Summary
نقدم نموذجا للنزيف داخل البطيني الوليدي باستخدام جراء الفئران التي تحاكي علم الأمراض الذي يظهر في البشر.
Abstract
النزف داخل البطيني الوليدي (IVH) هو نتيجة شائعة للولادة المبكرة ويؤدي إلى إصابة الدماغ واستسقاء الرأس الوضعي (PHH) والعجز العصبي مدى الحياة. بينما يمكن علاج PHH عن طريق إجراءات تحويل السائل النخاعي المؤقتة والدائمة (CSF) (الخزان البطيني والتحويلة البطينية الصفاقية ، على التوالي) ، لا توجد استراتيجيات دوائية لمنع أو علاج إصابة الدماغ التي يسببها IVH واستسقاء الرأس. هناك حاجة إلى نماذج حيوانية لفهم الفيزيولوجيا المرضية ل IVH بشكل أفضل واختبار العلاجات الدوائية. في حين أن هناك نماذج موجودة من IVH الوليدي ، فإن تلك التي تؤدي بشكل موثوق إلى استسقاء الرأس غالبا ما تكون محدودة بسبب ضرورة الحقن ذات الحجم الكبير ، مما قد يعقد نمذجة علم الأمراض أو إدخال تباين في النمط الظاهري السريري الذي لوحظ.
وقد ورطت الدراسات السريرية الحديثة الهيموغلوبين والفيريتين في التسبب في تضخم البطين بعد IVH. هنا ، نقوم بتطوير نموذج حيواني مباشر يحاكي النمط الظاهري السريري ل PHH باستخدام الحقن داخل البطيني صغير الحجم لمنتج تكسير الدم الهيموجلوبين. بالإضافة إلى تحفيز تضخم البطين واستسقاء الرأس بشكل موثوق ، يؤدي هذا النموذج إلى إصابة المادة البيضاء والالتهاب وتسلل الخلايا المناعية في المناطق المحيطة بالبطينين والمادة البيضاء. تصف هذه الورقة هذه الطريقة البسيطة ذات الصلة سريريا لنمذجة IVH-PHH في الفئران الوليدية باستخدام الحقن داخل البطيني وتقدم طرقا لتحديد حجم البطين بعد الحقن.
Introduction
ينشأ IVH الوليدي من المصفوفة الجرثومية ، وهو موقع الانقسام الخلوي السريع المجاور للبطينين الجانبيين للدماغ النامي. هذا الهيكل الوعائي للغاية عرضة لعدم استقرار الدورة الدموية المرتبط بالولادة المبكرة. يتم إطلاق الدم في البطينين الجانبيين في نزيف المصفوفة الجرثومية (GMH) -IVH عندما تمزق الأوعية الدموية الهشة داخل المصفوفة الجرثومية. في حالة الصف الرابع IVH ، قد يساهم احتشاء النزف حول البطين أيضا في إطلاق منتجات الدم داخل الدماغ. 1 قد يسبب الجمع بين GMH-IVH PHH ، خاصة بعد النزف عالي الدرجة (الصفان الثالث والرابع)1. يمكن علاج PHH بوضع تحويلة البطين الصفاقي ، لكن وضع التحويلة لا يعكس إصابة الدماغ التي قد تحدث من IVH. على الرغم من أن العناية المركزة الحديثة لحديثي الولادة قد خفضت معدلات IVH2 ، 3 ، لا توجد علاجات محددة لإصابة الدماغ أو استسقاء الرأس الناجم عن IVH بمجرد حدوثه. أحد القيود الكبيرة في تطوير العلاجات الوقائية لإصابات الدماغ التي يسببها IVH و PHH هو الفهم غير الكامل للفيزيولوجيا المرضية IVH.
في الآونة الأخيرة ، ثبت أن مستويات السائل الدماغي الشوكي المبكرة لمنتج انهيار الدم الرئيسي للهيموجلوبين مرتبطة بالتطور اللاحق ل PHH في حديثي الولادة المصابين ب IVH4 عالي الجودة. علاوة على ذلك ، ترتبط مستويات السائل الدماغي الشوكي لبروتينات مسار مناولة الحديد - الهيموجلوبين والفيريتين والبيليروبين - بحجم البطين في IVH الوليدي. وقد ظهر هذا أيضا في مجموعة متعددة المراكز من الرضع الذين يعانون من PHH قبل الأوان ، حيث ارتبطت مستويات CSF البطينية الأعلى من الفيريتين بحجم بطين أكبر5.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير نموذج ذي صلة سريريا لإصابة الدماغ التي يسببها IVH واستسقاء الرأس باستخدام حقن الهيموجلوبين في بطينات الدماغ ، مما يسمح بالقياس الكمي لإصابة الدماغ و PHH واختبار استراتيجيات علاجية جديدة (الشكل 1) 6 ، 7. يستخدم نموذج IVH هذا صغار الفئران حديثي الولادة ، والتي يتم وضعها تحت التخدير العام طوال مدة الإجراء. يتم إجراء شق خط الوسط على فروة الرأس ، وتستخدم الإحداثيات المشتقة من معالم الجمجمة - bregma أو lambda - لاستهداف البطينين الجانبيين للحقن. الحقن البطيء باستخدام مضخة التسريب يسلم الهيموغلوبين إلى البطين. هذا البروتوكول سهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات ويمكنه نمذجة مكونات مختلفة من IVH التي تؤدي إلى PHH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان التابعة للمؤسسة. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. تحضير محاليل الهيموجلوبين والسائل الدماغي الشوكي
- قم بإعداد محلول CSF اصطناعي معقم (aCSF) عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول aCSF إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل وتخزينه على الثلج.
- تحضير محلول هيموجلوبين معقم 150 مجم / مل بإضافة 75 مجم من الهيموجلوبين إلى 500 ميكرولتر من السائل الدماغي النخاعي في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل وتخزينه على ثلج.
2. تحضير الحيوان للحقن
- أدر وسادة التدفئة إلى الإعداد المتوسط للحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران.
- تخدير فئران اليوم الرابع بعد الولادة (P4) في غرفة تحريض مليئة ب 3٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: تأكد من التخدير الكافي باستخدام استجابة إصبع القدم / الذيل كل 15 دقيقة. مراقبة التخدير مع الملاحظة البصرية للون الأنسجة ودرجة حرارة الجسم ومعدل التنفس. - يتم تطبيق مسكنات الألم بحقن كاربروفين تحت الجلد بمحلول 5 ملغ/كغ للفئران المخدرة.
- ضع الفئران المخدرة المعرضة في جهاز التجسيم مع وضع الأنف في محول التخدير مع تدفق مستمر بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران.
- شد قضبان الأذن غير الممزقة على الصماخ السمعي الخارجي لتأمين الرأس.
ملاحظة: ضع مرهم الطبيب البيطري للحفاظ على ترطيب العينين إذا كانت العينان مفتوحتين في سن الحقن. - نظف الرأس ، بالتناوب مع أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية مبللة بالبيتادين و 70٪ من الإيثانول.
- المس قضيب البيتادين المنقوع في مركز فروة الرأس وانشر البيتادين في دوائر ، مع التحرك للخارج.
- كرر الخطوة 2.6.1.1 مع قضيب البقعه بالإيثانول.
- كرر الخطوة 2.6.1.1 والخطوة 2.6.1.2 3x.
- ضع ستارة جراحية معقمة لحماية المجال الجراحي.
- باستخدام مشرط معقم ، قم بعمل شق 0.3 سم عموديا أسفل مركز الرأس لكشف بريجما الجمجمة.
ملاحظة: في حالة الحقن من لامدا ، كشف لامدا الجمجمة بدلا من بريغما. - استخدم أداة تطبيق معقمة ذات رأس قطني لتجفيف المنطقة.
3. إعداد حاقن التجسيم
- ارسم محلول الهيموجلوبين المحضر في الخطوة 1.2 في حقنة معقمة سعة 0.3 مل بإبرة 30G وضع المحقنة في نظام حاقن التجسيم.
ملاحظة: في حالة توليد ظروف التحكم ، ارسم محلول aCSF المحضر في الخطوة 1.1 في محقنة معقمة سعة 0.3 مل وتابع البروتوكول. - قم بتشغيل واجهة حاقن التجسيم وانقر على زر التكوين لإدخال إعدادات حجم الحقن ومعدله.
- انقر فوق مستوى الصوت واضبط مستوى الصوت على 20000 nL (20 μL).
- انقر فوق معدل التسريب واضبط المعدل على 8000 نانولتر / دقيقة (8 ميكرولتر / دقيقة).
- اخرج من التكوين بالنقر فوق الزر "إعادة تعيين نقاط البيع".
- اغسل طرف الإبرة بالنقر فوق الزر Infuse حتى تظهر حبة صغيرة من محلول الهيموجلوبين عند طرف الإبرة.
- قم بفتيل محلول الهيموجلوبين برفق من طرف الإبرة باستخدام قضيب معقم برأس قطني.
4. حقن الحيوانات
- اضبط البريغما على أنه صفر على نظام حاقن التجسيم عن طريق ضبط المواضع المتوسطة والأمامية الخلفية للمحقنة قبل خفض طرف إبرة المحقنة المتدفقة للمس الجمجمة برفق عند البريغما.
ملاحظة: في حالة الحقن من لامدا ، اضبط لامدا على صفر. - تحديد إحداثيات الاختيار.
- في حالة الحقن من bregma ، في الفئران P4 الموصوفة هنا ، استخدم 1.5 مم جانبي ، 0.4 مم أمامي ، وعمق 2.0 مم من bregma.
- في حالة الحقن من لامدا ، استخدم الإحداثيات التالية لفئران P4: 1.1 مم جانبي ، 4.6 مم أمامي ، وعمق 3.3 مم من لامدا.
- ارفع إبرة المحقنة 1 سم فوق الجمجمة لتنظيف فروة الرأس. عندما يتم رفع المحقنة ، تابع ضبط الإحداثيات المتوسطة والأمامية الخلفية.
- اخفض إبرة المحقنة للمس الجمجمة برفق. تأكد من أن الإبرة تلمس الجمجمة.
- اضبط الإحداثي الظهري البطني على مدى 30 ثانية.
ملاحظة: أثناء ضبط الإحداثي الظهري البطني ، ستقوم الإبرة بثقب الجمجمة. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المحقنة تمر عبر الجمجمة دون تشويه الجمجمة. يتم تجنب تشوه الجمجمة عن طريق سحب الإبرة ببطء على طول الإحداثيات الظهرية البطنية في حالة حدوث تشوه ، ثم وضع الإبرة مرة أخرى على نفس المسار. هذا يسمح للإبرة بالمرور عبر الفتحة الموجودة في الجمجمة بقوة أقل وبدون تشوه. - على واجهة حاقن التجسيمي ، انقر فوق الزر " تشغيل" لبدء الحقن.
- بعد الانتهاء من الحقن ، اترك إبرة المحقنة في مكانها لمدة 2 دقيقة لتقليل التدفق العكسي للمحلول.
- اسحب المحقنة ببطء على طول الإحداثي الظهري البطني لمدة دقيقتين حتى يصبح طرف الإبرة 2 سم فوق فروة الرأس.
- قم بتدوير ذراع حاقن التجسيم بعيدا عن مجال المنطوق.
5. رعاية ما بعد الجراحة
- أغلق فروة الرأس بخياطة حيدة 6-0. قم بعمل خياطة واحدة متقطعة بسيطة في مركز شق 0.3 سم.
- أخرج الجرو من التخدير وضعه في منطقة آمنة على وسادة التدفئة.
- أعد القوارض إلى قفص المنزل للتعافي من التخدير تحت رعاية سدها.
ملاحظة: العودة في الوقت المناسب إلى رعاية السد يقلل من الوفيات المبكرة بعد العملية الجراحية. - مراقبة الحيوانات للتخدير عن طريق فقدان منعكس تصحيح كل ساعة بعد الجراحة لمدة 3 ساعات.
- راقب الحيوانات يوميا لمدة 7 أيام للنشاط الطبيعي وتناول الطعام وزيادة الوزن. راقب موقع الشق لالتئام الجروح وإغلاقها وظهور الفراء مرة أخرى في موقع الجراحة.
ملاحظة: في الحالة النادرة التي يتم فيها ملاحظة التغيرات العصبية مثل النوبات أو الاكتئاب المركزي أو انخفاض الشهية أثناء المراقبة ، يتم القتل الرحيم للحيوان باستخدام التروية داخل الأوعية الدموية أو خلع عنق الرحم تحت التخدير. - لمنع العدوى بمجرد إغلاق الخيط والتئام الجرح ، ضع مضادا حيويا ثلاثيا موضعيا في موقع الشق.
6. اكتساب التصوير بالرنين المغناطيسي والقياس الكمي
- قم بإجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على ماسح ضوئي للحيوانات الصغيرة 4.7T أو 9.4T.
- أدر وسادة التدفئة إلى الإعداد المتوسط للحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران.
- حث التخدير في غرفة باستخدام 3٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: تأكد من التخدير الكافي باستخدام استجابة إصبع القدم / الذيل كل 15 دقيقة. مراقبة التخدير مع الملاحظة البصرية للون الأنسجة ودرجة حرارة الجسم ومعدل التنفس. - ضع الفئران المخدرة المعرضة في التصوير بالرنين المغناطيسي مع وضع الأنف في محول التخدير مع تدفق ثابت بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران.
- قم بإجراء التصوير المرجح T2 عن طريق تحديد تسلسل صدى الدوران السريع المرجح T2.
- إذا كنت تستخدم ماسحا ضوئيا للتصوير بالرنين المغناطيسي 4.7T ، فأدخل المعلمات التالية في برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي: وقت التكرار = 3000 مللي ثانية ، وقت الصدى = 27.50 مللي ثانية ، عدد المتوسطات = 3 ، مجال الرؤية = 18.0 مم × 18.0 مم ، المصفوفة = 128 × 128 ، عدد الشرائح المحورية = 24 ، السماكة = 0.50 مم.
- إذا كنت تستخدم ماسحا ضوئيا للتصوير بالرنين المغناطيسي 9.4T ، فأدخل المعلمات التالية في برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي: وقت التكرار = 5000 مللي ثانية ، وقت الصدى = 66.00 مللي ثانية ، تباعد الصدى = 16.50 مللي ثانية ، عدد المتوسطات = 2 ، التكرار = 1 ، العامل النادر = 8 ، مجال الرؤية = 16.0 مم × 16.0 مم ، المصفوفة = 256 × 256 ، عدد الشرائح المحورية = 32 ، السماكة = 0.50 مم.
- انقر فوق الزر " متابعة" لبدء التسلسل.
7. معالجة الصور وتحليلها
- استخدم البيانات الأصلية المرجحة T2 لتحليل حجم الدماغ. استخدم برنامج التجزئة لتحديد البطينين الجانبيين يدويا6. انقر فوق وضع فرشاة الرسم وحدد نمط الفرشاة المربع . اضبط حجم الفرشاة على 1. انقر فوق مخطط المفتش وحدد طريقة العرض المحورية. انقر فوق تكبير/تصغير للملاءمة. ضع المؤشر على الصورة ؛ تتبع وملء مساحة البطين الجانبي.
- انقر فوق تجزئة في شريط الأدوات | الحجم والإحصائيات لعرض وحدات التخزين المجزأة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تأكيد نجاح الحقن بالوسائل الإشعاعية والكيميائية المناعية. أصيبت الحيوانات التي خضعت لحقن الهيموغلوبين بتضخم البطين الحاد المعتدل عند تقييمها عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (الشكل 2 أ) ، مع بطينين جانبيين أكبر بكثير عند 24 ساعة و 72 ساعة بعد حقن الهيموجلوبين مقارنة بالحيوانات المحقونة ب aCSF (الشكل 2B ، C). على الرغم من عدم وجود فرق كبير في حجم البطين الجانبي بين الحيوانات المحقونة بالهيموجلوبين والحيوانات المحقونة ب aCSF بعد 38 يوما من الحقن (الشكل 2D) ، فمن المهم ملاحظة أن 44٪ (4/9) من الحيوانات في المجموعة المحقونة بالهيموجلوبين التي تمت متابعتها لمدة 38 يوما بعد الحقن أظهرت تضخم البطين غير المحلول في هذه النقطة الزمنية (الشكل 2D ). هذا التوزيع الواسع في أحجام البطينين هو نمط يتوافق مع المسار السريري ل IVH-PHH. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد حجم المادة البيضاء في 38 يوما بعد الحقن (الشكل 3) وانخفض بشكل ملحوظ في المجموعة المحقونة بالهيموجلوبين مقارنة بمجموعة حقن السائل الدماغي النخاعي (الشكل 3 ب).
نشرنا سابقا دراسة توضح بالتفصيل التفاعل الالتهابي الحاد الذي يحدث بعد حقن الهيموغلوبين9. في هذه الدراسة الحالية ، تم تقييم السيتوكينات المسببة للالتهابات لإنتاج عامل نخر الورم ألفا (TNFα) في الجسم الحي (الشكل 4) ، وتم تقييم تسلل الخلايا المناعية إلى المناطق المحيطة بالبطينين والمادة البيضاء باستخدام التألق المناعي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) (الشكل 5). أدى حقن 15 ميكرولتر من الهيموجلوبين أو الدم الكامل أو المحلول الملحي في البطين الجانبي لفئران اليوم 5 بعد الولادة إلى مستويات أعلى من السيتوكين الالتهابي TNFα 3 h بعد حقن الهيموجلوبين مقارنة بالدم الكامل والمحلول الملحي (الشكل 4). كان هناك خلايا نجمية تفاعلية أكثر بكثير في الجسم الثفني للحيوانات المحقونة بالهيموجلوبين مقارنة بالحيوانات المحقونة ب aCSF (الشكل 5). أخيرا ، تم استخدام منتجات تكسير الدم الأخرى بهذه الطريقة بما في ذلك الحديد والفيريتين لتؤدي بشكل موثوق إلى تضخم البطين واستسقاء الرأس 6,7.
الشكل 1: الجدول الزمني التجريبي والتخطيطي لنموذج IVH للفئران حديثي الولادة . (أ) رسم تخطيطي يوضح حقن الهيموغلوبين والجدول الزمني للتصوير بالرنين المغناطيسي المستخدم للبيانات التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة. (ب) رسم تخطيطي للإعداد التجسيمي للحقن (يسار) وموقع حقن الهيموجلوبين في البطين الجانبي الأيمن (يمين). الاختصارات: IVH = نزيف داخل البطيني. التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي ؛ PN = يوم ما بعد الولادة N. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: أحجام البطين الجانبي في نموذج فأر النزف داخل البطيني. (أ) تمثيل صور التصوير بالرنين المغناطيسي الإكليلي T2 في الجسم الحي لأدمغة الفئران بعد 24 ساعة و 72 ساعة و 38 يوما من الحقن داخل البطيني ل aCSF (يسار) أو 150 مجم / مل من Hb (يمين) في البطين الجانبي الأيمن في اليوم 4 بعد الولادة. قضبان المقياس = 1 مم. (B-D) القياس الكمي لأحجام البطين الجانبي (B) 24 ساعة ، (C) 72 ساعة ، و (D) 38 يوما بعد حقن aCSF أو Hb. كان للحيوانات المحقونة ب Hb بطينين أكبر بكثير في 24 ساعة و 72 ساعة. البيانات في B و C هي متوسط ± s.e.m. ، n = 13 لكل مجموعة ، اختبار t ثنائي الطرف غير المزاوج. البيانات في D هي متوسط ± SEM ، n = 3 في مجموعة aCSF و n = 9 في مجموعة Hb ، اختبار t ثنائي الطرف غير المزاوج. الاختصارات: التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي ؛ PN = يوم ما بعد الولادة N ؛ aCSF = السائل النخاعي الاصطناعي. Hb = الهيموغلوبين. SEM = الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إصابة المادة البيضاء في نموذج الفئران النزفية داخل البطيني . (أ) ممثل في الجسم الحي T2 صور التصوير بالرنين المغناطيسي الإكليلي لأدمغة الفئران بعد 38 يوما من الحقن داخل البطيني ل aCSF (يسار) أو 150 ملغ / مل من Hb (يمين) في البطين الجانبي الأيمن في يوم ما بعد الولادة 4. المادة البيضاء محددة باللون الأحمر. قضبان المقياس = 1 مم. (ب) القياس الكمي لأحجام المادة البيضاء بعد 38 يوما من حقن aCSF أو Hb. الحيوانات المحقونة بالهيموغلوبين قد انخفضت أحجام المادة البيضاء. البيانات في B هي متوسط ± SEM ، n = 3 في مجموعة aCSF ، n = 9 في مجموعة Hb. اختبار t ثنائي الذيل غير المزاوج. الاختصارات: التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي ؛ PN = يوم ما بعد الولادة N ؛ aCSF = السائل النخاعي الاصطناعي. Hb = الهيموغلوبين. SEM = الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: يحفز الهيموجلوبين إنتاج TNFα أكثر من الدم الكامل في الجسم الحي. أدى إعطاء 15 ميكرولتر من الهيموجلوبين أو الدم الكامل أو المحلول الملحي في البطين الجانبي لفئران اليوم 5 بعد الولادة إلى مستويات أعلى من السيتوكين الالتهابي TNFα 3 h بعد حقن الهيموجلوبين مقارنة بالدم الكامل والمحلول الملحي. البيانات هي متوسط ± SEM ، n = 4 في جميع المجموعات ، ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق. الاختصارات: Hb = الهيموغلوبين. TNFα = عامل نخر الورم ألفا ؛ WB = الدم الكامل ؛ ANOVA = تحليل التباين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تنشيط الخلايا النجمية في الجسم الثفني بعد حقن الهيموجلوبين في البطين الجانبي. (أ) يظهر التلوين المناعي GFAP أن حقن الهيموجلوبين في البطين الجانبي للقوارض بعد الولادة في اليوم 4 أدى إلى تنشيط الخلايا النجمية في الجسم الثفني والمنطقة تحت البطينية بعد 72 ساعة من الحقن. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) زاد عدد الخلايا النجمية التفاعلية بشكل ملحوظ في الحيوانات المحقونة بالهيموجلوبين مقارنة بالحيوانات المحقونة ب aCSF. البيانات هي متوسط ± SEM ، n = 3 في مجموعة aCSF ، n = 4 في مجموعة Hb ، اختبار t ثنائي الطرف غير المزاوج. الاختصارات: GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ LV = البطين الجانبي. SVZ = المنطقة تحت البطينية ؛ cc = الجسم الثفني ؛ aCSF = السائل النخاعي الاصطناعي. Hb = الهيموغلوبين. SEM = الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: مقارنة جودة صورة التصوير بالرنين المغناطيسي 4.7T و 9.4T. (أ) التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح 4.7T و 9.4T T2 المأخوذ بعد 72 ساعة بعد حقن الهيموجلوبين في البطين الجانبي الأيمن لفئران اليوم الرابع بعد الولادة. قضبان المقياس = 1 مم. اختصار: التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح نموذج IVH هذا باستخدام حقن الهيموغلوبين بدراسة أمراض IVH بوساطة الهيموجلوبين على وجه التحديد. بالنسبة للدراسات التكميلية ، يمكن أيضا توصيل الهيموجلوبين بسهولة في المختبر ولا يربك المقايسات الكيميائية الحيوية للبروتينات التي تصنعها الخلايا الدبقية الصغيرة / الضامة الموجودة في الدم الكامل.
تشمل النظريات الرائدة في IVH-PHH الانسداد الميكانيكي لدوران السائل الدماغي الشوكي ، وتعطيل الأهداب المبطنة لجدران البطانة العصبية ، والالتهاب ، والتليف ، وسمية الحديد10. النماذج الحيوانية الحالية ل IVH مثل نموذج جرو الفئران الناجم عن الكولاجين تحفز IVH من خلال الإصابة المباشرة وتعطيل المصفوفة خارج الخلية11 ، في حين أن نماذج أخرى مثل نموذج جرو الأرانب الناجم عن الجلسرين تحفز IVH كتأثير لانخفاض ضغط الدم داخل الجمجمة12. تستخدم النماذج الإضافية حقن دم الفئران الذاتية والمتبرع في البطينين الجانبيين13 ، 14. في حين أن هذه النماذج وغيرها من النماذج الموجودة تقدم ميزات مهمة لدراسة IVH-PHH ، فإنها تركز على تأثير الدم داخل البطين دون النظر في دور مكونات معينة من الدم المنطلق أثناء النزف على تطور عقابيل عصبية بعد IVH.
تبين أن مستويات السائل الدماغي الشوكي المبكرة للهيموجلوبين بعد IVH مرتبطة ب PHH ، وترتبط مستويات السائل الدماغي الشوكي لبروتينات مسار استقلاب الحديد - الهيموجلوبين والفيريتين والبيليروبين - بحجم البطين بعد IVH4. هذا يشير إلى أن التسبب في PHH قد يرتبط على وجه التحديد مع مكونات الهيموغلوبين والحديد في الدم التي يتم إطلاقها في البطينين أثناء IVH. وبالتالي ، يقدم هذا النموذج وسيلة مهمة للتحقيق المستهدف في دور الهيموجلوبين في تطوير PHH ويسمح بإجراء مزيد من الدراسات حول العلاجات التي تستهدف مسارات استقلاب الهيموجلوبين والحديد بعد IVH.
يمكن أن يكون تضخم البطين بعد IVH في البشر بسبب فقدان متني الدماغ (يشار إليه أحيانا باسم استسقاء الرأس خارج الفراغ) أو استسقاء الرأس ، مما يشير إلى زيادة ضغط السائل الدماغي النخاعي. يمكن أن تحدث هذه العمليات معا15 وقد يكون من الصعب تحديد إلى أي مدى تحدث التغيرات البطينية بسبب زيادة ضغط السائل الدماغي النخاعي مقابل فقدان الحجم دون إجراءات جراحية. هذا النموذج ، الذي يسمح بتقييم حجم البطين إشعاعيا في الحيوانات الحية وتقييم إصابة الأنسجة عن طريق الأنسجة ، يمكن أن يساعد الباحثين على فهم العلاقة بين الاثنين ، والأهم من ذلك ، تقييم إلى أي مدى تعكس العلاجات المحتملة إصابة الدماغ.
تقليديا ، اعتمدت المقارنات بين الأنواع لنمو الدماغ في المقام الأول على كتلة الدماغ بعد الوفاة. قدرت دراسة أساسية أجراها Dobbing and Sands بهذه الطريقة أن P7 هي فترة رئيسية لنمو الدماغ في القوارض ، مقارنة بالتغيرات التي لوحظت في حديثي الولادة من البشر المولودين في الفصل16. في الآونة الأخيرة ، حددت الدراسات التي تقارن المعالم التنموية مثل نضوج الخلايا قليلة التغصن وإنشاء الحاجز الدموي الدماغي P1-P3 في القوارض ليكون مشابها للحمل لمدة 23-32 أسبوعا في حديثي الولادةمن البشر 17،18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، لا تنحرف المصفوفة الجرثومية حتى P7 في الفئران22. لذلك ، تتوافق الفئران P4 المستخدمة في هذا النموذج مع فترة نضج الدماغ التي توجد فيها المصفوفة الجرثومية ، مع خصائص نعتقد أنها تمثل السكان البشريين المعرضين لخطر IVH-PHH. علاوة على ذلك ، فإن معدل تضخم البطين الذي لم يتم حله بعد 38 يوما من حقن الهيموجلوبين في هذه الدراسة (44٪) يمكن مقارنته بالمعدلات السريرية ل PHH بعد IVH (30٪)23.
تشمل قيود نموذج IVH للفئران بعد الولادة استخدام الدماغ وعدم وجود إصابة مباشرة للمصفوفة الجرثومية و / أو الحمة حول البطين. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج له العديد من الفوائد بما في ذلك التكاثر الجيد ، والتكلفة المنخفضة ، والتنوع الذي يسمح باستخدام الحيوانات القديمة المختلفة والتحليلات الإشعاعية (الشكل 6) والكيمياء الحيوية والتحليلات النسيجية. قد يؤدي العمل المختبري المستقبلي على الفيزيولوجيا المرضية ل IVH إلى علاجات أفضل لهذه الحالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تلقت JMS تمويلا من NIH / NINDS R01 NS110793 و K12 (برنامج التطوير الوظيفي لأبحاث جراح الأعصاب). تلقت BAM تمويلا من NIH / NINDS K08 NS112580-01A1 ، وجائزة المنطقة ذات الأولوية لأبحاث علم الأعصاب بجامعة كنتاكي ، وجائزة مبتكر جمعية استسقاء الرأس .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
References
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php (2022).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
