Les inhibiteurs typiques des microtubules, largement utilisés dans la recherche fondamentale et appliquée, ont des effets de grande portée sur les cellules. Récemment, les photostatines sont apparues comme une classe d’inhibiteurs de microtubules photoscommutables, capables de manipulation instantanée, réversible et spatio-temporelle précise des microtubules. Ce protocole étape par étape détaille l’application de photostatines dans un embryon de souris préimplantatoire vivant en 3D.
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Article de méthode
Manipulation subcellulaire spatio-temporelle du cytosquelette de microtubules dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant à l’aide de photostatines
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cytosquelette des microtubules forme le cadre d’une cellule et est fondamental pour le transport intracellulaire, la division cellulaire et la transduction du signal. La perturbation pharmacologique traditionnelle du réseau de microtubules omniprésents en utilisant, par exemple, le nocodazole peut avoir des conséquences dévastatrices pour n’importe quelle cellule. Les inhibiteurs de microtubules photocommutables de manière réversible ont le potentiel de surmonter les limites en permettant aux effets des médicaments d’être mis en œuvre de manière spatio-temporelle contrôlée. L’une de ces familles de médicaments est la photostatine à base d’azobenzène (PST). Ces composés sont inactifs dans des conditions sombres et, lors de l’éclairage par la lumière UV, ils se lient au site de liaison à la colchicine de la β-tubuline et bloquent la polymérisation des microtubules et le renouvellement dynamique. Ici, l’application de PST dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant en 3 dimensions (3D) vise à perturber le réseau de microtubules au niveau subcellulaire. Ce protocole fournit des instructions pour la configuration expérimentale, ainsi que des paramètres d’activation et de désactivation de la lumière pour les PST utilisant la microscopie confocale à cellules vivantes. Cela garantit la reproductibilité et permet à d’autres d’appliquer cette procédure à leurs questions de recherche. Des photocommutateurs innovants comme les PST peuvent évoluer en tant qu’outils puissants pour faire progresser la compréhension du réseau dynamique de microtubules intracellulaires et pour manipuler le cytosquelette de manière non invasive en temps réel. En outre, les PST peuvent s’avérer utiles dans d’autres structures 3D telles que les organoïdes, les blastoïdes ou les embryons d’autres espèces.
Introduction
L’architecture des microtubules varie considérablement selon les différents types de cellules pour prendre en charge diverses fonctions 1,2. Sa nature dynamique de croissance et de rétrécissement permet une adaptation rapide aux signaux extra- et intracellulaires et de répondre aux besoins en constante évolution d’une cellule. Par conséquent, il peut être considéré comme « l’empreinte morphologique » jouant un rôle clé dans l’identité cellulaire.
Le ciblage pharmacologique du cytosquelette des microtubules à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules a conduit à une pléthore de décou....
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Protocole
Les expériences ont été approuvées par le Monash Animal Ethics Committee sous le numéro d’éthique animale 19143. Les animaux ont été logés dans des conditions spécifiques de maison d’animaux exempts d’agents pathogènes à l’animalerie (Monash Animal Research Platform) dans le strict respect des directives éthiques.
1. Collecte d’embryons de souris préimplantatoires
- Superovulez et accouplez les souris comme décrit précédemment16,18, conformément aux directives institutionnelles en matière d’éthique animale.
REMARQUE: Les souches les plus couramment utilis....
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Résultats
Conformément au protocole, des embryons de souris préimplantatoires ont été microinjectés avec de l’ARNc pour EB3, marqués avec du dTomato fluorescent rouge (EB3-dTomato). Cela permet de visualiser les microtubules en croissance lorsque EB3 se lie au microtubule polymérisant plus se termine24.
Les expériences ont été réalisées 3 jours après la fécondation (E3) lorsque l’embryon de souris est composé de 16 cellules. Tout autre stade de développement préimplantatoire peut.......
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Discussion
Le réseau de microtubules fait partie intégrante du fonctionnement interne fondamental d’une cellule. Par conséquent, cela présente des défis dans la manipulation de la dynamique des microtubules dans les organismes vivants, car toute perturbation du réseau a tendance à avoir des conséquences généralisées pour tous les aspects de la fonction cellulaire. L’émergence de composés de ciblage de microtubules photocommutables présente un moyen de manipuler avec précision le cytosquelette au niveau subcellulaire, avec un contrô.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent ou financier.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Oliver Thorn-Seshold et Li Gao de nous avoir fourni des photostatines et des conseils sur la préparation des manuscrits, Monash Production pour le soutien au tournage et Monash Micro Imaging pour le soutien à la microscopie.
Ce travail a été soutenu par la subvention de projet APP2002507 du Conseil national de la santé et de recherches médicales (CRSM) à J.Z. et la bourse Azrieli de l’Institut canadien de recherches avancées (ICRA) à J.Z. L’Australian Regenerative Medicine Institute est soutenu par des subventions du gouvernement de l’État de Victoria et du gouvernement australien.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube aspirateur | Sigma-Aldrich | A5177 | Pour appareil d’aspiration buccale |
| Lames de chambre - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| codage de l’ARNc pour EB3-dTomato | N/A | N/A | Préparé selon les instructions du fabricant à l’aide de mMessage in vitro Kit |
| de transcription Boîtes de culture - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Hormone de croissance chorionique humaine | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Fluide tubaire humain (HTF) moyen | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Logiciel d’analyse d’images Imaris | Bitplane | ||
| W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | À utiliser avec l’objectif d’immersion du microscope |
| Torche LED - Lumière rouge | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Souris - type sauvage FVB/N, mâles et femelles | N/A | N/A | Femelles âgées de 8 à 9 semaines. Mâles de 2 à 6 mois. |
| Pipettes microcapillaires - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | Pour appareil d’aspiration buccale |
| Tampon de micro-injection | N/ | A N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4 |
| Huile minérale | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Kit de transcription | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotomètre | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Sérum de jument gestante gonadotrophine | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Inhibiteurs photocommutables de la dynamique des microtubules contrôlent optiquement la mitose et la mort cellulaire. Cell. 162 (2), 403-411, doi :10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| Kit de purification d’ARN | Sangon | B511361-0100 | |
| Eau ultrapure | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Noir Logiciel | Carl Zeiss |
Références
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. ....
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Réimpressions et autorisations
