Manipulation subcellulaire spatio-temporelle du cytosquelette de microtubules dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant à l’aide de photostatines

Summary

Les inhibiteurs typiques des microtubules, largement utilisés dans la recherche fondamentale et appliquée, ont des effets de grande portée sur les cellules. Récemment, les photostatines sont apparues comme une classe d’inhibiteurs de microtubules photoscommutables, capables de manipulation instantanée, réversible et spatio-temporelle précise des microtubules. Ce protocole étape par étape détaille l’application de photostatines dans un embryon de souris préimplantatoire vivant en 3D.

Abstract

Le cytosquelette des microtubules forme le cadre d’une cellule et est fondamental pour le transport intracellulaire, la division cellulaire et la transduction du signal. La perturbation pharmacologique traditionnelle du réseau de microtubules omniprésents en utilisant, par exemple, le nocodazole peut avoir des conséquences dévastatrices pour n’importe quelle cellule. Les inhibiteurs de microtubules photocommutables de manière réversible ont le potentiel de surmonter les limites en permettant aux effets des médicaments d’être mis en œuvre de manière spatio-temporelle contrôlée. L’une de ces familles de médicaments est la photostatine à base d’azobenzène (PST). Ces composés sont inactifs dans des conditions sombres et, lors de l’éclairage par la lumière UV, ils se lient au site de liaison à la colchicine de la β-tubuline et bloquent la polymérisation des microtubules et le renouvellement dynamique. Ici, l’application de PST dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant en 3 dimensions (3D) vise à perturber le réseau de microtubules au niveau subcellulaire. Ce protocole fournit des instructions pour la configuration expérimentale, ainsi que des paramètres d’activation et de désactivation de la lumière pour les PST utilisant la microscopie confocale à cellules vivantes. Cela garantit la reproductibilité et permet à d’autres d’appliquer cette procédure à leurs questions de recherche. Des photocommutateurs innovants comme les PST peuvent évoluer en tant qu’outils puissants pour faire progresser la compréhension du réseau dynamique de microtubules intracellulaires et pour manipuler le cytosquelette de manière non invasive en temps réel. En outre, les PST peuvent s’avérer utiles dans d’autres structures 3D telles que les organoïdes, les blastoïdes ou les embryons d’autres espèces.

Introduction

L’architecture des microtubules varie considérablement selon les différents types de cellules pour prendre en charge diverses fonctions ^1,2. Sa nature dynamique de croissance et de rétrécissement permet une adaptation rapide aux signaux extra- et intracellulaires et de répondre aux besoins en constante évolution d’une cellule. Par conséquent, il peut être considéré comme « l’empreinte morphologique » jouant un rôle clé dans l’identité cellulaire.

Le ciblage pharmacologique du cytosquelette des microtubules à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules a conduit à une pléthore de découvertes fondamentales en biologie du développement, en biologie des cellules souches, en biologie du cancer et en neurobiologie ^3,4,5,6,7. Cette approche, bien qu’indispensable, présente diverses limites telles que la toxicité et les effets hors cible. Par exemple, l’un des agents ciblant les microtubules les plus utilisés, le nocodazole, est un puissant médicament dépolymérisant les microtubules⁸. Cependant, les inhibiteurs de petites molécules tels que le nocodazole sont actifs dès le moment de l’application et, compte tenu de la nature essentielle du cytosquelette de microtubules à de nombreuses fonctions cellulaires critiques, la dépolymérisation globale des microtubules peut produire des effets hors cible, ce qui peut ne pas convenir à de nombreuses applications. De plus, le traitement au nocodazole est irréversible à moins que les échantillons ne soient lavés sans médicament, ce qui empêche l’imagerie continue en direct et, par conséquent, le suivi précis des filaments de microtubules individuels.

Le développement de composés activés par la lumière a commencé avec la création de molécules photoconçues et a annoncé une nouvelle ère dans le ciblage et la surveillance des effets de l’inhibition de la croissance des microtubules de manière précise et contrôlée par spatiotemporalité. Une famille de médicaments photocommutables réversibles, les photostatines (PST), a été développée en remplaçant le composant stilbène de la combretastatine A-4 par de l’azobenzène⁹. Les PST sont inactifs jusqu’à l’éclairage par lumière UV, la trans-configuration inactive se convertissant en configuration cis active par isomérisation réversible. Les Cis-PST inhibent la polymérisation des microtubules en se liant au site de liaison à la colchicine de la β-tubuline, bloquant son interface avec la β-tubuline et empêchant la dimérisation nécessaire à la croissance des^{microtubules 10}. Parmi une cohorte de PST, le PST-1P est apparu comme un composé de plomb car il a la puissance la plus élevée, est entièrement soluble dans l’eau et montre un début rapide de bioactivité après l’illumination.

La trans- à cis-isomérisation la plus efficace des PST se produit à des longueurs d’onde comprises entre 360 et 420 nm, ce qui permet deux options pour l’activation PST. Une ligne laser de 405 nm sur un microscope confocal typique peut être administrée pour un ciblage spatial optimal de l’inhibition de la croissance des microtubules. La capacité de localiser l’emplacement et le moment de l’activation PST grâce à un éclairage laser de 405 nm facilite un contrôle temporel et spatial précis, permettant une perturbation de la dynamique des microtubules au niveau subcellulaire, dans des temps de réponse inférieurs à^{la seconde 9}. Alternativement, une lumière UV LED abordable permet à l’éclairage de l’organisme entier d’induire une perturbation de l’architecture des microtubules à l’échelle de l’organisme. Cela peut être une alternative rentable pour les chercheurs pour qui l’objectif est l’apparition précise de l’inhibition, plutôt que le ciblage spatial. Une autre caractéristique des PST est leur inactivation à la demande en appliquant la lumière verte d’une longueur d’onde comprise entre 510 et 540 nm⁹. Cela permet de tracer les filaments de microtubules avant, pendant et après l’inhibition de la croissance médiée par PST.

Les PST, bien qu’ils soient encore relativement récents, ont été utilisés dans de nombreuses applications in vitro dans divers domaines de recherche¹¹, y compris l’étude de nouveaux mécanismes de migration cellulaire dans les amiboïdes¹², dans les neurones isolés du cerveau de la souris nouveau-née¹³, et le développement de l’épithélium alaire chez Drosophila melanogaster¹⁴ . D’autres médicaments réactifs à la lumière se sont avérés être des outils précieux pour perturber de manière ciblée la fonction cellulaire. Par exemple, un analogue de la blébbistatine, l’azidoblébbistatine, a été utilisé pour améliorer l’inhibition de la myosine sous éclairage^15,16. Cela met en évidence le potentiel de nouvelles découvertes en raison de la capacité d’inhibition spatiotemporalement contrôlée de la fonction cellulaire.

Les organismes 3D vivants présentent des systèmes superbes mais plus délicats pour manipuler la dynamique des microtubules au niveau de l’animal entier, d’une seule cellule ou subcellulaire dans des conditions physiologiques. En particulier, l’embryon de souris préimplantatoire offre un aperçu exceptionnel du fonctionnement interne de la cellule ainsi que des relations intercellulaires au sein d’un organisme¹⁷. Des cycles consécutifs d’activation et de désactivation des PST ciblés temporellement et spatialement ont contribué à la caractérisation du pont interphasique, une structure post-cytocinétique entre les cellules, en tant que centre d’organisation de microtubules non centrosomiques dans l’embryon de souris préimplantatoire¹⁶. Une configuration expérimentale similaire a démontré l’implication de microtubules en croissance dans l’étanchéité de l’embryon de souris pour permettre la formation de blastocystes¹⁸. En outre, les PST ont également été utilisés dans des embryons entiers de poisson-zèbre pour étudier la migration des cellules neuronales en inhibant la croissance des microtubules dans un sous-ensemble de cellules du cerveau postérieur¹⁹.

Ce protocole décrit la configuration expérimentale et l’utilisation de PST-1P dans l’embryon de souris préimplantatoire. Les instructions présentées ici peuvent également guider l’application des PST pour un large éventail d’objectifs tels que l’étude de la ségrégation chromosomique et de la division cellulaire, le trafic de cargaison intracellulaire et la morphogenèse et la migration cellulaires. En outre, de telles études aideront à la mise en œuvre des PST dans les systèmes organoïdes, les blastoïdes et d’autres modèles embryonnaires tels que Caenorhabditis elegans et Xenopus laevis, ainsi qu’à étendre potentiellement l’utilisation des PST pour les technologies de fécondation in vitro .

Protocol

Les expériences ont été approuvées par le Monash Animal Ethics Committee sous le numéro d’éthique animale 19143. Les animaux ont été logés dans des conditions spécifiques de maison d’animaux exempts d’agents pathogènes à l’animalerie (Monash Animal Research Platform) dans le strict respect des directives éthiques.

1. Collecte d’embryons de souris préimplantatoires

1. Superovulez et accouplez les souris comme décrit précédemment^16,18, conformément aux directives institutionnelles en matière d’éthique animale.
   REMARQUE: Les souches les plus couramment utilisées pour la collecte d’embryons vivants sont les souris C57BL / 6 ou FVB / N. Toutes les données présentées ici ont été générées à l’aide de souris FVB/N.
2. Le matin après l’accouplement, rincez les zygotes de l’oviducte à l’aide d’un milieu M2 tel que décrit²⁰ ou d’un milieu de liquide tubaire humain (HTF). À l’aide d’un appareil de pipette buccale tel que décrit ^21,22, transférer les zygotes dans des gouttelettes fraîches de potassium Simplex Optimised Medium (KSOM), préavertiquées à 37 °C et équilibrées à 5 % de CO₂, dans une boîte de culture de 35 mm recouverte d’un volume suffisant d’huile minérale pour assurer une couverture médiatique.
3. Microinjectez des zygotes comme décrit²⁰ avec codage d’ARNc pour un microtubule rouge marqué par fluorescence plus marqueur d’extrémité. Ici, l’ARNc pour la protéine de liaison terminale 3 (EB3)-dTomato a été utilisé à une concentration de 30 ng / μL après préparation et purification comme décrit^16,18 et dilution dans un tampon de microinjection.
   REMARQUE: Il est recommandé de préparer l’ARNc à l’avance et de le conserver à -20 ° C jusqu’à ce que nécessaire.
4. Cultiver des embryons dans l’obscurité à 37 °C et 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les embryons aient atteint le stade de développement souhaité pour le traitement PST-1P.
   REMARQUE: Pour une ressource complète des temps de culture requis pour différents stades embryonnaires, voir²³. Pour les embryons au stade 16 cellules utilisés ici, la culture jusqu’au jour embryonnaire 3 (E3) après la fécondation.

2. Préparation de médicaments et de plats d’imagerie

REMARQUE: Pour les étapes 2.1 à 2.10, travaillez exclusivement dans des conditions sombres ou rouges pour éviter l’activation involontaire de PST-1P. Du papier d’aluminium ou des couvercles sombres doivent être utilisés pour tous les tubes et plats contenant des PST.

1. Préparer une concentration de stock de 50 mM PST-1P dans de l’eau ultrapure.
   REMARQUE: Le poids moléculaire de PST-1P est de 440 g / mol. La solution mère est stable à -20 °C jusqu’à 1 an. Le PST-1P est soluble dans l’eau ou le tampon aqueux, mais ne se dissout pas facilement dans le DMSO.
2. À partir de l’étape 2.1, préparer une concentration de travail intermédiaire de 800 μM PST-1P dans de l’eau ultrapure.
3. Diluer pst-1P à une concentration finale de 40 μM dans du KSOM frais. Comme une expérience typique nécessite environ 20 μL de KSOM traité au PST-1P, diluer 1 μL de 800 μM PST-1P dans 19 μL de KSOM pour un volume final de 20 μL afin de s’assurer que suffisamment de milieu est préparé à l’avance, en utilisant uniquement de la lumière rouge pour la visibilité.
   REMARQUE: La concentration et l’état d’activation d’une dilution PST-1P peuvent être vérifiés en prenant un spectre d’absorbance UV-Vis à l’aide d’un spectrophotomètre qui doit être effectué lors de l’établissement du dosage. L’absorbance à 380 nm (A₃₈₀) d’une dilution entièrement trans de 40 μM dans une cuvette de 1 cm doit être d’environ 0,8. Les formes cis et trans ont la même absorbance à 455 nm (A₄₅₅). Lorsque le rapport de l’A₃₈₀ à l’A₄₅₅ est d’environ 9:1, la dilution est inactive (entièrement trans). Lorsque le rapport A₃₈₀:A₄₅₅ est de 1:2, la dilution est complètement activée (entièrement cis). Les ratios intermédiaires reflètent les états intermédiaires d’activation.
4. Pour préparer la lame de la chambre à l’imagerie en direct, pipettez 10 μL de KSOM traité pst-1P au centre d’un puits pour former une gouttelette hémisphérique (Figure 1A).
5. Ajoutez doucement suffisamment d’huile minérale pour couvrir la gouttelette, en veillant à ce qu’elle ne disperse pas le milieu. Cela garantira que la gouttelette ne s’évapore pas.
6. Préchauffer et équilibrer le plat coulissant de la chambre dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 3 h ou au plus, pendant la nuit.
7. À la fin de la période d’équilibrage, à l’étape 2.6, préparez une boîte de culture de 35 mm avec une gouttelette de 10 μL de KSOM traité au PST-1P, préchauffé et équilibré comme étape de lavage. Ne pas superposer avec de l’huile.
8. Transférer les embryons par pipetage buccal dans la gouttelette KSOM traitée par PST-1P à partir de l’étape 2.7.
   REMARQUE: Les étapes 2.7 et 2.8 sont recommandées pour le pipetage buccal des embryons, mais sont facultatives.
9. Transférer immédiatement les embryons par pipetage buccal au centre de la gouttelette KSOM traitée par PST-1P dans la lame de la chambre d’imagerie préparée aux étapes 2.4-2.6 (Figure 1A).
10. Incuber des embryons à 37 °C et 5 % de CO₂ dans du KSOM traité au PST-1P dans la lame de la chambre d’imagerie pendant au moins 1 h avant l’imagerie. Si possible, montez la lame de chambre sur le microscope à l’intérieur d’une chambre environnementale à 37 °C et 5 % de CO_2, et dans l’obscurité totale pour vous assurer que tous les PST-1P sont dans la configuration trans inactive et que les embryons peuvent couler au fond de la boîte.

3. Imagerie en direct et photoactivation PST-1P

REMARQUE: Les étapes 3.1 à 3.13 sont effectuées sur un microscope confocal à balayage laser équipé de détecteurs de photodiodes d’avalanche (APD) et d’une chambre environnementale sombre. Ces instructions se réfèrent spécifiquement à la configuration de l’imagerie à l’aide du logiciel d’acquisition décrit dans la Table des matériaux; cependant, ils peuvent également être appliqués à d’autres systèmes de microscopie confocale.

1. Préparez un objectif d’immersion dans l’huile d’eau 63x/1,2 NA avec le milieu d’immersion prescrit.
2. À l’aide d’une torche à lumière rouge pour guider le positionnement, avancez l’objectif pour entrer en contact avec le milieu d’immersion. À ce stade, évitez d’utiliser une lumière blanche ou brillante pour trouver les embryons, car cela pourrait activer précocement PST-1P.
3. À l’aide de l’oculaire et sous éclairage à la lumière rouge, localisez le bord de la gouttelette de milieu et positionnez l’objectif directement sur cet endroit. Cela peut aider l’utilisateur à établir l’orientation et à trouver le plan focal.
4. Ensuite, à travers l’oculaire ou sur la numérisation en mode live activée par logiciel, utilisez un filtre de longueur d’onde rouge ou un laser de 561 nm pour localiser les embryons dans la gouttelette.
5. Utilisez des contrôleurs de scène et le mode de balayage en direct pour définir les points de départ et d’arrivée pour l’acquisition d’une pile z de l’embryon entier.
6. Ajustez les paramètres de puissance laser (généralement, avec des détecteurs très sensibles tels que les APD, une puissance laser de 561 nm inférieure à 5% est suffisante), le décalage numérique (généralement à -0,900) pour optimiser l’apparence des comètes EB3-dTomato et minimiser le bruit de fond, le sténopé à 2 μm, la résolution des pixels de 512 x 512 et le temps de séjour des pixels de 3,15 μs.
7. Acquérir une pile z de l’embryon entier avec des intervalles de section de 1 μm pour évaluer les zones de croissance des microtubules dans l’organisme entier (Figure 1B).
8. Utilisez l’image z-stack 3D de l’étape 3.7 pour identifier les régions d’intérêt (ROI) pour les expériences de suivi EB3-dTomato. Augmentez le zoom à 3x et dessinez un retour sur investissement rectangulaire autour de la zone subcellulaire spécifique d’intérêt.
9. Acquérir un film time-lapse d’un seul plan z en utilisant les valeurs typiques des paramètres d’imagerie: puissance laser de 561 nm à 5%, décalage numérique de -0,900, résolution en pixels de 512 x 512, sténopé à 3 μm, temps de séjour en pixels de 3,15 μs, zoom de 3x, intervalle de temps de 500 ms.
   REMARQUE: 120 délais fourniront un film de suivi de 1 min et devraient être suffisants pour l’analyse des données. L’acquisition peut se poursuivre plus longtemps, à condition que le blanchiment du fluorophore soit minime (Figure 1C).
10. Pour activer PST-1P, passez à un laser 405 nm et acquérez un autre film time-lapse avec le laser 405 nm réglé sur 10 % de puissance, une résolution de pixels de 512 x 512, un sténopé ouvert au maximum, un temps de séjour en pixels de 3,15 μs, un zoom de 3x, un intervalle de temps de 500 ms et un total de 20 images (Figure 1D).
11. Revenez au laser 561 nm et répétez l’acquisition comme à l’étape 3.9 pour confirmer la perte des comètes EB3-dTomato après activation de PST-1P (Figure 1E). Assurez-vous que cette acquisition a lieu le plus tôt possible après l’activation.
    REMARQUE: L’étape 3.10 peut être effectuée de manière répétitive pour une inhibition plus longue des comètes EB3-dTomato. Cependant, les embryons doivent être surveillés attentivement pour éviter tout dommage causé par la lumière UV.
12. Pour inverser le PST-1P à son état trans inactif, engagez un laser 514 nm à 10% de puissance. Obtenez un film en accéléré avec le laser 514 nm réglé sur 10 % de puissance, une résolution en pixels de 512 x 512, un sténopé ouvert au maximum, un temps de séjour en pixels de 3,15 μs, un zoom de 3x, un intervalle de temps de 500 ms et un total de 20 périodes (Figure 1F).
13. Répétez l’étape 3.11 pour visualiser la récupération des comètes EB3-dTomato (Figure 1G).

4. Analyse des données d’image

1. Pour analyser et quantifier l’inhibition de la polymérisation des microtubules par les PST, utilisez des logiciels à la disposition des chercheurs pour répondre à leurs besoins spécifiques. Ceux recommandés pour une utilisation posséderont un outil de suivi, qui peut suivre manuellement ou automatiquement le mouvement, la direction et la vitesse des comètes EB3-dTomato^16,18.

Figure 1 : Représentation schématique de la photoactivation et de la désactivation du PST-1P dans l’embryon de souris préimplantatoire 3D vivant. Toutes les expériences sont réalisées dans l’obscurité totale (fond noir) ou uniquement par éclairage à la lumière rouge. (A) Des embryons de souris préimplantatoires vivants exprimant EB3-dTomato sont cultivés au stade 16 cellules, puis transférés sur une gouttelette de KSOM contenant 40 μM PST-1P dans une lame de chambre d’imagerie. (B) Une image 3D de l’embryon entier permet d’évaluer la croissance des microtubules en visualisant la distribution des comètes EB3-dTomato. (C) Pour commencer l’expérience, les comètes EB3-dTomato sont suivies dans une région subcellulaire à l’aide de l’imagerie time-lapse. (D) La photoactivation ultérieure de PST-1P dans la même région subcellulaire à l’aide d’un laser de 405 nm entraîne la perte de comètes EB3-dTomato (E). L’activation intensifiée du PST-1P peut être mise en œuvre, si nécessaire, par un éclairage lumineux séquentiel de 405 nm. (F-G) Pour inverser PST-1P à son état inactif et restaurer les comètes EB3-dTomato, un laser de 514 nm est appliqué à la même région subcellulaire. Si nécessaire, plusieurs cycles de photoactivation et de désactivation peuvent être effectués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Representative Results

Conformément au protocole, des embryons de souris préimplantatoires ont été microinjectés avec de l’ARNc pour EB3, marqués avec du dTomato fluorescent rouge (EB3-dTomato). Cela permet de visualiser les microtubules en croissance lorsque EB3 se lie au microtubule polymérisant plus se termine²⁴.

Les expériences ont été réalisées 3 jours après la fécondation (E3) lorsque l’embryon de souris est composé de 16 cellules. Tout autre stade de développement préimplantatoire peut être utilisé, selon la question scientifique à étudier. Pour démontrer un photoblanchiment minimal à l’aide du protocole d’activation de la lumière laser de 405 nm, une expérience de contrôle avec un embryon non traité est montrée (Figure 2A i). Un ROI avec une densité EB3-dTomato frappante est choisi en fonction de l’image 3D acquise de l’embryon. Dans cet exemple, un seul plan z d’une cellule entière est utilisé pour l’imagerie haute résolution EB3-dTomato. Cependant, différentes régions de l’embryon peuvent être sélectionnées selon les besoins (par exemple, région corticale, région périnucléaire, cellule mitotique, cellule interne ou externe). Une image de l’expression d’EB3-dTomato avant un éclairage de lumière laser de 405 nm montre un signal EB3-dTomato très dense dans l’ensemble du cytoplasme de la cellule, à l’exception de la zone nucléaire (Figure 2A ii). Aucun changement dans la densité EB3-dTomato n’a été observé après un éclairage de lumière laser de 405 nm (Figure 2A iii et iv). Ainsi, la lumière laser de 405 nm en soi ne provoque aucun photodommage de la dynamique de l’embryon ou du microtubule.

Ensuite, les embryons au stade 16 cellules ont été traités avec 40 μM PST-1P 3 h avant l’imagerie en direct et maintenus dans l’obscurité. Pour réussir des expériences PST sur des organismes 3D vivants, il est essentiel de trouver l’équilibre optimal entre la concentration PST, le temps d’incubation et la puissance laser requise pour éviter les effets nocifs¹¹. Dans des conditions d’obscurité strictes, une forte expression d’EB3-dTomato peut être détectée dans l’image 3D (Figure 2B i), de la même manière que les embryons témoins (Figure 2A i). Ainsi, pst-1P ne provoque pas d’inhibition de la polymérisation des microtubules dans des conditions sombres. L’imagerie en accéléré d’un seul plan z a confirmé une forte expression d’EB3-dTomato et une polymérisation de microtubules avant un éclairage par lumière laser de 405 nm (Figure 2B ii). En quelques secondes, une réduction du signal EB3-dTomato a été observée après l’activation de la lumière laser de 405 nm de PST-1P (Figure 2B iii). Cette perte durerait environ 2 à 20 minutes avant de revenir progressivement en raison de la relaxation thermique ou de la diffusion dans les zones environnantes¹¹. Ainsi, une activation répétitive de la lumière laser de 405 nm pourrait prolonger la durée de la perte EB3-dTomato (Figure 1E-D). Il est important de noter que les embryons microinjectés avec EB3-dTomato et incubés avec PST-1P présentent un potentiel embryonnaire normal, se développant au stade de blastocyste (Figure 3 et Figure supplémentaire 1) et une dynamique normale des microtubules, par exemple, pendant la mitose (Figure supplémentaire 2). Par conséquent, le PST-1P inactif ne présente aucune toxicité pour l’embryon.

La désactivation contrôlée du PST-1P peut être obtenue par un éclairage laser de 514 nm (Figure 2B iv). Alors que cette approche peut être utile pour déterminer l’origine de la croissance des microtubules après inhibition de la croissance induite par PST-1P, elle exclut l’utilisation de protéines fluorescentes vertes pour l’imagerie en direct. Bien qu’il soit fortement recommandé de travailler dans des conditions sombres, si les PST sont activés par inadvertance, l’éclairage de la lumière verte permet le retour PST à un état trans inactif. Dans ce cas, une période adéquate de récupération des cellules est nécessaire par mesure de précaution pour s’assurer que les cellules peuvent revenir à leur état de pré-activation. Si le temps le permet, ce serait idéalement un minimum de quelques heures.

Figure 2 : Imagerie en direct d’EB3-dTomato avant et après l’activation de la lumière UV et la désactivation de PST-1P dans l’embryon de souris vivant. (A i) Projection maximale 3D z-stack d’un embryon de souris témoin non traité au stade 16 cellules marqué pour EB3-dTomato. Un pont de microtubule cytocinétique est présent (désigné par pointe de flèche grise) à côté de multiples ponts interphasiques (désignés par des pointes de flèche jaunes). (A ii) Plan Z unique d’une cellule imagée avant une exposition laser de 405 nm. (A iii-iv) Plan z unique d’une cellule imagé immédiatement (A iii) et 4 min (A iv) après une exposition à la lumière laser de 405 nm (indiquée par un éclair violet), ne montrant aucun changement dans le signal EB3-dTomato. (B i) Projection maximale 3D z-stack d’un embryon de stade 16 cellules marqué pour EB3-dTomato, qui est traité avec 40 μM PST-1P et conservé dans l’obscurité. Les ponts interphasés sont indiqués par des pointes de flèches jaunes. (B ii) Plan z unique d’une cellule imagée avant l’activation. (B iii) Plan Z unique d’une cellule imagé immédiatement après une exposition à la lumière laser de 405 nm (indiqué par un éclair violet), montrant une réduction marquée du signal EB3-dTomato. (B iv) Plan Z unique d’une cellule imagé immédiatement après une exposition à la lumière laser de 514 nm (indiqué par un éclair vert), montrant la récupération du signal EB3-dTomato. Les noyaux sont indiqués par la ligne bleue pointillée. Barres d’échelle : 15 μm pour des embryons 3D entiers ; 5 μm en médaillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les conditions de culture PST-1P inactives permettent un développement embryonnaire normal au stade de blastocyste. (A) Contraste d’interférence différentielle unique (DIC) plan z d’un embryon au stade de blastocyste (E4.5) après culture dans 40 μM PST-1P dans l’obscurité. (B) Projection maximale 3D z-stack de l’embryon montré en (A), montrant l’expression EB3-dTomato. Barres d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans les films time-lapse acquis, l’étiquetage EB3-dTomato apparaît comme des structures « cométaires » et permet de suivre les filaments de microtubules en croissance (Figure 4). Dans les embryons traités par PST-1P maintenus dans des conditions sombres (Figure 4A), on peut voir des comètes EB3-dTomato individuelles (désignées par des pointes de flèches blanches et jaunes sur la Figure 4B) émanant du pont interphasique, qui agit comme un centre d’organisation de microtubules non centrosomiques dans l’embryon de souris précoce¹⁶ (Figure 4B). Une projection de points temporels (pile en T) représente le nombre total et la distance parcourue par les comètes EB3-dTomato (Figure 4B), montrant la densité la plus élevée d’EB3-dTomato dans la région du pont interphasique. Suite à l’activation de PST-1P avec une lumière laser de 405 nm, les comètes EB3-dTomato ne peuvent plus être vues à la base du pont interphasé et sont également absentes dans la pile en T (Figure 4C).

Figure 4 : Suivi des comètes EB3-dTomato avant et après l’activation subcellulaire de PST-1P par la lumière UV dans l’embryon de souris vivant. (A) Projection maximale 3D z-stack d’un embryon de souris au stade 16 cellules marqué pour EB3-dTomato, traité avec 40 μM PST-1P et maintenu dans l’obscurité. (B) Quatre plans Z simples sélectionnés et la pile en T correspondante d’un retour sur investissement au pont interphasique (indiqué par *) avant l’éclairage laser de 405 nm, montrant les comètes EB3-dTomato au fil du temps. Le mouvement des comètes individuelles est indiqué par les pointes de flèches jaunes et blanches tandis que les pointes de flèches pointillées de couleur assortie montrent les positions des comètes aux points temporels précédents. Les temps indiqués sont en secondes (s). (C) Quatre plans Z simples sélectionnés et la pile en T correspondante du pont interphasique imagé immédiatement après une exposition à la lumière laser de 405 nm (indiqués par un éclair violet) montrent une perte de comètes EB3-dTomato. Barres d’échelle: 10 μm pour l’embryon 3D complet; 2 μm pour les plans z simples; 1,5 μm pour la pile en T. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pris ensemble, ces résultats démontrent l’application de PST-1P dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant. PST-1P inhibe efficacement la polymérisation des microtubules après activation avec un laser de 405 nm et cette inhibition est réversible lors de l’éclairage de la lumière laser de 514 nm au niveau cellulaire et subcellulaire.

Figure supplémentaire 1 : Les embryons préimplantatoires cultivés dans le PST-1P inactif démontrent un potentiel de développement normal au stade de blastocyste. (A) Témoins non traités et (B) embryons traités par PST-1P montrant un taux de développement au stade de blastocyste. Tous les embryons ont été maintenus dans l’obscurité tout au long du développement pour assurer l’inactivité de PST-1P. Le taux de développement au stade de blastocyste était comparable entre les témoins (100 %, n = 13) et les embryons traités par PST-1P (91,3 %, n = 23). Les barres d’échelle sont de 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Les embryons préimplantatoires cultivés dans du PST-1P inactif présentent une dynamique de fuseau normale pendant la mitose. (A) Témoins non traités et (B) embryons traités au PST-1P se divisant du stade 8 cellules au stade 16 cellules, injectés avec EB3-dTomato et Histone 2B (H2B)-GFP. Tous les embryons ont été maintenus dans l’obscurité tout au long du développement pour assurer l’inactivité de PST-1P. L’alignement des chromosomes peut être observé (A i et B i), suivi de l’anaphase précoce (A ii et B ii), de l’anaphase tardive (A iii et B iii) et de la cytokinèse (A iv et B iv) sans défauts. Les barres d’échelle sont de 10 μm dans les images 3D et de 5 μm dans les encarts. (C) L’anaphase a duré en moyenne 8 min 53 s chez les témoins et 8 min 40 s chez les embryons traités par PST-1P (valeur p = 0,8241) et les chromosomes (D) déconsdensés pendant la télophase, soit une moyenne de 19 min 38 s chez les témoins et de 18 min 51 s après l’initiation de l’anaphase chez les embryons traités pst-1P (valeur p = 0,2743). Pour l’analyse, n = 10 chez les témoins et n = 12 dans le traitement PST-1P. De plus, toutes les cellules sont divisées en une seule onde synchrone, comme prévu. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le réseau de microtubules fait partie intégrante du fonctionnement interne fondamental d’une cellule. Par conséquent, cela présente des défis dans la manipulation de la dynamique des microtubules dans les organismes vivants, car toute perturbation du réseau a tendance à avoir des conséquences généralisées pour tous les aspects de la fonction cellulaire. L’émergence de composés de ciblage de microtubules photocommutables présente un moyen de manipuler avec précision le cytosquelette au niveau subcellulaire, avec un contrôle supérieur pour l’induction et l’inversion de l’inhibition de la croissance des microtubules⁹. Ce protocole montre comment la polymérisation des microtubules peut être inhibée dans l’embryon de souris préimplantatoire par PST-1P activé par la lumière à l’échelle subcellulaire, et d’une manière temporellement précise. De plus, cette inhibition peut être inversée pour permettre l’étude de la perturbation à court terme du réseau de microtubules.

Le protocole présenté est optimisé pour l’application des PST sur des embryons de souris préimplantatoires vivants et peut être utilisé comme base pour étendre leur utilisation à divers autres systèmes de culture. Les nouveaux utilisateurs de fichiers PST peuvent rencontrer certains points dans leurs applications nécessitant un dépannage, pour lesquels plusieurs étapes de résolution de problèmes sont présentées.

La cytotoxicité des PST doit être évaluée et une concentration de travail qui provoque une forte inhibition de la croissance des microtubules avec une toxicité minimale pour les cellules doit être choisie. Un protocole complet d’optimisation des concentrations de travail des PST et autres photocommutateurs a été détaillé dans une pré-impression récente¹¹. En bref, les nouveaux utilisateurs de PST peuvent évaluer la cytotoxicité dans des conditions sombres avec des dilutions en série du médicament. Dans ce contexte, il ne devrait y avoir aucun effet mesurable sur les comètes EB3-dTomato et aucune toxicité pour les cellules. Cela fournit un point de départ pour tester une concentration non cytotoxique dans des conditions éclairées. Pour une expérimentation plus poussée, la concentration la plus faible qui provoque une réduction des comètes EB3-dTomato est recommandée.

Comme pour tout traitement médicamenteux, les PST peuvent être métabolisés par la cellule; cependant, d’un point de vue pratique, cela risque d’être négligeable, comme le démontrent l’incubation d’embryons de C. elegans dans pst-1P pendant 150 minutes et l’isomérisation efficace ultérieure⁹. Pour les systèmes hautement actifs métaboliquement, une concentration accrue de PST-1P peut être nécessaire. Les PST peuvent également diffuser à travers le milieu de culture, réduisant ainsi la charge des PST actifs dans le retour sur investissement. Pour atténuer ce problème, une photoactivation répétée peut être nécessaire, dont la cytotoxicité devrait être évaluée sur une base de type cellulaire individuel, car certains systèmes peuvent être sensibles à la phototoxicité. De même, les PST activés peuvent diffuser hors du retour sur investissement activé par la lumière et affecter les microtubules environnants. Cependant, en raison de leur tendance inhérente à se détendre vers l’état trans inactif, l’effet sur les zones environnantes devrait être négligeable.

Un autre obstacle potentiel à l’utilisation des PST concerne leur application dans des organoïdes ou des organismes plus grands en raison de la nature de la pénétrabilité limitée de la lumière de ces tissus. Les tissus plus gros peuvent ne pas être accessibles pour la photoactivation des cellules plus profondes. L’embryon de souris préimplantatoire présente un défi unique en ce sens qu’il est entouré d’un revêtement externe, la zone pellucide, qui peut entraver la perméabilité des médicaments ajoutés au milieu. Pour atténuer ce problème, les embryons sont pré-incubés pendant au moins 1 h dans PST-1P avant l’imagerie. Des approches d’optimisation similaires peuvent être applicables pour améliorer la pénétration du médicament lors de l’utilisation de PST dans des organismes entiers ou des systèmes organoïdes, comme l’ajout d’acétonitrile pour faciliter l’absorption cellulaire des PST⁹.

En raison de la réversibilité à la lumière verte des PST, ces composés ne sont pas compatibles avec l’imagerie de fluorophores nécessitant une excitation inférieure à 530 nm (comme le GFP). Cependant, les utilisateurs peuvent mettre en œuvre le suivi des fluorophores avec n’importe quel fluorophore nécessitant une excitation supérieure à 530 nm, par exemple, RFP, mCherry ou mPlum. Si un double marquage des structures subcellulaires est nécessaire, les utilisateurs peuvent utiliser des fluorophores à base de rouge et de rouge lointain. Si la compatibilité GFP est essentielle, une nouvelle classe de photocommutateurs, SBTubs, pourrait être intéressante²⁵. Ces composés sont également activés par la lumière UV; cependant, ils ne répondent pas à la lumière verte, ce qui les rend fonctionnellement réversibles uniquement par diffusion, mais également compatibles avec tous les fluorophores ayant une longueur d’onde d’excitation de 488 nm ou plus. Avec les PST, qui offrent une réversibilité mais ne sont pas compatibles avec l’imagerie de GFP, ces composés offrent à l’utilisateur une flexibilité accrue pour adopter une approche personnalisée et adapter les commutateurs photo disponibles à sa question de recherche.

Les approches conventionnelles d’inhibition, d’élimination et d’élimination des petites molécules peuvent être mises en œuvre à l’échelle des cellules entières ou de l’organisme entier pour caractériser l’action des microtubules. Ces approches fournissent des effets puissants, mais larges et destructeurs sur les microtubules qui ne sont pas facilement réversibles et sont souvent difficiles à cibler de manière subcellulaire ou temporellement contrôlée. Une stratégie pour contourner ces limitations consiste à faire appel au génie génétique d’un système optogénétique inductible à la lumière. Les applications de ces systèmes varient considérablement et comprennent l’hétérodimérisation induite par la lumière, l’homodimérisation et la dissociation des protéines ou des domaines protéiques²⁶. Récemment, une construction de protéine de liaison terminale 1 (EB1) contrôlée optogénétiquement a été conçue, où un commutateur inductible par la lumière a permis la dissociation des terminaux amino et carboxyle du microtubule plus le partenaire de liaison finale EB1. Cela a rendu la protéine fonctionnellement inactive avec des temps de réponse inférieurs à la seconde, bloquant la croissance des microtubules dans une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain²⁷. De même, un commutateur optogénétique a été utilisé pour relier les filaments de microtubules et d’actine chez D. melanogaster afin de comprendre l’influence de la réticulation du cytosquelette sur les changements morphologiques de la cellule²⁸. L’utilisation d’outils optogénétiques pour manipuler l’embryon précoce est un domaine de recherche très actuel et a connu des avancées récentes¹. Un système d’exportation nucléaire modifié optogénétiquement a été développé pour induire la mauvaise localisation des protéines nucléaires. Cela pourrait imiter les modèles génétiques de perte de fonction, avec la flexibilité supplémentaire à mener à des moments précis de développement chez les embryons de D. melanogaster ²⁹. Les approches optogénétiques sont un outil puissant pour le contrôle spatio-temporel de la dynamique des microtubules; cependant, ils peuvent être difficiles à concevoir, longs et coûteux. En revanche, les PST offrent une alternative chimique à la manipulation génétique complexe qui offre des temps de réponse, une spécificité et une réversibilité similaires avec l’avantage supplémentaire d’une utilisation et d’une accessibilité faciles.

Une autre approche ciblée pour perturber mécaniquement les filaments de microtubules est l’ablation au laser à l’aide d’un laser à deux photons. Cela a été appliqué avec succès pour ablation du pont interphasique dans les embryons de souris préimplantatoires¹⁶. Lorsqu’il est bien mis en œuvre, les utilisateurs peuvent obtenir un gain élevé. Cependant, l’exécution de cette technique est difficile et nécessite un haut degré de précision pour éviter la destruction ou la lyse de toute structure environnante ou des cellules elles-mêmes. En outre, les utilisateurs peuvent avoir besoin d’ablation répétée de leurs échantillons pour obtenir l’effet escompté, car les microtubules peuvent repousser rapidement³⁰. En revanche, les PST inhibent directement la polymérisation des microtubules³¹ et évitent les effets indésirables qui peuvent survenir avec l’ablation au laser, en raison de leur spécificité pour la liaison à la β-tubuline. De plus, les PST peuvent être appliqués à l’ensemble de l’organisme, tandis que l’ablation au laser par nature ne peut être ciblée que sur une région spécifique.

Grâce à ce protocole, les possibilités d’application des PST sont vastes et convaincantes. Les PST peuvent permettre l’inhibition subcellulaire précise de la croissance des microtubules dans des temps de réponse inférieurs à la seconde pour étudier les aspects de la ségrégation chromosomique au cours de la division cellulaire mitotique ou méiotique. Le trafic de cargaison intracellulaire pourrait être perturbé en inhibant les voies de transport fournies par le réseau de microtubules pour étudier le trafic endosomal, le mouvement des mitochondries ou le positionnement nucléaire. Les PST ont également été utilisés pour inhiber avec succès la croissance des microtubules dans les sphéroïdes multicellulaires 3D cultivés à partir de lignées cellulaires de mélanome humain^32,33. Le couplage de la flexibilité de l’activation PST avec leurs superbes temps de réponse offre aux chercheurs un outil dynamique pour étudier la dynamique des microtubules et manipuler la fonction cellulaire. En outre, la réversibilité des PST rend leur application idéale pour l’étude des conséquences à court et à long terme de l’inhibition des microtubules sur une seule cellule ou des cellules sélectionnées dans un tissu ou un organisme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides - LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes - 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch - Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice - wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss