Summary
Typische microtubuleremmers, die veel worden gebruikt in fundamenteel en toegepast onderzoek, hebben verstrekkende effecten op cellen. Onlangs ontstonden fototatinen als een klasse van fotoschakelbare microtubuleremmers, in staat tot onmiddellijke, omkeerbare, spatiotemporaal nauwkeurige manipulatie van microtubuli. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de toepassing van fototatinen in een 3D live pre-implantatiemuismyo.
Abstract
Het microtubule cytoskelet vormt het raamwerk van een cel en is fundamenteel voor intracellulair transport, celdeling en signaaltransductie. Traditionele farmacologische verstoring van het alomtegenwoordige microtubulinetwerk met behulp van bijvoorbeeld nocodazol kan verwoestende gevolgen hebben voor elke cel. Reversibel fotoschakelbare microtubuleremmers hebben het potentieel om de beperkingen te overwinnen door medicijneffecten op een spatiotemporaal gecontroleerde manier te implementeren. Een dergelijke familie van geneesmiddelen is de op azobenzeen gebaseerde fototatinen (PST's). Deze verbindingen zijn inactief in donkere omstandigheden en bij verlichting met UV-licht binden ze zich aan de colchicine-bindingsplaats van β tubuline en blokkeren ze microtubule polymerisatie en dynamische omzet. Hier is de toepassing van PST's in het 3-dimensionale (3D) levende pre-implantatiemuismyo bedoeld om het microtubulinetwerk op subcellulair niveau te verstoren. Dit protocol biedt instructies voor de experimentele opstelling, evenals lichtactiverings- en deactiveringsparameters voor PST's met behulp van live-cell confocale microscopie. Dit zorgt voor reproduceerbaarheid en stelt anderen in staat om deze procedure toe te passen op hun onderzoeksvragen. Innovatieve fotoschakelaars zoals PST's kunnen evolueren als krachtige hulpmiddelen om het begrip van het dynamische intracellulaire microtubulinetwerk te vergroten en het cytoskelet in realtime niet-invasief te manipuleren. Bovendien kunnen PST's nuttig zijn in andere 3D-structuren zoals organoïden, blastoïden of embryo's van andere soorten.
Introduction
De microtubule-architectuur varieert sterk tussen verschillende celtypen om verschillende functies te ondersteunen 1,2. De dynamische aard van groei en krimp maakt een snelle aanpassing aan extra- en intracellulaire signalen mogelijk en om te reageren op de steeds veranderende behoeften van een cel. Daarom kan het worden beschouwd als de "morfologische vingerafdruk" die een sleutelrol speelt in de cellulaire identiteit.
Farmacologische targeting van het microtubule cytoskelet met behulp van kleine molecuulremmers heeft geleid tot een overvloed aan fundamentele ontdekkingen in ontwikkelingsbiologie, stamcelbiologie, kankerbiologie en neurobiologie 3,4,5,6,7. Deze aanpak, hoewel onmisbaar, brengt verschillende beperkingen met zich mee, zoals toxiciteit en off-target effecten. Een van de meest gebruikte microtubule-targeting middelen, nocodazol, is bijvoorbeeld een krachtig microtubule-depolymeriserend medicijn8. Kleine-molecuulremmers zoals nocodazol zijn echter actief vanaf het moment van toepassing en, gezien de essentiële aard van het microtubule cytoskelet voor veel kritieke cellulaire functies, kan wereldwijde depolymerisatie van microtubuli off-target effecten veroorzaken, die mogelijk ongeschikt zijn voor veel toepassingen. Bovendien is de behandeling met nocodazol onomkeerbaar, tenzij monsters vrij van het geneesmiddel worden gewassen, waardoor continue live beeldvorming en dus nauwkeurige tracking van individuele microtubulifilamenten wordt voorkomen.
De ontwikkeling van lichtgeactiveerde verbindingen begon met de creatie van foto-onopgeloste moleculen en heeft een nieuw tijdperk ingeluid in het richten en monitoren van de effecten van microtubuligroeiremming op een nauwkeurige en spatiotemporaal gecontroleerde manier. Een familie van reversibel fotoschakelbare geneesmiddelen, fototatinen (PST's), werden ontwikkeld door de stilbeencomponent van combretastatine A-4 te vervangen door azobenzeen9. PST's zijn inactief tot verlichting met UV-licht, waarbij de inactieve transconfiguratie wordt omgezet in de actieve cis-configuratie door omkeerbare isomerisatie. Cis-PST's remmen de polymerisatie van microtubuli door zich te binden aan de colchicine-bindingsplaats van β-tubuline, waardoor de interface met β-tubuline wordt geblokkeerd en dimerisatie wordt voorkomen die nodig is voor de groei van microtubuli10. Onder een cohort van PST's is PST-1P naar voren gekomen als een loodverbinding omdat het de hoogste potentie heeft, volledig in water oplosbaar is en een snel begin van bioactiviteit vertoont na verlichting.
De meest effectieve trans- naar cis-isomerisatie van PST's vindt plaats op golflengten tussen 360-420 nm, wat dubbele opties voor PST-activering mogelijk maakt. Een 405 nm laserlijn op een typische confocale microscoop kan worden toegediend voor een optimale ruimtelijke targeting van microtubuligroeiremming. De mogelijkheid om de locatie en timing van PST-activering te lokaliseren door middel van 405 nm laserverlichting vergemakkelijkt nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle, waardoor verstoring van de microtubuledynamica op subcellulair niveau mogelijk is, binnen subseconde respons maal9. Als alternatief zorgt een betaalbaar LED UV-licht ervoor dat de verlichting van het hele organisme de microtubule-architectuur in het hele organisme verstoort. Dit kan een kosteneffectief alternatief zijn voor onderzoekers voor wie het nauwkeurig getimede begin van remming, in plaats van ruimtelijke targeting, het doel is. Een ander kenmerk van PST's is hun on-demand inactivatie door groen licht toe te passen van een golflengte in het bereik van 510-540 nm9. Dit maakt het traceren van microtubule filamenten voor, tijdens en na PST-gemedieerde groeiremming mogelijk.
PST's, hoewel nog steeds een relatief recent ontwerp, zijn gebruikt in tal van in vitro toepassingen op verschillende onderzoeksgebieden11, waaronder onderzoek naar nieuwe mechanismen van celmigratie in amoeboïden12, in neuronen geïsoleerd uit de hersenen van de pasgeboren muis13, en vleugelepitheelontwikkeling in Drosophila melanogaster14 . Andere lichtreactieve geneesmiddelen hebben bewezen waardevolle hulpmiddelen te zijn bij gerichte verstoring van de cellulaire functie. Een analoog van blebbistatine, azidoblebbistatine, werd bijvoorbeeld gebruikt voor verbeterde myosineremming onder verlichting15,16. Dit benadrukt het potentieel voor nieuwe ontdekkingen als gevolg van het vermogen tot spatiotemporaal gecontroleerde remming van de cellulaire functie.
Levende 3D-organismen presenteren prachtige maar delicatere systemen om microtubulidynamica te manipuleren op een heel dier,eencellig of subcellulair niveau onder fysiologische omstandigheden. Met name het pre-implantatie muizenembryo biedt uitzonderlijk inzicht in de innerlijke werking van de cel en intercellulaire relaties binnen een organisme17. Temporeel en ruimtelijk gerichte opeenvolgende cycli van activering en deactivering van PST's droegen bij aan de karakterisering van de interfasebrug, een post-cytokinetische structuur tussen cellen, als een niet-centrosomaal microtubuliorganiserend centrum in het pre-implantatiemuismyo16. Een vergelijkbare experimentele opstelling toonde de betrokkenheid van groeiende microtubuli bij de afdichting van het muizenembryo om blastocystvorming18 mogelijk te maken. Bovendien werden PST's ook gebruikt in hele zebravisembryo's om neuronale celmigratie te onderzoeken door de groei van microtubuli in een subset van cellen in de achterhersenente remmen 19.
Dit protocol beschrijft de experimentele opstelling en het gebruik van PST-1P in het pre-implantatiemuismyo. De instructies die hier worden gepresenteerd, kunnen ook de toepassing van PST's begeleiden voor een breed scala aan doelstellingen, zoals het bestuderen van chromosoomsegregatie en celdeling, handel in intracellulaire lading en celmorfogenese en migratie. Bovendien zullen dergelijke studies de implementatie van PST's in organoïde systemen, blastoïden en andere embryomodellen zoals Caenorhabditis elegans en Xenopus laevis helpen, evenals mogelijk het gebruik van PST's voor in-vitrofertilisatietechnologieën uitbreiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten werden goedgekeurd door de Monash Animal Ethics Committee onder dierethiek nummer 19143. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije dierhuisomstandigheden in de dierenfaciliteit (Monash Animal Research Platform) in strikte overeenstemming met ethische richtlijnen.
1. Pre-implantatie muizenembryoverzameling
- Superovuleren en paren muizen zoals eerder beschreven 16,18, in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen voor dieren.
OPMERKING: De meest gebruikte stammen voor het verzamelen van levende embryo's zijn C57BL/6- of FVB/N-muizen. Alle hier getoonde gegevens zijn gegenereerd met behulp van FVB/N-muizen. - Spoel op de ochtend na de paring zygoten uit de eileider met behulp van M2-medium zoals beschreven20, of Human Tubal Fluid (HTF) medium. Breng met behulp van een mondpipetapparaat zoals beschreven21,22 zygoten over op verse Kalium Simplex Optimised Medium (KSOM) druppels, voorgewarmd tot 37 °C en gebalanceerd tot 5% CO2, in een 35 mm kweekschaal bedekt met een voldoende volume minerale olie om media-aandacht te garanderen.
- Micro-inject zygoten zoals beschreven20 met cRNA-codering voor een rode fluorescerend gelabelde microtubuli plus eindmarker. Hier werd cRNA voor het eindbindende eiwit 3 (EB3)-dTomato gebruikt bij een concentratie van 30 ng/μL na bereiding en zuivering zoals beschreven16,18 en verdunning in micro-injectiebuffer.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om cRNA van tevoren te bereiden en het bij -20 °C te bewaren totdat het nodig is. - Kweek embryo's in het donker bij 37 °C en 5% CO2 totdat embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium voor PST-1P-behandeling hebben bereikt.
OPMERKING: Voor een uitgebreide bron van de kweektijden die nodig zijn voor verschillende embryonale stadia, zie23. Voor 16-cel stadium embryo's die hier worden gebruikt, kweek tot embryonale dag 3 (E3) na de bevruchting.
2. Bereiding van geneesmiddelen en beeldvormingsgerechten
OPMERKING: Voor stappen 2.1-2.10 moet u uitsluitend in het donker of rood licht werken om onbedoelde PST-1P-activering te voorkomen. Aluminiumfolie of donkere hoezen moeten worden gebruikt voor alle buizen en schalen die PST's bevatten.
- Bereid een voorraadconcentratie van 50 mM PST-1P in ultrapuur water.
OPMERKING: Het molecuulgewicht van PST-1P is 440 g/mol. De stamoplossing is stabiel bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar. PST-1P is oplosbaar in water of waterige buffer, maar lost niet gemakkelijk op in DMSO. - Bereid vanaf stap 2.1 een tussenliggende werkconcentratie van 800 μM PST-1P in ultrapuur water.
- Verdun PST-1P tot een eindconcentratie van 40 μM in vers KSOM. Aangezien een typisch experiment ongeveer 20 μL PST-1P-behandelde KSOM vereist, verdun 1 μL van 800 μM PST-1P in 19 μL KSOM voor een eindvolume van 20 μL om ervoor te zorgen dat er van tevoren voldoende medium wordt bereid, met alleen rood licht voor zichtbaarheid.
OPMERKING: Zowel de concentratie als de activeringsstatus van een PST-1P-verdunning kunnen worden gecontroleerd door een UV-Vis-absorptiespectrum te nemen met behulp van een spectrofotometer, wat moet worden gedaan tijdens het opzetten van de test. De absorptie bij 380 nm (A380) van een volledig trans 40 μM verdunning in een cuvette van 1 cm moet ongeveer 0,8 zijn. Zowel cis- als transvormen hebben dezelfde absorptie bij 455 nm (A455). Wanneer de verhouding van de A380 tot de A455 ongeveer 9:1 is, is de verdunning inactief (volledig trans). Wanneer de verhouding A380:A455 1:2 is, wordt de verdunning volledig geactiveerd (volledig cis). Intermediaire verhoudingen weerspiegelen tussenliggende toestanden van activering. - Om de kamerdia voor te bereiden op live beeldvorming, pipetteer 10 μL PST-1P-behandelde KSOM in het midden van één put om een hemisferische druppel te vormen (figuur 1A).
- Voeg voorzichtig voldoende minerale olie toe om de druppel te bedekken, zodat deze de media niet dispergeert. Dit zorgt ervoor dat de druppel niet verdampt.
- Verwarm en CO2-evenwicht de kamerschuifschaal in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 3 uur of maximaal een nacht.
- Bereid aan het einde van de equilibratieperiode in stap 2.6 een kweekschaal van 35 mm met een 10 μL druppel PST-1P-behandelde, voorgewarmde en gebalanceerde KSOM als wasstap. Niet bedekken met olie.
- Breng embryo's via de mondpipetitie over in de met PST-1P behandelde KSOM-druppel uit stap 2.7.
OPMERKING: Stappen 2.7 en 2.8 worden aanbevolen voor het pipetteren in de mond van embryo's, maar zijn optioneel. - Breng embryo's onmiddellijk via de mondpipetitie terug in het midden van de met PST-1P behandelde KSOM-druppel in de beeldvormingskamerdia die is voorbereid in stappen 2.4-2.6 (figuur 1A).
- Incubeer embryo's bij 37 °C en 5% CO2 in PST-1P-behandelde KSOM in de beeldvormingskamerdia gedurende ten minste 1 uur vóór de beeldvorming. Monteer de kamerglaasjes indien mogelijk op de microscoop in een omgevingskamer bij 37 °C en 5% CO2, en in volledige duisternis om ervoor te zorgen dat alle PST-1P's zich in de inactieve transconfiguratie bevinden en dat embryo's naar de bodem van de schaal kunnen zinken.
3. Live imaging en PST-1P fotoactivatie
OPMERKING: Stappen 3.1-3.13 worden uitgevoerd op een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met lawinefotodiodedetectoren (APD's) en een donkere omgevingskamer. Deze instructies hebben specifiek betrekking op de beeldvormingsopstelling met behulp van de acquisitiesoftware die wordt beschreven in de Tabel met materialen; ze kunnen echter ook worden toegepast op andere confocale microscopiesystemen.
- Bereid een 63x/1.2 NA waterolie-onderdompelingsdoel voor met het voorgeschreven onderdompelingsmedium.
- Gebruik een roodlichtlamp om de positionering te begeleiden en het doel te bereiken om contact te maken met het onderdompelingsmedium. Vermijd in dit stadium het gebruik van wit of helder veldlicht om de embryo's te vinden, omdat dit PST-1P vroegtijdig kan activeren.
- Gebruik het oculair en onder roodlichtverlichting, lokaliseer de rand van de druppel medium en plaats het objectief direct boven deze locatie. Dit kan de gebruiker helpen om de oriëntatie vast te stellen en het brandpuntsvlak te vinden.
- Gebruik vervolgens via het oculair of op software-enabled live-mode scanning een rood golflengtefilter of 561 nm laser om de embryo's in de druppel te lokaliseren.
- Gebruik stagecontrollers en live-scanmodus om de begin- en eindpunten in te stellen voor het verkrijgen van een z-stack van het hele embryo.
- Pas de laservermogensinstellingen aan (meestal is bij zeer gevoelige detectoren zoals de APD's een laservermogen van 561 nm van minder dan 5% voldoende), digitale offset (meestal bij -0,900) om het uiterlijk van EB3-dTomato-kometen te optimaliseren en achtergrondgeluid te minimaliseren, pinhole bij 2 μm, pixelresolutie van 512 x 512 en pixelverblijftijd van 3,15 μs.
- Verkrijg een z-stack van het hele embryo met intervallen van 1 μm sectie om gebieden met microtubulegroei in het hele organisme te beoordelen (figuur 1B).
- Gebruik de 3D z-stack-afbeelding uit stap 3.7 om interessante regio's (ROI's) te identificeren voor EB3-dTomato-trackingexperimenten. Verhoog de zoom tot 3x en teken een rechthoekige ROI rond het specifieke subcellulaire interessegebied.
- Verkrijg een time-lapse-film van een enkel z-vlak met behulp van de typische waarden van beeldparameters: 561 nm laservermogen bij 5%, digitale offset van -0,900, pixelresolutie van 512 x 512, pinhole bij 3 μm, pixel dwell-tijd van 3,15 μs, zoom van 3x, tijdsinterval van 500 ms.
OPMERKING: 120 tijdframes bieden een trackingfilm van 1 minuut en zouden voldoende moeten zijn voor gegevensanalyse. De overname kan langer doorgaan, mits het bleken van de fluorofoor minimaal is (figuur 1C). - Om PST-1P te activeren, schakelt u over naar een 405 nm-laser en krijgt u nog een time-lapse-film met de 405 nm-laser ingesteld op 10% vermogen, pixelresolutie van 512 x 512, pinhole maximaal geopend, pixelverblijftijd van 3,15 μs, zoom van 3x, tijdsinterval van 500 ms en een totaal van 20 frames (figuur 1D).
- Schakel terug naar 561 nm laser en herhaal acquisitie zoals in stap 3.9 om het verlies van EB3-dTomato-kometen na activering van PST-1P te bevestigen (Figuur 1E). Zorg ervoor dat deze overname zo snel mogelijk na activering plaatsvindt.
OPMERKING: Stap 3.10 kan herhaaldelijk worden uitgevoerd voor langere remming van EB3-dTomato-kometen. Embryo's moeten echter zorgvuldig worden gecontroleerd om schade door UV-licht te voorkomen. - Om PST-1P terug te brengen naar de inactieve trans-toestand, schakelt u een 514 nm laser in op 10% vermogen. Koop een time-lapse-film met de 514 nm-laser ingesteld op 10% vermogen, pixelresolutie van 512 x 512, pinhole maximaal geopend, pixelverblijftijd van 3,15 μs, zoom van 3x, tijdsinterval van 500 ms en in totaal 20 tijdframes (figuur 1F).
- Herhaal stap 3.11 om het herstel van EB3-dTomato-kometen te visualiseren (figuur 1G).
4. Analyse van beeldgegevens
- Voor het analyseren en kwantificeren van de remming van microtubule polymerisatie door PST's, gebruik softwareprogramma's die beschikbaar zijn voor onderzoekers om aan hun specifieke behoeften te voldoen. Degenen die worden aanbevolen voor gebruik, beschikken over een trackingtool, die handmatig of automatisch de beweging, richting en snelheid van EB3-dTomato-kometen 16,18 kan volgen.
Figuur 1: Schematische weergave van PST-1P fotoactivatie en deactivering in het levende 3D pre-implantatie muizenembryo. Alle experimenten worden uitgevoerd in volledige duisternis (zwarte achtergrond) of alleen door roodlichtverlichting. (A) Levende pre-implantatiemuismyo's die EB3-dTomato tot expressie brengen, worden gekweekt in het 16-celstadium en vervolgens overgebracht naar een druppel KSOM met 40 μM PST-1P in een beeldvormingskamerdia. (B) Een 3D-beeld van het hele embryo maakt de beoordeling van de groei van microtubuli mogelijk door de verdeling van EB3-dTomato-kometen te visualiseren. (C) Om het experiment te starten, worden EB3-dTomato-kometen gevolgd in een subcellulair gebied met behulp van time-lapse beeldvorming. (D) Daaropvolgende PST-1P-fotoactivatie in hetzelfde subcellulaire gebied met behulp van een 405 nm-laser resulteert in het verlies van EB3-dTomato-kometen (E). Geïntensiveerde PST-1P-activering kan, indien nodig, worden geïmplementeerd door sequentiële 405 nm lichtverlichting. (F-G) Om PST-1P terug te brengen naar zijn inactieve toestand en EB3-dTomato-kometen te herstellen, wordt een 514 nm-laser toegepast op hetzelfde subcellulaire gebied. Indien nodig kunnen meerdere foto-activerings- en deactiveringsrondes worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In overeenstemming met het protocol werden pre-implantatiemuismyo's micro-geïnjecteerd met cRNA voor EB3, gelabeld met rood fluorescerend dTomato (EB3-dTomato). Dit maakt de visualisatie van groeiende microtubuli mogelijk terwijl EB3 zich bindt aan polymeriserende microtubuli plus uiteinden24.
De experimenten werden 3 dagen na de bevruchting (E3) uitgevoerd wanneer het muizenembryo uit 16 cellen bestaat. Elke andere pre-implantatie ontwikkelingsstadium kan worden gebruikt, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag die moet worden onderzocht. Om minimale fotobleaching aan te tonen met behulp van het 405 nm laserlichtactiveringsprotocol, wordt een controle-experiment met een onbehandeld embryo getoond (figuur 2A i). Een ROI met opvallende EB3-dTomato-dichtheid wordt gekozen op basis van het verkregen 3D-beeld van het embryo. In dit voorbeeld wordt een enkel z-vlak van een hele cel gebruikt voor EB3-dTomato-beeldvorming met hoge resolutie. Verschillende regio's van het embryo kunnen echter naar behoefte worden geselecteerd (bijvoorbeeld corticale regio, perinucleair gebied, een mitotische cel, een binnenste of buitenste cel). Een afbeelding van EB3-dTomato-expressie vóór 405 nm laserlichtverlichting toont een zeer dicht EB3-dTomato-signaal in het gehele cytoplasma van de cel, behalve het nucleaire gebied (figuur 2A ii). Er werd geen verandering in EB3-dTomato-dichtheid waargenomen na 405 nm laserlichtverlichting (figuur 2A iii en iv). Het 405 nm laserlicht op zich veroorzaakt dus geen fotoschade aan de embryo- of microtubulidynamica.
Vervolgens werden embryo's in het 16-celstadium behandeld met 40 μM PST-1P 3 uur vóór live beeldvorming en in het donker gehouden. Om PST-experimenten met succes uit te voeren op levende 3D-organismen, is het van cruciaal belang om het optimale evenwicht van PST-concentratie, incubatietijd en vereiste laserkracht te vinden om schadelijke effecten te voorkomen11. Onder strikte donkere omstandigheden kan een sterke EB3-dTomato-expressie worden gedetecteerd in het 3D-beeld (figuur 2B i), vergelijkbaar met controle-embryo's (figuur 2A i). PST-1P lokt dus geen remming uit van microtubulipolymerisatie onder donkere omstandigheden. Time-lapse beeldvorming van een enkel z-vlak bevestigde sterke EB3-dTomato-expressie en microtubulepolymerisatie voorafgaand aan 405 nm laserlichtverlichting (figuur 2B ii). Binnen enkele seconden werd een vermindering van het EB3-dTomato-signaal waargenomen na 405 nm laserlichtactivering van PST-1P (figuur 2B iii). Dit verlies duurt naar verluidt ongeveer 2 tot 20 minuten voordat het geleidelijk terugkeert als gevolg van thermische ontspanning of diffusie in omliggende gebieden11. Een repetitieve 405 nm laserlichtactivering kan dus de duur van EB3-dTomato-verlies verlengen (figuur 1E-D). Belangrijk is dat embryo's die micro-geïnjecteerd zijn met EB3-dTomato en geïncubeerd met PST-1P een normaal embryonaal potentieel vertonen, zich ontwikkelen tot het blastocyststadium (figuur 3 en aanvullende figuur 1) en normale microtubulidynamica, bijvoorbeeld tijdens mitose (aanvullende figuur 2). Daarom vertoont inactieve PST-1P geen toxiciteit voor het embryo.
Gecontroleerde PST-1P-deactivering kan worden bereikt door 514 nm laserlichtverlichting (figuur 2B iv). Hoewel deze benadering nuttig kan zijn om de oorsprong van microtubuligroei na PST-1P-geïnduceerde groeiremming te bepalen, sluit het het gebruik van groene fluorescerende eiwitten voor live beeldvorming uit. Hoewel het ten zeerste wordt aanbevolen om in donkere omstandigheden te werken, zorgt groene lichtverlichting ervoor dat PST terugkeert naar een inactieve transstatus als PST per ongeluk wordt geactiveerd als PST's onbedoeld worden geactiveerd. In deze omstandigheid is een adequate periode van herstel voor de cellen vereist als voorzorgsmaatregel om ervoor te zorgen dat cellen kunnen terugkeren naar hun pre-activeringstoestand. Als de tijd het toelaat, zou het idealiter minimaal een paar uur zijn.
Figuur 2: Live beeldvorming van EB3-dTomato voor en na uv-lichtactivering en deactivering van PST-1P in het levende muizenembryo. (A i) Maximale projectie 3D z-stack van een onbehandeld controle 16-cels muisembryo gelabeld voor EB3-dTomato. Een cytokinetische microtubulebrug is aanwezig (aangeduid met grijze pijlpunt) naast meerdere interfasebruggen (aangeduid met gele pijlpunten). (A ii) Enkel z-vlak van één cel afgebeeld vóór 405 nm laserblootstelling. (A iii-iv) Enkel z-vlak van één cel onmiddellijk afgebeeld (A iii) en 4 min (A iv) na 405 nm blootstelling aan laserlicht (aangegeven door een violette bliksemschicht), wat geen verandering in eb3-dTomato-signaal laat zien. (B i) Maximale projectie 3D z-stack van een embryo met 16 cellen gelabeld voor EB3-dTomato, dat wordt behandeld met 40 μM PST-1P en in het donker wordt bewaard. Interfasebruggen worden aangegeven door gele pijlpunten. (B ii) Eén z-vlak van één cel in beeld gebrachte pre-activering. (B iii) Enkel z-vlak van één cel afgebeeld onmiddellijk na 405 nm blootstelling aan laserlicht (aangegeven door een violette bliksemschicht), wat een duidelijke vermindering van het EB3-dTomato-signaal laat zien. (B iv) Enkel z-vlak van één cel afgebeeld onmiddellijk na 514 nm blootstelling aan laserlicht (aangegeven door een groene bliksemschicht), met herstel van EB3-dTomato-signaal. Kernen worden aangegeven door de onderbroken blauwe lijn. Schaalbalken: 15 μm voor volledige 3D-embryo's; 5 μm in inzetstukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Inactieve PST-1P-kweekomstandigheden maken een normale embryonale ontwikkeling tot blastocyststadium mogelijk. (A) Enkel differentieel interferentiecontrast (DIC) z-vlak van een embryo in blastocyststadium (E4.5) na kweek in 40 μM PST-1P in het donker. (B) Maximale projectie 3D z-stack van het embryo weergegeven in (A), met EB3-dTomato-expressie. Schaalbalken: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In de verworven time-lapse-films verschijnt EB3-dTomato-etikettering als "komeetachtige" structuren en maakt het mogelijk om groeiende microtubulifilamenten te volgen (figuur 4). In met PST-1P behandelde embryo's die in donkere omstandigheden worden gehouden (figuur 4A), zijn individuele EB3-dTomato-kometen (aangeduid met witte en gele pijlpunten in figuur 4B) te zien die afkomstig zijn van de interfasebrug, die fungeert als een niet-centrosomaal microtubule-organiserend centrum in het vroege muizenembryo16 (figuur 4B). Een projectie van tijdspunten (t-stack) toont het totale aantal en de afstand afgelegd door EB3-dTomato-kometen (figuur 4B), met de hoogste dichtheid van EB3-dTomato in het gebied van de interfasebrug. Na activering van PST-1P met een 405 nm laserlicht zijn EB3-dTomato-kometen niet meer te zien aan de basis van de interfasebrug en zijn ze ook afwezig in de t-stack (figuur 4C).
Figuur 4: Tracking van EB3-dTomato-kometen voor en na subcellulaire UV-lichtactivering van PST-1P in het levende muizenembryo. (A) Maximale projectie 3D z-stack van een 16-cels muisembryo gelabeld voor EB3-dTomato, behandeld met 40 μM PST-1P en in het donker bewaard. (B) Vier geselecteerde enkele z-vlakken en bijbehorende t-stack van een ROI op de interfasebrug (aangegeven door *) vóór 405 nm laserverlichting, met EB3-dTomato-kometen in de loop van de tijd. De beweging van individuele kometen wordt aangegeven door de gele en witte pijlpunten, terwijl de op kleur afgestemde pijlpunten komeetposities op eerdere tijdstippen weergeven. De getoonde tijden zijn in seconden(en). (C) Vier geselecteerde enkele z-vlakken en bijbehorende t-stack van de interfasebrug afgebeeld onmiddellijk na 405 nm laserlichtblootstelling (aangegeven door een violette bliksemschicht) tonen een verlies van EB3-dTomato-kometen. Schaalbalken: 10 μm voor volledig 3D-embryo; 2 μm voor enkele z-vlakken; 1,5 μm voor t-stack. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Samen tonen deze resultaten de toepassing van PST-1P in het levende pre-implantatiemuismyo. PST-1P remt effectief microtubule polymerisatie na activering met een 405 nm laser en deze remming is omkeerbaar bij 514 nm laserlichtverlichting op cellulair en subcellulair niveau.
Aanvullende figuur 1: Pre-implantatie-embryo's gekweekt in inactieve PST-1P vertonen een normaal ontwikkelingspotentieel tot blastocyststadium. (A) Onbehandelde controles en (B) met PST-1P behandelde embryo's die een ontwikkelingssnelheid tot het blastocyststadium vertonen. Alle embryo's werden tijdens de ontwikkeling in donkere omstandigheden gehouden om inactiviteit van PST-1P te garanderen. De snelheid van ontwikkeling tot blastocyststadium was vergelijkbaar tussen controles (100%, n = 13) en PST-1P behandelde embryo's (91,3%, n = 23). Schaalbalken zijn 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Pre-implantatie-embryo's gekweekt in inactieve PST-1P vertonen een normale spindeldynamiek tijdens mitose. (A) Onbehandelde controles en (B) MET PST-1P behandelde embryo's die zich delen van het 8-cels naar het 16-celstadium, geïnjecteerd met EB3-dTomato en Histone 2B (H2B)-GFP. Alle embryo's werden tijdens de ontwikkeling in donkere omstandigheden gehouden om inactiviteit van PST-1P te garanderen. Uitlijning van chromosomen kan worden gezien (A i en B i), gevolgd door vroege anafase (A ii en B ii), late anafase (A iii en B iii) en cytokinese (A iv en B iv) zonder defecten. Schaalbalken zijn 10 μm in 3D-afbeeldingen en 5 μm in inzetstukken. (C) Anafase duurde gemiddeld 8 min 53 s in controles en 8 min 40 s in met PST-1P behandelde embryo's (p-waarde = 0,8241) en (D) chromosomen gedecondenseerd tijdens telophase een gemiddelde van 19 min 38 s in controles en 18 min 51 s na anafase-initiatie in met PST-1P behandelde embryo's (p-waarde = 0,2743). Voor analyse, n = 10 in controles en n = 12 in PST-1P behandeling. Bovendien worden alle cellen zoals verwacht in één synchrone golf verdeeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het microtubulinetwerk is een integraal onderdeel van de fundamentele innerlijke werking van een cel. Bijgevolg biedt dit uitdagingen bij het manipuleren van microtubulidynamica in levende organismen, omdat elke verstoring van het netwerk de neiging heeft wijdverspreide gevolgen te hebben voor alle aspecten van de cellulaire functie. De opkomst van fotoschakelbare microtubule-targeting verbindingen biedt een manier om het cytoskelet nauwkeurig te manipuleren op een subcellulair niveau, met superieure controle voor de inductie en omkering van microtubuligroeiremming9. Dit protocol laat zien hoe microtubule polymerisatie kan worden geremd in het pre-implantatiemuismyo door lichtgeactiveerde PST-1P op subcellulaire schaal en op een temporeel nauwkeurige manier. Bovendien kan deze remming worden teruggedraaid om onderzoek naar kortetermijnverstoring van het microtubule-netwerk mogelijk te maken.
Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor de toepassing van PST's op levende pre-implantatiemuismyo's en kan worden gebruikt als basis voor het uitbreiden van het gebruik ervan naar verschillende andere kweeksystemen. Nieuwe gebruikers van PST's kunnen enkele punten tegenkomen in hun toepassingen die probleemoplossing vereisen, waarvoor verschillende probleemoplossende stappen worden gepresenteerd.
Cytotoxiciteit van PST's moet worden beoordeeld en er moet een werkconcentratie worden gekozen die een sterke remming van de groei van microtubuli met minimale toxiciteit voor cellen veroorzaakt. Een uitgebreid protocol voor het optimaliseren van de werkconcentraties van PST's en andere fotoschakelaars werd gedetailleerd beschreven in een recente pre-print11. Kortom, nieuwe gebruikers van PST's kunnen cytotoxiciteit beoordelen in donkere omstandigheden met seriële verdunningen van het medicijn. In deze setting zou er geen meetbaar effect moeten zijn op EB3-dTomato-kometen en geen toxiciteit voor de cellen. Dit biedt een startpunt voor het testen van een niet-cytotoxische concentratie onder verlichte omstandigheden. Voor verdere experimenten wordt de laagste concentratie aanbevolen die een vermindering van EB3-dTomato-kometen veroorzaakt.
Zoals bij elke medicamenteuze behandeling kunnen PST's door de cel worden gemetaboliseerd; vanuit praktisch oogpunt is dit echter waarschijnlijk verwaarloosbaar, zoals blijkt uit incubatie van C. elegans-embryo's in PST-1P gedurende 150 minuten en daaropvolgende effectieve isomerisatie9. Voor zeer metabolisch actieve systemen kan een verhoogde concentratie PST-1P nodig zijn. PST's kunnen ook diffunderen via het kweekmedium, waardoor de belasting van actieve PST's binnen de ROI wordt verminderd. Om dit te verminderen, kan herhaalde fotoactivatie nodig zijn, waarvan de cytotoxiciteit op individuele celtypebasis zou moeten worden beoordeeld, omdat sommige systemen vatbaar kunnen zijn voor fototoxiciteit. Evenzo kunnen geactiveerde PST's diffunderen uit de door licht geactiveerde ROI en omliggende microtubuli beïnvloeden. Vanwege hun inherente neiging om terug te ontspannen naar de inactieve trans-toestand, zou het effect op omliggende gebieden echter verwaarloosbaar moeten zijn.
Een ander potentieel obstakel voor het gebruik van PST's heeft betrekking op hun toepassing in organoïden of grotere organismen vanwege de aard van de beperkte lichtdoordringbaarheid van deze weefsels. Grotere weefsels zijn mogelijk niet toegankelijk voor de fotoactivering van diepere cellen. Het pre-implantatiemuismyo vormt een unieke uitdaging omdat het is omgeven door een buitenste coating, de zona pellucida, die de permeabiliteit van geneesmiddelen die aan de media worden toegevoegd, kan belemmeren. Om dit te verminderen, worden embryo's gedurende ten minste 1 uur voorgeïncubeerd in PST-1P voordat ze worden afgebeeld. Vergelijkbare optimalisatiebenaderingen kunnen van toepassing zijn om de penetratie van het geneesmiddel te verbeteren bij het gebruik van PST's in systemen van hele organismen of organoïden, zoals de toevoeging van acetonitril om de cellulaire opname van PST'ste bevorderen 9.
Vanwege de omkeerbaarheid van PST's voor groen licht zijn deze verbindingen niet compatibel met beeldvorming van fluoroforen die excitatie onder 530 nm vereisen (zoals GFP). Gebruikers kunnen echter fluorofoortracking implementeren met elke fluorofoor die een excitatie boven 530 nm vereist, bijvoorbeeld RFP, mCherry of mPlum. Als dubbele labeling van subcellulaire structuren vereist is, kunnen gebruikers rode en verrode fluoroforen gebruiken. Als GFP-compatibiliteit essentieel is, kan een nieuwe klasse fotoschakelaars, SBTubs, van belang zijn25. Deze verbindingen worden ook geactiveerd door UV-licht; ze reageren echter niet op groen licht, waardoor ze alleen functioneel omkeerbaar zijn door diffusie, maar ook compatibel met alle fluoroforen met een excitatiegolflengte van 488 nm of hoger. Samen met PST's, die omkeerbaarheid bieden maar niet compatibel zijn met beeldvorming van GFP, bieden deze verbindingen de gebruiker meer flexibiliteit om een aangepaste aanpak te volgen en de beschikbare fotoschakelaars aan te passen aan hun onderzoeksvraag.
Conventionele remmings-, knock-out- en knockdown-benaderingen met kleine moleculen kunnen worden geïmplementeerd op schaal van hele cellen of hele organismen om de werking van microtubuli te karakteriseren. Deze benaderingen bieden krachtige, maar brede en destructieve effecten op microtubuli die niet gemakkelijk omkeerbaar zijn en vaak moeilijk te richten zijn op een subcellulaire of temporeel gecontroleerde manier. Een strategie om deze beperkingen te omzeilen is door de genetische manipulatie van een licht-induceerbaar optogenetisch systeem. De toepassingen van deze systemen variëren sterk en omvatten lichtgeïnduceerde heterodimerisatie, homodimerisatie en dissociatie van eiwitten of eiwitdomeinen26. Onlangs is een optogenetisch gestuurde eindbindende eiwit 1 (EB1) constructie ontworpen, waarbij een licht-induceerbare schakelaar disassociatie van de amino- en carboxyl-terminals van de microtubule plus End Binding partner EB1 mogelijk maakte. Dit maakte het eiwit functioneel inactief met responstijden van minder dan een seconde, waardoor de groei van microtubuli in een menselijke longcarcinoomcellijn27 werd geblokkeerd. Evenzo werd een optogenetische schakelaar gebruikt om microtubuli- en actinefilamenten in D. melanogaster te kruisen om de invloed van cytoskeletale crosslinking op morfologische veranderingen in de cel te begrijpen28. Het gebruik van optogenetische hulpmiddelen om het vroege embryo te manipuleren is een zeer actueel onderzoeksgebied en heeft enkele recente ontwikkelingen gezien1. Een optogenetisch gemodificeerd nucleair exportsysteem werd ontwikkeld om de mislokalisatie van nucleaire eiwitten te induceren. Dit zou genetische modellen met functieverlies kunnen nabootsen, met de extra flexibiliteit die moet worden uitgevoerd op precieze ontwikkelingstijdpunten in D. melanogaster-embryo's 29. Optogenetische benaderingen zijn een krachtig hulpmiddel voor de spatiotemporale controle van microtubulidynamica; ze kunnen echter moeilijk te engineeren, tijdrovend en duur zijn. PST's bieden daarentegen een chemisch alternatief voor complexe genetische manipulatie met vergelijkbare responstijden, specificiteit en omkeerbaarheid met het extra voordeel van eenvoudig gebruik en toegankelijkheid.
Een andere gerichte aanpak om microtubule filamenten mechanisch te verstoren is laserablatie met behulp van een laser met twee fotonen. Dit werd met succes toegepast om de interfasebrug in pre-implantatiemuismyo's af tebreken 16. Wanneer goed geïmplementeerd, kunnen gebruikers een hoge pay-off bereiken. Het uitvoeren van deze techniek is echter een uitdaging en vereist een hoge mate van precisie om de vernietiging of lysis van omliggende structuren of de cellen zelf te voorkomen. Bovendien moeten gebruikers hun monsters mogelijk herhaaldelijk aborteren om het beoogde effect te bereiken, omdat microtubuli snel kunnen hergroeien30. Daarentegen remmen PST's direct de polymerisatie van microtubuli31 en voorkomen ze ongewenste effecten die kunnen optreden bij laserablatie, vanwege hun specificiteit voor binding aan β-tubuline. Bovendien kunnen PST's op het hele organisme worden toegepast, terwijl laserablatie van nature alleen op een specifiek gebied kan worden gericht.
Met behulp van dit protocol zijn de mogelijkheden voor de toepassing van PST's breed en aantrekkelijk. PST's kunnen de precieze, subcellulaire remming van microtubuligroei binnen responstijden van minder dan een seconde mogelijk maken om aspecten van chromosoomsegregatie tijdens mitotische of meiotische celdeling te bestuderen. De handel in intracellulaire lading kan worden verstoord door het remmen van de transportroutes die door het microtubulinetwerk worden geboden om endosomale handel, beweging van mitochondriën of nucleaire positionering te bestuderen. PST's werden ook gebruikt om met succes de groei van microtubuli te remmen in 3D meercellige sferoïden gekweekt uit menselijke melanoomcellijnen32,33. Het koppelen van de flexibiliteit van PST-activering aan hun uitstekende responstijden biedt onderzoekers een dynamisch hulpmiddel om microtubulidynamica te onderzoeken en de cellulaire functie te manipuleren. Bovendien maakt de omkeerbaarheid van PST's hun toepassing ideaal voor de studie van zowel korte- als langetermijngevolgen van microtubuliremming op een enkele cel of geselecteerde cellen in een weefsel of organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend of financieel belang te hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. Oliver Thorn-Seshold en Li Gao bedanken voor het verstrekken van fototatines en advies over manuscriptvoorbereiding, Monash Production voor filmondersteuning en Monash Micro Imaging voor microscopie-ondersteuning.
Dit werk werd ondersteund door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) projectsubsidie APP2002507 aan J.Z. en de Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli Scholarship aan J.Z. Het Australian Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door subsidies van de staatsregering van Victoria en de Australische regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al.
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T.
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T.
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
