利用光控抑制剂在活体小鼠着床前胚胎中对微管细胞骨架进行时空分辨的亚细胞操控

摘要

常用的微管抑制剂在基础和应用研究中被广泛使用，其对细胞具有广泛的影响。最近，光控微管抑制剂（photostatins）作为一种可光控的微管抑制剂新类别出现，能够实现对微管的瞬时、可逆且在空间和时间上精确的操控。本逐步实验方案详细描述了在三维活体小鼠着床前胚胎中应用光控微管抑制剂的具体方法。

摘要

微管细胞骨架构成细胞的框架，对细胞内运输、细胞分裂和信号转导至关重要。传统药理学方法通过例如诺考达唑（nocodazole）破坏普遍存在的微管网络，可能对任何细胞造成毁灭性后果。可逆光控微管抑制剂有望克服这些局限，实现药物效应在时空上的精确控制。其中一类此类药物是基于偶氮苯的光开关抑制剂（photostatins, PSTs）。这些化合物在黑暗条件下无活性，而在紫外光照射下可结合至β-微管蛋白的秋水仙素结合位点，从而抑制微管的聚合及其动态转换。本文介绍了将PSTs应用于三维（3D）活体小鼠着床前胚胎中，以在亚细胞水平上干扰微管网络的方法。本实验方案提供了实验设置的详细说明，以及利用活细胞共聚焦显微镜进行PSTs光激活与光失活的参数设定。这确保了实验的可重复性，并使其他研究者能够将该方法应用于各自的科研问题中。像PSTs这类创新性光控分子开关有望成为强大的工具，推动人们对动态细胞内微管网络的理解，并实现对细胞骨架的非侵入性实时操控。此外，PSTs也可能在其他三维结构（如类器官、囊胚样结构或其它物种的胚胎）中具有应用价值。

引言

微管结构在不同细胞类型中差异显著，以支持多种功能^1,2。其动态的生长与缩短特性使其能够快速响应细胞内外信号，适应细胞不断变化的需求。因此，微管可被视为细胞身份的关键“形态学指纹”""。

利用小分子抑制剂对微管细胞骨架进行药理学靶向研究，已在发育生物学、干细胞生物学、癌症生物学和神经生物学领域带来大量基础性发现^3,4,5,6,7。尽管这种方法不可或缺，但仍存在多种局限性，例如毒性和脱靶效应。以最常用的微管靶向试剂之一诺考达唑（nocodazole）为例，它是一种强效的微管去聚合药物⁸。然而，像诺考达唑这样的小分子抑制剂自施用起即具有活性，而由于微管细胞骨架对许多关键细胞功能至关重要，全局性的微管去聚合可能引发脱靶效应，因而不适用于许多实验场景。此外，除非将样品彻底洗去药物，否则诺考达唑处理不可逆，这阻碍了 持续的活细胞成像，从而无法精确追踪单个微管纤维的动态变化。

方案

实验经莫纳什动物伦理委员会批准，动物伦理编号为19143。动物饲养于动物设施（莫纳什动物研究平台）的特定病原体阴性动物房环境中，严格遵守伦理指导原则。

1. 小鼠胚胎着床前的采集

1. 按照先前所述方法对小鼠进行超数排卵并交配^16,18，操作需符合机构动物伦理指南。
   注意：用于活体胚胎采集最常用的小鼠品系为 C57BL/6 或 FVB/N 小鼠。本文所示所有数据均使用 FVB/N 小鼠获得。
2. 交配后次日早晨，使用 M2 培养基按文献所述方法²⁰从输卵管中冲洗合子，或使用人输卵管液（HTF）培养基。按照文献所述方法^21,22，利用口控移液装置将合子转移至预先在 37 °C 温育并平衡于 5% CO₂ 环境下的新鲜钾离子优化简单培养基（KSOM）液滴中，培养基于 35 mm 培养皿中，并覆盖足量矿物油以确保培养基完全覆盖。
3. 按照文献所述方法²⁰对合子进行显微注射，注射物为编码红色荧光标记的微管正端结合蛋白的 cRNA。本实验中，使用....

结果

根据实验方案，将带有红色荧光蛋白dTomato标记的EB3的cRNA（EB3-dTomato）显微注射到小鼠植入前胚胎中。由于EB3可结合于聚合中的微管正端，因此能够实现生长中微管的可视化²⁴。

实验在受精后第3天（E3）进行，此时小鼠胚胎由16个细胞组成。根据所研究的科学问题，也可使用其他任何着床前发育阶段的胚胎。为了证明使用405 nm激光激活方案可实现最小程度的光漂白，展示了一个未经处理的胚胎对照实验（图2A i）。根据获取的胚胎三维图像，选择一个EB3-dTomato密度显著的感兴趣区域（ROI）。在此示例中，使用单个z平面覆盖整个细胞，用于EB3-dTomato的高分辨率成像。然而，可根据需要选择胚胎中的不同区域（例如，皮质区、核周区、有丝分裂细胞、内层或外层细胞）。在405 nm激光照射前的EB3-dTomato表达图像显示，除细胞核区域外，整个细胞质中均存在高密度的EB3-dTomato信号（

讨论

微管网络对细胞的基本内部功能至关重要。因此，在活体生物中调控微管动态存在较大挑战，因为对该网络的任何干扰通常都会对细胞功能的各个方面产生广泛影响。光控微管靶向化合物的出现为在亚细胞水平上精确操控细胞骨架提供了可能，并能更精确地控制微管生长抑制的诱导与逆转过程⁹。本实验方案展示了如何在小鼠早期胚胎中，通过光激活的PST-1P在亚细胞尺度上并以时间精确的方式抑制微管聚合。此外，这种抑制作用可被逆转，从而便于研究微管网络的短期扰动效应。

本方案已针对活体小鼠着床前胚胎中PSTs的应用进行了优化，可作为将其应用扩展至其他多种培养系统的基础。PSTs的新用户在应用过程中可能会遇到一些需要排查的问题，本文提供了若干相应的解决步骤。

应评估PST的细胞毒性，并选择一种能够显著抑制微管生长但对细胞毒性最小的工作浓度。近期一篇预印本中详细描述了优化PST及其他光控开关分子工作浓度的完整实验方案¹¹。简而言之，PST的新使用者可在黑暗条件下通过药物的系.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸液管	Sigma-Aldrich	A5177	用于口吸装置
培养皿载片 - LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
编码 EB3-dTomato 的 cRNA	N/A	N/A	根据生产商说明书，使用 mMessage in vitro 转录试剂盒制备
培养皿 - 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150560
人绒毛膜促性腺激素	Sigma-Aldrich	C8554
人输卵管液（HTF）培养基	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris 图像分析软件	Bitplane
浸油 W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	与显微镜浸油物镜配合使用
LED 手电筒 - 红光	Celestron	93588
M2 培养基	Sigma-Aldrich	M7167
小鼠 - 野生型 FVB/N，雄性和雌性	N/A	N/A	雌性 8–9 周龄，雄性 2–6 月龄
微量毛细移液管 - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	用于口吸装置
显微注射缓冲液	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
矿物油	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro 转录试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop 分光光度计	Thermo Fisher Scientific
钾离子优化简单培养基（KSOM）培养基	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
孕马血清促性腺激素	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., 光控微管动力学抑制剂实现光学调控有丝分裂与细胞死亡. Cell. 162 (2), 403–411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA 纯化试剂盒	Sangon	B511361-0100
超纯水	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black 软件	Carl Zeiss