1503
ZEN Black Software Carl Zeiss

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 177 प्रतिवर्ती photoswitches photostatins सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन preimplantation माउस भ्रूण लाइव इमेजिंग spatiotemporal नियंत्रण
Spatiotemporal Subcellular हेरफेर सूक्ष्मनलिकाएं साइटोस्केलेटन में जीवित प्रीइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण में फोटोस्टैटिन का उपयोग करके
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Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos,… More

Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos, G. G., Aberkane, A., Zenker, J. Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins. J. Vis. Exp. (177), e63290, doi:10.3791/63290 (2021).

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