Summary
Typische Mikrotubuli-Inhibitoren, die in der Grundlagen- und angewandten Forschung weit verbreitet sind, haben weitreichende Auswirkungen auf Zellen. In jüngster Zeit haben sich Photostatine zu einer Klasse von photoschaltbaren Mikrotubuli-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, mikrotubuli augenblicklich, reversibel, räumlich-zeitlich präzise zu manipulieren. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt die Anwendung von Photostatinen in einem 3D-lebenden Präimplantations-Mausembryo.
Abstract
Das Mikrotubuli-Zytoskelett bildet das Gerüst einer Zelle und ist grundlegend für den intrazellulären Transport, die Zellteilung und die Signaltransduktion. Traditionelle pharmakologische Störungen des allgegenwärtigen Mikrotubuli-Netzwerks, die beispielsweise Nocodazol verwenden, können verheerende Folgen für jede Zelle haben. Reversibel photoschaltbare Mikrotubuli-Inhibitoren haben das Potenzial, die Einschränkungen zu überwinden, indem sie die Umsetzung von Arzneimittelwirkungen in einer räumlich-zeitlich kontrollierten Weise ermöglichen. Eine solche Familie von Medikamenten sind die Azobenol-basierten Photostatine (PSTs). Diese Verbindungen sind unter dunklen Bedingungen inaktiv und binden bei Beleuchtung mit UV-Licht an die Colchicin-Bindungsstelle des β-Tubulins und blockieren die Mikrotubulipolymerisation und den dynamischen Umsatz. Hier soll die Anwendung von PSTs im 3-dimensionalen (3D) lebenden Präimplantations-Mausembryo das Mikrotubuli-Netzwerk auf subzellulärer Ebene stören. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für den Versuchsaufbau sowie Lichtaktivierungs- und Deaktivierungsparameter für PSTs mit konfokaler Lebendzellmikroskopie. Dies gewährleistet die Reproduzierbarkeit und ermöglicht es anderen, dieses Verfahren auf ihre Forschungsfragen anzuwenden. Innovative Fotoschalter wie PSTs können sich zu leistungsstarken Werkzeugen entwickeln, um das Verständnis des dynamischen intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks voranzutreiben und das Zytoskelett in Echtzeit nicht-invasiv zu manipulieren. Darüber hinaus können sich PSTs in anderen 3D-Strukturen wie Organoiden, Blastoiden oder Embryonen anderer Spezies als nützlich erweisen.
Introduction
Die Mikrotubuli-Architektur variiert stark zwischen verschiedenen Zelltypen, um verschiedene Funktionen zu unterstützen 1,2. Seine dynamische Natur des Wachstums und der Schrumpfung ermöglicht eine schnelle Anpassung an extra- und intrazelluläre Hinweise und die Reaktion auf die sich ständig ändernden Bedürfnisse einer Zelle. Daher kann es als der "morphologische Fingerabdruck" betrachtet werden, der eine Schlüsselrolle bei der zellulären Identität spielt.
Das pharmakologische Targeting des Mikrotubuli-Zytoskeletts unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren hat zu einer Fülle grundlegender Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie, Stammzellbiologie, Krebsbiologie und Neurobiologiegeführt 3,4,5,6,7. Dieser Ansatz ist zwar unverzichtbar, weist jedoch verschiedene Einschränkungen wie Toxizität und Off-Target-Effekte auf. Zum Beispiel ist eines der am weitesten verbreiteten Mikrotubuli-Targeting-Mittel, Nocodazol, ein starkes Mikrotubuli-Depolymerisationsmittel8. Niedermolekulare Inhibitoren wie Nocodazol sind jedoch ab dem Zeitpunkt der Anwendung aktiv, und angesichts der essentiellen Natur des Mikrotubuli-Zytoskeletts für viele kritische zelluläre Funktionen kann die globale Depolymerisation von Mikrotubuli Off-Target-Effekte erzeugen, die für viele Anwendungen ungeeignet sein können. Darüber hinaus ist die Nocodazol-Behandlung irreversibel, es sei denn, die Proben werden frei von dem Arzneimittel gewaschen, wodurch eine kontinuierliche Live-Bildgebung und damit eine präzise Verfolgung einzelner Mikrotubuli-Filamente verhindert wird.
Die Entwicklung lichtaktivierter Verbindungen begann mit der Schaffung von photounkäfigförmigen Molekülen und hat eine neue Ära in der gezielten und überwachung der Auswirkungen der Wachstumshemmung von Mikrotubuli auf präzise und räumlich-zeitlich kontrollierte Weise eingeläutet. Eine Familie von reversibel photoschaltbaren Medikamenten, Photostatine (PSTs), wurde entwickelt, indem die Stilbenkomponente von Combretastatin A-4 durch Azobenzel 9 ersetztwurde. PSTs sind bis zur Beleuchtung mit UV-Licht inaktiv, wobei die inaktive Transkonfiguration durch reversible Isomerisierung in die aktive cis-Konfiguration umgewandelt wird. Cis-PSTs hemmen die Mikrotubulipolymerisation durch Bindung an die Colchicin-Bindungsstelle von β-Tubulin, blockieren seine Grenzfläche mit β-Tubulin und verhindern die für das Wachstum der Mikrotubuli erforderliche Dimerisierung10. Unter einer Kohorte von PSTs hat sich PST-1P als Bleiverbindung herauskristallisiert, da es die höchste Potenz hat, vollständig wasserlöslich ist und nach der Beleuchtung einen schnellen Beginn der Bioaktivität zeigt.
Die effektivste Trans- bis Cis-Isomerisierung von PSTs erfolgt bei Wellenlängen zwischen 360-420 nm, was zwei Optionen für die PST-Aktivierung ermöglicht. Eine 405-nm-Laserlinie auf einem typischen konfokalen Mikroskop kann für eine optimale räumliche Ausrichtung der Mikrotubuli-Wachstumshemmung verabreicht werden. Die Möglichkeit, den Ort und das Timing der PST-Aktivierung durch 405-nm-Laserbeleuchtung zu bestimmen, erleichtert eine präzise zeitliche und räumliche Kontrolle, die eine Störung der Mikrotubuli-Dynamik auf subzellulärer Ebene innerhalb von Subsekunden-Reaktionszeitenermöglicht 9. Alternativ ermöglicht ein erschwingliches LED-UV-Licht die Beleuchtung des gesamten Organismus, um eine organismusweite Störung der Mikrotubuli-Architektur zu induzieren. Dies kann eine kostengünstige Alternative für Forscher sein, für die der genau zeitlich abgestimmte Beginn der Hemmung und nicht das räumliche Targeting das Ziel ist. Ein weiteres Merkmal von PSTs ist ihre On-Demand-Inaktivierung durch Anlegen von grünem Licht einer Wellenlänge im Bereich von 510-540 nm9. Dies ermöglicht die Rückverfolgung von Mikrotubuli-Filamenten vor, während und nach der PST-vermittelten Wachstumshemmung.
PSTs, obwohl noch ein relativ neues Design, wurden in zahlreichen In-vitro-Anwendungen in verschiedenen Forschungsbereicheneingesetzt 11, einschließlich der Untersuchung neuer Mechanismen der Zellmigration in Amöboiden12, in Neuronen, die aus dem Gehirn der neugeborenen Mausisoliert wurden 13, und der Flügelepithelentwicklung in Drosophila melanogaster14 . Andere lichtreaktive Medikamente haben sich als wertvolle Werkzeuge zur gezielten Störung der Zellfunktion erwiesen. Zum Beispiel wurde ein Analogon von Blebbistatin, Azidoblebbistatin, zur verstärkten Myosinhemmung unter Beleuchtung15,16 verwendet. Dies unterstreicht das Potenzial für neue Entdeckungen aufgrund der Fähigkeit zur räumlich-zeitlich kontrollierten Hemmung der zellulären Funktion.
Lebende 3D-Organismen präsentieren hervorragende, aber empfindlichere Systeme, um die Dynamik von Mikrotubuli auf Ganztier-, Einzelzell- oder subzellulärer Ebene unter physiologischen Bedingungen zu manipulieren. Insbesondere der Präimplantationsmausembryo bietet einen außergewöhnlichen Einblick in das Innenleben der Zelle sowie in die interzellulären Beziehungen innerhalb eines Organismus17. Zeitlich und räumlich zielgerichtete aufeinanderfolgende Zyklen der Aktivierung und Deaktivierung von PSTs trugen zur Charakterisierung der Interphasenbrücke, einer postzytokinetischen Struktur zwischen Zellen, als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-organisierendes Zentrum im Präimplantationsmausembryobei 16. Ein ähnlicher Versuchsaufbau zeigte die Beteiligung wachsender Mikrotubuli an der Versiegelung des Mausembryos, um die Blastozystenbildung zu ermöglichen18. Darüber hinaus wurden PSTs auch in ganzen Zebrafischembryonen verwendet, um die neuronale Zellmigration zu untersuchen, indem das Wachstum von Mikrotubuli in einer Untergruppe von Zellen im Hinterhirn gehemmtwurde 19.
Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Aufbau und die Verwendung von PST-1P im Präimplantations-Mausembryo. Die hier vorgestellten Anweisungen können auch die Anwendung von PSTs für eine breite Palette von Zielen wie die Untersuchung der Chromosomensegregation und Zellteilung, des Handels mit intrazellulärer Fracht sowie der Zellmorphogenese und -migration leiten. Darüber hinaus werden solche Studien die Implementierung von PSTs in Organoidsystemen, Blastoiden und anderen Embryomodellen wie Caenorhabditis elegans und Xenopus laevis unterstützen und möglicherweise die Verwendung von PSTs für In-vitro-Fertilisationstechnologien erweitern.
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Protocol
Die Experimente wurden von der Monash Animal Ethics Committee unter der Tierethiknummer 19143 genehmigt. Die Tiere wurden in der Tiereinrichtung (Monash Animal Research Platform) unter strikten ethischen Richtlinien unter bestimmten pathogenfreien Tierstallbedingungen untergebracht.
1. Präimplantations-Maus-Embryo-Entnahme
- Superovulierte und paarende Mäuse wie zuvor beschrieben16,18, in Übereinstimmung mit den institutionellen tierethischen Richtlinien.
HINWEIS: Die am häufigsten verwendeten Stämme für die Lebendembryonenentnahme sind C57BL/6- oder FVB/N-Mäuse. Alle hier gezeigten Daten wurden mit FVB/N-Mäusen generiert. - Am Morgen nach der Paarung spülen Sie Zygoten aus dem Eileiter mit M2-Medium wiebeschrieben 20 oder Human Tubal Fluid (HTF) -Medium. Unter Verwendung einer Mundpipettenvorrichtung wie beschrieben21,22 werden Zygoten in einer 35-mm-Kulturschale, die mit einer ausreichenden Menge Mineralöl überzogen ist, in eine 35-mm-Kulturschale überlagert, die mit einem ausreichenden Volumen Mineralöl überzogen ist, um eine Medienberichterstattung zu gewährleisten, auf frische Kalium-Simplex-optimierte Medium-Tröpfchen (KSOM) übertragen, die auf 37 °C vorerwärmt und auf 5 % CO2 ausgeglichen werden.
- Microinject-Zygoten wie beschrieben20 mit cRNA-Kodierung für einen roten, fluoreszierend markierten Mikrotubuli plus Endmarker. Hier wurde cRNA für das End Binding Protein 3 (EB3)-dTomato in einer Konzentration von 30 ng/μL nach Präparation und Reinigung wie beschrieben16,18 und Verdünnung in Mikroinjektionspuffer verwendet.
HINWEIS: Es wird empfohlen, cRNA im Voraus vorzubereiten und bei -20 ° C zu lagern, bis dies erforderlich ist. - Kultivieren Sie Embryonen in Dunkelheit bei 37 °C und 5% CO2 , bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium für die PST-1P-Behandlung erreicht haben.
HINWEIS: Für eine umfassende Ressource der Kulturzeiten, die für verschiedene Embryonalstadien erforderlich sind, siehe23. Für 16-Zell-Stadium-Embryonen, die hier verwendet werden, Kultur bis zum embryonalen Tag 3 (E3) nach der Befruchtung.
2. Zubereitung von Medikamenten und bildgebenden Gerichten
HINWEIS: Arbeiten Sie bei den Schritten 2.1-2.10 ausschließlich bei Dunkelheit oder Rotlicht, um eine unbeabsichtigte PST-1P-Aktivierung zu vermeiden. Aluminiumfolie oder dunkle Abdeckungen sollten für alle Rohre und Schalen verwendet werden, die PSTs enthalten.
- Bereiten Sie eine Lagerkonzentration von 50 mM PST-1P in Reinstwasser vor.
HINWEIS: Das Molekulargewicht von PST-1P beträgt 440 g / mol. Die Lagerlösung ist bis zu 1 Jahr bei -20 °C stabil. PST-1P ist in Wasser oder wässrigem Puffer löslich, löst sich aber nicht leicht in DMSO auf. - Aus Schritt 2.1 wird eine Zwischenarbeitskonzentration von 800 μM PST-1P in Reinstwasser hergestellt.
- PST-1P in frischem KSOM auf eine Endkonzentration von 40 μM verdünnen. Da ein typisches Experiment etwa 20 μL PST-1P-behandeltes KSOM erfordert, verdünnen Sie 1 μL 800 μM PST-1P in 19 μL KSOM für ein Endvolumen von 20 μL, um sicherzustellen, dass ausreichend Medium im Voraus vorbereitet wird, wobei nur rotes Licht für die Sichtbarkeit verwendet wird.
HINWEIS: Sowohl die Konzentration als auch der Aktivierungsstatus einer PST-1P-Verdünnung können überprüft werden, indem ein UV-Vis-Absorptionsspektrum mit einem Spektralphotometer gemessen wird, das während der Assay-Etablierung durchgeführt werden sollte. Die Absorption bei 380 nm (A380) einer vollständig trans 40 μM-Verdünnung in einer 1-cm-Küvette sollte ungefähr 0,8 betragen. Sowohl cis- als auch trans-Formen haben die gleiche Absorption bei 455 nm (A455). Wenn das Verhältnis von A380 zu A455 ungefähr 9:1 beträgt, ist die Verdünnung inaktiv (vollständig trans). Wenn das Verhältnis A380:A455 1:2 beträgt, wird die Verdünnung vollständig aktiviert (vollständig cis). Zwischenverhältnisse spiegeln Zwischenzustände der Aktivierung wider. - Um den Kammerobjektträger für die Live-Bildgebung vorzubereiten, pipettieren Sie 10 μL PST-1P-behandeltes KSOM in die Mitte eines Bohrlochs, um einen halbkugelförmigen Tröpfchen zu bilden (Abbildung 1A).
- Fügen Sie vorsichtig ausreichend Mineralöl hinzu, um den Tröpfchen zu bedecken, und stellen Sie sicher, dass er das Medium nicht verteilt. Dadurch wird sichergestellt, dass das Tröpfchen nicht verdunstet.
- Vorwärmen und CO2-equilibrieren Sie die Kammerschiebeschale in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 3 h oder höchstens über Nacht.
- Am Ende der Gleichgewichtsperiode in Schritt 2.6 wird eine 35-mm-Kulturschale mit einem 10-μL-Tröpfchen PST-1P-behandeltem, vorgewärmtem und gleichgestelltem KSOM als Waschschritt zubereitet. Nicht mit Öl überlagern.
- Transfer von Embryonen durch Mundpipettieren in das PST-1P-behandelte KSOM-Tröpfchen aus Schritt 2.7.
HINWEIS: Die Schritte 2.7 und 2.8 werden für das Mundpipettieren von Embryonen empfohlen, sind jedoch optional. - Sofortige Übertragung von Embryonen durch Mundpipettieren in die Mitte des PST-1P-behandelten KSOM-Tröpfchens in dem in den Schritten 2.4-2.6 vorbereiteten Objektträger der Bildgebungskammer (Abbildung 1A).
- Inkubieren Sie Embryonen bei 37 °C und 5% CO2 in PST-1P-behandeltem KSOM im Objektträger der Bildgebungskammer für mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung. Wenn möglich, montieren Sie den Kammerobjektträger auf dem Mikroskop in einer Umgebungskammer bei 37 °C und 5%CO2 und in völliger Dunkelheit, um sicherzustellen, dass sich alle PST-1Ps in der inaktiven Transkonfiguration befinden und dass Embryonen auf den Boden der Schale sinken können.
3. Live-Bildgebung und PST-1P-Photoaktivierung
HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.13 werden an einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durchgeführt, das mit Lawinenphotodiodendetektoren (APDs) und einer dunklen Umgebungskammer ausgestattet ist. Diese Anweisungen beziehen sich speziell auf die Bildgebung unter Verwendung der in der Materialtabelle beschriebenen Erfassungssoftware. Sie können aber auch auf andere konfokale Mikroskopiesysteme angewendet werden.
- Bereiten Sie ein 63x/1,2 NA Wasseröl-Tauchobjektiv mit dem vorgeschriebenen Tauchmedium vor.
- Verwenden Sie eine Rotlichtlampe zur Führung der Positionierung, um das Objektiv zu bewegen, um das Tauchmedium zu kontaktieren. Vermeiden Sie in diesem Stadium die Verwendung von weißem oder Hellfeldlicht, um die Embryonen zu finden, da dies PST-1P frühreif aktivieren könnte.
- Lokalisieren Sie mit dem Okular und unter Rotlichtbeleuchtung den Rand des Mediumtröpfchens und positionieren Sie das Objektiv direkt über dieser Stelle. Dies kann dem Benutzer helfen, sich zu orientieren und die Fokusebene zu finden.
- Als nächstes verwenden Sie durch das Okular oder beim softwaregestützten Live-Modus-Scannen einen Rotwellenlängenfilter oder einen 561-nm-Laser, um die Embryonen im Tröpfchen zu lokalisieren.
- Verwenden Sie Bühnencontroller und den Live-Scanning-Modus, um die Start- und Endpunkte für die Aufnahme eines Z-Stacks des gesamten Embryos festzulegen.
- Passen Sie die Laserleistungseinstellungen an (typischerweise ist bei hochempfindlichen Detektoren wie den APDs eine Laserleistung von 561 nm von weniger als 5% ausreichend), der digitale Offset (typischerweise bei -0,900), um das Erscheinungsbild von EB3-dTomato-Kometen zu optimieren und Hintergrundgeräusche zu minimieren, Pinhole bei 2 μm, Pixelauflösung von 512 x 512 und Pixelverweilzeit von 3,15 μs.
- Erwerben Sie einen Z-Stapel des gesamten Embryos mit 1-μm-Schnittintervallen, um Bereiche des Mikrotubuliwachstums im gesamten Organismus zu beurteilen (Abbildung 1B).
- Verwenden Sie das 3D-Z-Stack-Bild aus Schritt 3.7, um Bereiche von Interesse (ROIs) für EB3-dTomato-Tracking-Experimente zu identifizieren. Erhöhen Sie den Zoom auf das 3-fache und zeichnen Sie einen rechteckigen ROI um den spezifischen subzellulären Bereich von Interesse.
- Erfassen Sie einen Zeitrafferfilm einer einzelnen Z-Ebene mit den typischen Werten der Bildgebungsparameter: 561 nm Laserleistung bei 5%, digitaler Offset von -0,900, Pixelauflösung von 512 x 512, Pinhole bei 3 μm, Pixelverweilzeit von 3,15 μs, Zoom von 3x, Zeitintervall von 500 ms.
HINWEIS: 120 Zeitrahmen bieten einen Tracking-Film von 1 Minute und sollten für die Datenanalyse ausreichen. Die Erfassung kann länger fortgesetzt werden, sofern die Bleiche des Fluorophors minimal ist (Abbildung 1C). - Um PST-1P zu aktivieren, wechseln Sie zu einem 405-nm-Laser und erfassen Sie einen weiteren Zeitrafferfilm mit dem 405-nm-Laser, der auf 10 % Leistung eingestellt ist, Pixelauflösung von 512 x 512, maximal geöffneter Lochblende, Pixelverweilzeit von 3,15 μs, Zoom von 3x, Zeitintervall von 500 ms und insgesamt 20 Bildern (Abbildung 1D).
- Wechseln Sie zurück zum 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung wie in Schritt 3.9, um den Verlust von EB3-dTomato-Kometen nach der Aktivierung von PST-1P zu bestätigen (Abbildung 1E). Stellen Sie sicher, dass diese Erfassung so schnell wie möglich nach der Aktivierung erfolgt.
HINWEIS: Schritt 3.10 kann wiederholt durchgeführt werden, um eine längere Hemmung von EB3-dTomato-Kometen zu erreichen. Embryonen müssen jedoch sorgfältig überwacht werden, um Schäden durch UV-Licht zu vermeiden. - Um PST-1P wieder in seinen inaktiven Trans-Zustand zu versetzen, schalten Sie einen 514-nm-Laser mit einer Leistung von 10% ein. Erwerben Sie einen Zeitrafferfilm mit einem 514-nm-Lasersatz von 10 %, einer Pixelauflösung von 512 x 512, maximal geöffnetem Loch, einer Pixelverweilzeit von 3,15 μs, einem Zoom von 3x, einem Zeitintervall von 500 ms und insgesamt 20 Zeitrahmen (Abbildung 1F).
- Wiederholen Sie Schritt 3.11, um die Wiederherstellung von EB3-dTomato-Kometen zu visualisieren (Abbildung 1G).
4. Bilddatenanalyse
- Um die Hemmung der Mikrotubulipolymerisation durch PSTs zu analysieren und zu quantifizieren, verwenden Sie Softwareprogramme, die den Forschern zur Verfügung stehen, um ihren spezifischen Bedürfnissen gerecht zu werden. Diejenigen, die für die Verwendung empfohlen werden, verfügen über ein Tracking-Tool, das die Bewegung, Richtung und Geschwindigkeit der EB3-dTomato-Kometen16,18 manuell oder automatisch verfolgen kann.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der PST-1P-Photoaktivierung und -Deaktivierung im lebenden 3D-Präimplantationsmaus-Embryo. Alle Experimente werden in völliger Dunkelheit (schwarzer Hintergrund) oder nur durch Rotlichtbeleuchtung durchgeführt. (A) Lebende Präimplantations-Mausembryonen, die EB3-dTomate exprimieren, werden in ein 16-Zell-Stadium kultiviert und dann in einen Tropfen KSOM mit 40 μM PST-1P in einem Objektträger der Bildgebungskammer überführt. (B) Ein 3D-Bild des gesamten Embryos ermöglicht die Beurteilung des Mikrotubuli-Wachstums durch Visualisierung der Verteilung von EB3-dTomato-Kometen. (C) Um das Experiment zu starten, werden EB3-dTomato-Kometen in einer subzellulären Region mittels Zeitraffer-Bildgebung verfolgt. (D) Die nachfolgende PST-1P-Photoaktivierung in derselben subzellulären Region mit einem 405-nm-Laser führt zum Verlust von EB3-dTomaten-Kometen (E). Eine verstärkte PST-1P-Aktivierung kann bei Bedarf durch sequentielle 405 nm Lichtbeleuchtung realisiert werden. (F-G) Um PST-1P in seinen inaktiven Zustand zurückzuversetzen und EB3-dTomato-Kometen wiederherzustellen, wird ein 514-nm-Laser auf dieselbe subzelluläre Region angewendet. Bei Bedarf können mehrere Runden der Photoaktivierung und Deaktivierung durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
In Übereinstimmung mit dem Protokoll wurden Präimplantations-Mausembryonen mit cRNA für EB3 mikroinjiziert, die mit rot fluoreszierenden dTomato (EB3-dTomato) markiert wurde. Dies ermöglicht die Visualisierung wachsender Mikrotubuli, da EB3 an polymerisierende Mikrotubuli plus ends24 bindet.
Die Experimente wurden 3 Tage nach der Befruchtung (E3) durchgeführt, wenn der Mausembryo aus 16 Zellen besteht. Abhängig von der zu untersuchenden wissenschaftlichen Fragestellung kann jedes andere Entwicklungsstadium der Präimplantation verwendet werden. Um eine minimale Photobleiche unter Verwendung des 405-nm-Laserlichtaktivierungsprotokolls zu demonstrieren, wird ein Kontrollexperiment mit einem unbehandelten Embryo gezeigt (Abbildung 2A i). Ein ROI mit auffallender EB3-dTomatendichte wird basierend auf dem aufgenommenen 3D-Bild des Embryos ausgewählt. In diesem Beispiel wird eine einzelne Z-Ebene einer ganzen Zelle für die hochauflösende EB3-dTomato-Bildgebung verwendet. Verschiedene Regionen des Embryos können jedoch nach Bedarf ausgewählt werden (z. B. kortikale Region, perinukleäre Region, eine mitotische Zelle, eine innere oder äußere Zelle). Ein Bild der EB3-dTomato-Expression vor 405-nm-Laserlichtbeleuchtung zeigt ein hochdichtes EB3-dTomato-Signal innerhalb des gesamten Zytoplasmas der Zelle, mit Ausnahme des Kernbereichs (Abbildung 2A ii). Nach einer Laserlichtbeleuchtung von 405 nm wurde keine Veränderung der EB3-dTomatendichte beobachtet (Abbildung 2A iii und iv). Somit verursacht das 405 nm Laserlicht per se keine Lichtschäden am Embryo oder Mikrotubulidynamik.
Als nächstes wurden Embryonen im 16-Zellstadium mit 40 μM PST-1P 3 h vor der Live-Bildgebung behandelt und im Dunkeln gehalten. Um PST-Experimente an lebenden 3D-Organismen erfolgreich durchzuführen, ist es wichtig, das optimale Gleichgewicht von PST-Konzentration, Inkubationszeit und erforderlicher Laserleistung zu finden, um schädliche Effekte zu vermeiden11. Unter strengen dunklen Bedingungen kann eine starke EB3-dTomatenexpression im 3D-Bild nachgewiesen werden (Abbildung 2B i), ähnlich wie bei Kontrollembryonen (Abbildung 2A i). Somit löst PST-1P keine Hemmung der Mikrotubulipolymerisation unter dunklen Bedingungen aus. Die Zeitrafferbildgebung einer einzelnen z-Ebene bestätigte eine starke EB3-dTomatenexpression und Mikrotubulipolymerisation vor einer Laserlichtbeleuchtung von 405 nm (Abbildung 2B ii). Innerhalb von Sekunden wurde eine Reduktion des EB3-dTomato-Signals nach 405 nm Laserlichtaktivierung von PST-1P beobachtet (Abbildung 2B iii). Es wird berichtet, dass dieser Verlust etwa 2 bis 20 Minuten dauert, bevor er aufgrund der thermischen Entspannung oder Diffusion in die umliegenden Gebiete allmählich zurückkehrt11. Daher kann eine sich wiederholende 405-nm-Laserlichtaktivierung die Dauer des EB3-dTomato-Verlusts verlängern (Abbildung 1E-D). Wichtig ist, dass Embryonen, die mit EB3-dToma mikroinjiziert und mit PST-1P inkubiert wurden, ein normales embryonales Potenzial aufweisen, das sich zum Blastozystenstadium entwickelt (Abbildung 3 und ergänzende Abbildung 1) und eine normale Mikrotubulidynamik, beispielsweise während der Mitose (ergänzende Abbildung 2). Daher zeigt inaktives PST-1P keine Toxizität für den Embryo.
Eine kontrollierte PST-1P-Deaktivierung kann durch eine Laserlichtbeleuchtung von 514 nm erreicht werden (Abbildung 2B iv). Während dieser Ansatz nützlich sein kann, um den Ursprung des Mikrotubuliwachstums nach PST-1P-induzierter Wachstumshemmung zu bestimmen, schließt er die Verwendung von grün fluoreszierenden Proteinen für die Lebendbildgebung aus. Während es dringend empfohlen wird, unter dunklen Bedingungen zu arbeiten, wenn PSTs versehentlich aktiviert werden, ermöglicht die grüne Lichtbeleuchtung die PST-Rückkehr in einen inaktiven Trans-Zustand. Unter diesen Umständen ist eine angemessene Erholungsphase für die Zellen als Vorsichtsmaßnahme erforderlich, um sicherzustellen, dass die Zellen in ihren Voraktivierungszustand zurückkehren können. Wenn es die Zeit erlaubt, wären es idealerweise mindestens ein paar Stunden.
Abbildung 2: Live-Bildgebung von EB3-dTomato vor und nach UV-Lichtaktivierung und Deaktivierung von PST-1P im lebenden Mausembryo. (A i) Maximale Projektion 3D-Z-Stack eines unbehandelten Kontroll-Mausembryos im 16-Zell-Stadium, der für EB3-dTomato markiert ist. Eine zytokinetische Mikrotubulibrücke ist (gekennzeichnet durch graue Pfeilspitze) neben mehreren Interphasenbrücken (gekennzeichnet durch gelbe Pfeilspitzen) vorhanden. A ii) Einzelne Z-Ebene einer Zelle, aufgenommen vor der 405-nm-Laserbelichtung. (A iii-iv) Einzelne Z-Ebene einer Zelle, die sofort (A iii) und 4 min (A iv) nach 405 nm Laserlichtbelichtung (angezeigt durch einen violetten Blitz) aufgenommen wurde und keine Änderung des EB3-dTomato-Signals zeigte. (B i) Maximale Projektion 3D-Z-Stack eines Embryos im 16-Zell-Stadium, der für EB3-dTomato markiert ist, der mit 40 μM PST-1P behandelt und im Dunkeln gehalten wird. Interphasenbrücken sind durch gelbe Pfeilspitzen gekennzeichnet. B ii) Einzelne z-Ebene einer Zelle mit abgebildeter Voraktivierung. B iii) Einzelne Z-Ebene einer Zelle, die unmittelbar nach der 405-nm-Laserlichtbelichtung (angezeigt durch einen violetten Blitz) aufgenommen wurde und eine deutliche Verringerung des EB3-dTomato-Signals zeigt. B iv) Einzelne Z-Ebene einer Zelle, die unmittelbar nach der 514-nm-Laserlichtbelichtung (angezeigt durch einen grünen Blitz) aufgenommen wurde und die Wiederherstellung des EB3-dTomato-Signals zeigt. Kerne sind durch die gestrichelte blaue Linie gekennzeichnet. Maßstabsstäbe: 15 μm für ganze 3D-Embryonen; 5 μm in Einschüben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Inaktive PST-1P-Kulturbedingungen ermöglichen eine normale embryonale Entwicklung bis zum Blastozystenstadium. (A) Single differential interference contrast (DIC) z-Ebene eines Embryos im Blastozystenstadium (E4.5) nach Kultur in 40 μM PST-1P im Dunkeln. (B) Maximale Projektion 3D-Z-Stack des in (A) gezeigten Embryos mit EB3-dTomatenexpression. Maßstabsstäbe: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
In den erfassten Zeitrafferfilmen erscheint die EB3-dTomato-Beschriftung als "kometenartige" Strukturen und ermöglicht die Verfolgung wachsender Mikrotubuli-Filamente (Abbildung 4). In PST-1P-behandelten Embryonen, die unter dunklen Bedingungen gehalten wurden (Abbildung 4A), sind einzelne EB3-dTomaten-Kometen (in Abbildung 4B durch weiße und gelbe Pfeilspitzen gekennzeichnet) zu sehen, die von der Interphasenbrücke ausgehen, die im frühen Mausembryo16 als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-organisierendes Zentrum fungiert (Abbildung 4B). Eine Projektion der Zeitpunkte (t-Stack) zeigt die Gesamtzahl und die von EB3-dTomato-Kometen zurückgelegte Strecke (Abbildung 4B) und zeigt die höchste Dichte von EB3-dTomato im Bereich der Interphasenbrücke. Nach der Aktivierung von PST-1P mit einem 405 nm Laserlicht sind EB3-dTomato-Kometen an der Basis der Interphasenbrücke nicht mehr zu sehen und fehlen auch im t-Stack (Abbildung 4C).
Abbildung 4: Verfolgung von EB3-dTomaten-Kometen vor und nach der subzellulären UV-Lichtaktivierung von PST-1P im lebenden Mausembryo. (A) Maximale Projektion 3D-Z-Stack eines 16-Zell-Stadium-Mausembryos, der für EB3-dTomato markiert, mit 40 μM PST-1P behandelt und im Dunkeln gehalten wurde. (B) Vier ausgewählte einzelne z-Ebenen und entsprechender t-Stack eines ROI an der Interphasenbrücke (gekennzeichnet durch *) vor 405 nm Laserbeleuchtung, die EB3-dTomato-Kometen im Laufe der Zeit zeigt. Die Bewegung einzelner Kometen wird durch die gelben und weißen Pfeilspitzen angezeigt, während die farblich abgestimmten gestrichelten Pfeilspitzen Kometenpositionen zu früheren Zeitpunkten anzeigen. Die angezeigten Zeiten sind in Sekunden(s) angegeben. (C) Vier ausgewählte einzelne z-Ebenen und der entsprechende t-Stack der Interphasenbrücke, die unmittelbar nach der 405-nm-Laserlichtbelichtung (angezeigt durch einen violetten Blitz) aufgenommen wurden, zeigen einen Verlust von EB3-dTomato-Kometen. Maßstabsstäbe: 10 μm für vollen 3D-Embryo; 2 μm für einzelne Z-Ebenen; 1,5 μm für T-Stack. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse die Anwendung von PST-1P im lebenden Präimplantationsmaus-Embryo. PST-1P hemmt effektiv die Mikrotubulipolymerisation nach der Aktivierung mit einem 405-nm-Laser, und diese Hemmung ist bei 514-nm-Laserlichtbeleuchtung auf zellulärer und subzellulärer Ebene reversibel.
Ergänzende Abbildung 1: Präimplantationsembryonen, die in inaktivem PST-1P kultiviert wurden, zeigen ein normales Entwicklungspotenzial bis zum Blastozystenstadium. (A) Unbehandelte Kontrollen und (B) PST-1P-behandelte Embryonen, die eine Entwicklungsrate bis zum Blastozystenstadium aufweisen. Alle Embryonen wurden während der gesamten Entwicklung unter dunklen Bedingungen gehalten, um die Inaktivität von PST-1P sicherzustellen. Die Entwicklungsrate bis zum Blastozystenstadium war vergleichbar zwischen Kontrollen (100%, n = 13) und PST-1P-behandelten Embryonen (91,3%, n = 23). Maßstabsbalken sind 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Präimplantationsembryonen, die in inaktivem PST-1P kultiviert wurden, zeigen eine normale Spindeldynamik während der Mitose. (A) Unbehandelte Kontrollen und (B) PST-1P-behandelte Embryonen, die sich vom 8-Zell- bis zum 16-Zell-Stadium teilen, injiziert mit EB3-dTomato und Histone 2B (H2B)-GFP. Alle Embryonen wurden während der gesamten Entwicklung unter dunklen Bedingungen gehalten, um die Inaktivität von PST-1P sicherzustellen. Es ist eine Ausrichtung der Chromosomen (A i und B i) zu sehen, gefolgt von einer frühen Anaphase (A ii und B ii), einer späten Anaphase (A iii und B iii) und einer Zytokinese (A iv und B iv) ohne Defekte. Maßstabsbalken sind 10 μm in 3D-Bildern und 5 μm in Insets. (C) Die Anaphase dauerte durchschnittlich 8 min 53 s in Kontrollen und 8 min 40 s in PST-1P behandelten Embryonen (p-Wert = 0,8241) und (D) Chromosomen, die während der Telophase dekonneniert wurden, ein Mittelwert von 19 min 38 s in Kontrollen und 18 min 51 s nach Anaphasenbeginn in PST-1P-behandelten Embryonen (p-Wert = 0,2743). Für die Analyse n = 10 in Kontrollen und n = 12 in PST-1P-Behandlung. Darüber hinaus sind alle Zellen wie erwartet in eine synchrone Welle unterteilt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Mikrotubuli-Netzwerk ist integraler Bestandteil des grundlegenden Innenlebens einer Zelle. Folglich stellt dies eine Herausforderung bei der Manipulation der Mikrotubulidynamik in lebenden Organismen dar, da jede Störung des Netzwerks tendenziell weitreichende Folgen für alle Aspekte der zellulären Funktion hat. Das Aufkommen von photoschaltbaren Mikrotubuli-Targeting-Verbindungen stellt eine Möglichkeit dar, das Zytoskelett auf subzellulärer Ebene präzise zu manipulieren, mit überlegener Kontrolle für die Induktion und Umkehrung der Mikrotubuli-Wachstumshemmung9. Dieses Protokoll zeigt, wie die Mikrotubulipolymerisation im Präimplantations-Mausembryo durch lichtaktiviertes PST-1P auf subzellulärer Ebene und zeitlich präzise gehemmt werden kann. Darüber hinaus kann diese Hemmung umgekehrt werden, um eine Untersuchung der kurzfristigen Störung des Mikrotubuli-Netzwerks zu ermöglichen.
Das vorgestellte Protokoll ist für die Anwendung von PSTs an lebenden Präimplantations-Mausembryonen optimiert und kann als Grundlage für die Ausweitung ihrer Verwendung auf verschiedene andere Kultursysteme verwendet werden. Neue Benutzer von PSTs können auf einige Punkte in ihren Anwendungen stoßen, die eine Fehlerbehebung erfordern, für die mehrere Problemlösungsschritte vorgestellt werden.
Die Zytotoxizität von PSTs sollte bewertet und eine Arbeitskonzentration ausgewählt werden, die eine starke Hemmung des Mikrotubuliwachstums mit minimaler Toxizität für Zellen hervorruft. Ein umfangreiches Protokoll zur Optimierung der Arbeitskonzentrationen von PSTs und anderen Fotoschaltern wurde in einem kürzlich veröffentlichtenPre-Print 11 detailliert beschrieben. Kurz gesagt, neue Benutzer von PSTs können die Zytotoxizität unter dunklen Bedingungen mit seriellen Verdünnungen des Arzneimittels beurteilen. In dieser Umgebung sollte es keine messbare Wirkung auf EB3-dTomaten-Kometen und keine Toxizität für die Zellen geben. Dies bietet einen Ausgangspunkt für die Prüfung einer nicht-zytotoxischen Konzentration unter beleuchteten Bedingungen. Für weitere Experimente wird die niedrigste Konzentration empfohlen, die eine Reduktion der EB3-dTomaten-Kometen hervorruft.
Wie bei jeder medikamentösen Behandlung können PSTs von der Zelle metabolisiert werden; Aus praktischer Sicht ist dies jedoch wahrscheinlich vernachlässigbar, wie die Inkubation von C. elegans-Embryonen in PST-1P für 150 min und die anschließende effektive Isomerisierunggezeigt haben 9. Für hochmetabolisch aktive Systeme kann eine erhöhte Konzentration von PST-1P erforderlich sein. PSTs können auch durch das Kulturmedium diffundieren, wodurch die Belastung durch aktive PSTs innerhalb des ROI reduziert wird. Um dies zu mildern, kann eine wiederholte Photoaktivierung erforderlich sein, deren Zytotoxizität auf einer individuellen Zelltypbasis bewertet werden müsste, da einige Systeme anfällig für Phototoxizität sein können. Ebenso können aktivierte PSTs aus dem lichtaktivierten ROI diffundieren und die umgebenden Mikrotubuli beeinflussen. Aufgrund ihrer inhärenten Tendenz, sich wieder in den inaktiven Trans-Staat zu entspannen, sollten die Auswirkungen auf die umliegenden Gebiete jedoch vernachlässigbar sein.
Ein weiteres potenzielles Hindernis für die Verwendung von PSTs bezieht sich auf ihre Anwendung in Organoiden oder größeren Organismen aufgrund der Art der begrenzten Lichtdurchlässigkeit dieser Gewebe. Größere Gewebe sind möglicherweise nicht für die Photoaktivierung tieferer Zellen zugänglich. Der Präimplantations-Mausembryo stellt eine einzigartige Herausforderung dar, da er von einer äußeren Beschichtung, der Zona pellucida, umgeben ist, die die Durchlässigkeit von Medikamenten behindern kann, die den Medien zugesetzt werden. Um dies zu mildern, werden die Embryonen vor der Bildgebung für mindestens 1 h in PST-1P vorinkubiert. Ähnliche Optimierungsansätze können anwendbar sein, um die Penetration des Arzneimittels zu verbessern, wenn PSTs im gesamten Organismus oder in Organoidsystemen verwendet werden, wie z. B. die Zugabe von Acetonitril zur Unterstützung der zellulären Aufnahme von PSTs9.
Aufgrund der Grünlichtreversibilität von PSTs sind diese Verbindungen nicht kompatibel mit der Bildgebung von Fluorophoren, die eine Anregung unter 530 nm erfordern (z. B. GFP). Benutzer können jedoch Fluorophor-Tracking mit jedem Fluorophor implementieren, der eine Anregung über 530 nm erfordert, z. B. RFP, mCherry oder mPlum. Wenn eine doppelte Markierung subzellulärer Strukturen erforderlich ist, können Benutzer rote und fernrote Fluorophore verwenden. Wenn GFP-Kompatibilität unerlässlich ist, könnte eine neue Klasse von Fotoschaltern, SBTubs, von Interesse sein25. Diese Verbindungen werden auch durch UV-Licht aktiviert; Sie reagieren jedoch nicht auf grünes Licht, wodurch sie nur durch Diffusion funktionell reversibel sind, aber auch mit allen Fluorophoren mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm oder höher kompatibel sind. Zusammen mit PSTs, die Reversibilität bieten, aber nicht mit der Bildgebung von GFP kompatibel sind, bieten diese Verbindungen dem Anwender eine erhöhte Flexibilität, um einen maßgeschneiderten Ansatz zu verfolgen und die verfügbaren Fotoschalter an seine Forschungsfrage anzupassen.
Herkömmliche niedermolekulare Hemm-, Knockout- und Knockdown-Ansätze können auf ganzzelliger oder ganzkörperbreiter Skala implementiert werden, um die Mikrotubuli-Aktion zu charakterisieren. Diese Ansätze bieten starke, aber breite und zerstörerische Effekte auf Mikrotubuli, die nicht leicht reversibel sind und oft schwer subzellulär oder zeitgesteuert anvisiert werden können. Eine Strategie, um diese Einschränkungen zu umgehen, ist die Gentechnik eines lichtinduzierbaren optogenetischen Systems. Die Anwendungen dieser Systeme sind sehr unterschiedlich und umfassen die lichtinduzierte Heterodimerisierung, Homodimerisierung und Dissoziation von Proteinen oder Proteindomänen26. Kürzlich wurde ein optogenetisch kontrolliertes Endbindungsprotein 1 (EB1)-Konstrukt entwickelt, bei dem ein lichtinduzierbarer Schalter die Dissoziation der Amino- und Carboxylterminals der Mikrotubulie plus Endbindungspartner EB1 ermöglichte. Dies machte das Protein funktionell inaktiv mit Reaktionszeiten von unter einer Sekunde und blockierte das Wachstum von Mikrotubuli in einer menschlichen Lungenkarzinom-Zelllinie27. In ähnlicher Weise wurde ein optogenetischer Schalter verwendet, um Mikrotubuli und Aktinfilamente in D. melanogaster zu vernetzen, um den Einfluss der zytoskelettalen Vernetzung auf morphologische Veränderungen der Zellezu verstehen 28. Der Einsatz optogenetischer Werkzeuge zur Manipulation des frühen Embryos ist ein hochaktuelles Forschungsgebiet und hat in jüngster Zeit einige Fortschritte gemacht1. Ein optogenetisch verändertes nukleares Exportsystem wurde entwickelt, um die Fehllokalisierung von Kernproteinen zu induzieren. Dies könnte genetische Modelle mit Funktionsverlust nachahmen, mit der zusätzlichen Flexibilität, die zu genauen Entwicklungszeitpunkten in D. melanogaster-Embryonen durchgeführt werdenkann 29. Optogenetische Ansätze sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur raumzeitlichen Kontrolle der Mikrotubuli-Dynamik; Sie können jedoch schwierig zu entwickeln, zeitaufwendig und kostspielig sein. Im Gegensatz dazu bieten PSTs eine chemische Alternative zur komplexen genetischen Manipulation, die ähnliche Reaktionszeiten, Spezifität und Reversibilität mit dem zusätzlichen Vorteil der einfachen Verwendung und Zugänglichkeit aufweist.
Ein weiterer gezielter Ansatz, um Mikrotubuli-Filamente mechanisch zu stören, ist die Laserablation mit einem Zwei-Photonen-Laser. Dies wurde erfolgreich angewendet, um die Interphasenbrücke in Präimplantationsmausembryonen16 abzutragen. Bei guter Implementierung können Benutzer eine hohe Auszahlung erzielen. Die Ausführung dieser Technik ist jedoch eine Herausforderung und erfordert ein hohes Maß an Präzision, um die Zerstörung oder Lyse von umgebenden Strukturen oder der Zellen selbst zu vermeiden. Darüber hinaus müssen Benutzer ihre Proben möglicherweise wiederholt abtragen, um die beabsichtigte Wirkung zu erzielen, da Mikrotubuli schnellnachwachsen können 30. Im Gegensatz dazu hemmen PSTs direkt die Mikrotubulipolymerisation31 und vermeiden unerwünschte Effekte, die bei der Laserablation aufgrund ihrer Spezifität für die Bindung an β-Tubulin auftreten können. Darüber hinaus können PSTs auf den gesamten Organismus angewendet werden, während die Laserablation von Natur aus nur auf eine bestimmte Region ausgerichtet werden kann.
Mit diesem Protokoll sind die Möglichkeiten für die Anwendung von PSTs vielfältig und überzeugend. PSTs können die präzise, subzelluläre Hemmung des Mikrotubuliwachstums innerhalb von Subsekunden-Reaktionszeiten ermöglichen, um Aspekte der Chromosomensegregation während der mitotischen oder meiotischen Zellteilung zu untersuchen. Der Handel mit intrazellulärer Fracht könnte gestört werden, indem die Transportwege gehemmt werden, die vom Mikrotubuli-Netzwerk zur Untersuchung des endosomalen Handels, der Bewegung von Mitochondrien oder der nuklearen Positionierung bereitgestellt werden. PSTs wurden auch verwendet, um das Wachstum von Mikrotubuli in 3D-multizellulären Sphäroiden erfolgreich zu hemmen, die aus menschlichen Melanomzelllinien gezüchtetwurden 32,33. Die Kopplung der Flexibilität der PST-Aktivierung mit ihren hervorragenden Reaktionszeiten bietet Forschern ein dynamisches Werkzeug, um die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen und die Zellfunktion zu manipulieren. Darüber hinaus macht die Reversibilität von PSTs ihre Anwendung ideal für die Untersuchung von kurz- und langfristigen Folgen der Mikrotubuli-Hemmung auf eine einzelne Zelle oder ausgewählte Zellen innerhalb eines Gewebes oder Organismus.
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Disclosures
Die Autoren erklären kein konkurrierendes oder finanzielles Interesse.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Oliver Thorn-Seshold und Li Gao für die Bereitstellung von Photostatinen und Ratschlägen zur Manuskriptvorbereitung, Monash Production für die Unterstützung bei den Dreharbeiten und Monash Micro Imaging für die Unterstützung der Mikroskopie.
Diese Arbeit wurde durch den Projektzuschuss APP2002507 des National Health and Medical Research Council (NHMRC) an J.Z. und das Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli-Stipendium für J.Z. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Landesregierung von Victoria und der australischen Regierung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al.
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T.
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T.
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
