Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التلاعب المكاني الزماني دون الخلوي للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة في جنين الفأر الحي قبل الزرع باستخدام الفوتوستاتينات

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63290
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

Summary

مثبطات الأنابيب الدقيقة النموذجية ، المستخدمة على نطاق واسع في البحوث الأساسية والتطبيقية ، لها تأثيرات بعيدة المدى على الخلايا. في الآونة الأخيرة ، ظهرت الفوتوستاتينات كفئة من مثبطات الأنابيب الدقيقة القابلة للتحويل الضوئي ، القادرة على التلاعب الفوري والقابل للانعكاس والدقيق مكانيا للأنابيب الدقيقة. يفصل هذا البروتوكول خطوة بخطوة تطبيق photostatins في جنين فأر 3D حي قبل الزرع.

Abstract

يشكل الهيكل الخلوي للنبيبات الدقيقة إطار الخلية وهو أساسي للنقل داخل الخلايا وانقسام الخلايا ونقل الإشارة. يمكن أن يكون للاضطراب الدوائي التقليدي لشبكة الأنابيب الدقيقة في كل مكان باستخدام ، على سبيل المثال ، نوكودازول عواقب وخيمة على أي خلية. مثبطات الأنابيب الدقيقة القابلة للتحويل الضوئي بشكل عكسي لديها القدرة على التغلب على القيود من خلال تمكين تنفيذ تأثيرات الدواء بطريقة يتم التحكم فيها مكانيا وزمنيا. واحدة من هذه العائلات من الأدوية هي الفوتوستاتينات القائمة على الآزوبنزين (PSTs). هذه المركبات غير نشطة في الظروف المظلمة ، وعند الإضاءة بضوء الأشعة فوق البنفسجية ، فإنها ترتبط بموقع ربط الكولشيسين β-tubulin وتمنع بلمرة الأنابيب الدقيقة والدوران الديناميكي. هنا ، تم تعيين تطبيق PSTs في جنين الفأر الحي ثلاثي الأبعاد (3D) قبل الزرع لتعطيل شبكة microtubule على المستوى دون الخلوي. يوفر هذا البروتوكول إرشادات للإعداد التجريبي ، بالإضافة إلى معلمات التنشيط الضوئي وإلغاء التنشيط ل PSTs باستخدام المجهر البؤري للخلية الحية. وهذا يضمن قابلية التكرار ويمكن الآخرين من تطبيق هذا الإجراء على أسئلتهم البحثية. قد تتطور مفاتيح التبديل الضوئية المبتكرة مثل PSTs كأدوات قوية لتعزيز فهم شبكة الأنابيب الدقيقة الديناميكية داخل الخلايا والتلاعب بالهيكل الخلوي بشكل غير جراحي في الوقت الفعلي. علاوة على ذلك ، قد تكون PSTs مفيدة في هياكل 3D الأخرى مثل المواد العضوية أو الأروميات أو أجنة الأنواع الأخرى.

Introduction

تختلف بنية الأنابيب الدقيقة اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة لدعم وظائف متنوعة 1,2. تسمح طبيعتها الديناميكية للنمو والانكماش بالتكيف السريع مع الإشارات خارج وداخل الخلايا والاستجابة للاحتياجات المتغيرة باستمرار للخلية. وبالتالي ، يمكن اعتبارها "بصمة مورفولوجية" تلعب دورا رئيسيا في الهوية الخلوية.

أدى الاستهداف الدوائي للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة باستخدام مثبطات الجزيئات الصغيرة إلى عدد كبير من الاكتشافات الأساسية في علم الأحياء التنموي ، وبيولوجيا الخلايا الجذعية ، وبيولوجيا السرطان ، والبيولوجيا العصبية3،4،5،6،7. وعلى الرغم من أن هذا النهج لا غنى عنه، فإنه ينطوي على قيود مختلفة مثل السمية والآثار غير المستهدفة. على سبيل المثال ، أحد أكثر عوامل استهداف الأنابيب الدقيقة استخداما على نطاق واسع ، نوكودازول ، هو دواء قوي لإزالة البلمرة من الأنابيب الدقيقة8. ومع ذلك ، فإن مثبطات الجزيئات الصغيرة مثل نوكودازول نشطة من وقت التطبيق ، وبالنظر إلى الطبيعة الأساسية للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة للعديد من الوظائف الخلوية الحرجة ، فإن إزالة البلمرة العالمية من الأنابيب الدقيقة يمكن أن تنتج تأثيرات خارج الهدف ، والتي قد تكون غير مناسبة للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن علاج نوكودازول لا رجعة فيه ما لم يتم غسل العينات الخالية من الدواء ، مما يمنع التصوير الحي المستمر ، وبالتالي التتبع الدقيق لخيوط الأنابيب الدقيقة الفردية.

بدأ تطوير المركبات المنشطة بالضوء بإنشاء جزيئات غير محبوسة ضوئيا وبشرت بعصر جديد في استهداف ومراقبة آثار تثبيط نمو الأنابيب الدقيقة بطريقة دقيقة وخاضعة للتحكم الزماني المكاني. تم تطوير عائلة واحدة من الأدوية القابلة للتحويل الضوئي بشكل عكسي ، photostatins (PSTs) ، عن طريق استبدال مكون stilbene من combretastatin A-4 ب azobenzene9. تكون PSTs غير نشطة حتى الإضاءة بضوء الأشعة فوق البنفسجية ، حيث يتحول التكوين العابر غير النشط إلى تكوين رابطة الدول المستقلة النشط عن طريق الأيزومرات القابلة للعكس. تمنع Cis-PSTs بلمرة الأنابيب الدقيقة عن طريق الارتباط بموقع ربط الكولشيسين β-توبولين ، مما يمنع واجهته مع β-tubulin ويمنع dimerization المطلوب لنمو microtubule10. من بين مجموعة من PSTs ، برز PST-1P كمركب رصاص لأنه يتمتع بأعلى فعالية ، وهو قابل للذوبان في الماء بالكامل ، ويظهر بداية سريعة للنشاط الحيوي بعد الإضاءة.

يحدث الأيزومرات الأكثر فعالية عبر إلى رابطة الدول المستقلة ل PSTs عند أطوال موجية تتراوح بين 360-420 نانومتر ، مما يتيح خيارات مزدوجة لتنشيط PST. يمكن إعطاء خط ليزر 405 نانومتر على مجهر بؤري نموذجي للاستهداف المكاني الأمثل لتثبيط نمو الأنابيب الدقيقة. إن القدرة على تحديد موقع وتوقيت تنشيط PST من خلال إضاءة ليزر 405 نانومتر تسهل التحكم الزمني والمكاني الدقيق ، مما يسمح بتعطيل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة على المستوى دون الخلوي ، ضمن أوقات الاستجابة دون الثانية9. بدلا من ذلك ، يسمح ضوء الأشعة فوق البنفسجية LED بأسعار معقولة لإضاءة الكائن الحي بالكامل بالحث على تعطيل بنية الأنابيب الدقيقة على مستوى الكائن الحي. قد يكون هذا بديلا فعالا من حيث التكلفة للباحثين الذين يكون الهدف هو بداية التثبيط في الوقت المحدد بدقة ، بدلا من الاستهداف المكاني. ميزة أخرى ل PSTs هي تعطيلها عند الطلب عن طريق تطبيق الضوء الأخضر للطول الموجي في نطاق 510-540 نانومتر9. وهذا يتيح تتبع خيوط الأنابيب الدقيقة قبل وأثناء وبعد تثبيط النمو بوساطة PST.

على الرغم من أن PSTs لا يزال تصميما حديثا نسبيا ، فقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات المخبرية عبر مجالات بحثية متنوعة11 ، بما في ذلك التحقيق في آليات جديدة لهجرة الخلايا في الأميبويدات12 ، في الخلايا العصبية المعزولة من دماغ الفأر حديث الولادة13 ، وتطوير ظهارة الجناح في ذبابة الفاكهة 14 . أثبتت الأدوية الأخرى التفاعلية الخفيفة أنها أدوات قيمة في التعطيل المستهدف للوظيفة الخلوية. على سبيل المثال ، تم استخدام تناظرية من blebbistatin ، azidoblebbistatin ، لتعزيز تثبيط الميوسين تحت الإضاءة15,16. وهذا يسلط الضوء على إمكانية اكتشافات جديدة بسبب القدرة على تثبيط الوظيفة الخلوية التي يتم التحكم فيها زمنيا ومكانيا.

تقدم الكائنات الحية 3D أنظمة رائعة ولكنها أكثر حساسية للتعامل مع ديناميكيات الأنابيب الدقيقة على مستوى حيواني كامل أو خلية واحدة أو دون خلوية في ظل ظروف فسيولوجية. على وجه الخصوص ، يقدم جنين الفأر قبل الزرع نظرة ثاقبة استثنائية في الأعمال الداخلية للخلية وكذلك العلاقات بين الخلايا داخل الكائن الحي17. ساهمت الدورات المتتالية المستهدفة زمنيا ومكانيا لتنشيط وتعطيل PSTs في توصيف الجسر بين الأطوار ، وهو بنية ما بعد الحركية الخلوية بين الخلايا ، كمركز غير مركزي لتنظيم الأنابيب الدقيقة في جنين الفأر قبل الزرع16. أظهر إعداد تجريبي مماثل مشاركة الأنابيب الدقيقة النامية في ختم جنين الفأر للسماح بتكوين الكيسة الأريمية18. علاوة على ذلك ، تم استخدام PSTs أيضا في أجنة الزرد الكاملة للتحقيق في هجرة الخلايا العصبية عن طريق تثبيط نمو الأنابيب الدقيقة في مجموعة فرعية من الخلايا في الدماغ الخلفي19.

يصف هذا البروتوكول الإعداد التجريبي واستخدام PST-1P في جنين الفأر قبل الزرع. يمكن للتعليمات المقدمة هنا أيضا توجيه تطبيق PSTs لمجموعة واسعة من الأهداف مثل دراسة فصل الكروموسومات وانقسام الخلايا ، والاتجار بالبضائع داخل الخلايا ، وتكوين الخلايا وهجرتها. وعلاوة على ذلك، ستساعد هذه الدراسات على تنفيذ PSTs في الأنظمة العضوية، والأروميات، وغيرها من نماذج الأجنة مثل Caenorhabditis elegans و Xenopus laevis، فضلا عن إمكانية توسيع استخدام PSTs لتقنيات الإخصاب في المختبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة موناش لأخلاقيات الحيوان تحت رقم أخلاقيات الحيوان 19143. تم إيواء الحيوانات في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوانات (منصة موناش لأبحاث الحيوانات) بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية.

1. جمع أجنة الفأر قبل الزرع

  1. الفئران Superovulate و mate كما هو موضح سابقا16,18 ، وفقا للمبادئ التوجيهية لأخلاقيات الحيوان المؤسسية.
    ملاحظة: السلالات الأكثر استخداما لجمع الأجنة الحية هي الفئران C57BL/6 أو FVB/N. تم إنشاء جميع البيانات المعروضة هنا باستخدام فئران FVB / N.
  2. في صباح اليوم التالي للتزاوج ، اطرد الزيجوت من قناة البيض باستخدام وسط M2 كما هو موضح20 ، أو وسط سائل البوق البشري (HTF). باستخدام جهاز ماصة الفم كما هو موضح21,22 ، قم بنقل الزيجوت إلى قطرات متوسطة محسنة من البوتاسيوم البسيط الطازج (KSOM) ، تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية وتوازنها إلى 5٪ CO2 ، في طبق استزراع 35 مم متراكب مع كمية كافية من الزيوت المعدنية لضمان التغطية الإعلامية.
  3. الزيجوت الحقن الدقيق كما هو موضح20 مع ترميز cRNA للأنابيب الدقيقة الحمراء الموسومة بالفلورسنت بالإضافة إلى علامة النهاية. هنا ، تم استخدام cRNA لبروتين ربط النهاية 3 (EB3)-dTomato بتركيز 30 نانوغرام / ميكرولتر بعد التحضير والتنقية كما هو موضح16,18 والتخفيف في المخزن المؤقت للحقن المجهري.
    ملاحظة: يوصى بإعداد cRNA في وقت مبكر وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
  4. زرع الأجنة في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى تصل الأجنة إلى مرحلة النمو المطلوبة لعلاج PST-1P.
    ملاحظة: للحصول على مورد شامل لأوقات الاستزراع المطلوبة للمراحل الجنينية المختلفة ، انظر23. بالنسبة للأجنة المكونة من 16 خلية المستخدمة هنا ، فإن الزراعة إلى اليوم الجنيني 3 (E3) بعد الإخصاب.

2. إعداد طبق المخدرات والتصوير

ملاحظة: بالنسبة للخطوات من 2.1 إلى 2.10، اعمل حصريا في ظروف الإضاءة المظلمة أو الحمراء لتجنب تنشيط PST-1P غير المقصود. يجب استخدام رقائق الألومنيوم أو الأغطية الداكنة لجميع الأنابيب والأطباق التي تحتوي على PSTs.

  1. تحضير تركيز مخزون 50 mM PST-1P في الماء فائق النقاء.
    ملاحظة: الوزن الجزيئي ل PST-1P هو 440 جم / مول. حل المخزون مستقر عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. PST-1P قابل للذوبان في الماء أو المخزن المؤقت المائي ولكنه لا يذوب بسهولة في DMSO.
  2. من الخطوة 2.1 ، قم بإعداد تركيز عمل متوسط يبلغ 800 ميكرومتر PST-1P في ماء فائق النقاء.
  3. تمييع PST-1P إلى تركيز نهائي من 40 ميكرومتر في KSOM الطازجة. نظرا لأن التجربة النموذجية تتطلب حوالي 20 ميكرولتر من PST-1P المعالجة ب KSUM ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 800 ميكرومتر PST-1P في 19 ميكرولتر من KSOM للحصول على حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر لضمان إعداد وسط كاف مقدما ، باستخدام الضوء الأحمر فقط للرؤية.
    ملاحظة: يمكن التحقق من كل من تركيز وحالة تنشيط تخفيف PST-1P عن طريق أخذ طيف امتصاص UV-Vis باستخدام مقياس الطيف الضوئي الذي ينبغي القيام به أثناء إنشاء المقايسة. يجب أن يكون الامتصاص عند 380 نانومتر (A380) لتخفيف 40 ميكرومتر كامل الترانس في كوفيت 1 سم حوالي 0.8. كل من أشكال رابطة الدول المستقلة والأشكال المتحولة لها نفس الامتصاص عند 455 نانومتر (A455). عندما تكون نسبة A380 إلى A455 حوالي 9: 1 ، يكون التخفيف غير نشط ( محول بالكامل). عندما تكون النسبة A380: A455 هي 1: 2 ، يتم تنشيط التخفيف بالكامل ( رابطة الدول المستقلة بالكامل). تعكس النسب الوسيطة حالات التنشيط الوسيطة.
  4. لإعداد شريحة الحجرة للتصوير الحي ، ماصة 10 ميكرولتر من KSOM المعالج ب PST-1P في وسط بئر واحد لتشكيل قطرة نصف كروية (الشكل 1A).
  5. أضف بلطف ما يكفي من الزيت المعدني لتغطية القطرة ، مع التأكد من أنها لا تشتت الوسائط. هذا سيضمن عدم تبخر القطرة.
  6. قم بموازنة طبق انزلاق الغرفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة لا تقل عن 3 ساعات أو على الأكثر ، بين عشية وضحاها.
  7. في نهاية فترة التوازن في الخطوة 2.6 ، قم بإعداد طبق استزراع 35 مم مع قطرة 10 ميكرولتر من PST-1P المعالج والاحترار المسبق والمتوازن KSOM كخطوة غسيل. لا تتراكب مع الزيت.
  8. انقل الأجنة عن طريق سحب الأجنة عن طريق الفم إلى قطرة KSOM المعالجة ب PST-1P من الخطوة 2.7.
    ملاحظة: يوصى بالخطوتين 2.7 و2.8 لسحب الأجنة عن طريق الفم ولكنها اختيارية.
  9. انقل الأجنة على الفور عن طريق سحب الأجنة عن طريق الفم إلى وسط قطرة KSOM المعالجة ب PST-1P في شريحة غرفة التصوير المعدة في الخطوات 2.4-2.6 (الشكل 1A).
  10. احتضن الأجنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في KSOM المعالج ب PST-1P في شريحة غرفة التصوير لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التصوير. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتركيب شريحة الغرفة على المجهر داخل غرفة بيئية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وفي ظلام دامس لضمان أن جميع PST-1Ps في التكوين غير النشط وأن الأجنة يمكن أن تغرق في قاع الطبق.

3. التصوير الحي والتنشيط الضوئي PST-1P

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات من 3.1 إلى 3.13 على مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر مزود بكاشفات الصمام الثنائي الضوئي الثلجي (APDs) وغرفة بيئية مظلمة. تشير هذه التعليمات على وجه التحديد إلى إعداد التصوير باستخدام برنامج الاقتناء الموضح في جدول المواد؛ ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيقها على أنظمة الفحص المجهري البؤري الأخرى.

  1. قم بإعداد هدف غمر الزيت المائي 63x/1.2 NA باستخدام وسط الغمر المحدد.
  2. باستخدام شعلة الضوء الأحمر لتوجيه تحديد المواقع ، تقدم الهدف للاتصال بوسط الغمر. في هذه المرحلة ، تجنب استخدام الضوء الأبيض أو الساطع للعثور على الأجنة لأن هذا يمكن أن ينشط PST-1P مبكرا.
  3. باستخدام العدسة وأثناء الإضاءة تحت الضوء الأحمر ، حدد موقع حافة قطرة الوسط ووضع الهدف مباشرة فوق هذا الموقع. هذا يمكن أن يساعد المستخدم على تحديد الاتجاه والعثور على المستوى البؤري.
  4. بعد ذلك ، من خلال العدسة أو على المسح الضوئي المباشر الذي يدعم البرنامج ، استخدم مرشح الطول الموجي الأحمر أو ليزر 561 نانومتر لتحديد موقع الأجنة داخل القطرة.
  5. استخدم وحدات التحكم في المرحلة ووضع المسح الضوئي المباشر لتعيين نقاط البداية والنهاية للحصول على مكدس z للجنين بأكمله.
  6. اضبط إعدادات طاقة الليزر (عادة ، مع أجهزة الكشف عالية الحساسية مثل APDs ، تكفي طاقة ليزر 561 نانومتر أقل من 5٪) ، والإزاحة الرقمية (عادة عند -0.900) لتحسين مظهر مذنبات EB3-dTomato وتقليل ضوضاء الخلفية ، والثقب عند 2 ميكرومتر ، ودقة البكسل 512 × 512 ، ووقت سكن البكسل 3.15 ميكروثانية.
  7. الحصول على كومة z من الجنين بأكمله مع فترات مقطع 1 ميكرومتر لتقييم مناطق نمو الأنابيب الدقيقة في الكائن الحي بأكمله (الشكل 1B).
  8. استخدم صورة z-stack ثلاثية الأبعاد من الخطوة 3.7 لتحديد مناطق الاهتمام (ROIs) لتجارب تتبع EB3-dTomato. قم بزيادة التكبير/التصغير إلى 3x وارسم عائد استثمار مستطيل حول منطقة الاهتمام دون الخلوية المحددة.
  9. احصل على فيلم بفاصل زمني لمستوى z واحد باستخدام القيم النموذجية لمعلمات التصوير: طاقة ليزر 561 نانومتر بنسبة 5٪ ، إزاحة رقمية تبلغ -0.900 ، دقة بكسل تبلغ 512 × 512 ، ثقب عند 3 ميكرومتر ، وقت سكن بكسل 3.15 ميكروثانية ، تكبير 3x ، فاصل زمني يبلغ 500 مللي ثانية.
    ملاحظة: سيوفر 120 إطارا زمنيا فيلم تتبع مدته 1 دقيقة ويجب أن يكون كافيا لتحليل البيانات. يمكن أن يستمر الاستحواذ لفترة أطول ، شريطة أن يكون تبييض الفلوروفور ضئيلا (الشكل 1C).
  10. لتنشيط PST-1P ، قم بالتبديل إلى ليزر 405 نانومتر واحصل على فيلم آخر بفاصل زمني مع ضبط ليزر 405 نانومتر على طاقة 10٪ ، ودقة بكسل تبلغ 512 × 512 ، وثقب مفتوح إلى أقصى حد ، ووقت سكن بكسل يبلغ 3.15 ميكروثانية ، وتكبير 3x ، وفاصل زمني يبلغ 500 مللي ثانية ، وما مجموعه 20 إطارا (الشكل 1D).
  11. قم بالتبديل مرة أخرى إلى ليزر 561 نانومتر وكرر الاستحواذ كما في الخطوة 3.9 لتأكيد فقدان مذنبات EB3-dTomato بعد تنشيط PST-1P (الشكل 1E). تأكد من أن هذا الاستحواذ يتم في أقرب وقت ممكن بعد التنشيط.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوة 3.10 بشكل متكرر لتثبيط أطول لمذنبات EB3-dTomato. ومع ذلك ، يجب مراقبة الأجنة بعناية لتجنب أي ضرر تسببه الأشعة فوق البنفسجية.
  12. لعكس PST-1P مرة أخرى إلى حالته العابرة غير النشطة ، قم بتشغيل ليزر 514 نانومتر بقوة 10٪. احصل على فيلم بفاصل زمني مع ضبط ليزر 514 نانومتر على طاقة 10٪ ، ودقة بكسل تبلغ 512 × 512 ، وثقب مفتوح إلى أقصى حد ، ووقت سكن بكسل يبلغ 3.15 ميكروثانية ، وتكبير/تصغير 3x ، وفاصل زمني يبلغ 500 مللي ثانية ، وما مجموعه 20 إطارا زمنيا (الشكل 1F).
  13. كرر الخطوة 3.11 لتصور استرداد مذنبات EB3-dTomato (الشكل 1G).

4. تحليل بيانات الصور

  1. لتحليل وقياس تثبيط بلمرة الأنابيب الدقيقة بواسطة PSTs ، استخدم البرامج المتاحة للباحثين لتناسب احتياجاتهم الخاصة. أولئك الموصى باستخدامهم سيمتلكون أداة تتبع ، يمكنها تتبع حركة واتجاه وسرعة مذنبات EB3-dTomato يدويا أو تلقائيا16,18.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للتنشيط الضوئي PST-1P وإلغاء التنشيط في جنين الفأر الحي ثلاثي الأبعاد قبل الزرع. يتم إجراء جميع التجارب في ظلام دامس (خلفية سوداء) أو فقط عن طريق إضاءة الضوء الأحمر. (أ) يتم استزراع أجنة الفئران الحية قبل الزرع التي تعبر عن EB3-dTomato إلى مرحلة 16 خلية ثم يتم نقلها إلى قطرة من KSOM تحتوي على 40 ميكرومتر PST-1P في شريحة غرفة تصوير. (ب) تسمح الصورة ثلاثية الأبعاد للجنين بأكمله بتقييم نمو الأنابيب الدقيقة من خلال تصور توزيع المذنبات EB3-dTomato. (ج) لبدء التجربة، يتم تتبع مذنبات EB3-dTomato في منطقة دون خلوية باستخدام التصوير بالفاصل الزمني. (د) يؤدي التنشيط الضوئي اللاحق PST-1P في نفس المنطقة دون الخلوية باستخدام ليزر 405 نانومتر إلى فقدان مذنبات EB3-dTomato (E). يمكن تنفيذ تنشيط PST-1P المكثف ، إذا لزم الأمر ، عن طريق إضاءة ضوئية متسلسلة 405 نانومتر. (F-G) لعكس PST-1P مرة أخرى إلى حالته غير النشطة واستعادة مذنبات EB3-dTomato ، يتم تطبيق ليزر 514 نانومتر على نفس المنطقة دون الخلوية. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء جولات متعددة من التنشيط الضوئي وإلغاء التنشيط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتماشيا مع البروتوكول، تم حقن أجنة الفئران قبل الزرع بالحمض النووي الريبوزي المرسال (cRNA) ل EB3، الموسومة بالطماطم الفلورية الحمراء (EB3-dTomato). وهذا يتيح تصور الأنابيب الدقيقة المتنامية حيث يرتبط EB3 ببلمرة الأنابيب الدقيقة بالإضافة إلى نهايات24.

أجريت التجارب بعد 3 أيام من الإخصاب (E3) عندما يتكون جنين الفأر من 16 خلية. يمكن استخدام أي مرحلة أخرى من مراحل النمو قبل الزرع ، اعتمادا على السؤال العلمي المراد التحقيق فيه. لإظهار الحد الأدنى من التبييض الضوئي باستخدام بروتوكول تنشيط ضوء الليزر 405 نانومتر ، تظهر تجربة تحكم مع جنين غير معالج (الشكل 2A i). يتم اختيار عائد استثمار مع كثافة EB3-dTomato المذهلة بناء على الصورة ثلاثية الأبعاد المكتسبة للجنين. في هذا المثال، يتم استخدام مستوى z واحد لخلية بأكملها للتصوير عالي الدقة EB3-dTomato. ومع ذلك ، يمكن اختيار مناطق مختلفة من الجنين حسب الحاجة (على سبيل المثال ، المنطقة القشرية ، المنطقة المحيطة بالنواة ، خلية انقسامية ، خلية داخلية أو خارجية). تظهر صورة تعبير EB3-dTomato قبل إضاءة ضوء الليزر 405 نانومتر إشارة EB3-dTomato عالية الكثافة داخل السيتوبلازم بأكمله للخلية ، باستثناء المنطقة النووية (الشكل 2A ii). ولم يلاحظ أي تغيير في كثافة الطماطم EB3-dTomato بعد إضاءة ضوء الليزر 405 نانومتر (الشكل 2A iii و iv). وبالتالي ، فإن ضوء الليزر 405 نانومتر في حد ذاته لا يسبب أي ضرر ضوئي للجنين أو ديناميكيات الأنابيب الدقيقة.

بعد ذلك ، عولجت الأجنة المكونة من 16 خلية ب 40 ميكرومتر PST-1P 3 h قبل التصوير الحي وبقيت في الظلام. لإجراء تجارب PST بنجاح على الكائنات الحية 3D ، من الأهمية بمكان العثور على التوازن الأمثل لتركيز PST ، ووقت الحضانة ، وقوة الليزر المطلوبة لتجنب الآثار الضارة11. في ظل ظروف مظلمة صارمة ، يمكن اكتشاف تعبير EB3-dTomato القوي في الصورة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2B i) ، على غرار الأجنة الضابطة (الشكل 2A i). وبالتالي ، فإن PST-1P لا يثير تثبيط بلمرة الأنابيب الدقيقة في ظل الظروف المظلمة. أكد التصوير بالفاصل الزمني لمستوى z واحد تعبيرا قويا عن EB3-dTomato وبلمرة الأنابيب الدقيقة قبل إضاءة ضوء الليزر 405 نانومتر (الشكل 2B ii). في غضون ثوان ، لوحظ انخفاض في إشارة EB3-dTomato بعد تنشيط ضوء الليزر 405 نانومتر ل PST-1P (الشكل 2B iii). وتفيد التقارير بأن هذه الخسارة تستمر حوالي 2 إلى 20 دقيقة قبل أن تعود تدريجيا بسبب الاسترخاء الحراري أو الانتشار في المناطق المحيطة11. وبالتالي ، فإن تنشيط ضوء الليزر المتكرر 405 نانومتر قد يطيل مدة فقدان EB3-dTomato (الشكل 1E-D). والأهم من ذلك، أن الأجنة المحقونة بالطماطم EB3-dTomato والمحتضنة باستخدام PST-1P تظهر إمكانات جنينية طبيعية، تتطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية (الشكل 3، والشكل التكميلي 1)، وديناميات الأنابيب الدقيقة الطبيعية، على سبيل المثال، أثناء الانقسام الخيطي (الشكل التكميلي 2). لذلك ، لا يظهر PST-1P غير النشط أي سمية للجنين.

يمكن تحقيق إلغاء تنشيط PST-1P الذي يتم التحكم فيه عن طريق إضاءة ضوء الليزر 514 نانومتر (الشكل 2B iv). في حين أن هذا النهج يمكن أن يكون مفيدا لتحديد أصل نمو الأنابيب الدقيقة بعد تثبيط النمو الناجم عن PST-1P ، فإنه يستبعد استخدام بروتينات الفلورسنت الخضراء للتصوير الحي. في حين أنه يوصى بشدة بالعمل في ظروف مظلمة ، إذا تم تنشيط PSTs عن غير قصد ، فإن إضاءة الضوء الأخضر تمكن من ارتداد PST إلى حالة عابرة غير نشطة. في هذه الحالة ، هناك حاجة إلى فترة كافية من الشفاء للخلايا كإجراء احترازي لضمان عودة الخلايا إلى حالة ما قبل التنشيط. إذا سمح الوقت ، فسيكون من الأفضل أن يكون الحد الأدنى لبضع ساعات.

Figure 2
الشكل 2: التصوير الحي للطماطم EB3-dTomato قبل وبعد تنشيط ضوء الأشعة فوق البنفسجية وإلغاء تنشيط PST-1P في جنين الفأر الحي. (A i) أقصى إسقاط ثلاثي الأبعاد z-stack لجنين فأر في مرحلة 16 خلية غير معالج يحمل علامة EB3-dTomato. يوجد جسر للأنابيب الدقيقة الحركية الخلوية (يشار إليه برأس سهم رمادي) إلى جانب جسور متعددة بين الأطوار (يشار إليها برؤوس أسهم صفراء). (أ ب) مستوى z واحد لخلية واحدة تم تصويرها قبل التعرض لليزر 405 نانومتر. (أ ثالثا إلى رابعا) مستوى z واحد لخلية واحدة تم تصويره على الفور (A iii) و 4 دقائق (A iv) بعد التعرض لضوء الليزر 405 نانومتر (يشار إليه بصاعقة البرق البنفسجية) ، مما يدل على عدم وجود تغيير في إشارة EB3-dTomato. (ب ط) الحد الأقصى للإسقاط 3D z-stack لجنين مرحلة 16 خلية المسمى ل EB3-dTomato، والذي يتم معالجته باستخدام 40 ميكرومتر PST-1P ويتم الاحتفاظ به في الظلام. يشار إلى الجسور بين الأطوار برؤوس أسهم صفراء. (ب الثاني) مستوى z واحد لخلية واحدة تم تصويره قبل التنشيط. (ب ثالثا) مستوى z واحد لخلية واحدة تم تصويره مباشرة بعد التعرض لضوء الليزر 405 نانومتر (يشار إليه بصاعقة بنفسجية) ، مما يدل على انخفاض ملحوظ في إشارة EB3-dTomato. (ب رابعا) مستوى z واحد لخلية واحدة تم تصويره مباشرة بعد التعرض لضوء الليزر 514 نانومتر (يشار إليه بصاعقة برق أخضر) ، مما يدل على استرداد إشارة EB3-dTomato. يشار إلى النوى بالخط الأزرق المتقطع. أشرطة المقياس: 15 ميكرومتر للأجنة 3D بأكملها. 5 ميكرومتر في insets. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تسمح ظروف زراعة PST-1P غير النشطة بالتطور الجنيني الطبيعي إلى مرحلة الكيسة الأريمية. (A) تباين التداخل التفاضلي الفردي (DIC) على مستوى z للجنين في مرحلة الكيسة الأريمية (E4.5) بعد الزرع في 40 ميكرومتر PST-1P في الظلام. (ب) الحد الأقصى للإسقاط ثلاثي الأبعاد z-stack للجنين الموضح في (A) ، مع إظهار تعبير EB3-dTomato. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في أفلام الفاصل الزمني المكتسبة ، تظهر علامات EB3-dTomato على أنها هياكل "تشبه المذنبات" وتمكن من تتبع خيوط الأنابيب الدقيقة المتنامية (الشكل 4). في الأجنة المعالجة PST-1P المحفوظة في ظروف مظلمة (الشكل 4A) ، يمكن رؤية مذنبات EB3-dTomato الفردية (المشار إليها برؤوس الأسهم البيضاء والصفراء في الشكل 4B) تنبعث من الجسر بين الأطوار ، والذي يعمل كمركز غير مركزي لتنظيم الأنابيب الدقيقة في جنين الفأر المبكر16 (الشكل 4B). يصور إسقاط النقاط الزمنية (t-stack) العدد الإجمالي والمسافة التي تقطعها مذنبات EB3-dTomato (الشكل 4B) ، مما يدل على أعلى كثافة ل EB3-dTomato في منطقة الجسر بين الطور. بعد تنشيط PST-1P بضوء ليزر 405 نانومتر ، لم يعد من الممكن رؤية مذنبات EB3-dTomato في قاعدة الجسر بين الأطوار وهي غائبة أيضا في مكدس t (الشكل 4C).

Figure 4
الشكل 4: تتبع مذنبات EB3-dTomato قبل وبعد تنشيط ضوء الأشعة فوق البنفسجية تحت الخلوية ل PST-1P في جنين الفأر الحي. (أ) الحد الأقصى للإسقاط ثلاثي الأبعاد z-stack لجنين فأر مكون من 16 خلية يحمل علامة EB3-dTomato، يعالج ب 40 ميكرومتر PST-1P ويبقى في الظلام. (ب) أربعة مستويات z مفردة مختارة ومكدس t المقابل لعائد استثمار عند الجسر البيني (المشار إليه ب *) قبل إضاءة الليزر 405 نانومتر، مما يدل على مذنبات EB3-dTomato بمرور الوقت. يشار إلى حركة المذنبات الفردية برؤوس الأسهم الصفراء والبيضاء بينما تظهر رؤوس الأسهم المتقطعة المتطابقة مع اللون مواقع المذنبات في النقاط الزمنية السابقة. الأوقات المعروضة هي بالثواني (الثواني). (ج) تظهر أربعة مستويات Z مفردة مختارة ومكدس t المقابل للجسر بين الأطوار الذي تم تصويره مباشرة بعد التعرض لضوء الليزر 405 نانومتر (المشار إليه بصاعقة البرق البنفسجية) فقدانا لمذنبات EB3-dTomato. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر للجنين الكامل ثلاثي الأبعاد. 2 ميكرومتر للطائرات z المفردة ؛ 1.5 ميكرومتر ل t-stack. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر هذه النتائج مجتمعة تطبيق PST-1P في جنين الفأر الحي قبل الزرع. يمنع PST-1P بشكل فعال بلمرة الأنابيب الدقيقة بعد التنشيط باستخدام ليزر 405 نانومتر ويمكن عكس هذا التثبيط عند إضاءة ضوء الليزر 514 نانومتر على المستوى الخلوي ودون الخلوي.

الشكل التكميلي 1: تظهر الأجنة قبل الزرع المستزرعة في PST-1P غير النشطة إمكانات نمو طبيعية لمرحلة الكيسة الأريمية. (أ) الضوابط غير المعالجة و (ب) الأجنة المعالجة PST-1P التي تظهر معدل التطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية. تم الاحتفاظ بجميع الأجنة في ظروف مظلمة طوال فترة التطور لضمان عدم نشاط PST-1P. كان معدل التطور إلى مرحلة الكيسة الأريمية قابلا للمقارنة بين الضوابط (100٪ ، n = 13) والأجنة المعالجة PST-1P (91.3٪ ، n = 23). أشرطة المقياس هي 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تظهر الأجنة قبل الزرع المستزرعة في PST-1P غير النشطة ديناميكيات المغزل الطبيعية أثناء الانقسام الخيطي. (أ) الضوابط غير المعالجة و (ب) الأجنة المعالجة PST-1P التي تنقسم من مرحلة 8 خلايا إلى مرحلة 16 خلية ، ويتم حقنها ب EB3-dTomato و Histone 2B (H2B)-GFP. تم الاحتفاظ بجميع الأجنة في ظروف مظلمة طوال فترة التطور لضمان عدم نشاط PST-1P. يمكن رؤية محاذاة الكروموسومات (A i و B i) ، تليها الطور المبكر (A ii و B ii) ، والطور المتأخر (A iii و B iii) ، و cytokinesis (A iv و B iv) دون عيوب. أشرطة المقياس هي 10 ميكرومتر في الصور ثلاثية الأبعاد و 5 ميكرومتر في المجموعات. (C) استمر Anaphase بمتوسط 8 دقائق و 53 ثانية في الضوابط و 8 دقائق 40 ثانية في الأجنة المعالجة PST-1P (قيمة p = 0.8241) و (D) كروموسومات غير مكثفة خلال الطور التيلوطوري بمتوسط 19 دقيقة 38 ثانية في الضوابط و 18 دقيقة 51 ثانية بعد بدء الطور في الأجنة المعالجة ب PST-1P (قيمة p = 0.2743). للتحليل ، n = 10 في الضوابط و n = 12 في علاج PST-1P. علاوة على ذلك ، تنقسم جميع الخلايا في موجة متزامنة واحدة ، كما هو متوقع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

شبكة الأنابيب الدقيقة هي جزء لا يتجزأ من الأعمال الداخلية الأساسية للخلية. وبالتالي ، فإن هذا يمثل تحديات في التلاعب بديناميكيات الأنابيب الدقيقة في الكائنات الحية ، حيث أن أي اضطراب في الشبكة يميل إلى أن يكون له عواقب واسعة النطاق على جميع جوانب الوظيفة الخلوية. يمثل ظهور مركبات استهداف الأنابيب الدقيقة القابلة للتحويل الضوئي طريقة للتعامل بدقة مع الهيكل الخلوي على مستوى دون الخلايا ، مع تحكم فائق في تحريض وعكس تثبيط نمو الأنابيب الدقيقة9. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن تثبيط بلمرة الأنابيب الدقيقة في جنين الفأر قبل الزرع بواسطة PST-1P المنشط بالضوء على نطاق دون خلوي ، وبطريقة دقيقة مؤقتا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن عكس هذا التثبيط للسماح بالتحقيق في اضطراب قصير الأجل في شبكة الأنابيب الدقيقة.

تم تحسين البروتوكول المقدم لتطبيق PSTs على أجنة الفئران الحية قبل الزرع ويمكن استخدامه كأساس لتوسيع نطاق استخدامها ليشمل مختلف أنظمة الاستزراع الأخرى. قد يواجه المستخدمون الجدد ل PSTs بعض النقاط في تطبيقاتهم التي تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والتي يتم تقديم العديد من خطوات حل المشكلات لها.

يجب تقييم السمية الخلوية ل PSTs ويجب اختيار تركيز عمل يثير تثبيطا قويا لنمو الأنابيب الدقيقة مع الحد الأدنى من السمية للخلايا. تم تفصيل بروتوكول واسع النطاق لتحسين تركيزات العمل من PSTs وغيرها من مفاتيح التبديل الضوئية في11 ما قبل الطباعة الأخيرة. باختصار ، يمكن للمستخدمين الجدد ل PSTs تقييم السمية الخلوية في الظروف المظلمة مع التخفيفات التسلسلية للدواء. في هذا الإعداد ، يجب ألا يكون هناك تأثير قابل للقياس على مذنبات EB3-dTomato ولا سمية للخلايا. وهذا يوفر نقطة انطلاق لاختبار تركيز غير سام للخلايا في ظل ظروف مضاءة. لمزيد من التجارب ، يوصى بأقل تركيز يؤدي إلى انخفاض في مذنبات EB3-dTomato.

كما هو الحال مع أي علاج دوائي ، فإن PSTs قادرة على استقلابها بواسطة الخلية. ومع ذلك ، من منظور عملي ، من المرجح أن يكون هذا ضئيلا كما يتضح من حضانة أجنة C. elegans في PST-1P لمدة 150 دقيقة والأيزومرات الفعالة اللاحقة9. بالنسبة للأنظمة النشطة استقلابيا للغاية ، قد تكون هناك حاجة إلى زيادة تركيز PST-1P. يمكن أن تنتشر PSTs أيضا من خلال وسيط الثقافة ، مما يقلل من حمل PSTs النشطة داخل عائد الاستثمار. وللتخفيف من حدة ذلك، قد يكون من الضروري تكرار التنشيط الضوئي، الذي يلزم تقييم سميته الخلوية على أساس نوع الخلية الفردية لأن بعض الأنظمة قد تكون عرضة للسمية الضوئية. وبالمثل ، قد تنتشر PSTs المنشطة خارج عائد الاستثمار المنشط بالضوء وتؤثر على الأنابيب الدقيقة المحيطة. ومع ذلك ، نظرا لميلها المتأصل إلى الاسترخاء مرة أخرى إلى الحالة العابرة غير النشطة ، يجب أن يكون التأثير على المناطق المحيطة ضئيلا.

هناك عقبة محتملة أخرى أمام استخدام PSTs تتعلق بتطبيقها في المواد العضوية أو الكائنات الحية الأكبر بسبب طبيعة الاختراق المحدود للضوء لهذه الأنسجة. قد لا يمكن الوصول إلى الأنسجة الأكبر حجما للتنشيط الضوئي للخلايا العميقة. يمثل جنين الفأر قبل الزرع تحديا فريدا من نوعه من حيث أنه محاط بطبقة خارجية ، وهي zona pellucida ، والتي يمكن أن تعيق نفاذية الأدوية المضافة إلى الوسائط. للتخفيف من هذا ، يتم احتضان الأجنة مسبقا لمدة ساعة واحدة على الأقل في PST-1P قبل التصوير. قد تكون أساليب التحسين المماثلة قابلة للتطبيق لتعزيز تغلغل الدواء عند استخدام PSTs في الكائنات الحية الكاملة أو الأنظمة العضوية ، مثل إضافة الأسيتونيتريل للمساعدة في امتصاص الخلايا من PSTs9.

نظرا لانعكاس الضوء الأخضر ل PSTs ، فإن هذه المركبات غير متوافقة مع تصوير الفلوروفورات التي تتطلب إثارة أقل من 530 نانومتر (مثل GFP). ومع ذلك ، يمكن للمستخدمين تنفيذ تتبع الفلوروفور مع أي فلوروفور يتطلب إثارة أعلى من 530 نانومتر ، على سبيل المثال ، RFP أو mCherry أو mPlum. إذا كانت هناك حاجة إلى وضع علامات مزدوجة على الهياكل دون الخلوية ، فيمكن للمستخدمين استخدام الفلوروفورات الحمراء والحمراء البعيدة. إذا كان توافق GFP ضروريا ، فقد تكون فئة جديدة من مفاتيح التبديل الضوئية ، SBTubs ، ذات أهمية25. يتم تنشيط هذه المركبات أيضا بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك ، فهي لا تستجيب للضوء الأخضر ، مما يجعلها قابلة للانعكاس وظيفيا فقط عن طريق الانتشار ، ولكنها متوافقة أيضا مع جميع الفلوروفورات ذات الطول الموجي للإثارة البالغ 488 نانومتر أو أعلى. جنبا إلى جنب مع PSTs ، التي توفر إمكانية الانعكاس ولكنها غير متوافقة مع تصوير GFP ، توفر هذه المركبات للمستخدم مرونة متزايدة لاتخاذ نهج مخصص وتكييف مفاتيح التبديل الضوئية المتاحة مع سؤالهم البحثي.

يمكن تنفيذ النهج التقليدية لتثبيط الجزيئات الصغيرة والضربة القاضية والضربة القاضية على نطاقات الخلية الكاملة أو الكائنات الحية بأكملها لتوصيف عمل الأنابيب الدقيقة. توفر هذه الأساليب تأثيرات قوية وواسعة النطاق ومدمرة على الأنابيب الدقيقة التي لا يمكن عكسها بسهولة وغالبا ما يصعب استهدافها بطريقة دون خلوية أو يتم التحكم فيها مؤقتا. تتمثل إحدى الاستراتيجيات للتحايل على هذه القيود في الهندسة الوراثية لنظام بصري وراثي مستحث للضوء. تختلف تطبيقات هذه الأنظمة على نطاق واسع وتشمل التباين الناجم عن الضوء ، والتجانس ، وتفكك البروتينات أو مجالات البروتين26. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم بنية بروتين ربط نهاية 1 (EB1) يتم التحكم فيها بصريا ، حيث مكن مفتاح قابل للحث الضوئي من فصل أطراف الأمينو والكربوكسيل للنبيب الدقيق بالإضافة إلى شريك الربط النهائي EB1. هذا جعل البروتين غير نشط وظيفيا مع أوقات استجابة دون الثانية ، مما منع نمو الأنابيب الدقيقة في خط خلية سرطان الرئة البشرية27. وبالمثل ، تم استخدام مفتاح بصري وراثي لربط خيوط الأنابيب الدقيقة والأكتين في D. melanogaster لفهم تأثير الربط المتقاطع الخلوي الهيكلي على التغيرات المورفولوجية في الخلية28. يعد استخدام الأدوات البصرية الجينية للتلاعب بالجنين المبكر مجالا بحثيا موضعيا للغاية وقد شهد بعض التطورات الحديثة1. وأنشئ نظام تصدير نووي معدل بصريا للحث على سوء توطين البروتينات النووية. هذا يمكن أن يحاكي النماذج الجينية لفقدان الوظيفة ، مع المرونة الإضافية التي يجب إجراؤها في نقاط زمنية دقيقة للنمو في أجنة D. melanogaster 29. النهج البصرية الجينية هي أداة قوية للتحكم الزماني المكاني في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب هندستها ، وتستغرق وقتا طويلا ، ومكلفة. في المقابل ، توفر PSTs بديلا كيميائيا للتلاعب الجيني المعقد الذي يتميز بأوقات استجابة مماثلة وخصوصية وقابلية للانعكاس مع ميزة إضافية تتمثل في سهولة الاستخدام وإمكانية الوصول.

نهج آخر مستهدف لتعطيل خيوط الأنابيب الدقيقة ميكانيكيا هو الاستئصال بالليزر باستخدام ليزر ثنائي الفوتون. تم تطبيق هذا بنجاح لاستئصال الجسر بين الأطوار في أجنة الفئران قبل الزرع16. عند تنفيذها بشكل جيد ، يمكن للمستخدمين تحقيق مردود مرتفع. ومع ذلك ، فإن تنفيذ هذه التقنية يمثل تحديا ويتطلب درجة عالية من الدقة لتجنب تدمير أو تحلل أي هياكل محيطة أو الخلايا نفسها. علاوة على ذلك ، قد يحتاج المستخدمون إلى حذف عيناتهم بشكل متكرر لتحقيق التأثير المقصود ، حيث يمكن أن تنمو الأنابيب الدقيقة بسرعة30. في المقابل ، تمنع PSTs مباشرة بلمرة الأنابيب الدقيقة31 وتتجنب الآثار غير المرغوب فيها التي قد تنشأ مع الاستئصال بالليزر ، نظرا لخصوصيتها للارتباط β-tubulin. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق PSTs على الكائن الحي بأكمله ، في حين أن الاستئصال بالليزر بطبيعته لا يمكن استهدافه إلا إلى منطقة معينة.

باستخدام هذا البروتوكول ، فإن إمكانيات تطبيق PSTs واسعة النطاق ومقنعة. يمكن أن تسمح PSTs بالتثبيط الدقيق تحت الخلوي لنمو الأنابيب الدقيقة خلال أوقات الاستجابة دون الثانية لدراسة جوانب فصل الكروموسومات أثناء انقسام الخلايا الانقسامية أو الانقسامية. ويمكن تعطيل الاتجار بالبضائع داخل الخلايا عن طريق تثبيط مسارات النقل التي توفرها شبكة الأنابيب الدقيقة لدراسة الاتجار بالغدد الصماء، أو حركة الميتوكوندريا، أو تحديد المواقع النووية. كما تم استخدام PSTs لمنع نمو الأنابيب الدقيقة بنجاح في الكرويات متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد المزروعة من خطوط خلايا سرطان الجلد البشري32,33. إن الجمع بين مرونة تنشيط PST وأوقات الاستجابة الرائعة يوفر للباحثين أداة ديناميكية للتحقيق في ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ومعالجة الوظيفة الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن انعكاس PSTs يجعل تطبيقها مثاليا لدراسة كل من العواقب قصيرة الأجل وطويلة الأجل لتثبيط microtubule على خلية واحدة أو خلايا مختارة داخل النسيج أو الكائن الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصلحة منافسة أو مالية.

Acknowledgments

يود المؤلفان أن يشكرا الدكتور أوليفر ثورن سيهولد ولي غاو على تزويدنا بالصور المخفضة للكوليستروتنات والمشورة بشأن إعداد المخطوطات ، وموناش للإنتاج لدعم التصوير ، وموناش مايكرو إيميتش لدعم الفحص المجهري.

تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) APP2002507 إلى J.Z. ومنحة Azrieli الدراسية للمعهد الكندي للبحوث المتقدمة (CIFAR) إلى J.Z. يتم دعم المعهد الأسترالي للطب التجديدي من خلال منح من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube Sigma-Aldrich A5177 For mouth aspiration apparatus
Chamber slides - LabTek Thermo Fisher Scientific NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato N/A N/A Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes - 35mm Thermo Fisher Scientific 150560
Human chorionic growth hormone Sigma-Aldrich C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium Cosmo-Bio CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software Bitplane
Immersion Oil W 2010 Carl Zeiss 444969-0000-000 For use with microscope immersion objective
LED torch - Red light Celestron 93588
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Mice - wild-type FVB/N, males and females N/A N/A Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes - Kimble Sigma-Aldrich Z543306 For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer N/A N/A 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil Origio ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1340
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium Cosmo-Bio CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin Prospec Bio HOR-272
PST-1P N/A N/A Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit Sangon B511361-0100
Ultrapure water Sigma-Aldrich W1503
ZEN Black Software Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
  2. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  3. Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
  4. Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
  5. Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
  6. Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  7. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  8. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  9. Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
  10. Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
  11. Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
  12. Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
  13. Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
  14. Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
  15. Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
  16. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  17. White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
  18. Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
  19. Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
  20. Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
  22. Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
  23. Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
  24. Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
  25. Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
  26. Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
  27. van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
  28. Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
  29. Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  30. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  31. Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
  32. Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
  33. Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 177 ، مفاتيح ضوئية قابلة للانعكاس ، فوتوستينات ، نبيب دقيق ، هيكل خلوي ، جنين فأر ما قبل الزرع ، تصوير حي ، تحكم مكاني زماني
التلاعب المكاني الزماني دون الخلوي للهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة في جنين الفأر الحي قبل الزرع باستخدام الفوتوستاتينات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos,… More

Greaney, J., Hawdon, A., Stathatos, G. G., Aberkane, A., Zenker, J. Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins. J. Vis. Exp. (177), e63290, doi:10.3791/63290 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter