Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Spatiotemporal subcellulær manipulering av mikrotubulen Cytoskeleton i living preimplantasjon mus embryo ved hjelp av photostatiner

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63290
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

Summary

Typiske mikrotubulhemmere, som brukes mye i grunnleggende og anvendt forskning, har vidtrekkende effekter på celler. Nylig oppstod fotostatiner som en klasse av fotoswitchable mikrotubulehemmere, i stand til øyeblikkelig, reversibel, romlig presis manipulering av mikrotubuler. Denne trinnvise protokollen beskriver bruken av fotostatiner i et 3D live preimplantasjonsmusembryo.

Abstract

Mikrotubule cytoskeleton danner rammen av en celle og er grunnleggende for intracellulær transport, celledeling og signaltransduksjon. Tradisjonell farmakologisk forstyrrelse av det allestedsnærværende mikrotubule nettverket ved hjelp av for eksempel nokodazol kan ha ødeleggende konsekvenser for enhver celle. Reversibelt fotoswitchable mikrotubulehemmere har potensial til å overvinne begrensningene ved å gjøre det mulig å implementere legemiddeleffekter på en romlig kontrollert måte. En slik familie av narkotika er de azobenzenbaserte fotostatiner (PSTs). Disse forbindelsene er inaktive i mørke forhold, og ved belysning med UV-lys binder de seg til det kolchicinbindende stedet for β-tubulin og blokkerer mikrotubul polymerisering og dynamisk omsetning. Her er anvendelsen av PSTs i det 3-dimensjonale (3D) levende preimplantasjonsmusembryoet satt ut for å forstyrre mikrotubulenettverket på et subcellulært nivå. Denne protokollen gir instruksjoner for det eksperimentelle oppsettet, samt lysaktiverings- og deaktiveringsparametere for PST-er ved hjelp av live-celle confocal mikroskopi. Dette sikrer reproduserbarhet og gjør det mulig for andre å anvende denne prosedyren på sine forskningsspørsmål. Innovative fotoswitches som PSTs kan utvikle seg som kraftige verktøy for å fremme forståelsen av det dynamiske intracellulære mikrotubule nettverket og å ikke-invasivt manipulere cytoskjelettet i sanntid. Videre kan PSTs være nyttige i andre 3D-strukturer som organoider, blastoider eller embryoer av andre arter.

Introduction

Mikrotubularkitekturen varierer mye på tvers av forskjellige celletyper for å støtte forskjellige funksjoner 1,2. Dens dynamiske natur av vekst og krymping gir rask tilpasning til ekstra- og intracellulære signaler og for å svare på de stadig skiftende behovene til en celle. Derfor kan det betraktes som det "morfologiske fingeravtrykket" som spiller en nøkkelrolle i cellulær identitet.

Farmakologisk målretting av mikrotubul cytoskeleton ved hjelp av små molekylhemmere har ført til en mengde grunnleggende funn innen utviklingsbiologi, stamcellebiologi, kreftbiologi og nevrobiologi 3,4,5,6,7. Denne tilnærmingen, selv om den er uunnværlig, presenterer ulike begrensninger som toksisitet og off-target effekter. For eksempel er et av de mest brukte mikrotubule-målrettingsmidlene, nokodazol, et kraftig mikrotubule-depolymeriserende legemiddel8. Imidlertid er småmolekylhemmere som nokodazol aktive fra påføringstidspunktet, og gitt mikrotubulens essensielle cytoskjelett til mange kritiske cellulære funksjoner, kan global depolymerisering av mikrotubuler produsere off-target effekter, noe som kan være uegnet for mange applikasjoner. I tillegg er nokodazolbehandling irreversibel med mindre prøver vaskes fri for stoffet, forhindrer kontinuerlig levende avbildning og dermed presis sporing av individuelle mikrotubulfilamenter.

Utviklingen av lysaktiverte forbindelser begynte med opprettelsen av fotouncaged molekyler og har varslet en ny epoke i målretting og overvåking av effekten av mikrotubul veksthemming på en presis og romlig kontrollert måte. En familie av reversibelt fotowitchable stoffer, fotostatiner (PSTs), ble utviklet ved å erstatte stilbenekomponenten i combretastatin A-4 med azobenzene9. PST-er er inaktive til belysning med UV-lys, der den inaktive transkonfigurasjonen konverteres til den aktive cis-konfigurasjonen ved reversibel isomerisering. Cis-PSTs hemmer mikrotubul polymerisering ved å binde seg til kolchicinbindingsstedet til β-tubulin, blokkere grensesnittet med β-tubulin og forhindre dimerisering som kreves for mikrotubul vekst10. Blant en kohort av PSTs har PST-1P dukket opp som en blyforbindelse, da den har den høyeste styrken, er helt vannløselig og viser en rask utbrudd av bioaktivitet etter belysning.

Den mest effektive trans- til cis-isomerization av PSTs skjer ved bølgelengder mellom 360-420 nm, noe som muliggjør doble alternativer for PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på et typisk konfokalt mikroskop kan administreres for optimal romlig målretting av mikrotubul veksthemming. Evnen til å finne plasseringen og tidspunktet for PST-aktivering gjennom 405 nm laserbelysning letter presis tids- og romlig kontroll, noe som muliggjør forstyrrelse av mikrotubuldynamikk på et subcellulært nivå, innen under-sekund responstid9. Alternativt tillater et rimelig LED UV-lys hele organismebelysning for å indusere organismeomfattende forstyrrelse av mikrotubularkitekturen. Dette kan være et kostnadseffektivt alternativ for forskere som nettopp har tidsberegnet inhibering, i stedet for romlig målretting, er målet. En annen funksjon ved PSTs er deres on-demand inaktivering ved å bruke grønt lys av en bølgelengde i området 510-540 nm9. Dette muliggjør sporing av mikrotubulfilamenter før, under og etter PST-mediert veksthemming.

PSTs, mens fortsatt en relativt nylig design, har blitt brukt i mange in vitro applikasjoner på tvers av ulike forskningsfelt11, inkludert å undersøke nye mekanismer for cellemigrasjon i amoeboider12, i nevroner isolert fra hjernen til den nyfødte musen13, og wing epitel utvikling i Drosophila melanogaster14 . Andre lys-reaktive stoffer har vist seg å være verdifulle verktøy i målrettet forstyrrelse av cellulær funksjon. For eksempel ble en analog av blebbistatin, azidoblebbistatin, brukt til forbedret myosininhibering under belysning 15,16. Dette fremhever potensialet for nye funn på grunn av evnen til romlig kontrollert hemming av cellulær funksjon.

Levende 3D-organismer presenterer suverene, men mer delikate systemer for å manipulere mikrotubuldynamikk på et helt dyr, encellet eller subcellulært nivå under fysiologiske forhold. Spesielt gir preimplantasjonsmusembryoen eksepsjonell innsikt i cellens indre arbeid samt intercellulære forhold i en organisme17. Tidsmessig og romlig målrettede påfølgende sykluser av aktivering og deaktivering av PSTs bidro til karakteriseringen av den interfasebroen, en post-cytokinetisk struktur mellom celler, som et ikke-sentrosomalt mikrotubule-organiseringssenter i preimplantasjonsmusembryo16. Et lignende eksperimentelt oppsett demonstrerte involvering av voksende mikrotubuler i forseglingen av museembryoet for å tillate blastocystformasjon18. Videre ble PSTs også brukt i hele sebrafiskembryoer for å undersøke nevronal cellemigrasjon ved å hemme mikrotubulvekst i en undergruppe av celler i hindbrain19.

Denne protokollen beskriver det eksperimentelle oppsettet og bruken av PST-1P i preimplantasjonsmusembryoet. Instruksjonene som presenteres her kan også veilede anvendelsen av PSTs for et bredt spekter av mål som å studere kromosomsegregering og celledeling, smugling av intracellulær last og cellemorfogenese og migrasjon. Videre vil slike studier hjelpe implementeringen av PSTs i organoidsystemer, blastoider og andre embryomodeller som Caenorhabditis elegans og Xenopus laevis, samt potensielt utvide bruken av PSTs for in vitro befruktningsteknologier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter ble godkjent av Monash Animal Ethics Committee under animalsk etikknummer 19143. Dyr ble plassert i spesifikke patogenfrie dyrehusforhold på dyreanlegget (Monash Animal Research Platform) i henhold til etiske retningslinjer.

1. Preimplantasjon mus embryo samling

  1. Superovulate og mate mus som beskrevet tidligere 16,18, i samsvar med institusjonelle dyreetiske retningslinjer.
    MERK: De mest brukte stammene for levende embryosamling er C57BL/6- eller FVB/N-mus. Alle data som vises her, ble generert ved hjelp av FVB/N-mus.
  2. Om morgenen etter parring, skyll zygoter fra ovidukten ved hjelp av M2 medium som beskrevet20, eller Human Tubal Fluid (HTF) medium. Bruk et munnpipetteapparat som beskrevet21,22, overfør zygoter til ferske kalium Simplex Optimalisert medium (KSOM) dråper, forhåndsvarslet til 37 °C og likevekt til 5 % CO 2, i en 35 mm kulturrett med tilstrekkelig volum mineralolje for å sikre mediedekning.
  3. Mikroinjektzygoter som beskrevet20 med cRNA-koding for en rød fluorescerende merket mikrotubul pluss endemarkør. Her ble cRNA for End Binding protein 3 (EB3)-dTomato brukt ved 30 ng/μL konsentrasjon etter tilberedning og rensing som beskrevet16,18 og fortynning i mikroinjeksjonsbuffer.
    MERK: Det anbefales å klargjøre cRNA på forhånd og oppbevare den ved -20 °C til det er nødvendig.
  4. Kulturembryoer i mørket ved 37 °C og 5 % CO2 til embryoer har nådd ønsket utviklingsstadium for PST-1P-behandling.
    MERK: For en omfattende ressurs av kulturtidene som kreves for ulike embryonale stadier, se23. For 16-cellers stadium embryoer som brukes her, kultur til embryonal dag 3 (E3) etter befruktning.

2. Forberedelse av stoff- og bildebehandlingsfat

MERK: For trinn 2.1-2.10 må du arbeide utelukkende under mørke eller røde lysforhold for å unngå utilsiktet PST-1P-aktivering. Aluminiumsfolie eller mørke deksler skal brukes til alle rør og retter som inneholder PSTs.

  1. Forbered en lagerkonsentrasjon på 50 mM PST-1P i ultrarent vann.
    MERK: Molekylvekten til PST-1P er 440 g/mol. Lagerløsningen er stabil ved -20 °C i opptil 1 år. PST-1P er løselig i vann eller vandig buffer, men oppløses ikke lett i DMSO.
  2. Fra trinn 2.1, lag en mellomliggende arbeidskonsentrasjon på 800 μM PST-1P i ultrarent vann.
  3. Fortynn PST-1P til en endelig konsentrasjon på 40 μM i fersk KSOM. Som et typisk eksperiment krever ca. 20 μL PST-1P-behandlet KSOM, fortynn 1 μL 800 μM PST-1P i 19 μL KSOM for et endelig volum på 20 μL for å sikre at tilstrekkelig medium er forberedt på forhånd, og bruker bare rødt lys for synlighet.
    MERK: Både konsentrasjonen og aktiveringsstatusen til en PST-1P-fortynning kan kontrolleres ved å ta et UV-Vis-absorbansspekter ved hjelp av et spektrofotometer som bør gjøres under analyseetablering. Absorbansen ved 380 nm (A380) av en heltrans 40 μM fortynning i en 1 cm cuvette skal være ca. 0,8. Både cis- og transformer har samme absorbans ved 455 nm (A455). Når forholdet mellom A380 og A455 er ca. 9:1, er fortynning inaktiv (helt trans). Når forholdet A380:A455 er 1:2, er fortynning fullt aktivert (fullt cis). Mellomliggende forhold gjenspeiler mellomliggende aktiveringstilstander.
  4. For å klargjøre kammersklie for levende avbildning, pipette 10 μL PST-1P-behandlet KSOM i midten av en brønn for å danne et halvkuleformet dråpe (figur 1A).
  5. Tilsett forsiktig tilstrekkelig mineralolje for å dekke dråpen, og sørg for at den ikke sprer mediet. Dette vil sikre at dråpen ikke fordamper.
  6. Forvarm og CO2-likevekt kammerskålen i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i minst 3 timer eller maksimalt over natten.
  7. På slutten av likevektsperioden i trinn 2.6, lag en 35 mm kulturrett med en 10 μL dråpe PST-1P-behandlet, forhåndsvarslet og likevektet KSOM som et vasketrinn. Ikke legg over med olje.
  8. Overfør embryoer ved munnpipettering til den PST-1P-behandlede KSOM-dråpen fra trinn 2.7.
    MERK: Trinn 2.7 og 2.8 anbefales for munnpipettering av embryoer, men er valgfrie.
  9. Overfør umiddelbart embryoer ved munnpipettering til midten av den PST-1P-behandlede KSOM-dråpen i bildekammersklie fremstilt i trinn 2.4-2.6 (figur 1A).
  10. Inkuber embryoer ved 37 °C og 5 % CO2 i PST-1P-behandlet KSOM i bildekammeret i minst 1 time før avbildning. Hvis det er mulig, monter kammersklie på mikroskopet inne i et miljøkammer ved 37 °C og 5 % CO2, og i fullstendig mørke for å sikre at alle PST-1Ps er i inaktiv transkonfigurasjon og at embryoer kan synke til bunnen av parabolen.

3. Live bildebehandling og PST-1P fotoaktivering

MERK: Trinn 3.1-3.13 utføres på et laserskanningskonfokalt mikroskop utstyrt med skredfotodiodedetektorer (APDer) og et mørkt miljøkammer. Disse instruksjonene refererer spesielt til bildeoppsettet ved hjelp av anskaffelsesprogramvaren som er beskrevet i materialfortegnelsen. Imidlertid kan de også brukes på andre kondokale mikroskopisystemer.

  1. Forbered et 63x/1.2 NA vannolje nedsenkingsmål med det foreskrevne nedsenkningsmediet.
  2. Bruk en rød lyslampe til å lede posisjonering, og fremtjene målet om å kontakte nedsenkningsmediet. På dette stadiet, unngå å bruke hvitt eller brightfield lys for å finne embryoer som dette kan precociously aktivere PST-1P.
  3. Bruk okularet og under rødt lysbelysning, finn kanten av dråpen av medium og plasser målet direkte over dette stedet. Dette kan hjelpe brukeren med å etablere orientering og finne fokusplanet.
  4. Deretter bruker du et rødt bølgelengdefilter eller 561 nm laser for å finne embryoene i dråpen gjennom okularet eller på programvareaktivert live-modusskanning.
  5. Bruk scenekontrollere og live-skannemodus for å stille inn start- og sluttpunktene for å skaffe en z-stabel med hele embryoet.
  6. Juster lasereffektinnstillingene (vanligvis med svært følsomme detektorer som APDene, en 561 nm lasereffekt på mindre enn 5% er tilstrekkelig), digital offset (vanligvis ved -0,900) for å optimalisere utseendet til EB3-dTomato-kometer og minimere bakgrunnsstøy, pinhole ved 2 μm, pikseloppløsning på 512 x 512, og pikselboende tid på 3,15 μs.
  7. Skaff deg en z-stabel av hele embryoet med 1 μm seksjonsintervaller for å vurdere områder med mikrotubulvekst i hele organismen (figur 1B).
  8. Bruk 3D z-stack-bildet fra trinn 3.7 til å identifisere interesseområder (ROIer) for EB3-dTomato-sporingseksperimenter. Øk zoomen til 3x og tegn en rektangulær avkastning rundt det spesifikke subcellulære interesseområdet.
  9. Skaff deg en tidsforløpfilm av et enkelt z-plan ved hjelp av de typiske verdiene for bildeparametere: 561 nm lasereffekt ved 5%, digital offset på -0,900, pikseloppløsning på 512 x 512, pinhole ved 3 μm, pikselbotid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsintervall på 500 ms.
    MERK: 120 tidsrammer vil gi en sporingsfilm på 1 min og bør være tilstrekkelig for dataanalyse. Oppkjøpet kan fortsette lenger, forutsatt at bleking av fluoroforen er minimal (figur 1C).
  10. For å aktivere PST-1P, bytt til en 405 nm laser og skaff deg en annen intervallfilm med 405 nm laser satt til 10% strøm, pikseloppløsning på 512 x 512, pinhole åpnet maksimalt, pikselbotid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsintervall på 500 ms og totalt 20 bilder (figur 1D).
  11. Bytt tilbake til 561 nm laser og gjenta oppkjøpet som i trinn 3.9 for å bekrefte tapet av EB3-dTomato kometer etter aktivering av PST-1P (figur 1E). Forsikre deg om at dette oppkjøpet finner sted så snart som mulig etter aktivering.
    MERK: Trinn 3.10 kan utføres gjentatte ganger for lengre hemming av EB3-dTomato kometer. Embryoer må imidlertid overvåkes nøye for å unngå skade forårsaket av UV-lys.
  12. For å reversere PST-1P tilbake til sin inaktive trans-tilstand, engasjere en 514 nm laser med 10% strøm. Skaff deg en intervallfilm med 514 nm laser satt til 10 % effekt, pikseloppløsning på 512 x 512, hull åpnet maksimalt, pikselboetid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsintervall på 500 ms og totalt 20 tidsrammer (figur 1F).
  13. Gjenta trinn 3.11 for å visualisere gjenoppretting av EB3-dTomato-kometer (figur 1G).

4. Analyse av bildedata

  1. For å analysere og kvantifisere hemming av mikrotubul polymerisering av PSTs, bruk programmer som er tilgjengelige for forskere for å passe deres spesifikke behov. De som anbefales for bruk vil ha et sporingsverktøy, som manuelt eller automatisk kan spore bevegelsen, retningen og hastigheten til EB3-dTomato-kometer 16,18.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av PST-1P-fotoaktivering og deaktivering i det levende 3D-preimplantasjonsmusembryoet. Alle eksperimenter utføres i fullstendig mørke (svart bakgrunn) eller bare ved rødt lysbelysning. (A) Levende preimplantasjon mus embryoer som uttrykker EB3-dTomato dyrkes til 16-cellers stadium og deretter overføres til et dråpe KSOM som inneholder 40 μM PST-1P i et bildekammer lysbilde. (B) Et 3D-bilde av hele embryoet tillater vurdering av mikrotubul vekst ved å visualisere fordelingen av EB3-dTomato kometer. (C) For å starte eksperimentet spores EB3-dTomato-kometer i et subcellulært område ved hjelp av tidsforløpavbildning. (D) Etterfølgende PST-1P fotoaktivering i samme subcellulære region ved hjelp av en 405 nm laser resulterer i tap av EB3-dTomato kometer (E). Intensivert PST-1P-aktivering kan implementeres, om nødvendig, ved sekvensiell 405 nm lysbelysning. (F-G) For å reversere PST-1P tilbake til sin inaktive tilstand og gjenopprette EB3-dTomato-kometer, påføres en 514 nm laser på samme subcellulære region. Om nødvendig kan flere runder med fotoaktivering og deaktivering utføres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I tråd med protokollen ble preimplantasjonsmusembryoer mikroinjisert med cRNA for EB3, merket med rød fluorescerende dTomato (EB3-dTomato). Dette muliggjør visualisering av voksende mikrotubuler når EB3 binder seg til polymerisering av mikrotubul pluss ender24.

Forsøkene ble utført 3 dager etter befruktning (E3) når museembryoet består av 16 celler. Ethvert annet utviklingsstadium førimplantasjon kan brukes, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet som skal undersøkes. For å demonstrere minimal fotobleking ved hjelp av 405 nm laserlysaktiveringsprotokollen, vises et kontrolleksperiment med et ubehandlet embryo (figur 2A i). En avkastning med slående EB3-dTomato tetthet er valgt basert på det oppkjøpte 3D-bildet av embryoet. I dette eksemplet brukes et enkelt z-plan av en hel celle til EB3-dTomato høyoppløselig avbildning. Imidlertid kan forskjellige regioner i embryoet velges etter behov (for eksempel kortikale regioner, perinukære regioner, en mitotisk celle, en indre eller ytre celle). Et bilde av EB3-dTomato-uttrykk før 405 nm laserlysbelysning viser et svært tett EB3-dTomato-signal i hele cytoplasmaet i cellen, unntatt atomområdet (figur 2A ii). Det ble ikke observert noen endring i EB3-dTomato-tettheten etter 405 nm laserlysbelysning (figur 2A iii og iv). Dermed forårsaker 405 nm laserlys i seg selv ingen fotodamage til embryo- eller mikrotubuldynamikken.

Deretter ble 16-cellers stadium embryoer behandlet med 40 μM PST-1P 3 timer før levende avbildning og holdt i mørket. For å kunne utføre PST-eksperimenter på levende 3D-organismer, er det viktig å finne den optimale likevekten av PST-konsentrasjon, inkubasjonstid og nødvendig laserkraft for å unngå skadelige effekter11. Under strenge mørke forhold kan sterkt EB3-dTomato-uttrykk påvises i 3D-bildet (figur 2B i), som ligner på kontrollembryoer (figur 2A i). Dermed fremkaller PST-1P ikke hemming av mikrotubul polymerisering under mørke forhold. Tidsforløpavbildning av et enkelt z-plan bekreftet sterkt EB3-dTomato-uttrykk og mikrotubulpolymerisering før 405 nm laserlysbelysning (figur 2B ii). I løpet av sekunder ble det observert en reduksjon av EB3-dTomato-signalet etter 405 nm laserlysaktivering av PST-1P (figur 2B iii). Dette tapet rapporteres å vare ca 2 til 20 min før det gradvis reverseres på grunn av termisk avslapning eller diffusjon i omkringliggende områder11. Dermed kan en repeterende 405 nm laserlysaktivering forlenge varigheten av EB3-dTomato-tap (figur 1E-D). Viktigst, embryoer mikroinjisert med EB3-dTomato og inkubert med PST-1P viser normalt embryonalt potensial, utvikler seg til blastocyststadiet (figur 3, og supplerende figur 1), og normal mikrotubuldynamikk, for eksempel under mitose (supplerende figur 2). Derfor viser inaktiv PST-1P ingen toksisitet for embryoet.

Kontrollert PST-1P-deaktivering kan oppnås ved 514 nm laserlysbelysning (figur 2B iv). Mens denne tilnærmingen kan være nyttig for å bestemme opprinnelsen til mikrotubul vekst etter PST-1P-indusert veksthemming, utelukker den bruk av grønne fluorescerende proteiner for levende avbildning. Selv om det anbefales på det sterkeste å jobbe under mørke forhold, hvis PST-er utilsiktet aktiveres, muliggjør grønn lysbelysning PST-tilbakevending til en inaktiv transtilstand. Under dette er det nødvendig med en tilstrekkelig gjenopprettingsperiode for cellene som et forsiktighetstiltak for å sikre at cellene kan gå tilbake til føraktiveringstilstanden. Hvis tiden tillater det, vil det ideelt sett være minst noen få timer.

Figure 2
Figur 2: Levende bildebehandling av EB3-dTomato før og etter UV-lysaktivering og deaktivering av PST-1P i det levende museembryoet. (A i) Maksimal projeksjon 3D z-stabel med ubehandlet kontroll 16-cellers museembryo merket for EB3-dTomato. En cytokinetisk mikrotubulbro er til stede (betegnet med grå pilspiss) sammen med flere interfasebroer (betegnet med gule pilspisser). (A ii) Enkelt z-plan av en celle avbildet før 405 nm lasereksponering. (A iii-iv) Enkelt z-plan av en celle avbildet umiddelbart (A iii) og 4 min (A iv) etter 405 nm laserlyseksponering (indikert av et fiolett lyn), som ikke viser noen endring i EB3-dTomato-signalet. (B i) Maksimal projeksjon 3D z-stabel av et 16-cellers stadium embryo merket for EB3-dTomato, som behandles med 40 μM PST-1P og holdes i mørket. Interfasebroer er indikert med gule pilspisser. (B ii) Enkelt z-plan med én celle avbildet før aktivering. (B iii) Enkelt z-plan av en celle avbildet umiddelbart etter 405 nm laserlyseksponering (indikert med et fiolett lyn), som viser en markert reduksjon i EB3-dTomato-signalet. (B iv) Enkelt z-plan av en celle avbildet umiddelbart etter 514 nm laserlyseksponering (indikert med et grønt lyn), som viser gjenoppretting av EB3-dTomato-signal. Kjerner indikeres av den stiplede blå linjen. Skalastenger: 15 μm for hele 3D-embryoer; 5 μm i innsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Inaktive PST-1P-kulturforhold gjør det mulig for normal embryonal utvikling å sprenge scenen. (A) Enkel differensialinterferenskontrast (DIC) z-plan av et embryo i blastocyststadiet (E4.5) etter kultur i 40 μM PST-1P i mørket. (B) Maksimal projeksjon 3D z-stabel av embryoet vist i (A), som viser EB3-dTomato-uttrykk. Skalastenger: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I de oppkjøpte intervallfilmene vises EB3-dTomato-merking som "kometlignende" strukturer og muliggjør sporing av voksende mikrotubulfilamenter (figur 4). I PST-1P-behandlede embryoer holdt i mørke forhold (figur 4A), kan man se individuelle EB3-dTomato-kometer (betegnet med hvite og gule pilspisser i figur 4B) som kommer fra den interfasebroen, som fungerer som et ikke-sentrosomalt mikrotubuleorganiseringssenter i det tidlige museembryoet16 (figur 4B). En projeksjon av tidspunkter (t-stack) viser det totale antallet og avstanden som er reist av EB3-dTomato-kometer (figur 4B), som viser den høyeste tettheten av EB3-dTomato i regionen av den interfasebroen. Etter aktivering av PST-1P med et 405 nm laserlys, kan EB3-dTomato-kometer ikke lenger ses ved foten av den interfasebroen og er også fraværende i t-stabelen (figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Sporing av EB3-dTomato-kometer før og etter subcellulær UV-lysaktivering av PST-1P i det levende museembryoet. (A) Maksimal projeksjon 3D z-stabel med et 16-cellers museembryo merket for EB3-dTomato, behandlet med 40 μM PST-1P og holdt i mørket. (B) Fire utvalgte enkelt z-plan og tilsvarende t-stabel med avkastning ved den interfasebroen (indikert med *) før 405 nm laserbelysning, som viser EB3-dTomato-kometer over tid. Bevegelsen av individuelle kometer indikeres av de gule og hvite pilspissene, mens de fargetilpassede stiplede pilspissene viser kometposisjoner på tidligere tidspunkter. Klokkeslettene som vises, er i sekunder. (C) Fire utvalgte enkelt z-plan og tilsvarende t-stabel av den interfasebroen som er avbildet umiddelbart etter 405 nm laserlyseksponering (indikert av et fiolett lyn) viser tap av EB3-dTomato-kometer. Skalastenger: 10 μm for fullt 3D-embryo; 2 μm for enkle z-plan; 1,5 μm for t-stack. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Samlet viser disse resultatene anvendelsen av PST-1P i det levende preimplantasjonsmusembryoet. PST-1P hemmer effektivt mikrotubulpolymerisering etter aktivering med en 405 nm laser, og denne hemmingen er reversibel ved 514 nm laserlysbelysning på mobil- og subcellulært nivå.

Supplerende figur 1: Preimplantasjonsembryoer dyrket i inaktive PST-1P viser normalt utviklingspotensial til blastocyststadiet. (A) Ubehandlede kontroller og (B) PST-1P-behandlede embryoer som viser utviklingshastighet til blastocyststadium. Alle embryoer ble holdt i mørke forhold gjennom hele utviklingen for å sikre inaktivitet av PST-1P. Utviklingshastigheten til blastocyststadiet var sammenlignbar mellom kontroller (100%, n = 13) og PST-1P-behandlede embryoer (91,3%, n = 23). Skalastenger er 20 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Preimplantasjonsembryoer dyrket i inaktive PST-1P demonstrerer normal spindeldynamikk under mitose. (A) Ubehandlede kontroller og (B) PST-1P-behandlede embryoer som deler seg fra 8-cellers til 16-cellers stadium, injisert med EB3-dTomato og Histone 2B (H2B)-GFP. Alle embryoer ble holdt i mørke forhold gjennom hele utviklingen for å sikre inaktivitet av PST-1P. Justering av kromosomer kan sees (A i og B i), etterfulgt av tidlig anafase (A ii og B ii), sen anafase (A iii og B iii), og cytokinesis (A iv og B iv) uten feil. Skalastolper er 10 μm i 3D-bilder og 5 μm i innfelt. (C) Anafase varte i gjennomsnitt 8 min 53 s i kontroller og 8 min 40 s i PST-1P-behandlede embryoer (p-verdi = 0,8241) og (D) kromosomer de under telofase var gjennomsnittlig 19 min 38 s i kontroller og 18 min 51 s etter anfaseinitiering i PST-1P-behandlede embryoer (p-verdi = 0,2743). For analyse, n = 10 i kontroller og n = 12 i PST-1P behandling. Videre er alle celler delt inn i en synkron bølge, som forventet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrotubulenettverket er integrert i de grunnleggende indre arbeidene til en celle. Følgelig gir dette utfordringer med å manipulere mikrotubuldynamikk i levende organismer, da enhver perturbasjon til nettverket har en tendens til å ha utbredte konsekvenser for alle aspekter av cellulær funksjon. Fremveksten av fotoswitchable mikrotubule-målretting forbindelser presenterer en måte å nøyaktig manipulere cytoskeleton på et subcellulært nivå, med overlegen kontroll for induksjon og reversering av mikrotubul veksthemming9. Denne protokollen demonstrerer hvordan mikrotubul polymerisering kan hemmes i preimplantasjon mus embryo av lysaktivert PST-1P på en subcellulær skala, og på en tidsmessig presis måte. I tillegg kan denne hemmingen reverseres for å tillate undersøkelse av kortsiktig perturbasjon av mikrotubulenettverket.

Protokollen som presenteres er optimalisert for bruk av PST-er på levende preimplantasjonsmusembryoer og kan brukes som grunnlag for å utvide bruken til ulike andre kultursystemer. Nye brukere av PST-er kan støte på noen punkter i programmene sine som krever feilsøking, som flere problemløsningstrinn presenteres for.

Cytotoksisitet av PST bør vurderes og en arbeidskonsentrasjon som fremkaller sterk hemming av mikrotubul vekst med minimal toksisitet til celler bør velges. En omfattende protokoll for optimalisering av arbeidskonsentrasjonene av PSTs og andre fotobrytere ble beskrevet i en nylig forhåndsutskrift11. Kort sagt, nye brukere av PSTs kan vurdere cytotoksisitet under mørke forhold med serielle fortynninger av stoffet. I denne innstillingen bør det ikke være noen målbar effekt på EB3-dTomato kometer og ingen toksisitet for cellene. Dette gir et utgangspunkt for å teste en ikke-cytotoksisk konsentrasjon under opplyste forhold. For videre eksperimentering anbefales den laveste konsentrasjonen som fremkaller en reduksjon i EB3-dTomato kometer.

Som med enhver narkotikabehandling, er PSTs i stand til å bli metabolisert av cellen; Men fra et praktisk perspektiv vil dette sannsynligvis være ubetydelig som demonstrert ved inkubasjon av C. elegans embryoer i PST-1P i 150 min og påfølgende effektiv isomerisering9. For svært metabolsk aktive systemer kan det være nødvendig med en økt konsentrasjon av PST-1P. PST-er kan også spre seg gjennom kulturmediet, noe som reduserer belastningen på aktive PST-er i avkastningen. For å redusere dette kan gjentatt fotoaktivering være nødvendig, hvis cytotoksisitet må vurderes på individuell celletypebasis, da noen systemer kan være utsatt for fototoksisitet. På samme måte kan aktiverte PST-er spre seg ut av den lysaktiverte avkastningen og påvirke omkringliggende mikrotubuler. På grunn av deres iboende tendens til å slappe av tilbake til den inaktive transtilstanden, bør effekten på omkringliggende områder imidlertid være ubetydelig.

Et annet potensielt hinder for bruk av PSTs er relatert til deres anvendelse i organoider eller større organismer på grunn av arten av begrenset lett gjennomførbarhet av disse vevene. Større vev er kanskje ikke tilgjengelig for fotoaktivering av dypere celler. Preimplantasjon mus embryoet presenterer en unik utfordring ved at det er omgitt av et ytre belegg, zona pellucida, som kan hindre permeabiliteten av legemidler lagt til media. For å redusere dette, er embryoer forhåndsinkubert i minst 1 time i PST-1P før avbildning. Lignende optimaliseringsmetoder kan være aktuelt for å forbedre penetrasjon av stoffet ved bruk av PSTs i hele organisme- eller organoidsystemer, for eksempel tilsetning av acetonitril for å hjelpe cellulært opptak av PSTs9.

På grunn av psts grønne lys reversibilitet er disse forbindelsene ikke kompatible med avbildning av fluoroforer som krever eksitasjon under 530 nm (for eksempel GFP). Brukere kan imidlertid implementere fluoroforsporing med hvilken som helst fluorofor som krever eksitasjon over 530 nm, for eksempel RFP, mCherry eller mPlum. Hvis dobbeltmerking av subcellulære strukturer er nødvendig, kan brukerne bruke røde og fjernrøde fluoroforer. Hvis GFP-kompatibilitet er viktig, kan en ny klasse med fotobrytere, SBTubs, være av interesse25. Disse forbindelsene aktiveres også av UV-lys; Imidlertid reagerer de ikke på grønt lys, noe som gjør dem funksjonelt reversible bare ved diffusjon, men også kompatible med alle fluoroforer med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm eller over. Sammen med PSTs, som tilbyr reversibilitet, men som ikke er kompatible med bildebehandling av GFP, tilbyr disse forbindelsene brukeren økt fleksibilitet til å ta en tilpasset tilnærming og tilpasse de tilgjengelige fotowitches til deres forskningsspørsmål.

Konvensjonelle småmolekylinhiberings-, knockout- og knockdown-tilnærminger kan implementeres ved hele celle- eller hele organismeskalaer for å karakterisere mikrotubulevirkning. Disse tilnærmingene gir potente, men likevel brede og destruktive effekter på mikrotubuler som ikke er lett reversible og ofte er vanskelige å målrette på en subcellulær eller timelig kontrollert måte. En strategi for å omgå disse begrensningene er gjennom genteknologi av et lett inducible optogenetisk system. Anvendelsen av disse systemene varierer mye og inkluderer lysindusert heterodimerisering, homodimerisering og dissosiasjon av proteiner eller proteindomener26. Nylig ble en optogenetisk kontrollert endebindingsprotein 1 (EB1) konstruksjon designet, der en lys-inducible bryter aktivert disassosiasjon av amino- og karboksylterminalene til mikrotubulen pluss End Binding partner EB1. Dette gjorde proteinet funksjonelt inaktivt med responstider på under andre sekund, og blokkerte veksten av mikrotubuler i en human lungekarsinomcellelinje27. På samme måte ble en optogenetisk bryter brukt til å kryss-koble mikrotubule og aktinfilamenter i D. melanogaster for å forstå påvirkningen av cytoskeletal krysskobling på morfologiske endringer i celle28. Bruken av optogenetiske verktøy for å manipulere det tidlige embryoet er et svært aktuelt forskningsområde og har sett noen nylige fremskritt1. Et optogenetisk modifisert kjernefysisk eksportsystem ble utviklet for å indusere feillokalisering av kjerneproteiner. Dette kan etterligne tap av funksjon genetiske modeller, med den ekstra fleksibiliteten som skal utføres på presise utviklingstidspunkter i D. melanogaster embryoer29. Optogenetiske tilnærminger er et kraftig verktøy for romlig kontroll av mikrotubuldynamikk; De kan imidlertid være vanskelige å konstruere, tidkrevende og kostbare. I motsetning tilbyr PSTs et kjemisk alternativ til kompleks genetisk manipulasjon som kan skryte av lignende responstider, spesifisitet og reversibilitet med den ekstra fordelen av enkel bruk og tilgjengelighet.

En annen målrettet tilnærming til mekanisk forstyrre mikrotubule filamenter er laser ablasjon ved hjelp av en to-foton laser. Dette ble brukt med hell for å fyre opp den interfasebroen i preimplantasjonsmusembryoer16. Når de implementeres godt, kan brukerne oppnå en høy utbetaling. Imidlertid er det utfordrende å utføre denne teknikken og krever en høy grad av presisjon for å unngå ødeleggelse eller lysis av omkringliggende strukturer eller cellene selv. Videre kan det hende at brukere må lyse opp prøvene sine gjentatte ganger for å oppnå den tiltenkte effekten, da mikrotubuler kan regrow raskt30. I kontrast hemmer PSTs direkte mikrotubul polymerisering31 og unngår uønskede effekter som kan oppstå med laserablasjon, på grunn av deres spesifisitet for binding til β-tubulin. Videre kan PSTs brukes på hele organismen, mens laserablasjon av naturen bare kan målrettes mot en bestemt region.

Ved hjelp av denne protokollen er mulighetene for anvendelse av PSTs vidtrekkende og overbevisende. PSTs kan tillate presis, subcellulær hemming av mikrotubul vekst innen sub-andre responstider for å studere aspekter av kromosom segregering under mitotisk eller meiotisk celledeling. Smugling av intracellulær last kan bli forstyrret ved å hemme veiene for transport levert av mikrotubulenettverket for å studere endosomal smugling, bevegelse av mitokondrier eller kjernefysisk posisjonering. PSTs ble også brukt til å hemme mikrotubulvekst i 3D multicellulære sfæroider dyrket fra menneskelige melanomcellelinjer32,33. Kobling av fleksibiliteten til PST-aktivering med deres suverene responstider gir forskere et dynamisk verktøy for å undersøke mikrotubuldynamikk og manipulere cellulær funksjon. I tillegg gjør reversibiliteten til PSTs deres anvendelse ideell for studiet av både kortsiktige og langsiktige konsekvenser av mikrotubul hemming på en enkelt celle eller utvalgte celler i et vev eller organisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomisk interesse.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Oliver Thorn-Seshold og Li Gao for å gi oss fotostatiner og råd om manuskriptforberedelse, Monash Production for filmstøtte og Monash Micro Imaging for mikroskopistøtte.

Dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council (NHMRC) prosjektstipend APP2002507 til J.Z. og Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli Scholarship til J.Z. Australian Regenerative Medicine Institute støttes av tilskudd fra delstatsregjeringen i Victoria og den australske regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177 For mouth aspiration apparatus
Chamber slides - LabTek Thermo Fisher Scientific NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato N/A N/A Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes - 35mm Thermo Fisher Scientific 150560
Human chorionic growth hormone Sigma-Aldrich C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium Cosmo-Bio CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software Bitplane
Immersion Oil W 2010 Carl Zeiss 444969-0000-000 For use with microscope immersion objective
LED torch - Red light Celestron 93588
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Mice - wild-type FVB/N, males and females N/A N/A Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes - Kimble Sigma-Aldrich Z543306 For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer N/A N/A 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil Origio ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1340
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium Cosmo-Bio CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin Prospec Bio HOR-272
PST-1P N/A N/A Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit Sangon B511361-0100
Ultrapure water Sigma-Aldrich W1503
ZEN Black Software Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
  2. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  3. Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
  4. Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
  5. Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
  6. Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  7. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  8. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  9. Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
  10. Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
  11. Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
  12. Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
  13. Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
  14. Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
  15. Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
  16. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  17. White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
  18. Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
  19. Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
  20. Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
  22. Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
  23. Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
  24. Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
  25. Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
  26. Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
  27. van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
  28. Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
  29. Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  30. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  31. Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
  32. Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
  33. Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 177 reversible fotoswitches fotostatiner mikrotubul cytoskjelett preimplantasjon mus embryo levende bildebehandling romlig kontroll
Spatiotemporal subcellulær manipulering av mikrotubulen Cytoskeleton i living preimplantasjon mus embryo ved hjelp av photostatiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos,… More

Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos, G. G., Aberkane, A., Zenker, J. Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins. J. Vis. Exp. (177), e63290, doi:10.3791/63290 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter