Spatiotemporal subcellulær manipulation af mikrotubuli cytoskelet i det levende præimplantationsmusembryo ved hjælp af fotostatiner

Summary

Typiske mikrotubulihæmmere, der anvendes bredt i grundforskning og anvendt forskning, har vidtrækkende virkninger på celler. For nylig opstod fotostatiner som en klasse af fotoswitchbare mikrotubulihæmmere, der er i stand til øjeblikkelig, reversibel, spatiotemporalt præcis manipulation af mikrotubuli. Denne trinvise protokol beskriver anvendelsen af fotostatiner i et 3D-levende præimplantationsmusembryo.

Abstract

Det mikrotubuli cytoskelet danner rammen om en celle og er grundlæggende for intracellulær transport, celledeling og signaltransduktion. Traditionel farmakologisk forstyrrelse af det allestedsnærværende mikrotubuli-netværk, der f.eks. bruger nocodazol, kan have ødelæggende konsekvenser for enhver celle. Reversibelt fotoheksebare mikrotubulihæmmere har potentialet til at overvinde begrænsningerne ved at gøre det muligt at implementere lægemiddeleffekter på en spatiotemporalt kontrolleret måde. En sådan familie af lægemidler er de azobenzenbaserede fotostatiner (PST'er). Disse forbindelser er inaktive under mørke forhold, og ved belysning med UV-lys binder de sig til colchicinbindingsstedet for β-tubulin og blokerer mikrotubulipolymerisation og dynamisk omsætning. Her er anvendelsen af PST'er i det 3-dimensionelle (3D) levende præimplantationsmusembryo sat ud for at forstyrre mikrotubulinetværket på et subcellulært niveau. Denne protokol indeholder instruktioner til den eksperimentelle opsætning samt lysaktiverings- og deaktiveringsparametre for PST'er ved hjælp af levende celle konfokal mikroskopi. Dette sikrer reproducerbarhed og gør det muligt for andre at anvende denne procedure på deres forskningsspørgsmål. Innovative fotoswøkker som PST'er kan udvikle sig som kraftfulde værktøjer til at fremme forståelsen af det dynamiske intracellulære mikrotubuli netværk og til ikke-invasivt at manipulere cytoskelettet i realtid. Desuden kan PST'er vise sig nyttige i andre 3D-strukturer såsom organoider, blastoider eller embryoner af andre arter.

Introduction

Mikrotubuliarkitekturen varierer meget på tværs af forskellige celletyper for at understøtte forskellige funktioner ^1,2. Dens dynamiske karakter af vækst og krympning muliggør hurtig tilpasning til ekstra- og intracellulære signaler og til at reagere på en celles stadigt skiftende behov. Derfor kan det betragtes som det "morfologiske fingeraftryk", der spiller en nøglerolle i cellulær identitet.

Farmakologisk målretning af mikrotubuli cytoskelet ved hjælp af små molekylehæmmere har ført til en overflod af grundlæggende opdagelser inden for udviklingsbiologi, stamcellebiologi, kræftbiologi og neurobiologi 3,4,5,6,7. Selv om denne tilgang er uundværlig, frembyder den forskellige begrænsninger såsom toksicitet og virkninger uden for målgruppen. For eksempel er et af de mest anvendte mikrotubuli-målretningsmidler, nocodazol, et kraftigt mikrotubuli-depolymeriserende lægemiddel⁸. Imidlertid er småmolekylehæmmere såsom nocodazol aktive fra påføringstidspunktet, og i betragtning af mikrotubulicytoskelettets væsentlige karakter til mange kritiske cellulære funktioner kan global depolymerisering af mikrotubuli producere off-target-effekter, hvilket kan være uegnet til mange applikationer. Derudover er nocodazolbehandling irreversibel, medmindre prøver vaskes fri for lægemidlet, hvilket forhindrer kontinuerlig levende billeddannelse og dermed præcis sporing af individuelle mikrotubulifilamenter.

Udviklingen af lysaktiverede forbindelser begyndte med dannelsen af fotouncaged molekyler og har indvarslet en ny æra i målretning og overvågning af virkningerne af mikrotubuli væksthæmning på en præcis og rumligt kontrolleret måde. En familie af reversibelt fotoswitchbare lægemidler, fotostatiner (PST'er), blev udviklet ved at erstatte stilbenkomponenten i combretastatin A-4 med azobenzen⁹. PST'er er inaktive indtil belysning med UV-lys, hvorved den inaktive transkonfiguration konverteres til den aktive cis-konfiguration ved reversibel isomerisering. Cis-PST'er hæmmer mikrotubuli polymerisation ved at binde til colchicinbindingsstedet for β-tubulin, blokere dets grænseflade med β-tubulin og forhindre dimerisering, der kræves til mikrotubuli vækst¹⁰. Blandt en kohorte af PST'er er PST-1P opstået som en blyforbindelse, da den har den højeste styrke, er fuldt vandopløselig og viser en hurtig indtræden af bioaktivitet efter belysning.

Den mest effektive trans- til cis-isomerisering af PST'er forekommer ved bølgelængder mellem 360-420 nm, hvilket muliggør dobbelte muligheder for PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på et typisk konfokalmikroskop kan administreres for optimal rumlig målretning af mikrotubuli væksthæmning. Evnen til at lokalisere placeringen og timingen af PST-aktivering gennem 405 nm laserbelysning letter præcis tidsmæssig og rumlig kontrol, hvilket muliggør forstyrrelse af mikrotubulidynamikken på et subcellulært niveau inden for responstider på under et sekund⁹. Alternativt, en overkommelig LED UV-lys tillader hele organismen belysning at fremkalde organisme-bred forstyrrelse af mikrotubuli arkitektur. Dette kan være et omkostningseffektivt alternativ for forskere, for hvem den præcist timede indtræden af hæmning snarere end rumlig målretning er målet. Et andet træk ved PST'er er deres on-demand inaktivering ved at anvende grønt lys af en bølgelængde i området 510-540 nm⁹. Dette muliggør sporing af mikrotubulifilamenter før, under og efter PST-medieret væksthæmning.

PST'er, selvom de stadig er et relativt nyt design, er blevet brugt i adskillige in vitro-applikationer på tværs af forskellige forskningsområder¹¹, herunder undersøgelse af nye mekanismer for cellemigration i amøbeoider¹², i neuroner isoleret fra hjernen hos den nyfødte mus¹³ og udvikling af vingeepitel i Drosophila melanogaster¹⁴ . Andre lysreaktive lægemidler har vist sig at være værdifulde værktøjer til målrettet forstyrrelse af cellulær funktion. For eksempel blev en analog af blebbistatin, azidoblebbistatin, anvendt til forbedret myosinhæmning under belysning ^15,16. Dette fremhæver potentialet for nye opdagelser på grund af evnen til rumligt kontrolleret hæmning af cellulær funktion.

Levende 3D-organismer præsenterer fremragende, men mere sarte systemer til at manipulere mikrotubuli dynamik på et heldyrs-, enkeltcelle- eller subcellulært niveau under fysiologiske forhold. Især præimplantationsmusembryoet giver enestående indsigt i cellens indre arbejde såvel som intercellulære forhold i en organisme¹⁷. Tidsmæssigt og rumligt målrettede på hinanden følgende cyklusser af aktivering og deaktivering af PST'er bidrog til karakteriseringen af interfasebroen, en postcytokinetisk struktur mellem celler, som et ikke-centrosomalt mikrotubuliorganiserende center i præimplantationsmusembryoet¹⁶. En lignende forsøgsopstilling viste inddragelsen af voksende mikrotubuli i forseglingen af museembryoet for at muliggøre blastocystdannelse¹⁸. Desuden blev PST'er også anvendt i hele zebrafiskembryoner til at undersøge neuronal cellemigration ved at hæmme mikrotubuli vækst i en delmængde af celler i baghjernen¹⁹.

Denne protokol beskriver forsøgsopstillingen og anvendelsen af PST-1P i præimplantationsmusembryoet. Instruktionerne, der præsenteres her, kan også guide anvendelsen af PST'er til en lang række mål såsom undersøgelse af kromosomadskillelse og celledeling, handel med intracellulær last og cellemorfogenese og migration. Desuden vil sådanne undersøgelser hjælpe med implementeringen af PST'er i organoidsystemer, blastoider og andre embryomodeller såsom Caenorhabditis elegans og Xenopus laevis samt potentielt udvide brugen af PST'er til in vitro-befrugtningsteknologier .

Protocol

Eksperimenter blev godkendt af Monash Animal Ethics Committee under dyreetik nummer 19143. Dyrene blev opstaldet under specifikke patogenfrie dyrehusforhold på dyreanlægget (Monash Animal Research Platform) i nøje overensstemmelse med etiske retningslinjer.

1. Indsamling af præimplantationsmusembryo

1. Superovulate og mate mus som beskrevet tidligere^16,18, i overensstemmelse med de institutionelle dyreetiske retningslinjer.
   BEMÆRK: De mest almindeligt anvendte stammer til indsamling af levende embryoner er C57BL/6- eller FVB/N-mus. Alle data, der vises her, blev genereret ved hjælp af FVB/N-mus.
2. Om morgenen efter parring skylles zygoter fra ovidukten ved hjælp af M2-medium som beskrevet²⁰ eller Human Tubal Fluid (HTF) medium. Ved hjælp af et mundpipetteapparat som beskrevet^21,22 overføres zygoter til friske Kalium Simplex Optimizeed Medium (KSOM) dråber, der er forvarmet til 37 °C og ligestillet til 5 % CO₂, i en 35 mm kulturskål overlejret med et tilstrækkeligt volumen mineralolie til at sikre mediedækning.
3. Mikroinjektzygoter som beskrevet²⁰ med cRNA-kodning for en rød fluorescerende mærket mikrotubuli plus endemarkør. Her blev cRNA til slutbindingsproteinet 3 (EB3)-dTomato anvendt ved 30 ng/μL-koncentration efter fremstilling og oprensning som beskrevet^16,18 og fortynding i mikroinjektionsbuffer.
   BEMÆRK: Det anbefales at forberede cRNA på forhånd og opbevare det ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
4. Dyrkning af embryoner i mørke ved 37 °C og 5 % CO₂ , indtil embryoner har nået det ønskede udviklingsstadium for PST-1P-behandling.
   BEMÆRK: For en omfattende ressource af de dyrkningstider, der kræves for forskellige embryonale stadier, se²³. For embryoner med 16 celletrin, der anvendes her, dyrkning til embryonal dag 3 (E3) efter befrugtning.

2. Tilberedning af lægemiddel- og billedbehandlingsskål

BEMÆRK: I trin 2.1-2.10 skal du udelukkende arbejde under mørke eller røde lysforhold for at undgå utilsigtet PST-1P-aktivering. Aluminiumsfolie eller mørke dæksler skal bruges til alle rør og tallerkener, der indeholder PST'er.

1. Forbered en lagerkoncentration på 50 mM PST-1P i ultrarent vand.
   BEMÆRK: Molekylvægten af PST-1P er 440 g/mol. Stamopløsningen er stabil ved -20 °C i op til 1 år. PST-1P er opløseligt i vand eller vandig buffer, men opløses ikke let i DMSO.
2. Fra trin 2.1 skal du forberede en mellemliggende arbejdskoncentration på 800 μM PST-1P i ultrarent vand.
3. PST-1P fortyndes til en endelig koncentration på 40 μM i frisk KSOM. Da et typisk eksperiment kræver ca. 20 μL PST-1P-behandlet KSOM, fortyndes 1 μL af 800 μM PST-1P i 19 μL KSOM til et endeligt volumen på 20 μL for at sikre, at der på forhånd fremstilles tilstrækkeligt medium, især ved kun at bruge rødt lys til synlighed.
   BEMÆRK: Både koncentrationen og aktiveringsstatus for en PST-1P-fortynding kan kontrolleres ved at tage et UV-Vis-absorbansspektrum ved hjælp af et spektrofotometer, som skal udføres under assayetablering. Absorbansen ved 380 nm (A₃₈₀) af en fuldtrans 40 μM fortynding i en 1 cm kuvette skal være ca. 0,8. Både cis- og transformer har samme absorbans ved 455 nm (A₄₅₅). Når forholdet mellem A₃₈₀ og A₄₅₅ er ca. 9:1, er fortyndingen inaktiv (fuldt trans). Når forholdet A₃₈₀:A₄₅₅ er 1:2, aktiveres fortyndingen fuldt ud (fuldt cis). Mellemliggende forhold afspejler mellemliggende aktiveringstilstande.
4. For at forberede kammerglideren til levende billeddannelse pipette 10 μL PST-1P-behandlet KSOM ind i midten af en brønd for at danne en halvkugleformet dråbe (figur 1A).
5. Tilsæt forsigtigt tilstrækkelig mineralolie til at dække dråben, og sikre, at den ikke spreder medierne. Dette vil sikre, at dråben ikke fordamper.
6. Forvarm og CO_2-ligevægt kammerrutsjebaneskålen i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO₂ i mindst 3 timer eller højst natten over.
7. Ved afslutningen af ligevægtsperioden i trin 2.6 skal du forberede en 35 mm kulturskål med en 10 μL dråbe PST-1P-behandlet, forvarmet og ligevægtig KSOM som et vasketrin. Overlejr ikke med olie.
8. Overfør embryoner ved mundpipettering til den PST-1P-behandlede KSOM-dråbe fra trin 2.7.
   BEMÆRK: Trin 2.7 og 2.8 anbefales til mundpipettering af embryoner, men er valgfrie.
9. Overfør straks embryoner ved mundpipettering ind i midten af den PST-1P-behandlede KSOM-dråbe i billedkammerglideren fremstillet i trin 2.4-2.6 (figur 1A).
10. Inkuber embryoner ved 37 °C og 5 % CO₂ i PST-1P-behandlet KSOM i billedbehandlingskammeret glider i mindst 1 time før billeddannelse. Hvis det er muligt, skal du montere kammerglideren på mikroskopet inde i et miljøkammer ved 37 ° C og 5% CO 2 og i fuldstændigt mørke for at sikre_, at alle PST-1P'er er i den inaktive transkonfiguration, og at embryoner kan synke til bunden af fadet.

3. Live billeddannelse og PST-1P fotoaktivering

BEMÆRK: Trin 3.1-3.13 udføres på et laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med lavinefotodiodedetektorer (APD'er) og et mørkt miljøkammer. Disse instruktioner henviser specifikt til billedbehandlingsopsætningen ved hjælp af den anskaffelsessoftware, der er beskrevet i materialetabellen; de kan dog også anvendes på andre konfokale mikroskopisystemer.

1. Forbered et 63x/1,2 NA vandolienedsænkningsmål med det foreskrevne nedsænkningsmedium.
2. Brug en lommelygte med rødt lys til at styre positioneringen til at fremme målet om at komme i kontakt med nedsænkningsmediet. På dette stadium skal du undgå at bruge hvidt eller lysfeltlys til at finde embryonerne, da dette tidligt kan aktivere PST-1P.
3. Brug okularet og under rød lysbelysning til at lokalisere kanten af mediumdråben og placere målet direkte over dette sted. Dette kan hjælpe brugeren med at etablere orientering og finde fokusplanet.
4. Brug derefter et rødt bølgelængdefilter eller 561 nm laser til at lokalisere embryonerne i dråben gennem okularet eller på softwareaktiveret live-mode scanning.
5. Brug scenecontrollere og live-scanningstilstand til at indstille start- og slutpunkterne for at erhverve en z-stak af hele embryoet.
6. Juster lasereffektindstillingerne (typisk med meget følsomme detektorer som APD'erne er en 561 nm lasereffekt på mindre end 5% tilstrækkelig), digital forskydning (typisk ved -0.900) for at optimere udseendet af EB3-dTomato-kæster og minimere baggrundsstøj, pinhole ved 2 μm, pixelopløsning på 512 x 512 og pixelopvaringstid på 3,15 μs.
7. Der erhverves en z-stak af hele embryoet med 1 μm sektionsintervaller for at vurdere områder med mikrotubulivækst i hele organismen (figur 1B).
8. Brug 3D z-stack-billedet fra trin 3.7 til at identificere områder af interesse (ROI'er) til EB3-dTomato-sporingseksperimenter. Forøg zoomen til 3x, og tegn et rektangulært investeringsafkast omkring det specifikke subcellulære interesseområde.
9. Anskaf en time-lapse-film af et enkelt z-plan ved hjælp af de typiske værdier for billedparametre: 561 nm lasereffekt ved 5%, digital forskydning på -0,900, pixelopløsning på 512 x 512, pinhole ved 3 μm, pixelopboringstid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsinterval på 500 ms.
   BEMÆRK: 120 tidsrammer giver en sporingsfilm på 1 minut og bør være tilstrækkelig til dataanalyse. Erhvervelsen kan fortsætte i længere tid, forudsat at blegningen af fluoroforen er minimal (figur 1C).
10. For at aktivere PST-1P skal du skifte til en 405 nm laser og erhverve en anden time-lapse-film med 405 nm laser indstillet til 10% effekt, pixelopløsning på 512 x 512, pinhole åbnet maksimalt, pixel dvæletid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsinterval på 500 ms og i alt 20 billeder (figur 1D).
11. Skift tilbage til 561 nm laser, og gentag anskaffelsen som i trin 3.9 for at bekræfte tabet af EB3-dTomato-kæter efter aktivering af PST-1P (figur 1E). Sørg for, at denne erhvervelse finder sted så hurtigt som muligt efter aktivering.
    BEMÆRK: Trin 3.10 kan udføres gentagne gange for længere hæmning af EB3-dTomato-keter. Embryoner skal dog overvåges nøje for at undgå skader forårsaget af UV-lys.
12. For at vende PST-1P tilbage til sin inaktive transtilstand skal du aktivere en 514 nm laser ved 10% effekt. Få en time-lapse-film med 514 nm-laseren indstillet til 10 % effekt, pixelopløsning på 512 x 512, pinhole åbnet maksimalt, pixelopboringstid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsinterval på 500 ms og i alt 20 tidsrammer (figur 1F).
13. Gentag trin 3.11 for at visualisere genvinding af EB3-dTomato-keter (figur 1G).

4. Analyse af billeddata

1. Til analyse og kvantificering af hæmningen af mikrotubuli polymerisation af PST'er skal du bruge softwareprogrammer, der er tilgængelige for forskere, så de passer til deres specifikke behov. De, der anbefales til brug, vil have et sporingsværktøj, der manuelt eller automatisk kan spore bevægelsen, retningen og hastigheden af EB3-dTomato-kometer^16,18.

Figur 1: Skematisk repræsentation af PST-1P-fotoaktivering og deaktivering i det levende 3D-præimplantationsmusembryo. Alle eksperimenter udføres i fuldstændigt mørke (sort baggrund) eller kun ved rødt lysbelysning. (A) Levende præimplantationsmusembryoner, der udtrykker EB3-dTomato, dyrkes til 16-cellestadiet og overføres derefter til en dråbe KSOM indeholdende 40 μM PST-1P i et billedkammerdias. (B) Et 3D-billede af hele embryoet gør det muligt at vurdere mikrotubulivækst ved at visualisere fordelingen af EB3-dTomato-ketaler. (C) For at starte eksperimentet spores EB3-dTomato-keter i et subcellulært område ved hjælp af time-lapse-billeddannelse. (D) Efterfølgende PST-1P-fotoaktivering i samme subcellulære område ved hjælp af en 405 nm laser resulterer i tab af EB3-dTomato-keter (E). Intensiveret PST-1P-aktivering kan om nødvendigt implementeres ved sekventiel 405 nm lysbelysning. (F-G) For at vende PST-1P tilbage til sin inaktive tilstand og gendanne EB3-dTomato-keter påføres en 514 nm laser på det samme subcellulære område. Om nødvendigt kan flere runder med fotoaktivering og deaktivering udføres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

I overensstemmelse med protokollen blev præimplantationsmusembryoner mikroinjiceret med cRNA for EB3, mærket med rød fluorescerende dTomato (EB3-dTomato). Dette muliggør visualisering af voksende mikrotubuli, da EB3 binder til polymeriserende mikrotubuli plus ender²⁴.

Forsøgene blev udført 3 dage efter befrugtningen (E3), når museembryoet består af 16 celler. Ethvert andet præimplantationsudviklingsstadium kan anvendes afhængigt af det videnskabelige spørgsmål, der skal undersøges. For at demonstrere minimal fotoblegeting ved hjælp af 405 nm laserlysaktiveringsprotokollen vises et kontroleksperiment med et ubehandlet embryo (figur 2A i). Et INVESTERINGSAFKAST med slående EB3-dTomato-tæthed vælges ud fra det erhvervede 3D-billede af embryoet. I dette eksempel bruges et enkelt z-plan af en hel celle til EB3-dTomato-billeddannelse i høj opløsning. Imidlertid kan forskellige regioner af embryoet vælges efter behov (for eksempel kortikal region, perinukleær region, en mitotisk celle, en indre eller ydre celle). Et billede af EB3-dTomato-ekspression før 405 nm laserlysbelysning viser et meget tæt EB3-dTomato-signal inden for hele cytoplasmaet i cellen, undtagen det nukleare område (figur 2A ii). Der blev ikke observeret nogen ændring i EB3-dTomato-densiteten efter 405 nm laserlysbelysning (figur 2A iii og iv). Således forårsager laserlyset på 405 nm i sig selv ingen fotoskader på embryo- eller mikrotubulidynamikken.

Dernæst blev 16-cellestadieembryoner behandlet med 40 μM PST-1P 3 timer før levende billeddannelse og opbevaret i mørket. For at kunne udføre PST-eksperimenter på levende 3D-organismer er det afgørende at finde den optimale ligevægt i PST-koncentration, inkubationstid og nødvendig laserkraft for at undgå skadelige virkninger¹¹. Under strenge mørke forhold kan der påvises stærk EB3-dTomato-ekspression i 3D-billedet (figur 2B i), svarende til kontrolembryoner (figur 2A i). PST-1P fremkalder således ikke hæmning af mikrotubulipolymerisation under mørke forhold. Time-lapse-billeddannelse af et enkelt z-plan bekræftede stærk EB3-dTomato-ekspression og mikrotubulipolymerisation før 405 nm laserlysbelysning (figur 2B ii). Inden for få sekunder blev der observeret en reduktion af EB3-dTomato-signalet efter 405 nm laserlysaktivering af PST-1P (figur 2B iii). Dette tab rapporteres at vare ca. 2 til 20 minutter, før det gradvist vender tilbage på grund af termisk afslapning eller diffusion i de omkringliggende områder¹¹. Således kan en gentagen 405 nm laserlysaktivering forlænge varigheden af EB3-dTomato-tab (figur 1E-D). Det er vigtigt, at embryoner mikroinjiceret med EB3-dTomato og inkuberet med PST-1P viser normalt embryonalt potentiale, der udvikler sig til blastocyststadiet (figur 3 og supplerende figur 1) og normal mikrotubulidynamik, for eksempel under mitose (supplerende figur 2). Derfor viser inaktiv PST-1P ingen toksicitet for embryoet.

Kontrolleret PST-1P-deaktivering kan opnås ved 514 nm laserlysbelysning (figur 2B iv). Mens denne tilgang kan være nyttig til at bestemme oprindelsen af mikrotubulivækst efter PST-1P-induceret væksthæmning, udelukker den brugen af grønne fluorescerende proteiner til levende billeddannelse. Selvom det på det kraftigste anbefales at arbejde under mørke forhold, hvis PST'er utilsigtet aktiveres, muliggør grøn lysbelysning PST-tilbagevenden til en inaktiv transtilstand. Under disse omstændigheder kræves en passende restitutionsperiode for cellerne som en sikkerhedsforanstaltning for at sikre, at cellerne kan vende tilbage til deres præaktiveringstilstand. Hvis tiden tillader det, vil det ideelt set være mindst et par timer.

Figur 2: Levende billeddannelse af EB3-dTomato før og efter AKTIVERING og deaktivering af UV-lys i PST-1P i det levende museembryo. (A i) Maksimal projektion 3D z-stak af et ubehandlet kontrol 16-cellet stadium museembryo mærket til EB3-dTomato. En cytokinetisk mikrotubulibro er til stede (betegnet med grå pilespids) sammen med flere interfasebroer (betegnet med gule pilespidser). (A ii) Enkelt z-plan af en celle afbildet før 405 nm lasereksponering. (A iii-iv) Enkelt z-plan af en celle afbildet straks (A iii) og 4 min (A iv) efter 405 nm laserlyseksponering (angivet med en violet lynbolt), der ikke viser nogen ændring i EB3-dTomato-signalet. (B i) Maksimal projektion 3D z-stak af et 16-cellet stadium embryo mærket til EB3-dTomato, som behandles med 40 μM PST-1P og opbevares i mørke. Interfasebroer er angivet med gule pilespidser. (B ii) Enkelt z-plan af en celle afbildet foraktivering. (B iii) Enkelt z-plan af en celle afbildet umiddelbart efter 405 nm laserlyseksponering (angivet med en violet lynbolt), der viser en markant reduktion i EB3-dTomato-signalet. (B iv) Enkelt z-plan af en celle afbildet umiddelbart efter 514 nm laserlyseksponering (angivet med en grøn lynbolt), der viser genopretning af EB3-dTomato-signal. Kerner er angivet med den stiplede blå linje. Skalastænger: 15 μm for hele 3D-embryoner; 5 μm i indsætninger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Inaktive PST-1P-dyrkningsbetingelser tillader normal embryonal udvikling at blastocyst stadium. (A) Enkelt differentiel interferenskontrast (DIC) z-plan af et embryo ved blastocyststadium (E4.5) efter dyrkning i 40 μM PST-1P i mørket. B) Maksimal projektion 3D z-stak af embryoet vist i (A), der viser EB3-dTomato-ekspression. Skalabjælker: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

I de erhvervede time-lapse-film fremstår EB3-dTomato-mærkning som "kometlignende" strukturer og muliggør sporing af voksende mikrotubulifilamenter (figur 4). I PST-1P-behandlede embryoner, der holdes under mørke forhold (figur 4A), kan individuelle EB3-dTomato-kølser (betegnet med hvide og gule pilespidser i figur 4B) ses udstråle fra interfasebroen, der fungerer som et ikke-centrosomalt mikrotubuliorganiserende center i det tidlige museembryo¹⁶ (figur 4B). En fremskrivning af tidspunkter (t-stack) viser det samlede antal og den afstand, som EB3-dTomato-keterne tilbagelægger (figur 4B), og viser den højeste tæthed af EB3-dTomato i området af interfasebroen. Efter aktivering af PST-1P med et laserlys på 405 nm kan EB3-dTomato-keter ikke længere ses ved bunden af interfasebroen og er også fraværende i t-stakken (figur 4C).

Figur 4: Sporing af EB3-dTomato-kæster før og efter subcellulær UV-lysaktivering af PST-1P i det levende museembryo. (A) Maksimal projektion 3D z-stak af et 16-cellet stadium museembryo mærket til EB3-dTomato, behandlet med 40 μM PST-1P og opbevaret i mørke. (B) Fire udvalgte enkelte z-planer og tilsvarende t-stack af et investeringsafkast ved interfasebroen (angivet med *) før 405 nm laserbelysning, der viser EB3-dTomato-kæter over tid. Bevægelsen af de enkelte keter er angivet med de gule og hvide pilespidser, mens de farvematchede stiplede pilespidser viser kometpositioner på tidligere tidspunkter. De viste tider er i sekunder(e). (C) Fire udvalgte enkelte z-planer og tilsvarende t-stak af interfasebroen afbildet umiddelbart efter 405 nm laserlyseksponering (angivet med en violet lynbolt) viser et tab af EB3-dTomato-keter. Skalastænger: 10 μm for fuld 3D-embryo; 2 μm for enkelte z-planer; 1,5 μm til t-stack. Klik her for at se en større version af denne figur.

Samlet set viser disse resultater anvendelsen af PST-1P i det levende præimplantationsmusembryo. PST-1P hæmmer effektivt mikrotubuli polymerisation efter aktivering med en 405 nm laser, og denne hæmning er reversibel ved 514 nm laserlysbelysning på cellulært og subcellulært niveau.

Supplerende figur 1: Præimplantationsembryoner dyrket i inaktiv PST-1P viser normalt udviklingspotentiale for blastocyststadiet. A) Ubehandlede kontroller og B) PST-1P-behandlede embryoner, der viser udviklingshastighed til blastocyststadiet. Alle embryoner blev holdt under mørke forhold under hele udviklingen for at sikre inaktivitet af PST-1P. Udviklingshastigheden til blastocyststadiet var sammenlignelig mellem kontroller (100%, n = 13) og PST-1P-behandlede embryoner (91,3%, n = 23). Skalabjælker er 20 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Præimplantationsembryoner dyrket i inaktiv PST-1P viser normal spindeldynamik under mitose. (A) Ubehandlede kontroller og (B) PST-1P-behandlede embryoner, der deler sig fra 8-celle til 16-cellestadium, injiceret med EB3-dTomato og Histone 2B (H2B)-GFP. Alle embryoner blev holdt under mørke forhold under hele udviklingen for at sikre inaktivitet af PST-1P. Justering af kromosomer kan ses (A i og B i), efterfulgt af tidlig anafase (A ii og B ii), sen anafase (A iii og B iii) og cytokinese (A iv og B iv) uden defekter. Skalabjælker er 10 μm i 3D-billeder og 5 μm i insets. (C) Anafasen varede i gennemsnit 8 min 53 s i kontroller og 8 min 40 s i PST-1P-behandlede embryoner (p-værdi = 0,8241) og (D) kromosomer dekondenseret under telofase et gennemsnit på 19 min 38 s i kontroller og 18 min 51 s efter anafaseinitiering i PST-1P behandlede embryoner (p-værdi = 0,2743). Til analyse er n = 10 i kontroller og n = 12 i PST-1P-behandling. Desuden er alle celler opdelt i en synkron bølge som forventet. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Mikrotubuli-netværket er integreret i en celles grundlæggende indre arbejde. Derfor giver dette udfordringer med at manipulere mikrotubuli dynamik i levende organismer, da enhver forstyrrelse af netværket har tendens til at have udbredte konsekvenser for alle aspekter af cellulær funktion. Fremkomsten af fotoomskiftelige mikrotubuli-målrettede forbindelser præsenterer en måde at præcist manipulere cytoskelettet på et subcellulært niveau med overlegen kontrol til induktion og reversering af mikrotubuli væksthæmning⁹. Denne protokol viser, hvordan mikrotubuli polymerisation kan hæmmes i præimplantationsmusembryoet ved lysaktiveret PST-1P på en subcellulær skala og på en tidsmæssigt præcis måde. Derudover kan denne hæmning vendes for at muliggøre undersøgelse af kortvarig forstyrrelse af mikrotubulinetværket.

Den præsenterede protokol er optimeret til anvendelse af PST'er på levende præimplantationsmusembryoner og kan bruges som grundlag for at udvide deres anvendelse til forskellige andre kultursystemer. Nye brugere af PST'er kan støde på nogle punkter i deres applikationer, der kræver fejlfinding, for hvilke flere problemløsningstrin præsenteres.

PST'ers cytotoksicitet bør vurderes, og der bør vælges en arbejdskoncentration, der fremkalder stærk hæmning af mikrotubulivækst med minimal toksicitet for cellerne. En omfattende protokol til optimering af arbejdskoncentrationerne af PST'er og andre fotoswitches blev beskrevet i et nyligt fortryk¹¹. Kort sagt kan nye brugere af PST'er vurdere cytotoksicitet under mørke forhold med serielle fortyndinger af lægemidlet. I denne indstilling bør der ikke være nogen målelig effekt på EB3-dTomato-kæter og ingen toksicitet for cellerne. Dette giver et udgangspunkt for test af en ikke-cytotoksisk koncentration under oplyste forhold. Til yderligere forsøg anbefales den laveste koncentration, der fremkalder en reduktion i EB3-dTomato-keterne.

Som med enhver lægemiddelbehandling er PST'er i stand til at blive metaboliseret af cellen; Fra et praktisk perspektiv vil dette imidlertid sandsynligvis være ubetydeligt, hvilket fremgår af inkubation af C. elegans embryoner i PST-1P i 150 minutter og efterfølgende effektiv isomerisering⁹. For meget metabolisk aktive systemer kan en øget koncentration af PST-1P være påkrævet. PST'er kan også diffundere gennem kulturmediet, hvilket reducerer belastningen af aktive PST'er inden for ROI. For at afbøde dette kan gentagen fotoaktivering være nødvendig, hvis cytotoksicitet skal vurderes på grundlag af en individuel celletype, da nogle systemer kan være modtagelige for fototoksicitet. Ligeledes kan aktiverede PST'er diffundere ud af det lysaktiverede investeringsafkast og påvirke omgivende mikrotubuli. På grund af deres iboende tendens til at slappe af tilbage til den inaktive transtilstand bør effekten på de omkringliggende områder imidlertid være ubetydelig.

En anden potentiel hindring for anvendelsen af PST'er vedrører deres anvendelse i organoider eller større organismer på grund af arten af disse vævs begrænsede lysgennemtrængelighed. Større væv er muligvis ikke tilgængelige for fotoaktivering af dybere celler. Præimplantationsmusembryoet udgør en unik udfordring, idet det er omgivet af en ydre belægning, zona pellucida, som kan hindre permeabiliteten af lægemidler, der tilsættes medierne. For at afbøde dette præinkkuberes embryoner i mindst 1 time i PST-1P før billeddannelse. Lignende optimeringsmetoder kan være anvendelige til at øge penetrationen af lægemidlet, når der anvendes PST'er i hele organisme- eller organoidsystemer, såsom tilsætning af acetonitril for at hjælpe cellulær optagelse af PSTs⁹.

På grund af PST'ernes reversibilitet med grønt lys er disse forbindelser ikke kompatible med billeddannelse af fluoroforer, der kræver excitation under 530 nm (såsom GFP). Brugere kan dog implementere fluoroforsporing med enhver fluorofor, der kræver en excitation over 530 nm, for eksempel RFP, mCherry eller mPlum. Hvis dobbeltmærkning af subcellulære strukturer er påkrævet, kan brugerne anvende røde og langt røde baserede fluoroforer. Hvis GFP-kompatibilitet er afgørende, kan en ny klasse af fotoswitches, SBTubs, være af interesse²⁵. Disse forbindelser aktiveres også af UV-lys; de reagerer imidlertid ikke på grønt lys, hvilket gør dem funktionelt reversible kun ved diffusion, men også kompatible med alle fluoroforer med en excitationsbølgelængde på 488 nm eller derover. Sammen med PST'er, der tilbyder reversibilitet, men ikke er kompatible med billeddannelse af GFP, giver disse forbindelser brugeren øget fleksibilitet til at tage en tilpasset tilgang og tilpasse de tilgængelige fotoswitches til deres forskningsspørgsmål.

Konventionelle småmolekylehæmnings-, knockout- og knockdown-tilgange kan implementeres på helcelle- eller helorganismeskalaer for at karakterisere mikrotubulivirkning. Disse tilgange giver potente, men alligevel brede og destruktive virkninger på mikrotubuli, der ikke er let reversible og ofte er vanskelige at målrette mod på en subcellulær eller tidsmæssigt kontrolleret måde. En strategi til at omgå disse begrænsninger er gennem gensplejsning af et lysinducerbart optogenetisk system. Anvendelserne af disse systemer varierer meget og omfatter lysinduceret heterodimerisering, homodimerisering og dissociation af proteiner eller proteindomæner²⁶. For nylig blev en optogenetisk kontrolleret slutbindingsprotein 1 (EB1) konstruktion designet, hvor en lysinducerbar switch muliggjorde disassociation af amino- og carboxylterminalerne i mikrotubuli plus End Binding partner EB1. Dette gjorde proteinet funktionelt inaktivt med responstider på under et sekund, hvilket blokerede væksten af mikrotubuli i en human lungekarcinomcellelinje²⁷. Tilsvarende blev en optogenetisk switch brugt til at krydsbinde mikrotubuli og actinfilamenter i D. melanogaster for at forstå indflydelsen af cytoskeletal tværbinding på morfologiske ændringer i cellen²⁸. Brugen af optogenetiske værktøjer til at manipulere det tidlige embryo er et meget aktuelt forskningsområde og har set nogle nylige fremskridt¹. Et optogenetisk modificeret nukleart eksportsystem blev udviklet for at fremkalde fejllokalisering af nukleare proteiner. Dette kunne efterligne genetiske modeller for funktionstab med den ekstra fleksibilitet, der skal udføres på præcise udviklingstidspunkter i D. melanogaster embryoner²⁹. Optogenetiske tilgange er et kraftfuldt værktøj til spatiotemporal kontrol af mikrotubuli dynamik; de kan dog være vanskelige at konstruere, tidskrævende og dyre. I modsætning hertil tilbyder PST'er et kemisk alternativ til kompleks genetisk manipulation, der kan prale af lignende responstider, specificitet og reversibilitet med den ekstra fordel ved nem brug og tilgængelighed.

En anden målrettet tilgang til mekanisk forstyrrelse af mikrotubuli filamenter er laserablation ved hjælp af en to-foton laser. Dette blev anvendt med succes til at ablate interfasebroen i præimplantationsmusembryoner¹⁶. Når de implementeres godt, kan brugerne opnå en høj pay-off. Udførelsen af denne teknik er imidlertid udfordrende og kræver en høj grad af præcision for at undgå ødelæggelse eller lysis af omgivende strukturer eller cellerne selv. Desuden kan det være nødvendigt for brugerne gentagne gange at ablate deres prøver for at opnå den tilsigtede effekt, da mikrotubuli hurtigt kan vokse igen³⁰. I modsætning hertil hæmmer PST'er direkte mikrotubuli polymerisation³¹ og undgår uønskede virkninger, der kan opstå ved laserablation, på grund af deres specificitet for binding til β-tubulin. Desuden kan PST'er påføres hele organismen, mens laserablation af natur kun kan målrettes mod en bestemt region.

Ved hjælp af denne protokol er mulighederne for anvendelse af PST'er vidtrækkende og overbevisende. PST'er kan tillade præcis, subcellulær hæmning af mikrotubulivækst inden for responstider på under et sekund for at studere aspekter af kromosomsegregering under mitotisk eller meiotisk celledeling. Handel med intracellulær last kan blive forstyrret ved at hæmme de transportveje, som mikrotubulinettet stiller til rådighed for at studere endosomal handel, bevægelse af mitokondrier eller nuklear positionering. PST'er blev også brugt til med succes at hæmme mikrotubuli vækst i 3D multicellulære sfæroider dyrket fra humane melanom cellelinjer^32,33. Kobling af fleksibiliteten ved PST-aktivering med deres fremragende responstider giver forskere et dynamisk værktøj til at undersøge mikrotubuli dynamik og manipulere cellulær funktion. Derudover gør PST'ernes reversibilitet deres anvendelse ideel til undersøgelse af både kortsigtede og langsigtede konsekvenser af mikrotubulihæmning på en enkelt celle eller udvalgte celler i et væv eller en organisme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides - LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes - 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch - Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice - wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss