Summary
基礎研究および応用研究で広く使用されている典型的な微小管阻害剤は、細胞に広範な影響を及ぼします。最近、フォトスタチンは、微小管の瞬間的、可逆的、時空間的に正確な操作が可能な光スイッチ可能な微小管阻害剤のクラスとして登場した。この段階的なプロトコルは、3Dライブ着床前マウス胚におけるフォトスタチンの適用を詳述する。
Abstract
微小管細胞骨格は、細胞のフレームワークを形成し、細胞内輸送、細胞分裂、およびシグナル伝達の基本である。例えば、ノコダゾールを用いたユビキタス微小管ネットワークの伝統的な薬理学的破壊は、あらゆる細胞に壊滅的な結果をもたらす可能性がある。可逆的に光交換可能な微小管阻害剤は、薬物効果を時空間的に制御された方法で実施することを可能にすることによって、限界を克服する可能性を秘めている。そのような薬物ファミリーの1つは、アゾベンゼンベースのフォトスタチン(PST)である。これらの化合物は暗所条件下では不活性であり、UV光で照明すると、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、微小管重合および動的ターンオーバーを遮断する。ここで、3次元(3D)ライブ着床前マウス胚におけるPSTの適用は、細胞内レベルで微小管ネットワークを破壊するように設定されている。このプロトコルは、実験セットアップの手順、および生細胞共焦点顕微鏡を使用したPSTの光活性化および不活性化パラメータを提供します。これにより、再現性が確保され、他の人がこの手順を研究課題に適用できるようになります。PSTのような革新的なフォトスイッチは、動的な細胞内微小管ネットワークの理解を促進し、リアルタイムで細胞骨格を非侵襲的に操作するための強力なツールとして進化する可能性があります。さらに、PSTは、オルガノイド、ブラストイド、または他の種の胚などの他の3D構造において有用であることが証明され得る。
Introduction
微小管アーキテクチャは、多様な機能をサポートするために、異なる細胞タイプ間で大きく異なる1,2。成長と収縮のそのダイナミックな性質は、細胞外および細胞内の手がかりへの迅速な適応を可能にし、細胞の絶え間なく変化するニーズに応えることを可能にする。したがって、それは細胞の同一性において重要な役割を果たす「形態学的指紋」と考えることができる。
小分子阻害剤を用いた微小管細胞骨格の薬理学的標的化は、発生生物学、幹細胞生物学、癌生物学、および神経生物学3、4、5、6、7における多数の基本的な発見をもたらしている。このアプローチは、不可欠ではありますが、毒性やオフターゲット効果など、さまざまな限界があります。例えば、最も広く使用されている微小管標的化剤の1つであるノコダゾールは、強力な微小管脱重合剤8である。しかしながら、ノコダゾールのような小分子阻害剤は、適用時から活性であり、微小管細胞骨格が多くの重要な細胞機能に必須の性質を有することを考えると、微小管のグローバルな解重合はオフターゲット効果を生じる可能性があり、これは多くの用途には適さない可能性がある。さらに、ノコダゾール処理は、サンプルを薬物なしで洗浄しない限り不可逆的であり、連続的なライブイメージング、したがって個々の微小管フィラメントの正確な追跡を妨げる。
光活性化化合物の開発は、光アンケージド分子の創製から始まり、微小管成長阻害の影響を正確かつ時空間的に制御された方法で標的化およびモニタリングする新しい時代を告げた。可逆的に光交換可能な薬物の1つのファミリーであるフォトスタチン(PST)は、コンブレタスタチンA-4のスチルベン成分をアゾベンゼン9で置き換えることによって開発された。PSTはUV光による照明まで不活性であり、それによって不活性 トランス配置は可逆的異性化によって活性 シス配置に変換される。 Cis-PSTsは、β-チューブリンのコルヒチン結合部位に結合し、β-チューブリンとの界面を遮断し、微小管増殖に必要な二量体化を防止することによって微小管重合を阻害する10。PSTのコホートの中で、PST-1Pは、最も高い効力を有し、完全に水溶性であり、照明後に生理活性の急速な発症を示すため、鉛化合物として浮上している。
PSTの最も効果的な トランスから シス異性化は、360〜420nmの波長で起こり、PST活性化のための二重オプションを可能にする。典型的な共焦点顕微鏡上の405nmレーザーラインを投与して、微小管成長阻害の最適な空間ターゲティングを行うことができる。405nmレーザー照射によるPST活性化の位置とタイミングを正確に特定する機能は、正確な時間的および空間的制御を容易にし、1秒未満の応答時間内に細胞内レベルで微小管ダイナミクスの破壊を可能にします9。あるいは、手頃な価格のLED UV光は、生物全体の照明が微小管アーキテクチャの生物全体の破壊を誘発することを可能にする。これは、空間的ターゲティングではなく、正確にタイミングを合わせた阻害の開始が目標である研究者にとって、費用対効果の高い代替手段となる可能性があります。PSTのもう1つの特徴は、510〜540nmの範囲の波長の緑色光を印加することによってオンデマンドで不活性化されることです9。これにより、PST媒介性増殖阻害の前、最中、および後の微小管フィラメントのトレースが可能になります。
PSTsは、まだ比較的最近の設計ではあるが、アメーバイド12、新生児マウス13の脳から単離されたニューロンにおける細胞遊走の新しいメカニズムの調査、ショウジョウバエメラノガスター14における翼上皮の発生の調査を含む、多様な研究分野にわたる多数のin vitroアプリケーション11で使用されてきた。.他の光反応性薬物は、細胞機能の標的破壊において貴重なツールであることが証明されている。例えば、ブレビスタチンの類似体であるアジドブレビスタチンを、照明下でのミオシン阻害の増強に使用した15、16。これは、細胞機能の時空間的に制御された阻害の能力による新しい発見の可能性を強調している。
生きた3D生物は、生理学的条件下で動物全体、単一細胞、または細胞内レベルで微小管のダイナミクスを操作するための、優れた、より繊細なシステムを提示します。特に、着床前マウス胚は、細胞の内部の働きならびに生物内の細胞間関係についての例外的な洞察を提供する17。PSTの活性化および不活性化の時間的および空間的に標的化された連続的なサイクルは、着床前マウス胚16における非中心染色体微小管組織化中心としての、細胞間の細胞間運動学的構造である相間架橋の特性評価に寄与した。同様の実験セットアップは、胚盤胞形成を可能にするためにマウス胚のシーリングにおける微小管の成長の関与を実証した18。さらに、PSTsは、後脳内の細胞のサブセットにおける微小管増殖を阻害することによって神経細胞遊走を調べるために、ゼブラフィッシュ胚全体においても使用された19。
このプロトコルは、着床前マウス胚におけるPST-1Pの実験セットアップおよび使用を記載する。ここで提示された指示はまた、染色体の分離および細胞分裂の研究、細胞内貨物の輸送、ならびに細胞の形態形成および遊走の研究など、幅広い目的のためのPSTの適用を導くことができる。さらに、このような研究は、オルガノイド系、芽球状、および Caenorhabditis elegans および Xenopus laevisなどの他の胚モデルにおけるPSTの実装を支援し、 体外 受精技術のためのPSTの使用を拡大する可能性がある。
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Protocol
実験は、モナッシュ動物倫理委員会によって動物倫理番号19143の下で承認された。動物は、動物施設(モナッシュ動物研究プラットフォーム)の特定の病原体のない動物ハウス条件で、倫理ガイドラインに厳密に従って飼育された。
1. 着床前マウス胚採取
- スーパー排卵および交配マウスは、先に記載したように16、18、制度的動物倫理ガイドラインに準拠している。
注:生きた胚採取に最も一般的に使用される株は、C57BL/6またはFVB/Nマウスである。ここに示したすべてのデータは、FVB/Nマウスを用いて生成した。 - 交配後の朝に、20に記載のM2培地、またはヒト管液(HTF)培地を用いて卵管から接合体をフラッシュする。21、22に記載されるような口内ピペット装置を用いて、接合体を新鮮な単純カリウム最適化培地(KSOM)液滴に移し、37°Cに予温し、5%CO2に平衡化し、35mm培養皿中で、培地被覆率を確実にするために十分な量の鉱物油を重ね合わせた。
- 20に記載のように接合体を赤色蛍光タグ付き微小管プラス末端マーカーをコードするcRNAと共にマイクロインジェクションする。ここで、エンドバインディングタンパク質3(EB3)-dTomatoのcRNAは、16、18記載のように調製・精製し、マイクロインジェクションバッファーで希釈した後、30ng/μL濃度で使用した。
注:cRNAは事前に準備し、必要になるまで-20°Cで保存することをお勧めします。 - 胚をPST−1P処理のための所望の発生段階に達するまで37°Cおよび5%CO2 で暗所で培養する。
注:異なる胚期に必要な培養時間の包括的なリソースについては、23を参照してください。ここで用いた16細胞期胚については、受精後の胚3日目(E3)まで培養する。
2. 薬物およびイメージング皿の準備
メモ: 手順 2.1-2.10 では、意図しない PST-1P アクティベーションを回避するために、暗い場所または赤色の明るい条件下でのみ作業してください。アルミホイルまたはダークカバーは、PSTを含むすべてのチューブや皿に使用する必要があります。
- 超純水中に濃度50mM PST-1Pのストックを調製する。
注:PST-1Pの分子量は440 g /モルです。原液は-20°Cで最大1年間安定しています。PST-1Pは水または水性緩衝液に可溶であるが、DMSOでは容易に溶解しない。 - ステップ2.1から、超純水中で800μM PST-1Pの中間作用濃度を準備する。
- PST-1Pを新鮮なKSOMで終濃度40μMに希釈する。典型的な実験では、約20 μLのPST-1P処理KSOMが必要であり、19 μLのKSOMで800 μM PST-1Pの1 μLを希釈し、最終容量を20 μLにし、視認性のために赤色光のみを使用して、十分な培地が事前に調製されるようにする。
注:PST-1P希釈液の濃度と活性化状態の両方は、アッセイの確立中に行うべき分光光度計を使用してUV-Vis吸光度スペクトルを撮影することによって確認することができます。1 cmキュベット中の完全トランス40μM希釈液の380nm(A 380)での吸光度は約0.8であるべきである。シス体およびトランス体の両方が、455nmで同じ吸光度を有する(A455)。A380とA455との比がおよそ9:1のとき、希釈は不活性(完全トランス)である。比A380:A455が1:2である場合、希釈は完全に活性化される(完全にシス)。中間比率は、アクティブ化の中間状態を反映します。 - ライブイメージング用のチャンバースライドを準備するために、PST-1P処理KSOMを1つのウェルの中央に10μLピペットし、半球状の液滴を形成した(図1A)。
- 液滴を覆うのに十分な鉱物油を静かに加え、媒体を分散させないようにします。これにより、液滴が蒸発しないようにします。
- チャンバースライド皿を37°Cおよび5%CO2のインキュベーター内で予め温め、CO2 平衡化して最低3時間、または最大で一晩平衡化する。
- ステップ2.6の平衡化期間の終わりに、洗浄ステップとしてPST-1P処理、予温、平衡化KSOMの10μL液滴を含む35mm培養皿を準備する。油で覆い隠さないでください。
- ステップ2.7からPST-1P処理KSOM液滴に口ピペッティングによって胚を移入する。
注:ステップ2.7および2.8は、胚の口ピペッティングに推奨されますが、オプションです。 - ステップ2.4〜2.6で調製した画像化チャンバスライド内のPST−1P処理KSOM液滴の中心に口ピペッティングによって胚を直ちに移入する(図1A)。
- 画像化前に、胚を37°CおよびPST-1P処理KSOM中の5%CO2 で画像化チャンバスライド中で少なくとも1時間インキュベートする。可能であれば、チャンバースライドを37°Cおよび5%CO2 の環境チャンバー内の顕微鏡に取り付け、完全な暗闇の中で、すべてのPST-1Pが不活性 トランス構成にあり、胚が皿の底に沈む可能性があることを確認します。
3.ライブイメージングとPST-1P光活性化
注:ステップ3.1-3.13は、アバランシェフォトダイオード検出器(APD)と暗い環境チャンバを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡で実行されます。これらの手順は、 材料表に記載されている集録ソフトウェアを使用したイメージング設定に特に言及しています。しかし、それらはまた、他の共焦点顕微鏡システムに適用することができる。
- 63x/1.2 NA水油浸漬対物レンズを所定の浸漬媒体で準備します。
- 誘導位置決めに赤色光トーチを用いて、浸漬媒体に接触するように対物レンズを前進させる。この段階では、胚を見つけるために白色または明視野光を使用することは、PST-1Pを早急に活性化する可能性があるため、避けてください。
- 接眼レンズを使用し、赤色光照明の下で、媒体の液滴の端を見つけて、この位置の上に対物レンズを直接配置する。これは、ユーザーが方向を確立し、焦点面を見つけるのを助けることができる。
- 次に、接眼レンズを介して、またはソフトウェア対応のライブモードスキャンで、赤色波長フィルターまたは561nmレーザーを使用して、液滴内の胚を見つけます。
- ステージコントローラとライブスキャンモードを使用して、胚全体のzスタックを取得するための開始点と終了点を設定します。
- レーザー出力設定(通常、APDなどの高感度検出器では561nmのレーザー出力で5%未満で十分です)、デジタルオフセット(通常は-0.900)を調整してEB3-dTomato彗星の外観を最適化し、バックグラウンドノイズ、2μmのピンホール、512 x 512のピクセル解像度、3.15μsのピクセルドウェル時間を最小限に抑えます。
- 1μmのセクション間隔で胚全体のzスタックを取得し、生物全体の微小管成長領域を評価します(図1B)。
- 手順 3.7 の 3D Z スタック画像を使用して、EB3-dTomato トラッキング実験の関心領域 (ROI) を特定します。ズームを 3 倍に増やし、関心のある特定の細胞内領域の周りに長方形の ROI を描画します。
- イメージングパラメータの典型的な値を使用して、単一のz平面のタイムラプスムービーを取得します:561nmレーザーパワー5%、デジタルオフセット-0.900、ピクセル解像度512 x 512、ピンホール3μm、ピクセルドウェル時間3.15μs、ズーム3x、時間間隔500ms。
注:120の時間枠は1分のトラッキングムービーを提供し、データ分析には十分です。蛍光色素分子の漂白が最小限であれば、集録はさらに長く続けることができます(図1C)。 - PST-1Pをアクティブにするには、405 nmレーザーに切り替えて、405 nmレーザーを10%パワーに設定し、ピクセル解像度を512 x 512、ピンホールを最大に開き、ピクセルドウェル時間を3.15 μs、ズーム3倍、時間間隔500 ms、合計20フレームに設定して、別のタイムラプスムービーを取得します(図1D)。
- 561nmレーザーに切り替え、ステップ3.9のように取得を繰り返して、PST-1Pの活性化後にEB3-dTomato彗星が失われることを確認します(図1E)。この取得がアクティブ化後、できるだけ早く行われるようにします。
注:ステップ3.10は、EB3-dトマト彗星のより長い阻害のために繰り返し行うことができる。しかし、胚はUV光によって引き起こされる害を避けるために慎重に監視されなければならない。 - PST-1Pを非アクティブな トランスステートに戻すには、514nmレーザーを10%のパワーで照射します。514 nmレーザーを10%のパワーに設定し、ピクセル解像度を512 x 512、ピンホールを最大に開き、ピクセルドウェル時間を3.15 μs、ズーム3倍、時間間隔500 ms、合計20時間フレームに設定したタイムラプスムービーを取得します(図1F)。
- ステップ3.11を繰り返して、EB3-dトマト彗星の回収率を可視化します(図1G)。
4. 画像データ解析
- PSTによる微小管重合の阻害を分析および定量するには、研究者が特定のニーズに合わせて利用できるソフトウェアプログラムを使用してください。使用を推奨するものは、EB3-dTomato彗星16,18の動き、方向、速度を手動または自動で追跡できる追跡ツールを備えています。
図1:生きた3D着床前マウス胚におけるPST-1P光活性化および失活の概略図。 すべての実験は、完全な暗闇(黒い背景)で、または赤色光照明によってのみ行われます。(a)EB3-dTomatoを発現する生着床前マウス胚を16細胞期まで培養した後、イメージングチャンバースライド中の40μM PST-1Pを含むKSOMの液滴に移す。(B)胚全体の3D画像は、EB3-dトマト彗星の分布を可視化することによって微小管の成長の評価を可能にする。(c)実験を開始するために、EB3-dTomato彗星をタイムラプスイメージングを用いて細胞内領域で追跡する。(d)405nmレーザーを用いた同じ細胞内領域におけるその後のPST−1P光活性化は、EB3−dトマト彗星の損失をもたらす(E)。強化されたPST-1P活性化は、必要に応じて、逐次的な405nm光照明によって実施することができる。(エフ-ジー)PST-1Pを逆にして非アクティブな状態に戻し、EB3-dトマト彗星を回復させるために、514nmレーザーを同じ細胞内領域に照射する。必要に応じて、光活性化および非活性化の複数回のラウンドを行うことができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
プロトコールに沿って、着床前マウス胚に、赤色蛍光dトマト(EB3−dTomato)でタグ付けされたEB3用のcRNAをマイクロインジェクションした。これにより、EB3が重合する微小管プラス末端24に結合するにつれて、成長する微小管の視覚化が可能になります。
実験は、マウス胚が16個の細胞からなる受精(E3)の3日後に行った。他の移植前発達段階は、調査される科学的質問に応じて使用することができる。405nmレーザー光活性化プロトコルを用いて最小限のフォトブリーチングを実証するために、未処理の胚を用いた対照実験が示されている(図2A i)。印象的なEB3-dトマト密度を有するROIは、取得した胚の3D画像に基づいて選択される。この例では、EB3-dTomato の高解像度イメージングにセル全体の単一の z 平面が使用されています。しかしながら、胚の異なる領域は、必要に応じて選択することができる(例えば、皮質領域、核周囲領域、有糸分裂細胞、内細胞または外細胞)。405nmレーザー光照射前のEB3-dトマト発現の画像は、核領域を除く細胞の細胞質全体内で高密度のEB3-dトマトシグナルを示す(図2A ii)。EB3-dトマト濃度の変化は、405nmレーザー光照射に続いて観察されなかった(図2A iii および iv)。したがって、405nmのレーザー光自体は、胚または微小管のダイナミクスにいかなる光損傷も引き起こさない。
次に、16細胞期胚を、ライブイメージングの3時間前に40μM PST-1Pで処理し、暗所に保持した。生体の3D生物に対してPST実験を成功させるためには、有害な影響を避けるためにPST濃度、インキュベーション時間、および必要なレーザー出力の最適な平衡を見つけることが不可欠です11。厳密な暗条件下では、対照胚(図2A i)と同様に、強いEB3-dTomato発現を3D画像で検出することができる(図2B i)。 したがって、PST−1Pは、暗条件下での微小管重合の阻害を惹起しない。単一のz面のタイムラプスイメージングは、405nmレーザー光照射の前に強いEB3-dTomato発現および微小管重合を確認した(図2B ii)。数秒以内に、PST−1Pの405nmレーザー光活性化後にEB3−dトマトシグナルの減少が観察された(図2B iii)。この損失は、熱緩和または周辺領域11への拡散のために徐々に復帰する前に、約2〜20分間持続すると報告されている。したがって、405nmのレーザー光の繰り返し活性化は、EB3-dトマトの損失の持続時間を延長する可能性がある(図1E-D)。重要なことに、EB3-dTomatoをマイクロインジェクションし、PST-1Pとインキュベートした胚は、正常な胚電位を示し、胚盤胞期に発達し(図3、および補足図1)、および有糸分裂の間など、正常な微小管ダイナミクスを示す(補足図2)。したがって、不活性PST-1Pは胚に対して毒性を示さない。
制御されたPST-1P失活は、514nmレーザー光照明によって達成することができる(図2B iv)。このアプローチは、PST-1P誘導増殖阻害後の微小管増殖の起源を決定するのに有用であり得るが、ライブイメージングのための緑色蛍光タンパク質の使用を排除する。暗い条件下で作業することを強くお勧めしますが、PST が誤ってアクティブになった場合、緑色のライト照明によって PST が非アクティブな トランスステートに復帰できるようになります。このような状況では、細胞が活性化前の状態に戻ることができることを保証するための予防措置として、細胞の適切な回復期間が必要である。時間が許せば、理想的には最低でも数時間です。
図2:生きたマウス胚におけるPST-1PのUV光活性化および失活の前後のEB3-dトマトのライブイメージング。 (A i)EB3-dTomatoについて標識された未処理の対照16細胞期マウス胚の最大投影3D zスタック。細胞動態微小管架橋(灰色の矢じりで示される)が複数の相間架橋(黄色の矢じりで示される)と共に存在する。(A2)405nmレーザー露光前に画像化された1つの細胞の単一z面。(ア iii-iv)1つの細胞の単一z面は、405nmレーザー光曝露後直ちに(A iii)および4分間(Abiv)画像化され(紫色の稲妻で示す)、EB3−dTomatoシグナルの変化を示さなかった。(ビ)EB3-dTomato用に標識された16細胞期胚の最大投影3D zスタックを、40μM PST-1Pで処理し、暗所に保持する。相間ブリッジは黄色の矢印で示されます。(ビイ)1つの細胞の単一z平面を活性化前に画像化した。(ロウ)405nmレーザー光曝露の直後に画像化された1つの細胞の単一z面(紫色の稲妻で示される)は、EB3-dTomatoシグナルの顕著な減少を示した。(ビ4)514nmレーザー光曝露の直後に画像化された1つの細胞の単一z面(緑色の稲妻で示す)、EB3−dTomatoシグナルの回復を示す。核は青色破線で示されている。スケールバー:3D胚全体で15μm。差し込み図で5μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:不活性なPST-1P培養条件は、胚盤胞期までの正常な胚発生を可能にする。 (A)暗所での40μM PST-1Pでの培養後の胚盤胞期(E4.5)における胚の単一差動干渉コントラスト(DIC)z面。(B)(A)に示す胚の最大投影3Dz積層体、EB3-dトマト発現量を示す。スケール バー: 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
取得したタイムラプスムービーでは、EB3-dTomatoラベリングは「彗星のような」構造として現れ、成長する微小管フィラメントの追跡を可能にします(図4)。暗条件下で保たれたPST−1P処理胚(図4A)では、個々のEB3−dTomato彗星(図4Bにおいて白および黄色の矢印で示される)が相間架橋から発せられるのが見られ、これは初期マウス胚16において非中心染色体微小管組織化中心として作用する(図4B)。タイムポイント(tスタック)の投影は、EB3-dトマト彗星が移動する全体的な数と距離を表し(図4B)、相間架橋の領域におけるEB3-dトマトの最高密度を示す。405nmのレーザー光でPST-1Pを活性化した後、EB3-dTomato彗星はもはや位相間架橋の基部では見ることができなくなり、tスタックにも存在しない(図4C)。
図4:生きたマウス胚におけるPST-1Pの細胞下UV光活性化前後のEB3-dTomato彗星の追跡。 (A)EB3-dTomatoで標識し、40μM PST-1Pで処理し、暗所に保持した16細胞期のマウス胚の最大投影3D zスタック。(B)405nmレーザー照射前の相間架橋(*で示す)におけるROIの4つの選択された単一のz面および対応するtスタックは、EB3-dTomato彗星を経時的に示す。個々の彗星の動きは黄色と白の矢印で示され、色が一致する破線の矢印は前の時点での彗星の位置を示します。表示される時間は秒単位です。(C)405nmレーザー光曝露の直後に画像化された4つの選択された単一のz平面および対応するtスタック(紫色の稲妻によって示される)は、EB3−dTomato彗星の損失を示す。スケールバー:フル3D胚の場合は10μm。単一のzプレーンの場合は2μm。tスタックの場合は1.5μmです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
まとめると、これらの結果は、生きている着床前マウス胚におけるPST−1Pの適用を実証する。PST-1Pは、405nmレーザーによる活性化後の微小管重合を効果的に阻害し、この阻害は、細胞および細胞内レベルでの514nmレーザー光照射時に可逆的である。
補足図1:不活性PST-1Pで培養された着床前胚は、胚盤胞期までの正常な発生可能性を示す。 (A)未処理対照および(B)PST−1P処理胚が胚盤胞期までの発達速度を示す。すべての胚は、PST-1Pの不活性を確保するために、発生中ずっと暗い条件に保たれた。胚盤胞期への発生率は、対照(100%、n = 13)およびPST-1P処理胚(91.3%、n = 23)の間で同等であった。スケール バーは 20 μm です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:不活性PST-1Pで培養された着床前胚は、有糸分裂中の正常な紡錘体動態を示す。 (A)未処理の対照および(B)PST−1P処理胚を8細胞期から16細胞期に分裂させ、EB3−dトマトおよびヒストン2B(H2B)−GFPを注射する。すべての胚は、PST-1Pの不活性を確保するために、発生中ずっと暗い条件に保たれた。染色体のアラインメントが見られ(AiおよびBi)、続いて早期分裂後期(AiおよびBii)、後期分裂後期(AiiiおよびBiii)、およびサイトカイン症(AbおよびBiv)が欠損なく見られる。スケールバーは、3D 画像で 10 μm、インセットで 5 μm です。(C)分裂後期は、対照において8分53秒、PST-1P処理胚において8分40秒の平均(p値=0.8241)を持続し、(D)テロフェーズ中に脱凝縮した染色体は、対照において19分38秒、PST-1P処理胚において分裂後期開始後18分51秒の平均であった(p値=0.2743)。分析のために、対照においてn=10およびPST−1P処置においてn=12である。さらに、予想通り、すべてのセルが1つの同期波で分割されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
微小管ネットワークは、細胞の基本的な内部動作に不可欠です。その結果、ネットワークへのいかなる摂動も細胞機能のあらゆる側面に広範な結果をもたらす傾向があるため、これは生物における微小管ダイナミクスを操作する上で課題を提示する。光スイッチ可能な微小管標的化合物の出現は、微小管増殖阻害の誘導および逆転に対する優れた制御を用いて、細胞内レベルで細胞骨格を正確に操作する方法を提示する9。このプロトコルは、光活性化PST-1Pによって着床前マウス胚において、細胞内スケールで、かつ時間的に正確な方法で微小管重合を阻害する方法を実証する。さらに、この阻害を逆転させて、微小管ネットワークの短期的な摂動の調査を可能にすることができる。
提示されたプロトコルは、生着床前マウス胚へのPSTの適用に最適化されており、それらの使用を他の様々な培養系に拡大するための基礎として使用することができる。PST の新規ユーザーは、アプリケーション内でトラブルシューティングが必要ないくつかのポイントに遭遇する可能性があり、そのためにいくつかの問題解決手順が提示されます。
PSTの細胞毒性を評価し、細胞に対する毒性を最小限に抑えて微小管増殖の強い阻害を惹起する作業濃度を選択するべきである。PSTおよび他のフォトスイッチの動作濃度を最適化するための広範なプロトコルは、最近のプレプリント11に詳述されている。要するに、PSTの新規使用者は、薬物の段階希釈で暗条件下での細胞毒性を評価することができる。この設定では、EB3-dトマト彗星に対する測定可能な影響はなく、細胞に対する毒性もないはずです。これは、点灯条件下で非細胞傷害性濃度を試験するための出発点を提供する。さらなる実験のためには、EB3-dTomato彗星の減少を惹起する最低濃度が推奨される。
他の薬物治療と同様に、PSTは細胞によって代謝される可能性がある。しかし、実際的な観点からは、 C. elegans 胚をPST-1Pに150分間孵化させ、その後に効果的な異性化を行うことで実証されているように、これは無視できる程度である可能性が高い9。代謝活性の高い系では、PST-1Pの濃度の増加が必要な場合があります。PSTはまた、培養培地を介して拡散し、ROI内の活性PSTの負荷を低減することができる。これを緩和するために、繰り返し光活性化が必要であり得、その細胞毒性は、いくつかの系が光毒性の影響を受けやすいので、個々の細胞型ベースで評価される必要があるであろう。同様に、活性化されたPSTは、光活性化されたROIから拡散し、周囲の微小管に影響を与える可能性がある。しかし、不活性な トランスステートにリラックスして戻るという固有の傾向のために、周辺地域への影響はごくわずかであるべきです。
PSTの使用のための別の潜在的な障害は、これらの組織の限られた光透過性の性質のために、オルガノイドまたはより大きな生物におけるそれらの適用に関連する。より大きな組織は、より深い細胞の光活性化のためにアクセスできない可能性がある。着床前マウス胚は、外側のコーティングである透明帯に囲まれているという点でユニークな課題を提示し、培地に添加された薬物の透過性を妨げる可能性がある。これを緩和するために、胚は、画像化の前にPST−1P中で少なくとも1時間プレインキュベートされる。同様の最適化アプローチは、PSTの細胞取り込みを助けるためにアセトニトリルを添加するなど、生物全体またはオルガノイド系においてPSTを使用する場合に薬物の浸透を増強するために適用され得る9。
PSTの緑色光可逆性のために、これらの化合物は、530nm未満の励起を必要とする蛍光色素(GFPなど)のイメージングと両立しない。ただし、ユーザーは、RFP、mCherry、mPlumなど、530nmを超える励起を必要とする任意の蛍光色素で蛍光色素追跡を実装できます。細胞下構造の二重標識が必要な場合は、赤色および遠赤色ベースの蛍光色素を使用することができます。GFPとの互換性が不可欠な場合、新しいクラスのフォトスイッチSBTubsが興味深いかもしれません25。これらの化合物はまた、UV光によって活性化される。しかし、緑色の光には反応せず、拡散によってのみ機能的に可逆的になりますが、励起波長が488nm以上のすべての蛍光色素とも互換性があります。可逆性を提供するがGFPのイメージングと互換性がないPSTとともに、これらの化合物は、カスタマイズされたアプローチを取り、利用可能なフォトスイッチを研究課題に適応させる柔軟性をユーザーに提供します。
従来の小分子阻害、ノックアウトおよびノックダウンアプローチは、微小管作用を特徴付けるために、全細胞または全生物スケールで実施することができる。これらのアプローチは、容易に可逆的ではなく、しばしば細胞内または時間的に制御された方法で標的とすることが困難な微小管に対して、強力でありながら広範かつ破壊的な効果をもたらす。これらの制限を回避するための1つの戦略は、光誘導性光遺伝学システムの遺伝子工学によるものです。これらの系の用途は大きく異なり、光誘導ヘテロ二量体化、ホモ二量体化、およびタンパク質またはタンパク質ドメインの解離を含む26。最近、光遺伝学的に制御された末端結合タンパク質1(EB1)構築物が設計され、そこでは光誘導性スイッチが微小管のアミノ末端およびカルボキシル末端と末端結合パートナーEB1の切断を可能にした。これにより、1秒未満の応答時間でタンパク質が機能的に不活性になり、ヒト肺癌細胞株27における微小管の増殖が遮断された。同様に、細胞28への形態学的変化に対する細胞骨格架橋の影響を理解するために、D. melanogasterにおける微小管およびアクチンフィラメントを架橋するために光遺伝学的スイッチを使用した。初期胚を操作するための光遺伝学的ツールの使用は、非常に局所的な研究分野であり、最近のいくつかの進歩が見られました1。核タンパク質の誤局在化を誘発するために、光遺伝学的に改変された核輸出システムが開発された。これは、機能喪失遺伝子モデルを模倣することができ、D. melanogaster胚29の正確な発生時点で実施される柔軟性が付加された。光遺伝学的アプローチは、微小管ダイナミクスの時空間制御のための強力なツールである。ただし、設計が難しく、時間がかかり、コストがかかる場合があります。対照的に、PSTは、同様の応答時間、特異性、および可逆性を誇り、使いやすさとアクセシビリティという追加の利点を備えた複雑な遺伝子操作に代わる化学的代替手段を提供します。
微小管フィラメントを機械的に破壊する別の標的アプローチは、2光子レーザーを用いたレーザーアブレーションである。これを、着床前マウス胚16における相間架橋をアブレーションするために首尾よく適用した。うまく実装すると、ユーザーは高い報酬を得ることができます。しかし、この技術を実行することは困難であり、周囲の構造または細胞自体の破壊または溶解を避けるために、高度な精度を必要とする。さらに、微小管が急速に再成長することができるため、ユーザーは意図した効果を達成するためにサンプルを繰り返しアブレーションする必要があるかもしれません30。対照的に、PSTは微小管重合31 を直接阻害し、βチューブリンへの結合に対する特異性のためにレーザーアブレーションで生じ得る望ましくない影響を回避する。さらに、PSTは生物全体に適用できますが、レーザーアブレーションは特定の領域にのみ標的にすることができます。
このプロトコルを使用すると、PSTの適用の可能性は広範で魅力的です。PSTは、有糸分裂または減数分裂細胞分裂中の染色体分離の側面を研究するために、1秒未満の応答時間内に微小管増殖の正確な細胞内阻害を可能にすることができる。細胞内貨物の輸送は、エンドソームの密輸、ミトコンドリアの移動、または核位置決めを研究するために微小管ネットワークによって提供される輸送経路を阻害することによって中断され得る。PSTsはまた、ヒトメラノーマ細胞株から増殖した3D多細胞スフェロイドにおける微小管増殖を首尾よく阻害するためにも使用された32、33。PST活性化の柔軟性と優れた応答時間を組み合わせることで、研究者は微小管のダイナミクスを調査し、細胞機能を操作するための動的なツールを得ることができます。さらに、PSTの可逆性は、その適用を、組織または生物内の単一細胞または選択された細胞に対する微小管阻害の短期的および長期的影響の両方の研究に理想的にする。
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Disclosures
著者らは、競合または金銭的利益を宣言する。
Acknowledgments
著者らは、原稿作成に関するフォトスタチンとアドバイスを提供してくれたOliver Thorn-Seshold博士とLi Gao博士、撮影支援のためのMonash Production、顕微鏡検査支援のためのMonash Micro Imaging に感謝します。
この研究は、J.Z.への国家保健医療研究評議会(NHMRC)プロジェクト助成金APP2002507とJ.Z.へのカナダ高等研究所(CIFAR)アズリエリ奨学金によって支援されました。オーストラリア再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの助成金によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
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