Summary
典型的微管抑制剂广泛用于基础和应用研究，对细胞具有深远的影响。最近，光敏素作为一类光开关微管抑制剂出现，能够对微管进行瞬时，可逆，时空精确操作。该分步实验方案详细介绍了迁光素在3D活体植入前小鼠胚胎中的应用。
Abstract
微管细胞骨架形成细胞的框架，是细胞内运输、细胞分裂和信号转导的基础。例如，使用诺考达唑对无处不在的微管网络进行传统的药理学破坏可能对任何细胞产生破坏性后果。可逆光开关微管抑制剂有可能通过使药物效应能够以时空控制的方式实现来克服局限性。其中一个这样的药物家族是基于偶氮苯的光敏类药物（PST）。这些化合物在黑暗条件下是无活性的，并且在用紫外光照射时，它们与β微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合并阻断微管聚合和动态周转。在这里，PST在3维（3D）活体植入前小鼠胚胎中的应用旨在亚细胞水平上破坏微管网络。该协议提供实验设置的说明，以及使用活细胞共聚焦显微镜的PST的光激活和失活参数。这确保了可重复性，并使其他人能够将此程序应用于他们的研究问题。像PST这样的创新型光开关可以发展成为促进对动态细胞内微管网络的理解并实时非侵入性地操纵细胞骨架的强大工具。此外，PST可能被证明在其他3D结构中有用，例如类器官，胚泡或其他物种的胚胎。
Introduction
微管结构在不同细胞类型之间差异很大，以支持不同的功能1，2。其生长和收缩的动态性质允许快速适应细胞外和细胞内线索，并响应细胞不断变化的需求。因此，它可以被认为是在细胞身份中起关键作用的“形态指纹”。
使用小分子抑制剂对微管细胞骨架进行药理靶向已导致发育生物学，干细胞生物学，癌症生物学和神经生物学中的大量基本发现3，4，5，6，7。这种方法虽然不可或缺，但存在各种局限性，例如毒性和脱靶效应。例如，使用最广泛的微管靶向剂之一诺考达唑是一种强大的微管解聚药物8。然而，诺考达唑等小分子抑制剂从应用时起就具有活性，并且鉴于微管细胞骨架对许多关键细胞功能的必要性质，微管的全局解聚可以产生脱靶效应，这可能不适用于许多应用。此外，除非样品洗涤不含药物，否则诺考达唑治疗是不可逆的，从而阻止连续的实时成像，从而防止精确跟踪单个微管丝。
光激活化合物的发展始于光辐射分子的产生，并预示着以精确和时空控制的方式靶向和监测微管生长抑制效果的新时代。一个可逆光开关药物家族，光刺激素（PST），是通过用偶氮苯9代替康布雷他汀A-4的二苯乙烯成分而开发的。PST在用紫外光照明之前处于非活性状态，其中非活性 转化构型通过可逆异构化转换为有源 顺式构型。 顺式-PST通过与秋水仙碱结合位点β-微管蛋白结合，阻断其与β微管蛋白的界面并防止微管生长所需的二聚反应来抑制微管聚合10。在一组PST中，PST-1P已成为一种先导化合物，因为它具有最高的效力，是完全水溶性的，并且在照明后显示出快速的生物活性。
PST最有效的 反式到 顺式异构化发生在360-420nm之间的波长处，这为PST活化提供了双重选择。可以在典型的共聚焦显微镜上施用405nm激光线，以实现微管生长抑制的最佳空间靶向。通过405 nm激光照明精确定位PST激活的位置和时间的能力有助于精确的时间和空间控制，允许在亚细胞水平上破坏微管动力学，在亚秒级响应时间内9。或者，经济实惠的LED紫外光允许整个生物体照明诱导生物体范围的微管结构破坏。对于研究人员来说，这可能是一种具有成本效益的替代方案，对他们来说，目标是精确定时的抑制发作，而不是空间靶向。PST的另一个特点是通过施加510-540nm范围内波长的绿光9来按需灭活。这样可以在PST介导的生长抑制之前，期间和之后追踪微管丝。
PST虽然仍然是一个相对较新的设计，但已被用于不同研究领域的许多体外应用11，包括研究变性腺细胞迁移的新机制12，从新生小鼠大脑中分离的神经元13，以及黑腹果蝇的翅膀上皮发育14.其他光反应药物已被证明是靶向破坏细胞功能的宝贵工具。例如，blebbistatin的类似物，azidoblebbistatin，用于在照明15，16下增强肌球蛋白抑制。这突出了由于时空控制抑制细胞功能的能力而具有新发现的潜力。
活的3D生物体呈现出精湛而又更精细的系统，可在生理条件下操纵整个动物，单细胞或亚细胞水平上的微管动力学。特别是，植入前小鼠胚胎为细胞的内部运作以及生物体内的细胞间关系提供了非凡的洞察力17。PST的激活和失活的时间和空间靶向连续循环有助于表征相间桥，即细胞之间的细胞动力学后结构，作为植入前小鼠胚胎16中的非中心体微管组织中心。类似的实验装置表明，生长的微管参与小鼠胚胎的密封以允许囊胚形成18。此外，PSTs还用于整个斑马鱼胚胎，通过抑制后脑19中一个细胞亚群中的微管生长来研究神经元细胞迁移。
该协议描述了PST-1P在植入前小鼠胚胎中的实验设置和使用。这里给出的说明还可以指导PST在各种目标中的应用，例如研究染色体分离和细胞分裂，细胞内货物的运输以及细胞形态发生和迁移。此外，这些研究将有助于在类器官系统，胚泡和其他胚胎模型中实施PST，如 秀丽隐杆线虫 和 非洲爪蟾，并可能扩大PST 在体外 受精技术中的应用。
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Protocol
实验由莫纳什动物伦理委员会批准，动物伦理编号为19143。严格按照道德准则，动物被安置在动物设施（莫纳什动物研究平台）的特定无病原体动物房屋条件下。
1. 胚胎植入前胚胎采集
- 如前所述16，18的超排卵和交配小鼠，符合机构动物伦理准则。
注意：用于活胚胎收集的最常用的菌株是C57BL / 6或FVB / N小鼠。这里显示的所有数据都是使用FVB / N小鼠生成的。 - 在交配后的早晨，使用M2培养基（如所述20）或人输卵管液（HTF）培养基从输卵管中冲洗受精卵。使用如21，22所述的口腔移液器装置，将受精卵转移到新鲜的单纯钾优化培养基（KSOM）液滴中，预热至37°C并平衡至5%CO2，在35mm培养皿中覆盖足够体积的矿物油以确保培养基覆盖率。
- 显微注射如20所述的受精卵，其cRNA编码为红色荧光标记的微管加末端标记物。这里，在如上所述16，18制备和纯化并在显微注射缓冲液中稀释后，以30ng / μL浓度使用末端结合蛋白3（EB3）-dTomato的cRNA。
注意：建议提前制备cRNA并将其储存在-20°C直至需要。 - 在37°C和5%CO2 的黑暗中培养胚胎，直到胚胎达到PST-1P处理的所需发育阶段。
注意：有关不同胚胎阶段所需培养时间的综合资源，请参见23。对于这里使用的16细胞阶段胚胎，培养到受精后胚胎第3天（E3）。
2. 药物和成像皿制备
注意：对于步骤 2.1-2.10，请仅在黑暗或红光条件下工作，以避免意外的 PST-1P 激活。所有含有PST的管子和培养皿都应使用铝箔或深色盖子。
- 在超纯水中制备50mM PST-1P的储备液。
注意：PST-1P的分子量为440克/摩尔。储备溶液在-20°C下稳定长达1年。PST-1P可溶于水或水缓冲液，但不易溶于DMSO。 - 从步骤2.1开始，在超纯水中制备工作浓度为800μM PST-1P的中间体。
- 将PST-1P稀释至新鲜KSOM中终浓度为40μM。由于典型的实验需要大约20μL的PST-1P处理的KSOM，将1μL的800μM PST-1P稀释在19μLKSOM中，最终体积为20μL，以确保提前制备足够的培养基，仅使用红光即可看到。
注意：PST-1P稀释液的浓度和活化状态都可以通过使用分光光度计采集紫外可见吸光度光谱来检查，这应该在测定建立期间完成。在1cm比色皿中，全反式40μM稀释液在380nm（A 380）处的吸光度应约为0.8。顺式和反式在455nm处具有相同的吸光度（A455）。当A380与A455的比例约为9：1时，稀释液是无活性的（完全反式）。当A380：A455的比例为1：2时，稀释液被完全激活（完全顺式）。中间比率反映了活化的中间状态。 - 为了准备用于实时成像的腔室载玻片，将10μLPST-1P处理的KSOM移液到一个孔的中心以形成半球形液滴（图1A）。
- 轻轻加入足够的矿物油以覆盖液滴，确保它不会分散介质。这将确保液滴不会蒸发。
- 预热和CO2-平衡室载玻片在培养箱中在37°C和5%CO2 下至少3小时或最多过夜。
- 在步骤2.6中的平衡期结束时，制备35mm培养皿，其中包含10μL PST-1P处理，预热和平衡KSOM液滴作为洗涤步骤。不要沾上油。
- 通过口腔移液将胚胎转移到步骤2.7中经过PST-1P处理的KSOM液滴中。
注意：建议将步骤2.7和2.8用于胚胎的口腔移液，但这是可选的。 - 立即通过口移液将胚胎移植到步骤2.4-2.6制备的成像室载玻片中PST-1P处理的KSOM液滴的中心（图1A）。
- 在成像前，在成像室载玻片中将胚胎在37°C和PST-1P处理的KSOM中孵育5%CO2 至少1小时。如果可能，将腔室载玻片安装在显微镜上，在37°C和5%CO 2的环境室内，并在完全黑暗中， 以确保所有PST-1P都处于非活性 反式配置中，并且胚胎可以沉入培养皿的底部。
3. 实时成像和PST-1P光活化
注：步骤3.1-3.13在装有雪崩光电二极管探测器（APD）和黑暗环境室的激光扫描共聚焦显微镜上执行。这些说明具体是指使用 材料表中描述的采集软件进行成像设置;然而，它们也可以应用于其他共聚焦显微镜系统。
- 用规定的浸渍培养基制备63x/ 1.2 NA水油浸物镜。
- 使用红灯手电筒引导定位，推进物镜接触浸入介质。在这个阶段，避免使用白光或明场光来寻找胚胎，因为这会早熟地激活PST-1P。
- 使用目镜并在红光照明下，定位介质液滴的边缘，并将物镜直接定位在该位置。这可以帮助用户建立方向并找到焦平面。
- 接下来，通过目镜或软件启用的实时模式扫描，使用红色波长滤光片或561nm激光定位液滴内的胚胎。
- 使用分阶段控制器和实时扫描模式设置获取整个胚胎的z堆栈的起点和终点。
- 调整激光功率设置（通常，使用高灵敏度探测器，如APD，561 nm激光功率小于5%就足够了），数字偏移（通常在-0.900）以优化EB3-dTomato彗星的外观并最小化背景噪声，针孔在2μm，像素分辨率为512 x 512，像素停留时间为3.15 μs。
- 以1μm的切片间隔获取整个胚胎的z堆栈，以评估整个生物体中微管生长的区域（图1B）。
- 使用步骤 3.7 中的 3D z 轴堆栈图像识别 EB3-dTomato 跟踪实验的感兴趣区域 （ROI）。将缩放比例增加到 3 倍，并在感兴趣的特定亚细胞区域周围绘制一个矩形 ROI。
- 使用成像参数的典型值获取单个z平面的延时短片：561 nm激光功率（5%），数字偏移为-0.900，像素分辨率为512 x 512，针孔为3 μm，像素停留时间为3.15 μs，变焦为3x，时间间隔为500 ms。
注意：120个时间范围将提供1分钟的跟踪电影，应该足以进行数据分析。只要荧光基团的漂白最小，采集可以持续更长时间（图1C）。 - 要激活 PST-1P，请切换到 405 nm 激光器并获取另一个延时短片，其中 405 nm 激光器设置为 10% 功率，像素分辨率为 512 x 512，针孔最大打开，像素停留时间为 3.15 μs，变焦为 3 倍，时间间隔为 500 ms，总共 20 帧（图 1D）。
- 切换回561 nm激光并重复采集，如步骤3.9所示，以确认PST-1P激活后EB3-d番茄彗星的损失（图1E）。确保在激活后尽快进行此获取。
注意：步骤3.10可以重复进行，以延长EB3-dTomato彗星的抑制时间。但是，必须仔细监测胚胎，以避免紫外线造成的任何伤害。 - 要将PST-1P反转回其非活动 交易状态，请以10%的功率接合514 nm激光器。将 514 nm 激光设置为 10% 功率、像素分辨率为 512 x 512、针孔最大打开、像素停留时间为 3.15 μs、变焦为 3 倍、时间间隔为 500 ms 以及总共 20 个时间帧，从而获取延时短片（图 1F）。
- 重复步骤3.11以可视化EB3-d番茄彗星的恢复（图1G）。
4. 图像数据分析
- 为了分析和量化PST对微管聚合的抑制作用，请使用研究人员可用的软件程序来满足他们的特定需求。那些推荐使用的人将拥有一个跟踪工具，可以手动或自动跟踪EB3-dTomato彗星16，18的运动，方向和速度。
图1：PST-1P光活化和失活在活体3D植入前小鼠胚胎中的示意图。 所有实验均在完全黑暗（黑色背景）或仅通过红光照明进行。（A）将表达EB3-dTomato的活植入前小鼠胚胎培养至16细胞阶段，然后转移到成像室载玻片中含有40μM PST-1P的KSOM液滴中。（B）整个胚胎的3D图像可以通过可视化EB3-dTomato彗星的分布来评估微管生长。（C）为了开始实验，EB3-dTomato彗星在亚细胞区域使用延时成像进行跟踪。（D）随后使用405nm激光在同一亚细胞区域的PST-1P光活化导致EB3-d番茄彗星（E）的损失。如有必要，可以通过顺序405 nm光照来实现增强的PST-1P激活。（F-G）为了将PST-1P逆转回其非活性状态并恢复EB3-dTomato彗星，将514nm激光器施加到相同的亚细胞区域。如果需要，可以执行多轮光活化和失活。请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
根据方案，植入前小鼠胚胎用cRNA显微注射EB3，用红色荧光dTomato（EB3-dTomato）标记。这使得生长中的微管可视化成为可能，因为EB3与聚合微管加末端24结合。
实验在受精后3天（E3）进行，当时小鼠胚胎由16个细胞组成。可以使用任何其他植入前发育阶段，具体取决于要研究的科学问题。为了证明使用405nm激光激活方案的最小光漂白，显示了未处理胚胎的对照实验（图2A i）。根据获得的胚胎的3D图像选择具有惊人的EB3-d番茄密度的ROI。在这个例子中，整个细胞的单个z平面用于EB3-dTomato高分辨率成像。然而，可以根据需要选择胚胎的不同区域（例如，皮质区域，核周区域，有丝分裂细胞，内细胞或外细胞）。在405nm激光照明之前，EB3-dTomato表达的图像显示细胞的整个细胞质内（核区域除外）内具有高密度的EB3-dTomato信号（图2A ii）。在405nm激光照射后，未观察到EB3-d番茄密度的变化（图2A iii 和 iv）。因此，405nm激光本身不会对胚胎或微管动力学造成任何光损伤。
接下来，在活体成像前3小时用40μM PST-1P处理16细胞阶段胚胎并保持在黑暗中。为了在活的3D生物体上成功进行PST实验，至关重要的是找到PST浓度，孵育时间和所需激光功率的最佳平衡，以避免有害影响11。在严格的黑暗条件下，可以在3D图像中检测到强烈的EB3-dTomato表达（图2B i），类似于对照胚胎（图2A i）。因此，PST-1P在黑暗条件下不会引发微管聚合的抑制。单个z平面的延时成像证实了在405nm激光照明之前具有很强的EB3-dTomato表达和微管聚合（图2B ii）。在几秒钟内，在PST-1P的405nm激光激活后观察到EB3-dTomato信号的减少（图2B iii）。据报道，这种损失持续约2至20分钟，然后由于热松弛或扩散到周围区域11而逐渐恢复。因此，重复的405nm激光激活可能会延长EB3-d番茄损失的持续时间（图1E-D）。重要的是，用EB3-dTomato显微注射并用PST-1P孵育的胚胎显示出正常的胚胎潜力，发育到囊胚阶段（图3和补充图1），以及正常的微管动力学，例如，在有丝分裂期间（补充图2）。因此，无活性的PST-1P对胚胎没有任何毒性。
受控的PST-1P失活可以通过514 nm激光照明来实现（图2B iv）。虽然这种方法可用于确定PST-1P诱导的生长抑制后微管生长的起源，但它排除了使用绿色荧光蛋白进行活体成像。虽然强烈建议在黑暗条件下工作，但如果PST被无意中激活，绿光照明使PST恢复到非活动 交易状态。在这种情况下，需要细胞足够的恢复期作为预防措施，以确保细胞能够恢复到其活化前状态。如果时间允许，理想情况下至少是几个小时。
图2：EB3-dTomato在活体小鼠胚胎中紫外光激活和失活之前和之后的EB3-dTomato的实时成像。 （A i）标记为EB3-dTomato的未经处理的对照16细胞阶段小鼠胚胎的最大投影3D z-stack。细胞动力学微管桥（用灰色箭头表示）与多个相间桥（用黄色箭头表示）一起存在。（二）在405 nm激光曝光之前成像的一个细胞的单个z平面。（三至四）在405nm激光暴露（由紫色闪电指示）后立即成像的一个细胞的单z平面（A iii）和4分钟（A iv），显示EB3-dTomato信号没有变化。（B i）标记为EB3-dTomato的16细胞阶段胚胎的最大投影3D z-stack，用40μM PST-1P处理并保持在黑暗中。相间桥由黄色箭头表示。（B 二）一个细胞的单个z平面成像预激活。（B 三）在405nm激光暴露（由紫色闪电指示）后立即成像的一个细胞的单个z平面，显示EB3-dTomato信号显着减少。（B 四）在514 nm激光暴露（由绿色闪电指示）后立即成像的一个细胞的单个z平面，显示EB3-dTomato信号的恢复。原子核由蓝虚线表示。比例尺：整个3D胚胎为15μm;5 μm 的插图。 请点击此处查看此图的大图。
图3：非活性PST-1P培养条件允许正常的胚胎发育到囊胚期。 （A）在黑暗中在40μM PST-1P中培养后，胚泡期（E4.5）胚胎的单差分干涉对比（DIC）z平面。（B）最大投影（A）所示胚胎的3D z-stack，显示EB3-dTomato的表达。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
在采集的延时短片中，EB3-dTomato标记显示为“彗星样”结构，可以跟踪生长中的微管丝（图4）。在PST-1P处理的胚胎中，保持在黑暗条件下（图4A），可以看到单个EB3-dTomato彗星（ 在图4B中由白色和黄色箭头表示）从相间桥发出，其充当早期小鼠胚胎16 中的非中心体微管组织中心（图4B）。时间点（t-stack）的投影描绘了EB3-dTomato彗星行进的总数和距离（图4B），显示了相间桥区域中EB3-dTomato的最高密度。在用405nm激光激活PST-1P之后，EB3-dTomato彗星在相间电桥的底部不再可见，并且在t-堆栈中也不存在（图4C）。
图4：跟踪活小鼠胚胎中PST-1P的亚细胞紫外光激活之前和之后的EB3-dTomato彗星。 （A）标记EB3-dTomato的16细胞阶段小鼠胚胎的最大投影3D z-stack，用40μM PST-1P处理并保持在黑暗中。（B）在405 nm激光照明之前，在相间电桥（用*表示）处有四个选定的单个z平面和相应的ROI t-堆栈（用*表示），显示EB3-dTomato彗星随时间的变化。单个彗星的运动由黄色和白色箭头表示，而颜色匹配的虚线箭头则显示彗星在先前时间点的位置。显示的时间以秒为单位。（C）在405 nm激光暴露（由紫色闪电指示）后立即成像的四个选定的单个z平面和相间桥的相应t-堆栈显示EB3-dTomato彗星的损失。比例尺：10μm用于全3D胚胎;单z平面为2 μm;1.5 μm 表示 t 堆叠。 请点击此处查看此图的大图。
综上所述，这些结果证明了PST-1P在活体植入前小鼠胚胎中的应用。PST-1P在用405nm激光激活后有效抑制微管聚合，并且在细胞和亚细胞水平上以514nm激光照明时，这种抑制是可逆的。
补充图1：在不活跃的PST-1P中培养的植入前胚胎显示出囊胚期的正常发育潜力。 （A）未经处理的对照和（B）PST-1P处理的胚胎显示出囊胚期的发育速度。在整个发育过程中将所有胚胎保持在黑暗条件下，以确保PST-1P不活动。对照组（100%，n = 13）和PST-1P处理的胚胎（91.3%，n = 23）的囊胚期发育速率相当。比例尺为 20 μm。 请单击此处下载此文件。
补充图2：在无活性PST-1P中培养的植入前胚胎在有丝分裂期间显示出正常的纺锤体动力学。 （A）未经处理的对照和（B）PST-1P处理的胚胎从8细胞阶段分裂到16细胞阶段，注射EB3-dTomato和组蛋白2B（H2B）-GFP。在整个发育过程中将所有胚胎保持在黑暗条件下，以确保PST-1P不活动。可以看到染色体的排列（A i 和 B i），然后是早期分析期（A ii 和 B ii），晚期分析期（A iii 和 B iii）和细胞分裂（A iv 和 B iv），没有缺陷。比例尺在 3D 图像中为 10 μm，在插图中为 5 μm。（C）在对照组中，Anaphase平均持续8分53秒，PST-1P处理的胚胎（p值= 0.8241）和（D）染色体在端粒期期间平均持续8分53秒，在PST-1P处理的胚胎中，平均持续19分38秒，在PST-1P处理的胚胎中，相位起始后18分51秒（p值= 0.2743）。对于分析，对照组n = 10，PST-1P治疗中n = 12。此外，正如预期的那样，所有单元都被分成一个同步波。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
微管网络是细胞基本内部运作的组成部分。因此，这为操纵生物体中的微管动力学带来了挑战，因为对网络的任何扰动往往对细胞功能的各个方面产生广泛的影响。光开关微管靶向化合物的出现提供了一种在亚细胞水平上精确操纵细胞骨架的方法，对微管生长抑制的诱导和逆转具有卓越的控制力9。该协议展示了如何在植入前小鼠胚胎中通过光激活的PST-1P在亚细胞尺度上以时间精确的方式抑制微管聚合。此外，这种抑制可以被逆转，以允许研究微管网络的短期扰动。
所提出的方案针对PST在活体植入前小鼠胚胎上的应用进行了优化，可用作将其使用扩展到各种其他培养系统的基础。PST 的新用户可能会在其应用程序中遇到需要故障排除的某些点，为此提供了几个解决问题的步骤。
应评估 PST 的细胞毒性，并选择能引起微管生长强烈抑制且对细胞毒性最小的工作浓度。用于优化PST和其他光开关工作浓度的广泛方案在最近的预印11中进行了详细说明。简而言之，PST的新用户可以通过连续稀释药物在黑暗条件下评估细胞毒性。在这种情况下，对EB3-dTomato彗星没有可测量的影响，对细胞没有毒性。这为在光照条件下测试非细胞毒性浓度提供了起点。为了进一步实验，建议使用导致EB3-dTomato彗星减少的最低浓度。
与任何药物治疗一样，PST能够被细胞代谢;然而，从实际角度来看，这很可能是可以忽略不计的，如 秀丽隐杆线虫 胚胎在PST-1P中孵育150分钟并随后的有效异构化9所示。对于高代谢活性系统，可能需要增加PST-1P的浓度。PST还可以通过培养基扩散，从而降低ROI内活性PST的负荷。为了减轻这种情况，可能需要重复光活化，其细胞毒性需要在单个细胞类型的基础上进行评估，因为某些系统可能容易受到光毒性的影响。同样，活化的PST可能从光活化的ROI中扩散出来并影响周围的微管。然而，由于它们固有的趋向于放松回非活性 的转化状态，对周围区域的影响应该可以忽略不计。
使用PST的另一个潜在障碍涉及它们在类器官或大型生物体中的应用，因为这些组织的光穿透性有限。较大的组织可能无法用于较深细胞的光活化。植入前小鼠胚胎提出了一个独特的挑战，因为它被外层涂层（透明带）包围，这可以阻碍添加到培养基中的药物的渗透性。为了缓解这种情况，胚胎在成像前在PST-1P中预孵育至少1小时。当在全生物体或类器官系统中使用PST时，类似的优化方法可能适用于增强药物的渗透，例如添加乙腈以帮助细胞摄取PSTs9。
由于PST的绿光可逆性，这些化合物与需要激发低于530nm的荧光团（如GFP）的成像不相容。然而，用户可以使用任何需要激发高于530nm的荧光团实现荧光团跟踪，例如RFP，mCherry或mPlum。如果需要对亚细胞结构进行双重标记，用户可以使用基于红色和远红色的荧光团。如果GFP兼容性至关重要，那么一类新的光开关SBTubs可能会引起人们的兴趣25。这些化合物也被紫外线激活;然而，它们对绿光无反应，仅通过扩散使它们在功能上可逆，但也与激发波长为488nm或更高的所有荧光团兼容。这些化合物与PST一起提供可逆性但与GFP成像不兼容，为用户提供了更大的灵活性，可以采取定制方法并使可用的光开关适应他们的研究问题。
传统的小分子抑制，敲除和敲低方法可以在全细胞或全生物体尺度上实施，以表征微管作用。这些方法对微管提供了有效但广泛和破坏性的影响，这些微管不易逆转，并且通常难以以亚细胞或时间控制的方式靶向。规避这些限制的一种策略是通过光诱导光遗传学系统的基因工程。这些系统的应用差异很大，包括光诱导的异源二聚化，同源二聚化以及蛋白质或蛋白质结构域的解离26。最近，设计了一种光遗传学控制的末端结合蛋白1（EB1）构建体，其中光诱导开关能够解离微管的氨基和羧基末端以及末端结合伴侣EB1。这使得该蛋白质在功能上无活性，具有亚秒级响应时间，阻断了人肺癌细胞系27中微管的生长。类似地，光遗传学开关用于交联 D. melanogaster 中的微管和肌动蛋白丝，以了解细胞骨架交联对细胞28形态学变化的影响。使用光遗传学工具来操纵早期胚胎是一个高度热门的研究领域，并且已经看到了一些最近的进展1。开发了一种光遗传学修饰的核输出系统来诱导核蛋白的错误定位。这可以模仿功能丧失的遗传模型，在 D. melanogaster 胚胎29的精确发育时间点进行增加灵活性。光遗传学方法是微管动力学时空控制的有力工具;但是，它们可能难以设计，耗时且成本高昂。相比之下，PST为复杂的遗传操作提供了一种化学替代品，具有相似的响应时间，特异性和可逆性，并具有易于使用和可访问的额外优势。
机械破坏微管丝的另一种靶向方法是使用双光子激光进行激光消融。该成功应用于胚胎植入前小鼠胚胎16中的相间桥消融。如果实施得当，用户可以获得高回报。然而，执行这种技术具有挑战性，并且需要高度的精度，以避免任何周围结构或细胞本身的破坏或裂解。此外，用户可能需要反复消融他们的样品以达到预期的效果，因为微管可以快速再生30。相反，PST直接抑制微管聚合31 并避免激光消融可能产生的不良影响，因为它们与β微管蛋白结合的特异性。此外，PST可以应用于整个生物体，而自然界的激光消融只能针对特定区域。
使用该协议，PST的应用可能性是广泛而引人注目的。PST可以在亚秒响应时间内精确地抑制微管生长，以研究有丝分裂或减数分裂期间染色体分离的各个方面。通过抑制微管网络提供的运输途径来破坏细胞内货物的运输途径，以研究内体运输，线粒体的运动或核定位。PST还用于成功抑制从人黑色素瘤细胞系32，33生长的3D多细胞球体中的微管生长。将PST激活的灵活性与其出色的响应时间相结合，为研究人员提供了一种动态工具，可以研究微管动力学并操纵细胞功能。此外，PST的可逆性使其应用非常适合研究微管抑制对组织或生物体内单个细胞或选定细胞的短期和长期后果。
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Disclosures
作者声明没有竞争或经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢Oliver Thorn-Seshold博士和Li Gao博士为我们提供的摄影素和手稿准备建议，Monash Production提供拍摄支持，Monash Micro Imaging提供显微镜支持。
这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）项目赠款APP2002507对J.Z.和加拿大高级研究所（CIFAR）Azrieli奖学金对J.Z.的支持。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚政府的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
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