Summary
Inibidores típicos de microtúbulos, amplamente utilizados em pesquisas básicas e aplicadas, têm efeitos de longo alcance nas células. Recentemente, as fotostatinas surgiram como uma classe de inibidores de microtúbulos fotossentaráveis, capazes de manipulação instantânea, reversível e espacialmente precisa de microtúbulos. Este protocolo passo a passo detalha a aplicação de fotostatinas em um embrião de rato de pré-implantação 3D vivo.
Abstract
O citoesqueleto microtúbulo forma a estrutura de uma célula e é fundamental para o transporte intracelular, divisão celular e transdução de sinais. A ruptura farmacológica tradicional da onipresente rede de microtúbulos usando, por exemplo, nocodazol pode ter consequências devastadoras para qualquer célula. Inibidores de microtúbulos reversivelmente fotossceráveis têm o potencial de superar as limitações, permitindo que os efeitos medicamentosos sejam implementados de forma espacialmente controlada. Uma dessas famílias de drogas é a fotostatina baseada em azobenzeno (PSTs). Esses compostos são inativos em condições escuras, e após a iluminação com luz UV, eles se ligam ao local de ligação colchicina de β-tubulina e bloqueiam a polimerização de microtúbulos e a rotatividade dinâmica. Aqui, a aplicação de PSTs no embrião de rato de pré-implantação ao vivo 3D (3D) é definida para interromper a rede de microtúbulos em um nível subcelular. Este protocolo fornece instruções para a configuração experimental, bem como parâmetros de ativação e desativação de luz para PSTs usando microscopia confocal de células vivas. Isso garante a reprodutibilidade e permite que outras pessoas apliquem esse procedimento às suas questões de pesquisa. Fotossensíveis inovadores como os PSTs podem evoluir como ferramentas poderosas para avançar na compreensão da rede dinâmica de microtúbulos intracelulares e manipular não invasivamente o citoesqueleto em tempo real. Além disso, os PSTs podem ser úteis em outras estruturas 3D, como organoides, blastóides ou embriões de outras espécies.
Introduction
A arquitetura de microtúbulos varia amplamente entre diferentes tipos de células para suportar diversas funções 1,2. Sua natureza dinâmica de crescimento e encolhimento permite uma rápida adaptação a pistas extra e intracelulares e responder às necessidades em constante mudança de uma célula. Assim, pode ser considerada como a "impressão digital morfológica" desempenhando um papel fundamental na identidade celular.
O direcionamento farmacológico do citoesqueleto microtúbulo usando inibidores de pequenas moléculas levou a uma infinidade de descobertas fundamentais na biologia do desenvolvimento, biologia de células-tronco, biologia do câncer e neurobiologia 3,4,5,6,7. Essa abordagem, embora indispensável, apresenta várias limitações, como toxicidade e efeitos fora do alvo. Por exemplo, um dos agentes de microtúbula mais utilizados, nocodazole, é uma poderosa droga despolimerizadora de microtúbulos8. No entanto, inibidores de pequenas moléculas como o nocodazol são ativos desde o momento da aplicação e, dada a natureza essencial do citoesqueleto microtúbulo para muitas funções celulares críticas, a despolimerização global de microtúbulos pode produzir efeitos fora do alvo, que podem ser inadequados para muitas aplicações. Além disso, o tratamento do nocodazol é irreversível, a menos que as amostras sejam lavadas livre da droga, prevenindo imagens vivas contínuas e, portanto, o rastreamento preciso de filamentos microtúbulos individuais.
O desenvolvimento de compostos ativados pela luz começou com a criação de moléculas fotouncaged e anunciou uma nova era na segmentação e monitoramento dos efeitos da inibição do crescimento de microtúbulos de forma precisa e espacialmente controlada. Uma família de drogas reversivelmente fotowitchable, fotostatinas (PSTs), foram desenvolvidas substituindo o componente de stilbene da combretastatina A-4 por azobenzeno9. Os PSTs estão inativos até a iluminação com luz UV, pela qual a configuração trans inativa se converte na configuração cis ativa por isomerização reversível. Os Cis-PSTs inibem a polimerização de microtúbulos ligando-se ao local de ligação colchicina de β-tubulina, bloqueando sua interface com β-tubulina e prevenindo a dimerização necessária para o crescimento de microtúbulos10. Entre uma coorte de PSTs, pst-1P emergiu como um composto de chumbo, pois tem a maior potência, é totalmente solúvel em água, e mostra um rápido início de bioatividade após a iluminação.
A trans-isomerização mais eficaz de PSTs ocorre em comprimentos de onda entre 360-420 nm, o que permite duas opções para ativação de PST. Uma linha laser de 405 nm em um microscópio confocal típico pode ser administrada para o direcionamento espacial ideal da inibição do crescimento de microtúbulos. A capacidade de identificar a localização e o tempo da ativação do PST através da iluminação laser de 405 nm facilita o controle temporal e espacial preciso, permitindo a interrupção da dinâmica dos microtúbulos em um nível subcelular, dentro do vezes de resposta sub-segundo9. Alternativamente, uma luz LED UV acessível permite que a iluminação do organismo inteiro induza a interrupção em todo o organismo da arquitetura do microtúbulo. Esta pode ser uma alternativa econômica para pesquisadores para os quais o início precisamente cronometrado da inibição, em vez de direcionamento espacial, é o objetivo. Outra característica dos PSTs é sua inativação sob demanda, aplicando luz verde de um comprimento de onda na faixa de 510-540 nm9. Isso permite o rastreamento de filamentos microtúbulos antes, durante e depois da inibição de crescimento mediada pelo PST.
Os PSTs, embora ainda um projeto relativamente recente, têm sido usados em inúmeras aplicações in vitro em diversos campos de pesquisa11, incluindo a investigação de novos mecanismos de migração celular em ameebóides12, em neurônios isolados do cérebro do camundongo recém-nascido13, e desenvolvimento de epitélio de asa em Drosophila melanogaster14 . Outras drogas leves reativas provaram ser ferramentas valiosas na interrupção direcionada da função celular. Por exemplo, um análogo de blebbistatina, azidoblebbistatin, foi usado para a inibição aprimorada da mosina sob iluminação15,16. Isso destaca o potencial para novas descobertas devido à capacidade de inibição espacialmente controlada da função celular.
Organismos 3D vivos apresentam sistemas soberbos e ainda mais delicados para manipular a dinâmica dos microtúbulos em um nível animal inteiro, unicelular ou subcelular em condições fisiológicas. Em particular, o embrião do rato de pré-implantação oferece uma visão excepcional do funcionamento interno da célula, bem como das relações intercelulares dentro de um organismo17. Ciclos consecutivos de ativação e desativação de PSTs contribuíram para a caracterização da ponte interfase, uma estrutura pós-citocinética entre as células, como um centro-organizador de microtúbulos não centrosômicos no embrião de camundongos pré-implantação16. Uma configuração experimental semelhante demonstrou o envolvimento de microtúbulos crescentes na vedação do embrião do rato para permitir a formação de blastocisto18. Além disso, os PSTs também foram usados em embriões inteiros de zebrafish para investigar a migração de células neuronais inibindo o crescimento de microtúbulos em um subconjunto de células no cérebro traseiro19.
Este protocolo descreve a configuração experimental e o uso de PST-1P no embrião do rato de pré-implantação. As instruções aqui apresentadas também podem orientar a aplicação de PSTs para uma ampla gama de objetivos, como o estudo da segregação de cromossomo e divisão celular, tráfico de carga intracelular e morfogênese celular e migração. Além disso, tais estudos auxiliarão a implementação de PSTs em sistemas organoides, blastóides e outros modelos de embriões, como Caenorhabditis elegans e Xenopus laevis, bem como potencialmente expandirão o uso de PSTs para tecnologias de fertilização in vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Monash sob o número de ética animal 19143. Os animais foram alojados em condições específicas de casária animal sem patógenos na instalação animal (Monash Animal Research Platform) em estrita conformidade com as diretrizes éticas.
1. Coleção de embriões de camundongos pré-implantação
- Camundongos superovulados e acasalados, conforme descrito anteriormente16,18, em conformidade com as diretrizes institucionais de ética animal.
NOTA: As cepas mais utilizadas para a coleta de embriões vivos são os camundongos C57BL/6 ou FVB/N. Todos os dados aqui mostrados foram gerados usando camundongos FVB/N. - Na manhã seguinte ao acasalamento, o flush zygotes do oviduto usando m2 médio como descrito20, ou fluido tubal humano (HTF) médio. Usando um aparelho de pipeta bucal como descrito21,22, transfira zygotes para gotículas frescas de Potássico Simplex Optimised Medium (KSOM), pré-armados a 37 °C e equilibradas para 5% de CO2, em um prato de cultura de 35 mm sobreposto com um volume suficiente de óleo mineral para garantir a cobertura da mídia.
- Zygotes microinjetados como descrito20 com codificação cRNA para um microtúbulo vermelho fluorescente marcado mais marcador final. Aqui, o cRNA para a proteína de ligação final 3 (EB3)-dTomato foi usado em concentração de 30 ng/μL após a preparação e purificação como descrito16,18 e diluição no tampão de microinjeção.
NOTA: Recomenda-se preparar o cRNA com antecedência e armazená-lo a -20 °C até que seja necessário. - Embriões de cultura no escuro a 37 °C e 5% de CO2 até que os embriões tenham atingido o estágio de desenvolvimento desejado para o tratamento PST-1P.
NOTA: Para um recurso abrangente dos tempos de cultura necessários para diferentes estágios embrionários, consulte23. Para embriões de estágio de 16 células usados aqui, cultura para o dia embrionário 3 (E3) pós-fertilização.
2. Preparação de pratos de drogas e imagens
NOTA: Para as etapas 2.1-2.10, trabalhe exclusivamente nas condições escuras ou de luz vermelha para evitar a ativação PST-1P não intencional. A folha de alumínio ou as tampas escuras devem ser usadas para todos os tubos e pratos que contenham PSTs.
- Prepare uma concentração de estoque de 50 mM PST-1P em água ultrauso.
NOTA: O peso molecular do PST-1P é de 440 g/mol. A solução de estoque é estável a -20 °C por até 1 ano. PST-1P é solúvel em água ou tampão aquoso, mas não se dissolve facilmente em DMSO. - A partir da etapa 2.1, prepare uma concentração de trabalho intermediária de 800 μM PST-1P em água ultrapura.
- Diluir PST-1P para uma concentração final de 40 μM em KSOM fresco. Como um experimento típico requer aproximadamente 20 μL de KSOM tratado com PST-1P, diluir 1 μL de 800 μM PST-1P em 19 μL de KSOM para um volume final de 20 μL para garantir que o meio suficiente seja preparado com antecedência, usando apenas luz vermelha para visibilidade.
NOTA: Tanto a concentração quanto o status de ativação de uma diluição PST-1P podem ser verificados tomando um espectro de absorção UV-Vis usando um espectrômetro que deve ser feito durante o estabelecimento do ensaio. A absorvância a 380 nm (A380) de uma diluição totalmente trans de 40 μM em uma cuvette de 1 cm deve ser de aproximadamente 0,8. Ambas as formas cis e trans têm a mesma absorvância a 455 nm (A455). Quando a proporção do A380 para o A455 é de aproximadamente 9:1, a diluição é inativa (totalmente trans). Quando a razão A380:A455 é 1:2, a diluição é totalmente ativada (totalmente cis). As relações intermediárias refletem estados intermediários de ativação. - Para preparar o slide de câmara para imagens ao vivo, pipeta 10 μL de KSOM tratado pst-1P no centro de um poço para formar uma gotícula hemisférica (Figura 1A).
- Adicione suavemente óleo mineral suficiente para cobrir a gota, garantindo que ela não disperse a mídia. Isso garantirá que a gota não evapore.
- Pré-quente e CO2-equilibre a antena de slides de câmara em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 para um mínimo de 3h ou no máximo, durante a noite.
- Ao final do período de equilíbrio na etapa 2.6, prepare um prato de cultura de 35 mm com uma gota de 10 μL de KSOM tratado por PST-1P, pré-armado e equilibrado como um passo de lavagem. Não sobreponha com óleo.
- Transfira embriões por tubos bucais na gotícula KSOM tratada pelo PST-1P a partir da etapa 2.7.
NOTA: As etapas 2.7 e 2.8 são recomendadas para a tubulação bucal de embriões, mas são opcionais. - Transfira imediatamente os embriões por tubos de boca para o centro da gotícula KSOM tratada pst-1P no slide da câmara de imagem preparado nas etapas 2.4-2.6 (Figura 1A).
- Incubar embriões a 37 °C e 5% de CO2 em KSOM tratados com PST-1P no slide da câmara de imagem por pelo menos 1 h antes da imagem. Se possível, monte o slide da câmara no microscópio dentro de uma câmara ambiental a 37 °C e 5% de CO2, e na escuridão completa para garantir que todos os PST-1Ps estejam na configuração transativa inativa e que os embriões possam afundar até o fundo do prato.
3. Imagem ao vivo e fotoativação PST-1P
NOTA: As etapas 3.1-3.13 são realizadas em um microscópio confocal de varredura a laser equipado com detectores de fotodiodo de avalanche (APDs) e uma câmara ambiental escura. Estas instruções referem-se especificamente à configuração de imagem usando o software de aquisição descrito na Tabela de Materiais; no entanto, eles também podem ser aplicados a outros sistemas de microscopia confocal.
- Prepare um objetivo de imersão de óleo de água 63x/1.2 NA com o meio de imersão prescrito.
- Usando uma tocha de luz vermelha para orientar o posicionamento, avance com o objetivo de entrar em contato com o meio de imersão. Nesta fase, evite usar luz branca ou brilhante para encontrar os embriões, pois isso poderia ativar precocemente o PST-1P.
- Usando a ocular e sob iluminação da luz vermelha, localize a borda da gota de meio e posicione o objetivo diretamente sobre este local. Isso pode ajudar o usuário a estabelecer orientação e encontrar o plano focal.
- Em seguida, através da ocular ou na varredura de modo ao vivo habilitada para software, use um filtro de comprimento de onda vermelho ou laser de 561 nm para localizar os embriões dentro da gotícula.
- Use controladores de palco e modo de varredura ao vivo para definir os pontos de partida e fim para adquirir uma pilha z de todo o embrião.
- Ajuste as configurações de alimentação do laser (normalmente, com detectores altamente sensíveis, como os APDs, é suficiente um laser de 561 nm de potência inferior a 5%, compensação digital (tipicamente em -0,900) para otimizar a aparência de cometas EB3-dTomato e minimizar o ruído de fundo, pinhole a 2 μm, resolução de pixels de 512 x 512, e tempo de pixel de 3,15 μs.
- Adquira uma pilha z de todo o embrião com intervalos de seção de 1 μm para avaliar áreas de crescimento de microtúbulos em todo o organismo (Figura 1B).
- Use a imagem 3D z-stack da etapa 3.7 para identificar regiões de interesse (ROIs) para experimentos de rastreamento EB3-dTomato. Aumente o zoom para 3x e desenhe um ROI retangular em torno da área subcelular específica de interesse.
- Adquira uma foto de lapso de tempo de um único z-plane usando os valores típicos dos parâmetros de imagem: 561 nm de potência laser a 5%, deslocamento digital de -0,900, resolução de pixels de 512 x 512, pinhole a 3 μm, pixel dwell tempo de 3,15 μs, zoom de 3x, intervalo de tempo de 500 ms.
NOTA: 120 períodos de tempo fornecerão um filme de rastreamento de 1 min e devem ser suficientes para análise de dados. A aquisição pode continuar por mais tempo, desde que o branqueamento do fluorohore seja mínimo (Figura 1C). - Para ativar o PST-1P, mude para um laser de 405 nm e adquira outra foto de lapso de tempo com o conjunto laser de 405 nm para 10% de potência, resolução de pixels de 512 x 512, pinhole aberto no máximo, pixel de 3,15 μs, zoom de 3x, intervalo de tempo de 500 ms, e um total de 20 quadros (Figura 1D).
- Mude de volta para laser de 561 nm e repita a aquisição como na etapa 3.9 para confirmar a perda de cometas EB3-dTomato após a ativação do PST-1P (Figura 1E). Certifique-se de que essa aquisição ocorra o mais rápido possível após a ativação.
NOTA: O passo 3.10 pode ser realizado repetidamente para maior inibição dos cometas EB3-dTomato. No entanto, os embriões devem ser monitorados cuidadosamente para evitar qualquer dano causado pela luz UV. - Para reverter o PST-1P de volta ao seu trans-estado inativos, engaje um laser de 514 nm com 10% de potência. Adquira um filme de lapso de tempo com o laser de 514 nm definido para 10% de potência, resolução de pixels de 512 x 512, pinhole aberto máximamente, pixel de 3,15 μs, zoom de 3x, intervalo de tempo de 500 ms, e um total de 20 períodos (Figura 1F).
- Repita o passo 3.11 para visualizar a recuperação dos cometas EB3-dTomato (Figura 1G).
4. Análise de dados de imagem
- Para analisar e quantificar a inibição da polimerização de microtúbulos por PSTs, utilize programas de software disponíveis aos pesquisadores para atender às suas necessidades específicas. Aqueles recomendados para uso possuirão uma ferramenta de rastreamento, que pode rastrear manualmente ou automaticamente o movimento, a direção e a velocidade dos cometas EB3-dTomato16,18.
Figura 1: Representação esquemática da fotoativação e desativação do PST-1P no embrião de camundongos de pré-implantação 3D vivo. Todos os experimentos são realizados em completa escuridão (fundo preto) ou apenas pela iluminação da luz vermelha. (A) Embriões de camundongos de pré-implantação ao vivo expressando EB3-dTomato são cultivados para estágio de 16 células e, em seguida, transferidos para uma gotícula de KSOM contendo 40 μM PST-1P em um slide de câmara de imagem. (B) Uma imagem 3D de todo o embrião permite a avaliação do crescimento dos microtúbulos visualizando a distribuição de cometas EB3-dTomato. (C) Para iniciar o experimento, os cometas EB3-dTomato são rastreados em uma região subcelular usando imagens de lapso de tempo. (D) A fotoativação PST-1P subsequente na mesma região subcelular usando um laser de 405 nm resulta na perda de cometas EB3-dTomato (E). A ativação intensificada do PST-1P pode ser implementada, se necessário, por iluminação de luz sequencial de 405 nm. (F-G) Para reverter o PST-1P de volta ao seu estado inativo e restaurar cometas EB3-dTomato, um laser de 514 nm é aplicado na mesma região subcelular. Se necessário, várias rodadas de fotoativação e desativação podem ser realizadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De acordo com o protocolo, os embriões de camundongos pré-implantação foram microinjetados com cRNA para EB3, marcado com dTomato fluorescente vermelho (EB3-dTomato). Isso permite a visualização de microtúbulos em crescimento à medida que o EB3 se liga ao microtúbulo polimerizador mais termina24.
Os experimentos foram realizados 3 dias após a fertilização (E3) quando o embrião do camundongo é composto por 16 células. Qualquer outro estágio de desenvolvimento de pré-implantação pode ser usado, dependendo da questão científica a ser investigada. Para demonstrar o mínimo de fotobleaching usando o protocolo de ativação da luz laser de 405 nm, um experimento de controle com um embrião não tratado é mostrado (Figura 2A i). Um ROI com impressionante densidade EB3-dTomato é escolhido com base na imagem 3D adquirida do embrião. Neste exemplo, um único z-plane de uma célula inteira é usado para imagens de alta resolução EB3-dTomato. No entanto, diferentes regiões do embrião podem ser selecionadas conforme necessário (por exemplo, região cortical, região perinuclear, célula mitótica, célula interna ou externa). Uma imagem da expressão EB3-dTomato antes da iluminação de luz laser de 405 nm mostra um sinal altamente denso EB3-dTomato dentro de todo o citoplasma da célula, exceto a área nuclear (Figura 2A ii). Nenhuma alteração na densidade EB3-dTomato foi observada após a iluminação da luz laser de 405 nm (Figura 2A iii e iv). Assim, a luz laser de 405 nm por si só não causa qualquer fotodamagem para a dinâmica do embrião ou microtúbulo.
Em seguida, embriões de estágio de 16 células foram tratados com 40 μM PST-1P 3 h antes da imagem ao vivo e mantidos no escuro. Para realizar com sucesso experimentos PST em organismos 3D vivos, é fundamental encontrar o equilíbrio ideal da concentração de PST, tempo de incubação e energia laser necessária para evitar efeitos nocivos11. Sob condições escuras estritas, a forte expressão EB3-dTomato pode ser detectada na imagem 3D (Figura 2B i), semelhante aos embriões de controle (Figura 2A i). Assim, pst-1P não provoca inibição da polimerização de microtúbulos em condições escuras. Imagens de lapso de tempo de um único z-plane confirmaram forte expressão EB3-dTomato e polimerização de microtúbulos antes da iluminação da luz laser de 405 nm (Figura 2B ii). Em segundos, observou-se uma redução do sinal EB3-dTomato após a ativação da luz laser de 405 nm de PST-1P (Figura 2B iii). Esta perda é relatada para durar aproximadamente 2 a 20 minutos antes de reverter gradualmente devido ao relaxamento térmico ou difusão em áreas circundantes11. Assim, uma ativação repetitiva de luz laser de 405 nm pode prolongar a duração da perda de EB3-dTomato (Figura 1E-D). É importante ressaltar que os embriões microinjetados com EB3-dTomato e incubados com PST-1P apresentam potencial embrionário normal, desenvolvendo-se para o estágio blastocisto (Figura 3, e Figura Suplementar 1), e dinâmica normal de microtúbulos, por exemplo, durante a mitose (Figura Suplementar 2). Portanto, o PST-1P inativos não mostra nenhuma toxicidade ao embrião.
A desativação controlada do PST-1P pode ser alcançada pela iluminação da luz laser de 514 nm (Figura 2B iv). Considerando que essa abordagem pode ser útil para determinar a origem do crescimento de microtúbulos após a inibição de crescimento induzida pelo PST-1P, exclui o uso de proteínas fluorescentes verdes para imagens vivas. Embora seja fortemente recomendado trabalhar em condições escuras, se os PSTs forem ativados inadvertidamente, a iluminação da luz verde permite a reversão do PST a um trans-estado inativo. Nesta circunstância, é necessário um período adequado de recuperação das células como medida de precaução para garantir que as células possam retornar ao seu estado de pré-ativação. Se o tempo permitir, o ideal seria um mínimo de algumas horas.
Figura 2: Imagem ao vivo de EB3-dTomato antes e depois da ativação da luz UV e desativação de PST-1P no embrião do rato vivo. (A i) Projeção máxima 3D z-stack de um embrião de rato de 16 células de controle não tratado rotulado para EB3-dTomato. Uma ponte de microtúbulo citocinético está presente (denotada por ponta de flecha cinza) ao lado de múltiplas pontes interfasas (denotadas por pontas de flecha amarelas). (A ii) Plano Z único de uma célula imagem antes da exposição a laser de 405 nm. (A iii-iv) Plano z único de uma célula imagem imediatamente (A iii) e 4 min (A iv) após exposição à luz laser de 405 nm (indicada por um raio violeta), não mostrando nenhuma alteração no sinal EB3-dTomato. (B i) Projeção máxima 3D z-stack de um embrião estágio de 16 células rotulado para EB3-dTomato, que é tratado com 40 μM PST-1P e mantido no escuro. Pontes interfásas são indicadas por pontas de flecha amarelas. (B ii) Plano Z único de uma célula com imagens de pré-ativação. (B iii) Plano Z único de uma célula imagem imediatamente após exposição à luz laser de 405 nm (indicada por um raio violeta), mostrando uma redução acentuada no sinal EB3-dTomato. (B iv) Plano Z único de uma célula imagem imediatamente após exposição à luz laser de 514 nm (indicada por um raio verde), mostrando recuperação do sinal EB3-dTomato. Os núcleos são indicados pela linha azul tracejada. Barras de escala: 15 μm para embriões 3D inteiros; 5 μm em insets. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Condições de cultura PST-1P inativas permitem o desenvolvimento embrionário normal para o estágio blastocisto. (A) Contraste de interferência diferencial única (DIC) z-plano de um embrião no estágio blastocisto (E4.5) seguindo a cultura em 40 μM PST-1P no escuro. (B) Projeção máxima 3D z-stack do embrião mostrado em (A), mostrando expressão EB3-dTomato. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nos filmes adquiridos de lapso de tempo, a rotulagem EB3-dTomato aparece como estruturas "semelhantes a cometas" e permite o rastreamento de filamentos microtúbulos crescentes (Figura 4). Em embriões tratados PST-1P mantidos em condições escuras (Figura 4A), cometas individuais EB3-dTomato (denotados por pontas de flecha branca e amarela na Figura 4B) podem ser vistos emanando da ponte interfase, que atua como um centro de organização de microtúbulos não-centrossomais no embrião do camundongo16 (Figura 4B). Uma projeção de pontos de tempo (t-stack) retrata o número geral e a distância percorrida por cometas EB3-dTomato (Figura 4B), mostrando a maior densidade de EB3-dTomato na região da ponte interfase. Após a ativação do PST-1P com uma luz laser de 405 nm, os cometas EB3-dTomato não podem mais ser vistos na base da ponte interfase e também estão ausentes na pilha t (Figura 4C).
Figura 4: Rastreamento de cometas EB3-dTomato antes e depois da ativação da luz UV subcelular de PST-1P no embrião do rato vivo. (A) Projeção máxima 3D z-stack de um embrião de rato de estágio de 16 células rotulado para EB3-dTomato, tratado com 40 μM PST-1P e mantido no escuro. (B) Quatro planos z selecionados e t-stack correspondente de um ROI na ponte interfásica (indicada por *) antes da iluminação laser de 405 nm, mostrando cometas EB3-dTomato ao longo do tempo. O movimento de cometas individuais é indicado pelas pontas de flecha amarela e branca, enquanto as pontas de flechas tracejadas com cores mostram posições de cometas em pontos de tempo anteriores. Os tempos mostrados são em segundos (s). (C) Quatro planos z selecionados e uma pilha t correspondente da ponte interfásica imagem imediatamente após exposição à luz laser de 405 nm (indicada por um raio violeta) mostram uma perda de cometas EB3-dTomato. Barras de escala: 10 μm para embrião 3D completo; 2 μm para monomotores Z; 1,5 μm para t-stack. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Juntos, esses resultados demonstram a aplicação do PST-1P no embrião de camundongos pré-implantação vivos. PST-1P efetivamente inibe a polimerização de microtúbulos após a ativação com um laser de 405 nm e esta inibição é reversível sobre a iluminação de luz laser de 514 nm no nível celular e subcelular.
Figura suplementar 1: Embriões de pré-implantação cultivados inativos PST-1P demonstram potencial de desenvolvimento normal para estágio blastocisto. (A) Controles não tratados e (B) embriões tratados PST-1P mostrando taxa de desenvolvimento para estágio blastocisto. Todos os embriões foram mantidos em condições escuras durante todo o desenvolvimento para garantir a inatividade do PST-1P. A taxa de desenvolvimento para o estágio blastocisto foi comparável entre os controles (100%, n = 13) e os embriões tratados PST-1P (91,3%, n = 23). Barras de escala são 20 μm. Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Embriões de pré-implantação cultivados inativos PST-1P demonstram dinâmica normal do fuso durante a mitose. (A) Controles não tratados e (B) embriões tratados PST-1P que se dividem de estágio de 8 células a 16 células, injetados com EB3-dTomato e Histone 2B (H2B)-GFP. Todos os embriões foram mantidos em condições escuras durante todo o desenvolvimento para garantir a inatividade do PST-1P. Pode-se ver o alinhamento dos cromossomos (A i e B i), seguido de anafase precoce (A ii e B ii), anaphase tardia (A iii e B iii) e citocinese (A iv e B iv) sem defeitos. As barras de escala são de 10 μm em imagens 3D e 5 μm em insets. (C) A anafase durou uma média de 8 min 53 s em controles e 8 min 40 s em embriões tratados PST-1P (p-valor = 0,8241) e (D) cromossomos de condensed durante telophase uma média de 19 min 38 s em controles e 18 min 51 s após a iniciação da anafase em embriões tratados PST-1P (p-valor = 0,2743). Para análise, n = 10 em controles e n = 12 em tratamento PST-1P. Além disso, todas as células são divididas em uma onda síncronína, como esperado. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A rede de microtúbulos é parte integrante do funcionamento interno fundamental de uma célula. Consequentemente, isso apresenta desafios na manipulação da dinâmica dos microtúbulos em organismos vivos, pois qualquer perturbação à rede tende a ter consequências generalizadas para todos os aspectos da função celular. O surgimento de compostos de microtúbulos fototravavel apresenta uma maneira de manipular precisamente o citoesqueleto em um nível subcelular, com controle superior para a indução e reversão da inibição do crescimento de microtubulos9. Este protocolo demonstra como a polimerização de microtúbulos pode ser inibida no embrião do rato de pré-implantação por PST-1P ativado pela luz em uma escala subcelular, e de forma temporalmente precisa. Além disso, essa inibição pode ser revertida para permitir a investigação da perturbação a curto prazo da rede de microtúbulos.
O protocolo apresentado é otimizado para a aplicação de PSTs em embriões de camundongos pré-implantação vivos e pode ser usado como base para estender seu uso a vários outros sistemas culturais. Novos usuários de PSTs podem encontrar alguns pontos em seus aplicativos que requerem solução de problemas, para os quais várias etapas de resolução de problemas são apresentadas.
A citotoxicidade dos PSTs deve ser avaliada e deve ser selecionada uma concentração de trabalho que provoque forte inibição do crescimento de microtúbulos com toxicidade mínima para as células. Um protocolo extenso para otimizar as concentrações de trabalho de PSTs e outros photoswitches foi detalhado em um recente pré-impressão11. Em suma, novos usuários de PSTs podem avaliar a citotoxicidade em condições escuras com diluições seriais da droga. Nesta configuração, não deve haver efeito mensurável nos cometas EB3-dTomato e nenhuma toxicidade para as células. Isso fornece um ponto de partida para testar uma concentração não citotóxica em condições iluminadas. Para mais experimentações, recomenda-se a menor concentração que provoca uma redução nos cometas EB3-dTomato.
Como em qualquer tratamento medicamentoso, os PSTs são capazes de serem metabolizados pela célula; no entanto, de uma perspectiva prática, isso provavelmente será insignificante como demonstrado pela incubação de embriões C. elegans em PST-1P para 150 min e posterior isomerização efetiva9. Para sistemas altamente metabolicamente ativos, pode ser necessária uma concentração aumentada de PST-1P. Os PSTs também podem difundir através do meio de cultura, reduzindo a carga de PSTs ativos dentro do ROI. Para mitigar isso, pode ser necessária a fotoativação repetida, sendo que a citotoxicidade precisaria ser avaliada em uma base individual do tipo celular, pois alguns sistemas podem ser suscetíveis à fototoxicidade. Da mesma forma, os PSTs ativados podem difundir o ROI ativado pela luz e afetar os microtúbulos circundantes. No entanto, devido à sua tendência inerente de relaxar de volta ao estado transativo inativo, o efeito sobre as áreas circundantes deve ser insignificante.
Outro obstáculo potencial para o uso de PSTs diz respeito à sua aplicação em organoides ou organismos maiores devido à natureza da penetrabilidade limitada da luz desses tecidos. Tecidos maiores podem não ser acessíveis para a fotoativação de células mais profundas. O embrião do rato de pré-implantação apresenta um desafio único na forma de ser cercado por um revestimento externo, a zona pellucida, que pode dificultar a permeabilidade das drogas adicionadas à mídia. Para mitigar isso, os embriões são pré-incubados por pelo menos 1 h em PST-1P antes da imagem. Abordagens de otimização semelhantes podem ser aplicáveis para aumentar a penetração da droga ao usar PSTs em sistemas de organismo inteiro ou organoide, como a adição de acetonitrilo para ajudar a absorção celular de PSTs9.
Devido à reversibilidade da luz verde dos PSTs, esses compostos não são compatíveis com imagens de fluoroforos que requerem excitação abaixo de 530 nm (como o GFP). No entanto, os usuários podem implementar o rastreamento fluoróforo com qualquer fluoróforo que exija uma excitação acima de 530 nm, por exemplo, RFP, mCherry ou mPlum. Se for necessária rotulagem dupla de estruturas subcelulares, os usuários podem empregar fluoroforos vermelhos e vermelhos. Se a compatibilidade com o GFP for essencial, uma nova classe de fotoswitches, SBTubs, pode ser de interesse25. Esses compostos também são ativados por luz UV; no entanto, eles não são responder à luz verde, tornando-os funcionalmente reversíveis apenas por difusão, mas também compatíveis com todos os fluoroforos com um comprimento de onda de excitação de 488 nm ou superior. Juntamente com os PSTs, que oferecem reversibilidade, mas não são compatíveis com imagens de GFP, esses compostos oferecem ao usuário maior flexibilidade para adotar uma abordagem personalizada e adaptar os fotoswitches disponíveis à sua pergunta de pesquisa.
Inibições convencionais de pequenas moléculas, abordagens de nocaute e knockdown podem ser implementadas em escalas de células inteiras ou organismos inteiros para caracterizar a ação de microtúbulos. Essas abordagens fornecem efeitos potentes, mas amplos e destrutivos sobre microtúbulos que não são facilmente reversíveis e são muitas vezes difíceis de atingir de forma subcelular ou temporalmente controlada. Uma estratégia para contornar essas limitações é através da engenharia genética de um sistema optogenético indutível à luz. As aplicações desses sistemas variam amplamente e incluem heterodimerização induzida pela luz, homodimerização e dissociação de proteínas ou domínios proteicos26. Recentemente, foi projetado um construto de proteína de ligação final 1 (EB1) controlado optogeneticamente, onde um interruptor indutível de luz permitiu a dissociação dos terminais de amino e carboxíl do microtúbulo mais o parceiro end binding EB1. Isso tornou a proteína funcionalmente inativa com tempos de resposta sub-segundo, bloqueando o crescimento de microtúbulos em uma linha celular de carcinoma pulmonar humanolinha 27. Da mesma forma, um interruptor optogenético foi usado para cruzar filamentos de microtúbulos e actinas em D. melanogaster para entender a influência da ligação cruzada citoesquelética em alterações morfológicas para a célula28. O uso de ferramentas optogenéticas para manipular o embrião precoce é uma área altamente atual da pesquisa e tem visto alguns avanços recentes1. Um sistema de exportação nuclear optogeneticamente modificado foi desenvolvido para induzir a má localização das proteínas nucleares. Isso poderia imitar modelos genéticos de perda de função, com a flexibilidade adicional a ser conduzida em pontos de tempo de desenvolvimento precisos em embriões D. melanogaster 29. As abordagens optogenéticas são uma ferramenta poderosa para o controle espacial da dinâmica dos microtúbulos; no entanto, eles podem ser difíceis de projetar, demorados e caros. Em contraste, os PSTs oferecem uma alternativa química à manipulação genética complexa que possui tempos de resposta semelhantes, especificidade e reversibilidade com a vantagem adicional de fácil uso e acessibilidade.
Outra abordagem direcionada para interromper mecanicamente filamentos de microtúbulos é a ablação a laser usando um laser de dois fótons. Isso foi aplicado com sucesso para ablatar a ponte interfase em embriões de camundongos pré-implantação16. Quando bem implementado, os usuários podem obter um alto pagamento. No entanto, executar essa técnica é um desafio e requer um alto grau de precisão para evitar a destruição ou lise de qualquer estrutura circundante ou das próprias células. Além disso, os usuários podem precisar ablatar repetidamente suas amostras para alcançar o efeito pretendido, já que os microtúbulos podem crescer rapidamente30. Em contraste, os PSTs inibem diretamente a polimerização de microtúbulos31 e evitam efeitos indesejados que podem surgir com ablação a laser, devido à sua especificidade para a ligação à β-tubulina. Além disso, os PSTs podem ser aplicados a todo o organismo, enquanto a ablação a laser por natureza só pode ser direcionada para uma região específica.
Usando este protocolo, as possibilidades para a aplicação de PSTs são amplas e convincentes. Os PSTs podem permitir a inibição precisa e subcelular do crescimento de microtúbulos dentro do tempo de resposta sub-segundo para estudar aspectos da segregação do cromossomo durante a divisão celular mitótica ou meiotic. O tráfico de cargas intracelulares poderia ser interrompido inibindo as vias de transporte fornecidas pela rede de microtúbulos para estudar o tráfico endosomal, a movimentação de mitocôndrias ou o posicionamento nuclear. Os PSTs também foram usados para inibir com sucesso o crescimento de microtúbulos em esferoides multicelulares 3D cultivados a partir das linhascelulares de melanoma humano 32,33. Acoplamento da flexibilidade da ativação do PST com seus excelentes tempos de resposta oferece aos pesquisadores uma ferramenta dinâmica para investigar a dinâmica dos microtúbulos e manipular a função celular. Além disso, a reversibilidade dos PSTs torna sua aplicação ideal para o estudo de consequências de curto e longo prazo da inibição de microtúbulos em uma única célula ou células selecionadas dentro de um tecido ou organismo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesse concorrente ou financeiro.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Oliver Thorn-Seshold e Li Gao por nos fornecerem fotostatinas e conselhos sobre preparação de manuscritos, Monash Production para suporte de filmagem e Monash Micro Imaging para suporte a microscopia.
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do National Health and Medical Research Council (NHMRC) para a J.Z. e o Instituto Canadense de Pesquisa Avançada (CIFAR) Azrieli Scholarship para J.Z. O Instituto Australiano de Medicina Regenerativa é apoiado por subsídios do Governo do Estado de Victoria e do Governo Australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al.
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T.
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T.
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
