Summary
I tipici inibitori dei microtubuli, ampiamente utilizzati nella ricerca di base e applicata, hanno effetti di vasta portata sulle cellule. Recentemente, le fotostattine sono emerse come una classe di inibitori dei microtubuli fotointerruttori, in grado di manipolare istantaneamente, reversibile e spaziotemporalmente precisa dei microtubuli. Questo protocollo passo-passo descrive in dettaglio l'applicazione delle fototitine in un embrione di topo preimpianto vivo 3D.
Abstract
Il citoscheletro microtubulo forma la struttura di una cellula ed è fondamentale per il trasporto intracellulare, la divisione cellulare e la trasduzione del segnale. L'interruzione farmacologica tradizionale della rete di microtubuli onnipresenti che utilizza, ad esempio, il nocodazolo può avere conseguenze devastanti per qualsiasi cellula. Gli inibitori dei microtubuli fotocomducibili in modo reversibile hanno il potenziale per superare le limitazioni consentendo l'implementazione degli effetti dei farmaci in modo spatiotemporalmente controllato. Una di queste famiglie di farmaci è la fototitina a base di azobenzene (PST). Questi composti sono inattivi in condizioni di oscurità e, dopo l'illuminazione con luce UV, si legano al sito di legame con la colchicina della β-tubulina e bloccano la polimerizzazione dei microtubuli e il turnover dinamico. Qui, l'applicazione dei PST nell'embrione di topo preimpianto vivo tridimensionale (3D) è destinata a interrompere la rete di microtubuli a livello subcellulare. Questo protocollo fornisce istruzioni per la configurazione sperimentale, nonché parametri di attivazione e disattivazione della luce per i PST utilizzando la microscopia confocale a cellule vive. Ciò garantisce la riproducibilità e consente ad altri di applicare questa procedura alle loro domande di ricerca. Fotointerruttori innovativi come i PST possono evolversi come potenti strumenti per far progredire la comprensione della rete dinamica di microtubuli intracellulari e per manipolare in modo non invasivo il citoscheletro in tempo reale. Inoltre, i PST possono rivelarsi utili in altre strutture 3D come organoidi, blastoidi o embrioni di altre specie.
Introduction
L'architettura dei microtubuli varia ampiamente tra i diversi tipi di cellule per supportare diverse funzioni 1,2. La sua natura dinamica di crescita e restringimento consente un rapido adattamento a segnali extra- e intracellulari e di rispondere alle esigenze in continua evoluzione di una cellula. Quindi, può essere considerato come la "impronta digitale morfologica" che svolge un ruolo chiave nell'identità cellulare.
Il targeting farmacologico del citoscheletro dei microtubuli utilizzando inibitori di piccole molecole ha portato a una pletora di scoperte fondamentali nella biologia dello sviluppo, nella biologia delle cellule staminali, nella biologia del cancro e nella neurobiologia 3,4,5,6,7. Questo approccio, sebbene indispensabile, presenta varie limitazioni come la tossicità e gli effetti fuori bersaglio. Ad esempio, uno degli agenti bersaglio dei microtubuli più utilizzati, il nocodazolo, è un potente farmaco depolimerizzante dei microtubuli8. Tuttavia, gli inibitori di piccole molecole come il nocodazolo sono attivi dal momento dell'applicazione e, data la natura essenziale del citoscheletro dei microtubuli a molte funzioni cellulari critiche, la depolimerizzazione globale dei microtubuli può produrre effetti fuori bersaglio, che possono essere inadatti per molte applicazioni. Inoltre, il trattamento con nocodazolo è irreversibile a meno che i campioni non vengano lavati senza il farmaco, impedendo l'imaging vivo continuo e, quindi, il tracciamento preciso dei singoli filamenti di microtubuli.
Lo sviluppo di composti attivati dalla luce è iniziato con la creazione di molecole fotonunciate e ha annunciato una nuova era nel targeting e nel monitoraggio degli effetti dell'inibizione della crescita dei microtubuli in modo preciso e controllato spaziotemporalmente. Una famiglia di farmaci reversibilmente fotocommutabili, le fotostattine (PST), sono state sviluppate sostituendo il componente stilbene della combretastatina A-4 con l'azobenzene9. I PST sono inattivi fino all'illuminazione con luce UV, per cui la trans-configurazione inattiva si converte nella configurazione cis attiva mediante isomerizzazione reversibile. I Cis-PST inibiscono la polimerizzazione dei microtubuli legandosi al sito di legame della colchicina della β-tubulina, bloccando la sua interfaccia con β-tubulina e impedendo la dimerizzazione necessaria per la crescita dei microtubuli10. Tra una coorte di PST, PST-1P è emerso come un composto di piombo in quanto ha la più alta potenza, è completamente solubile in acqua e mostra un rapido inizio di bioattività dopo l'illuminazione.
L'isomerizzazione trans-cis più efficace dei PST si verifica a lunghezze d'onda comprese tra 360-420 nm, il che consente la doppia opzione per l'attivazione PST. Una linea laser da 405 nm su un tipico microscopio confocale può essere somministrata per un targeting spaziale ottimale dell'inibizione della crescita dei microtubuli. La capacità di individuare la posizione e la tempistica dell'attivazione PST attraverso l'illuminazione laser a 405 nm facilita un controllo temporale e spaziale preciso, consentendo l'interruzione della dinamica dei microtubuli a livello subcellulare, entro tempi di risposta inferiori al secondo9. In alternativa, una luce UV a LED a prezzi accessibili consente all'illuminazione dell'intero organismo di indurre l'interruzione dell'architettura dei microtubuli a livello di organismo. Questa può essere un'alternativa economica per i ricercatori per i quali l'inizio preciso dell'inibizione, piuttosto che il targeting spaziale, è l'obiettivo. Un'altra caratteristica dei PST è la loro inattivazione su richiesta applicando la luce verde di una lunghezza d'onda nell'intervallo 510-540 nm9. Ciò consente di tracciare i filamenti di microtubuli prima, durante e dopo l'inibizione della crescita mediata da PST.
I PST, pur essendo ancora un progetto relativamente recente, sono stati utilizzati in numerose applicazioni in vitro in diversi campi di ricerca11, tra cui lo studio di nuovi meccanismi di migrazione cellulare negli ameboidi12, nei neuroni isolati dal cervello del topo neonato13 e lo sviluppo dell'epitelio alare in Drosophila melanogaster14 . Altri farmaci reattivi alla luce hanno dimostrato di essere strumenti preziosi per l'interruzione mirata della funzione cellulare. Ad esempio, un analogo di blebbistatin, azidoblebbistatin, è stato utilizzato per una maggiore inibizione della miosina sotto illuminazione15,16. Ciò evidenzia il potenziale per nuove scoperte grazie alla capacità di inibizione della funzione cellulare controllata spatiotemporalmente.
Gli organismi 3D vivi presentano sistemi superbi ma più delicati per manipolare la dinamica dei microtubuli a livello di intero animale, singola cellula o subcellulare in condizioni fisiologiche. In particolare, l'embrione di topo preimpianto offre una visione eccezionale del funzionamento interno della cellula e delle relazioni intercellulari all'interno di un organismo17. Cicli consecutivi di attivazione e disattivazione dei PST temporalmente e spazialmente mirati hanno contribuito alla caratterizzazione del ponte interfase, una struttura post-citocinetica tra cellule, come centro di organizzazione dei microtubuli non centrosomiali nell'embrione di topo preimpianto16. Una configurazione sperimentale simile ha dimostrato il coinvolgimento dei microtubuli in crescita nella sigillatura dell'embrione di topo per consentire la formazione di blastocisti18. Inoltre, i PST sono stati utilizzati anche in embrioni interi di zebrafish per studiare la migrazione delle cellule neuronali inibendo la crescita di microtubuli in un sottogruppo di cellule nel cervello posteriore19.
Questo protocollo descrive la configurazione sperimentale e l'uso di PST-1P nell'embrione di topo preimpianto. Le istruzioni qui presentate possono anche guidare l'applicazione dei PST per una vasta gamma di obiettivi come lo studio della segregazione cromosomica e della divisione cellulare, il traffico di carichi intracellulari e la morfogenesi e migrazione cellulare. Inoltre, tali studi aiuteranno l'implementazione di PST in sistemi organoidi, blastoidi e altri modelli embrionali come Caenorhabditis elegans e Xenopus laevis, oltre a espandere potenzialmente l'uso di PST per le tecnologie di fecondazione in vitro .
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Protocol
Gli esperimenti sono stati approvati dal Monash Animal Ethics Committee con il numero di etica animale 19143. Gli animali sono stati alloggiati in specifiche condizioni di casa per animali privi di agenti patogeni presso la struttura per animali (Monash Animal Research Platform) in stretta conformità con le linee guida etiche.
1. Raccolta di embrioni di topo preimpianto
- Topi superovulati e mate come descritto in precedenza16,18, in conformità con le linee guida istituzionali di etica animale.
NOTA: I ceppi più comunemente usati per la raccolta di embrioni vivi sono topi C57BL/6 o FVB/N. Tutti i dati mostrati qui sono stati generati utilizzando mouse FVB / N. - La mattina dopo l'accoppiamento, sciacquare gli zigoti dall'ovidotto usando il mezzo M2 come descritto20 o il mezzo del liquido tubarico umano (HTF). Utilizzando un apparecchio a pipetta orale come descritto21,22, trasferire gli zigoti in goccioline fresche KSOM (Potassium Simplex Optimised Medium), preriscaldate a 37 °C ed equilibrate al 5% di CO2, in una capsula di coltura da 35 mm sovrapposta a un volume sufficiente di olio minerale per garantire la copertura mediatica.
- Microiniettare zigoti come descritto20 con codifica cRNA per un microtubulo rosso marcato fluorescente più marcatore finale. Qui, il cRNA per la proteina legante finale 3 (EB3)-dTomato è stato utilizzato a una concentrazione di 30 ng / μL dopo la preparazione e la purificazione come descritto16,18 e la diluizione nel tampone di microiniezione.
NOTA: Si consiglia di preparare il cRNA in anticipo e conservarlo a -20 °C fino a quando necessario. - Coltiva embrioni al buio a 37 °C e 5% di CO2 fino a quando gli embrioni non hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato per il trattamento PST-1P.
NOTA: Per una risorsa completa dei tempi di coltura richiesti per le diverse fasi embrionali si veda23. Per gli embrioni in stadio di 16 cellule utilizzati qui, dalla coltura al giorno embrionale 3 (E3) post-fecondazione.
2. Preparazione di farmaci e piatti di imaging
NOTA: per i passaggi da 2.1 a 2.10, lavorare esclusivamente in condizioni di buio o luce rossa per evitare l'attivazione involontaria di PST-1P. Il foglio di alluminio o le coperture scure devono essere utilizzati per tutti i tubi e le piastre contenenti PST.
- Preparare una concentrazione di stock di 50 mM PST-1P in acqua ultrapura.
NOTA: Il peso molecolare di PST-1P è di 440 g/mol. La soluzione madre è stabile a -20 °C fino a 1 anno. PST-1P è solubile in acqua o tampone acquoso ma non si dissolve facilmente in DMSO. - Dal passaggio 2.1, preparare una concentrazione di lavoro intermedia di 800 μM PST-1P in acqua ultrapura.
- Diluire PST-1P ad una concentrazione finale di 40 μM in KSOM fresco. Come esperimento tipico richiede circa 20 μL di KSOM trattato con PST-1P, diluire 1 μL di 800 μM PST-1P in 19 μL di KSOM per un volume finale di 20 μL per garantire che il mezzo sufficiente sia preparato in anticipo, utilizzando solo la luce rossa per la visibilità.
NOTA: Sia la concentrazione che lo stato di attivazione di una diluizione PST-1P possono essere controllati prendendo uno spettro di assorbanza UV-Vis utilizzando uno spettrofotometro che deve essere fatto durante la creazione del test. L'assorbanza a 380 nm (A380) di una diluizione completamente trans di 40 μM in una cuvetta da 1 cm dovrebbe essere di circa 0,8. Sia le forme cis- che trans hanno la stessa assorbanza a 455 nm (A455). Quando il rapporto tra A380 e A455 è di circa 9:1, la diluizione è inattiva (completamente trans). Quando il rapporto A380:A455 è 1:2, la diluizione è completamente attivata (completamente cis). I rapporti intermedi riflettono gli stati intermedi di attivazione. - Per preparare il vetrino della camera per l'imaging dal vivo, pipettare 10 μL di KSOM trattato con PST-1P nel centro di un pozzo per formare una goccia emisferica (Figura 1A).
- Aggiungere delicatamente olio minerale sufficiente a coprire la goccia, assicurandosi che non disperda il mezzo. Ciò garantirà che la goccia non evapori.
- Preriscaldare e CO 2-equilibrare la parabola della camera in un incubatore a 37 °C e 5% CO2 per un minimo di 3 ore o al massimo, durante la notte.
- Alla fine del periodo di equilibratura nel passaggio 2.6, preparare una piastra di coltura da 35 mm con una goccia da 10 μL di KSOM trattato con PST-1P, preriscaldato ed equilibrato come fase di lavaggio. Non sovrapporre con olio.
- Trasferire gli embrioni mediante pipettaggio orale nella goccia KSOM trattata con PST-1P dal passaggio 2.7.
NOTA: i passaggi 2.7 e 2.8 sono raccomandati per il pipettaggio orale degli embrioni, ma sono facoltativi. - Trasferire immediatamente gli embrioni mediante pipettaggio orale al centro della goccia KSOM trattata con PST-1P nel vetrino della camera di imaging preparato nei passaggi 2.4-2.6 (Figura 1A).
- Incubare embrioni a 37 °C e 5% di CO2 in KSOM trattato con PST-1P nel vetrino della camera di imaging per almeno 1 ora prima dell'imaging. Se possibile, montare il vetrino della camera sul microscopio all'interno di una camera ambientale a 37 °C e 5% di CO2 e nella completa oscurità per garantire che tutti i PST-1P siano nella trans-configurazione inattiva e che gli embrioni possano affondare sul fondo del piatto.
3. Imaging dal vivo e fotoattivazione PST-1P
NOTA: I passaggi da 3.1 a 3.13 vengono eseguiti su un microscopio confocale a scansione laser dotato di rilevatori di fotodiodi a valanga (APD) e una camera ambientale scura. Queste istruzioni si riferiscono specificamente alla configurazione dell'imaging utilizzando il software di acquisizione descritto nella Tabella dei materiali; tuttavia, possono essere applicati anche ad altri sistemi di microscopia confocale.
- Preparare un obiettivo di immersione in acqua 63x/1.2 NA con il mezzo di immersione prescritto.
- Utilizzando una torcia a luce rossa per guidare il posizionamento, avanzare l'obiettivo per contattare il mezzo di immersione. In questa fase, evitare di utilizzare la luce bianca o a campo brillante per trovare gli embrioni in quanto ciò potrebbe attivare precocemente PST-1P.
- Utilizzando l'oculare e sotto l'illuminazione a luce rossa, individuare il bordo della goccia di mezzo e posizionare l'obiettivo direttamente su questa posizione. Questo può aiutare l'utente a stabilire l'orientamento e trovare il piano focale.
- Successivamente, attraverso l'oculare o la scansione in modalità live abilitata dal software, utilizzare un filtro a lunghezza d'onda rossa o un laser a 561 nm per localizzare gli embrioni all'interno della goccia.
- Utilizza i controller di fase e la modalità di scansione dal vivo per impostare i punti di inizio e di fine per l'acquisizione di uno z-stack dell'intero embrione.
- Regolare le impostazioni di potenza del laser (in genere, con rilevatori altamente sensibili come gli APD, è sufficiente una potenza laser di 561 nm inferiore al 5%), offset digitale (in genere a -0,900) per ottimizzare l'aspetto delle comete EB3-dTomato e ridurre al minimo il rumore di fondo, foro stenopeico a 2 μm, risoluzione pixel di 512 x 512 e tempo di permanenza dei pixel di 3,15 μs.
- Acquisire una z-stack dell'intero embrione con intervalli di sezione di 1 μm per valutare le aree di crescita dei microtubuli nell'intero organismo (Figura 1B).
- Utilizzare l'immagine 3D z-stack del passaggio 3.7 per identificare le regioni di interesse (ROI) per gli esperimenti di tracciamento EB3-dTomato. Aumentare lo zoom a 3x e disegnare un ROI rettangolare attorno alla specifica area subcellulare di interesse.
- Acquisire un filmato time-lapse di un singolo piano z utilizzando i valori tipici dei parametri di imaging: potenza laser 561 nm al 5%, offset digitale di -0,900, risoluzione pixel di 512 x 512, foro stenopeico a 3 μm, tempo di permanenza pixel di 3,15 μs, zoom di 3x, intervallo di tempo di 500 ms.
NOTA: 120 intervalli di tempo forniranno un filmato di monitoraggio di 1 minuto e dovrebbero essere sufficienti per l'analisi dei dati. L'acquisizione può continuare più a lungo, a condizione che lo sbiancamento del fluoroforo sia minimo (Figura 1C). - Per attivare PST-1P, passare a un laser a 405 nm e acquisire un altro filmato time-lapse con il laser a 405 nm impostato al 10% di potenza, risoluzione pixel di 512 x 512, foro stenopeico aperto al massimo, tempo di permanenza dei pixel di 3,15 μs, zoom di 3x, intervallo di tempo di 500 ms e un totale di 20 fotogrammi (Figura 1D).
- Tornare al laser a 561 nm e ripetere l'acquisizione come nel passaggio 3.9 per confermare la perdita di comete EB3-dTomato dopo l'attivazione di PST-1P (Figura 1E). Assicurarsi che questa acquisizione avvenga il prima possibile dopo l'attivazione.
NOTA: Il passo 3.10 può essere eseguito ripetutamente per un'inibizione più lunga delle comete EB3-dTomato. Tuttavia, gli embrioni devono essere monitorati attentamente per evitare danni causati dalla luce UV. - Per invertire PST-1P al suo trans-stato inattivo, innestare un laser a 514 nm con una potenza del 10%. Acquisire un filmato time-lapse con il laser a 514 nm impostato al 10% di potenza, risoluzione pixel di 512 x 512, foro stenopeico aperto al massimo, tempo di permanenza dei pixel di 3,15 μs, zoom di 3x, intervallo di tempo di 500 ms e un totale di 20 intervalli di tempo (Figura 1F).
- Ripetere il passaggio 3.11 per visualizzare il recupero delle comete EB3-dTomato (Figura 1G).
4. Analisi dei dati delle immagini
- Per analizzare e quantificare l'inibizione della polimerizzazione dei microtubuli da parte dei PST, utilizzare programmi software a disposizione dei ricercatori per soddisfare le loro esigenze specifiche. Quelli consigliati per l'uso avranno uno strumento di tracciamento, in grado di tracciare manualmente o automaticamente il movimento, la direzione e la velocità delle comete EB3-dTomato16,18.
Figura 1: Rappresentazione schematica della fotoattivazione e disattivazione PST-1P nell'embrione di topo preimpianto 3D vivo. Tutti gli esperimenti vengono eseguiti nella completa oscurità (sfondo nero) o solo con illuminazione a luce rossa. (A) Gli embrioni di topo preimpianto vivi che esprimono EB3-dTomato vengono coltivati allo stadio a 16 cellule e quindi trasferiti in una goccia di KSOM contenente 40 μM PST-1P in un vetrino della camera di imaging. (B) Un'immagine 3D dell'intero embrione consente la valutazione della crescita dei microtubuli visualizzando la distribuzione delle comete EB3-dTomato. (C) Per iniziare l'esperimento, le comete EB3-dTomato vengono tracciate in una regione subcellulare utilizzando l'imaging time-lapse. (D) La successiva fotoattivazione PST-1P nella stessa regione subcellulare utilizzando un laser a 405 nm provoca la perdita di comete EB3-dTomato (E). L'attivazione intensificata di PST-1P può essere implementata, se necessario, mediante illuminazione sequenziale a 405 nm. (F-G) Per invertire PST-1P al suo stato inattivo e ripristinare le comete EB3-dTomato, un laser a 514 nm viene applicato alla stessa regione subcellulare. Se necessario, è possibile eseguire più cicli di fotoattivazione e disattivazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
In linea con il protocollo, gli embrioni di topo preimpianto sono stati microiniettati con cRNA per EB3, marcati con dTomato fluorescente rosso (EB3-dTomato). Ciò consente la visualizzazione di microtubuli in crescita mentre EB3 si lega al microtubulo polimerizzante più estremità24.
Gli esperimenti sono stati eseguiti 3 giorni dopo la fecondazione (E3) quando l'embrione di topo è composto da 16 cellule. Qualsiasi altra fase di sviluppo preimpianto può essere utilizzata, a seconda della domanda scientifica da indagare. Per dimostrare un minima fotosbiancamento utilizzando il protocollo di attivazione della luce laser a 405 nm, viene mostrato un esperimento di controllo con un embrione non trattato (Figura 2A i). Un ROI con una sorprendente densità EB3-dTomato viene scelto in base all'immagine 3D acquisita dell'embrione. In questo esempio, un singolo piano z di un'intera cellula viene utilizzato per l'imaging ad alta risoluzione EB3-dTomato. Tuttavia, diverse regioni dell'embrione possono essere selezionate secondo necessità (ad esempio, regione corticale, regione perinucleare, una cellula mitotica, una cellula interna o esterna). Un'immagine dell'espressione di EB3-dTomato prima dell'illuminazione della luce laser a 405 nm mostra un segnale EB3-dTomato altamente denso all'interno dell'intero citoplasma della cellula, ad eccezione dell'area nucleare (Figura 2A ii). Non è stato osservato alcun cambiamento nella densità di EB3-dTomato dopo l'illuminazione della luce laser a 405 nm (Figura 2A iii e iv). Pertanto, la luce laser a 405 nm di per sé non causa alcun fotodanno all'embrione o alla dinamica dei microtubuli.
Successivamente, gli embrioni in stadio di 16 cellule sono stati trattati con 40 μM PST-1P 3 h prima dell'imaging dal vivo e tenuti al buio. Per eseguire con successo esperimenti PST su organismi 3D viventi, è fondamentale trovare l'equilibrio ottimale tra concentrazione PST, tempo di incubazione e potenza laser richiesta per evitare effetti nocivi11. In condizioni di scarsa oscurità, nell'immagine 3D (Figura 2B i) può essere rilevata una forte espressione di EB3-dTomato( Figura 2B i), simile agli embrioni di controllo (Figura 2A i). Pertanto, PST-1P non provoca l'inibizione della polimerizzazione dei microtubuli in condizioni di oscurità. L'imaging time-lapse di un singolo piano z ha confermato una forte espressione di EB3-dTomato e la polimerizzazione dei microtubuli prima dell'illuminazione della luce laser a 405 nm (Figura 2B ii). In pochi secondi, è stata osservata una riduzione del segnale EB3-dTomato dopo l'attivazione della luce laser a 405 nm di PST-1P (Figura 2B iii). Si dice che questa perdita duri circa 2-20 minuti prima di tornare gradualmente a causa del rilassamento termico o della diffusione nelle aree circostanti11. Pertanto, un'attivazione ripetitiva della luce laser a 405 nm potrebbe prolungare la durata della perdita di EB3-dTomato (Figura 1E-D). È importante sottolineare che gli embrioni microiniettati con EB3-dTomato e incubati con PST-1P mostrano un potenziale embrionale normale, sviluppandosi allo stadio di blastocisti (Figura 3 e Figura supplementare 1) e la normale dinamica dei microtubuli, ad esempio durante la mitosi (Figura supplementare 2). Pertanto, PST-1P inattivo non mostra alcuna tossicità per l'embrione.
La disattivazione controllata pst-1P può essere ottenuta mediante illuminazione a luce laser a 514 nm (Figura 2B iv). Mentre questo approccio può essere utile per determinare l'origine della crescita dei microtubuli dopo l'inibizione della crescita indotta da PST-1P, esclude l'uso di proteine fluorescenti verdi per l'imaging dal vivo. Mentre si consiglia vivamente di lavorare in condizioni di oscurità, se i PST vengono attivati inavvertitamente, l'illuminazione a luce verde consente la reversione PST a uno stato trans inattivo. In questa circostanza, è necessario un adeguato periodo di recupero per le cellule come misura precauzionale per garantire che le cellule possano tornare al loro stato di pre-attivazione. Se il tempo lo consente, idealmente sarebbe un minimo di poche ore.
Figura 2: Imaging dal vivo di EB3-dTomato prima e dopo l'attivazione della luce UV e la disattivazione di PST-1P nell'embrione di topo vivente. (A i) Proiezione massima 3D z-stack di un embrione di topo a 16 cellule di controllo non trattato etichettato per EB3-dTomato. Un ponte citocinetico di microtubuli è presente (indicato con una punta di freccia grigia) accanto a più ponti interfase (indicati da punte di freccia gialle). (A ii) Singolo piano z di una cella ripreso prima dell'esposizione laser a 405 nm. (A iii-iv) Singolo piano z di una cellula ripreso immediatamente (A iii) e 4 min (A iv) dopo un'esposizione alla luce laser a 405 nm (indicata da un fulmine viola), che non mostra alcun cambiamento nel segnale EB3-dTomato. (B i) Proiezione massima 3D z-stack di un embrione in stadio di 16 cellule etichettato per EB3-dTomato, che viene trattato con 40 μM PST-1P e tenuto al buio. I ponti interfase sono indicati da punte di freccia gialle. (B ii) Singolo piano z di una cella ha ripreso la pre-attivazione. (B iii) Singolo piano z di una cella ripreso immediatamente dopo l'esposizione alla luce laser a 405 nm (indicato da un fulmine viola), mostrando una marcata riduzione del segnale EB3-dTomato. (B iv) Singolo piano z di una cella ripreso immediatamente dopo l'esposizione alla luce laser a 514 nm (indicato da un fulmine verde), che mostra il recupero del segnale EB3-dTomato. I nuclei sono indicati dalla linea blu tratteggiata. Barre di scala: 15 μm per interi embrioni 3D; 5 μm in inserti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le condizioni di coltura PST-1P inattive consentono il normale sviluppo embrionale allo stadio di blastocisti. (A) Contrasto a singola interferenza differenziale (DIC) piano z di un embrione allo stadio di blastocisti (E4.5) dopo coltura in 40 μM PST-1P al buio. (B) Proiezione massima 3D z-stack dell'embrione mostrato in (A), che mostra l'espressione di EB3-dTomato. Barre della scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nei filmati time-lapse acquisiti, l'etichettatura EB3-dTomato appare come strutture "simili a comete" e consente il monitoraggio dei filamenti di microtubuli in crescita (Figura 4). Negli embrioni trattati con PST-1P tenuti in condizioni di oscurità (Figura 4A), le singole comete EB3-dTomato (indicate da punte di freccia bianche e gialle nella Figura 4B) possono essere viste emanare dal ponte interfase, che agisce come un centro di organizzazione dei microtubuli non centrosomiali nell'embrione di topo precoce16 (Figura 4B). Una proiezione di punti temporali (t-stack) raffigura il numero complessivo e la distanza percorsa dalle comete EB3-dTomato (Figura 4B), mostrando la più alta densità di EB3-dTomato nella regione del ponte interfase. Dopo l'attivazione di PST-1P con una luce laser a 405 nm, le comete EB3-dTomato non possono più essere viste alla base del ponte interfase e sono anche assenti nel t-stack (Figura 4C).
Figura 4: Tracciamento delle comete EB3-dTomato prima e dopo l'attivazione della luce UV subcellulare di PST-1P nell'embrione di topo vivente. (A) Proiezione massima 3D z-stack di un embrione di topo allo stadio a 16 cellule etichettato per EB3-dTomato, trattato con 40 μM PST-1P e tenuto al buio. (B) Quattro piani z singoli selezionati e corrispondente t-stack di un ROI al ponte interfase (indicato da *) prima dell'illuminazione laser a 405 nm, mostrando le comete EB3-dTomato nel tempo. Il movimento delle singole comete è indicato dalle punte di freccia gialle e bianche, mentre le punte di freccia tratteggiate abbinate ai colori mostrano le posizioni delle comete nei punti temporali precedenti. I tempi mostrati sono in secondi (s). (C) Quattro piani z singoli selezionati e la corrispondente pila t del ponte interfase fotografati immediatamente dopo l'esposizione alla luce laser a 405 nm (indicata da un fulmine viola) mostrano una perdita di comete EB3-dTomato. Barre di scala: 10 μm per embrione 3D completo; 2 μm per singoli piani z; 1,5 μm per t-stack. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nel loro insieme, questi risultati dimostrano l'applicazione di PST-1P nell'embrione di topo vivente preimpianto. PST-1P inibisce efficacemente la polimerizzazione dei microtubuli dopo l'attivazione con un laser a 405 nm e questa inibizione è reversibile con l'illuminazione della luce laser a 514 nm a livello cellulare e subcellulare.
Figura supplementare 1: Gli embrioni preimpianto coltivati in PST-1P inattivo dimostrano un normale potenziale di sviluppo allo stadio di blastocisti. (A) Controlli non trattati e (B) embrioni trattati con PST-1P che mostrano un tasso di sviluppo allo stadio di blastocisti. Tutti gli embrioni sono stati tenuti in condizioni di oscurità durante lo sviluppo per garantire l'inattività di PST-1P. Il tasso di sviluppo allo stadio di blastocisti era paragonabile tra i controlli (100%, n = 13) e gli embrioni trattati con PST-1P (91,3%, n = 23). Le barre della scala sono 20 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Gli embrioni preimpianto coltivati in PST-1P inattivo dimostrano una normale dinamica del fuso durante la mitosi. (A) Controlli non trattati e (B) embrioni trattati con PST-1P che si dividono dallo stadio a 8-cellule a quello a 16 cellule, iniettati con EB3-dTomato e Histone 2B (H2B)-GFP. Tutti gli embrioni sono stati tenuti in condizioni di oscurità durante lo sviluppo per garantire l'inattività di PST-1P. L'allineamento dei cromosomi può essere visto (A i e B i), seguito da anafase precoce (A ii e B ii), anafase tardiva (A iii e B iii) e citochinesi (A iv e B iv) senza difetti. Le barre di scala sono 10 μm nelle immagini 3D e 5 μm negli inserti. (C) L'anafase è durata in media 8 min 53 s nei controlli e 8 min 40 s negli embrioni trattati con PST-1P (valore p = 0,8241) e (D) cromosomi decondensati durante la telofase una media di 19 min 38 s nei controlli e 18 min 51 s dopo l'inizio dell'anafase negli embrioni trattati con PST-1P (valore p = 0,2743). Per l'analisi, n = 10 nei controlli e n = 12 nel trattamento PST-1P. Inoltre, tutte le cellule sono divise in un'onda sincrona, come previsto. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La rete di microtubuli è parte integrante del funzionamento interno fondamentale di una cellula. Di conseguenza, questo presenta sfide nella manipolazione della dinamica dei microtubuli negli organismi viventi, poiché qualsiasi perturbazione della rete tende ad avere conseguenze diffuse per tutti gli aspetti della funzione cellulare. L'emergere di composti foto-commutabili che prendono di mira i microtubuli presenta un modo per manipolare con precisione il citoscheletro a livello subcellulare, con un controllo superiore per l'induzione e l'inversione dell'inibizione della crescita dei microtubuli9. Questo protocollo dimostra come la polimerizzazione dei microtubuli possa essere inibita nell'embrione di topo preimpianto da PST-1P attivato dalla luce su scala subcellulare e in modo temporalmente preciso. Inoltre, questa inibizione può essere invertita per consentire l'indagine della perturbazione a breve termine della rete di microtubuli.
Il protocollo presentato è ottimizzato per l'applicazione di PST su embrioni di topo vivi preimpianto e può essere utilizzato come base per estendere il loro utilizzo a vari altri sistemi di coltura. I nuovi utenti di PST possono incontrare alcuni punti nelle loro applicazioni che richiedono la risoluzione dei problemi, per i quali vengono presentati diversi passaggi per la risoluzione dei problemi.
Deve essere valutata la citotossicità delle PST e deve essere selezionata una concentrazione di lavoro che provochi una forte inibizione della crescita dei microtubuli con una tossicità minima per le cellule. Un ampio protocollo per ottimizzare le concentrazioni di lavoro di PST e altri fotointerruttori è stato dettagliato in un recente pre-stampa11. In breve, i nuovi utenti di PST possono valutare la citotossicità in condizioni di oscurità con diluizioni seriali del farmaco. In questo contesto, non dovrebbe esserci alcun effetto misurabile sulle comete EB3-dTomato e nessuna tossicità per le cellule. Ciò fornisce un punto di partenza per testare una concentrazione non citotossica in condizioni di illuminazione. Per ulteriori sperimentazioni, si raccomanda la concentrazione più bassa che provoca una riduzione delle comete EB3-dTomato.
Come con qualsiasi trattamento farmacologico, i PST sono in grado di essere metabolizzati dalla cellula; tuttavia, da un punto di vista pratico, è probabile che ciò sia trascurabile, come dimostrato dall'incubazione di embrioni di C. elegans in PST-1P per 150 minuti e dalla successiva isomerizzazione efficace9. Per i sistemi altamente metabolicamente attivi, può essere necessaria una maggiore concentrazione di PST-1P. I PST possono anche diffondersi attraverso il mezzo di coltura, riducendo il carico di PST attivi all'interno del ROI. Per mitigare questo, può essere necessaria una fotoattivazione ripetuta, la cui citotossicità dovrebbe essere valutata su base individuale di tipo cellulare in quanto alcuni sistemi possono essere suscettibili alla fototossicità. Allo stesso modo, i PST attivati possono diffondersi dal ROI attivato dalla luce e influenzare i microtubuli circostanti. Tuttavia, a causa della loro intrinseca tendenza a rilassarsi di nuovo al trans-stato inattivo, l'effetto sulle aree circostanti dovrebbe essere trascurabile.
Un altro potenziale ostacolo per l'uso dei PST riguarda la loro applicazione in organoidi o organismi più grandi a causa della natura della limitata penetrabilità della luce di questi tessuti. I tessuti più grandi potrebbero non essere accessibili per la fotoattivazione delle cellule più profonde. L'embrione di topo preimpianto presenta una sfida unica in quanto è circondato da un rivestimento esterno, la zona pellucida, che può ostacolare la permeabilità dei farmaci aggiunti ai media. Per mitigare questo, gli embrioni vengono pre-incubati per almeno 1 ora in PST-1P prima dell'imaging. Approcci di ottimizzazione simili possono essere applicabili per migliorare la penetrazione del farmaco quando si utilizzano PST in sistemi di organismi interi o organoidi, come l'aggiunta di acetonitrile per aiutare l'assorbimento cellulare di PST9.
A causa della reversibilità del semaforo verde dei PST, questi composti non sono compatibili con l'imaging di fluorofori che richiedono eccitazione inferiore a 530 nm (come la GFP). Tuttavia, gli utenti possono implementare il monitoraggio del fluoroforo con qualsiasi fluoroforo che richiede un'eccitazione superiore a 530 nm, ad esempio RFP, mCherry o mPlum. Se è necessaria la doppia etichettatura delle strutture subcellulari, gli utenti possono utilizzare fluorofori a base rossa e rosso lontano. Se la compatibilità GFP è essenziale, una nuova classe di fotointerruttori, SBTubs, potrebbe essere di interesse25. Questi composti sono anche attivati dalla luce UV; tuttavia, non rispondono alla luce verde, rendendoli funzionalmente reversibili solo per diffusione, ma anche compatibili con tutti i fluorofori con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm o superiore. Insieme ai PST, che offrono reversibilità ma non sono compatibili con l'imaging di GFP, questi composti offrono all'utente una maggiore flessibilità per adottare un approccio personalizzato e adattare i fotointerruttori disponibili alla loro domanda di ricerca.
Gli approcci convenzionali di inibizione, knockout e knockdown di piccole molecole possono essere implementati su scale di cellule intere o di organismi interi per caratterizzare l'azione dei microtubuli. Questi approcci forniscono effetti potenti, ma ampi e distruttivi sui microtubuli che non sono facilmente reversibili e sono spesso difficili da colpire in modo subcellulare o temporalmente controllato. Una strategia per aggirare queste limitazioni è attraverso l'ingegneria genetica di un sistema optogenetico inducibile dalla luce. Le applicazioni di questi sistemi variano ampiamente e includono l'eterodimerizzazione indotta dalla luce, l'omodimerizzazione e la dissociazione di proteine o domini proteici26. Recentemente, è stato progettato un costrutto della proteina legante finale 1 (EB1) controllata optogeneticamente, in cui un interruttore inducibile dalla luce ha permesso la disassociazione dei terminali amino- e carbossilici del microtubulo più end binding partner EB1. Ciò ha reso la proteina funzionalmente inattiva con tempi di risposta inferiori al secondo, bloccando la crescita di microtubuli in una linea cellulare di carcinoma polmonare umano27. Allo stesso modo, un interruttore optogenetico è stato utilizzato per reticolare i filamenti di microtubuli e actina in D. melanogaster per comprendere l'influenza del cross-linking citoscheletrico sui cambiamenti morfologici della cellula28. L'uso di strumenti optogenetici per manipolare l'embrione precoce è un'area di ricerca altamente attuale e ha visto alcuni recenti progressi1. È stato sviluppato un sistema di esportazione nucleare optogeneticamente modificato per indurre la mallocalizzazione delle proteine nucleari. Ciò potrebbe imitare modelli genetici di perdita di funzione, con la maggiore flessibilità da condurre in precisi punti temporali di sviluppo negli embrioni di D. melanogaster 29. Gli approcci optogenetici sono un potente strumento per il controllo spaziotemporale della dinamica dei microtubuli; tuttavia, possono essere difficili da progettare, dispendiosi in termini di tempo e costosi. Al contrario, i PST offrono un'alternativa chimica alla complessa manipolazione genetica che vanta tempi di risposta, specificità e reversibilità simili con l'ulteriore vantaggio di un facile utilizzo e accessibilità.
Un altro approccio mirato per interrompere meccanicamente i filamenti di microtubuli è l'ablazione laser utilizzando un laser a due fotoni. Questo è stato applicato con successo per ablare il ponte interfase in embrioni di topo preimpianto16. Se implementato bene, gli utenti possono ottenere un alto pay-off. Tuttavia, l'esecuzione di questa tecnica è impegnativa e richiede un alto grado di precisione per evitare la distruzione o la lisi di qualsiasi struttura circostante o delle cellule stesse. Inoltre, gli utenti potrebbero aver bisogno di ablare ripetutamente i loro campioni per ottenere l'effetto desiderato, poiché i microtubuli possono ricrescere rapidamente30. Al contrario, i PST inibiscono direttamente la polimerizzazione dei microtubuli31 ed evitano effetti indesiderati che possono insorgere con l'ablazione laser, a causa della loro specificità per il legame con β-tubulina. Inoltre, i PST possono essere applicati a tutto l'organismo, mentre l'ablazione laser per natura può essere mirata solo a una regione specifica.
Utilizzando questo protocollo, le possibilità per l'applicazione di PST sono ampie e convincenti. I PST possono consentire l'inibizione subcellulare precisa della crescita dei microtubuli entro tempi di risposta inferiori al secondo per studiare gli aspetti della segregazione cromosomica durante la divisione cellulare mitotica o meiotica. Il traffico di carico intracellulare potrebbe essere interrotto inibendo le vie di trasporto fornite dalla rete di microtubuli per studiare il traffico endosomiale, il movimento dei mitocondri o il posizionamento nucleare. I PST sono stati anche utilizzati per inibire con successo la crescita dei microtubuli negli sferoidi multicellulari 3D cresciuti da linee cellulari di melanoma umano32,33. Accoppiare la flessibilità dell'attivazione PST con i loro superbi tempi di risposta offre ai ricercatori uno strumento dinamico per studiare la dinamica dei microtubuli e manipolare la funzione cellulare. Inoltre, la reversibilità dei PST rende la loro applicazione ideale per lo studio delle conseguenze sia a breve che a lungo termine dell'inibizione dei microtubuli su una singola cellula o cellule selezionate all'interno di un tessuto o di un organismo.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun interesse concorrente o finanziario.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Oliver Thorn-Seshold e Li Gao per averci fornito fototine e consigli sulla preparazione del manoscritto, Monash Production per il supporto alle riprese e Monash Micro Imaging per il supporto alla microscopia.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del progetto National Health and Medical Research Council (NHMRC) APP2002507 a J.Z. e dalla borsa di studio Azrieli dell'Istituto canadese per la ricerca avanzata (CIFAR) a J.Z. L'Australian Regenerative Medicine Institute è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
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