I tipici inibitori dei microtubuli, ampiamente utilizzati nella ricerca di base e applicata, hanno effetti di vasta portata sulle cellule. Recentemente, le fotostattine sono emerse come una classe di inibitori dei microtubuli fotointerruttori, in grado di manipolare istantaneamente, reversibile e spaziotemporalmente precisa dei microtubuli. Questo protocollo passo-passo descrive in dettaglio l'applicazione delle fototitine in un embrione di topo preimpianto vivo 3D.
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Articolo metodologico
Manipolazione subcellulare spaziotemporale del citoscheletro del microtubulo nell'embrione di topo vivente preimpianto utilizzando le fotostattine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il citoscheletro microtubulo forma la struttura di una cellula ed è fondamentale per il trasporto intracellulare, la divisione cellulare e la trasduzione del segnale. L'interruzione farmacologica tradizionale della rete di microtubuli onnipresenti che utilizza, ad esempio, il nocodazolo può avere conseguenze devastanti per qualsiasi cellula. Gli inibitori dei microtubuli fotocomducibili in modo reversibile hanno il potenziale per superare le limitazioni consentendo l'implementazione degli effetti dei farmaci in modo spatiotemporalmente controllato. Una di queste famiglie di farmaci è la fototitina a base di azobenzene (PST). Questi composti sono inattivi in condizioni di oscurità e, dopo l'illuminazione con luce UV, si legano al sito di legame con la colchicina della β-tubulina e bloccano la polimerizzazione dei microtubuli e il turnover dinamico. Qui, l'applicazione dei PST nell'embrione di topo preimpianto vivo tridimensionale (3D) è destinata a interrompere la rete di microtubuli a livello subcellulare. Questo protocollo fornisce istruzioni per la configurazione sperimentale, nonché parametri di attivazione e disattivazione della luce per i PST utilizzando la microscopia confocale a cellule vive. Ciò garantisce la riproducibilità e consente ad altri di applicare questa procedura alle loro domande di ricerca. Fotointerruttori innovativi come i PST possono evolversi come potenti strumenti per far progredire la comprensione della rete dinamica di microtubuli intracellulari e per manipolare in modo non invasivo il citoscheletro in tempo reale. Inoltre, i PST possono rivelarsi utili in altre strutture 3D come organoidi, blastoidi o embrioni di altre specie.
Introduzione
L'architettura dei microtubuli varia ampiamente tra i diversi tipi di cellule per supportare diverse funzioni 1,2. La sua natura dinamica di crescita e restringimento consente un rapido adattamento a segnali extra- e intracellulari e di rispondere alle esigenze in continua evoluzione di una cellula. Quindi, può essere considerato come la "impronta digitale morfologica" che svolge un ruolo chiave nell'identità cellulare.
Il targeting farmacologico del citoscheletro dei microtubuli utilizzando inibitori di piccole molecole ha portato a una pletora di scoperte fondamentali nella biolog....
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Protocollo
Gli esperimenti sono stati approvati dal Monash Animal Ethics Committee con il numero di etica animale 19143. Gli animali sono stati alloggiati in specifiche condizioni di casa per animali privi di agenti patogeni presso la struttura per animali (Monash Animal Research Platform) in stretta conformità con le linee guida etiche.
1. Raccolta di embrioni di topo preimpianto
- Topi superovulati e mate come descritto in precedenza16,18, in conformità con le linee guida istituzionali di etica animale.
NOTA: I ceppi più comunemente usati per la raccolta di embrio....
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Risultati
In linea con il protocollo, gli embrioni di topo preimpianto sono stati microiniettati con cRNA per EB3, marcati con dTomato fluorescente rosso (EB3-dTomato). Ciò consente la visualizzazione di microtubuli in crescita mentre EB3 si lega al microtubulo polimerizzante più estremità24.
Gli esperimenti sono stati eseguiti 3 giorni dopo la fecondazione (E3) quando l'embrione di topo è composto da 16 cellule. Qualsiasi altra fase di sviluppo preimpianto può essere utilizzata,.......
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Discussione
La rete di microtubuli è parte integrante del funzionamento interno fondamentale di una cellula. Di conseguenza, questo presenta sfide nella manipolazione della dinamica dei microtubuli negli organismi viventi, poiché qualsiasi perturbazione della rete tende ad avere conseguenze diffuse per tutti gli aspetti della funzione cellulare. L'emergere di composti foto-commutabili che prendono di mira i microtubuli presenta un modo per manipolare con precisione il citoscheletro a livello subcellulare, con un controllo superiore .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun interesse concorrente o finanziario.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Oliver Thorn-Seshold e Li Gao per averci fornito fototine e consigli sulla preparazione del manoscritto, Monash Production per il supporto alle riprese e Monash Micro Imaging per il supporto alla microscopia.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del progetto National Health and Medical Research Council (NHMRC) APP2002507 a J.Z. e dalla borsa di studio Azrieli dell'Istituto canadese per la ricerca avanzata (CIFAR) a J.Z. L'Australian Regenerative Medicine Institute è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo aspiratore | Sigma-Aldrich | A5177 | Per apparecchio di aspirazione orale |
| Vetrini da camera - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| codifica cRNA per EB3-dTomato | N/A | N/A | Preparato secondo le istruzioni del produttore utilizzando mMessage in vitro Kit di trascrizione Piatti per |
| colture - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Ormone della crescita corionico umano | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Fluido tubarico umano (HTF) medio | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Software di analisi delle immagini Imaris | Olio da immersione Bitplane | ||
| W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | Per l'uso con la torcia LED dell'obiettivo ad immersione del microscopio |
| - Luce rossa | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Topi - wild-type FVB/N, maschi e femmine | N/A | N/A | Femmine di 8-9 settimane. Maschi di età compresa tra 2 e 6 mesi. |
| Pipette microcapillari - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | Per apparecchi di aspirazione orale |
| Tampone per microiniezione | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4 |
| Olio minerale | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Kit di trascrizione | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Gonadotropina sierica cavalla gravida | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Gli inibitori fotocommutabili della dinamica dei microtubuli controllano otticamente la mitosi e la morte cellulare. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| Kit di purificazione dell'RNA | Sangon | B511361-0100 | |
| Acqua ultrapura | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Nero Software | Carl Zeiss |
Riferimenti
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. ....
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Ristampe e permessi
