Summary
אנו מציגים מודל של דימום תוך חדרי ילודים באמצעות גורי חולדות המחקה את הפתולוגיה הנראית בבני אדם.
Abstract
דימום תוך-חדרי בילודים (IVH) הוא תוצאה שכיחה של לידה מוקדמת ומוביל לפגיעה מוחית, הידרוצפלוס פוסט-דימומי (PHH) וליקויים נוירולוגיים לכל החיים. בעוד שניתן לטפל ב- PHH על ידי הליכי הסחה זמניים וקבועים של נוזל מוחי (CSF) (מאגר חדרי ו- shunt ventriculoperitoneal, בהתאמה), אין אסטרטגיות פרמקולוגיות למניעה או לטיפול בפגיעה מוחית והידרוצפלוס הנגרמים על ידי IVH. מודלים של בעלי חיים נדרשים כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של IVH ולבדוק טיפולים תרופתיים. אמנם ישנם מודלים קיימים של IVH ילודים, אלה המביאים באופן אמין הידרוצפלוס מוגבלים לעתים קרובות על ידי הצורך בזריקות בנפח גדול, אשר עלול לסבך את המידול של הפתולוגיה או להציג שונות הפנוטיפ הקליני שנצפה.
מחקרים קליניים אחרונים קשרו המוגלובין ופריטין בגרימת הגדלת חדר לאחר IVH. כאן, אנו מפתחים מודל חייתי פשוט המחקה את הפנוטיפ הקליני של PHH תוך שימוש בזריקות תוך-חדריות בנפח קטן של המוגלובין תוצר פירוק הדם. בנוסף לגרימת הגדלת חדר והידרוצפלוס באופן אמין, מודל זה גורם לפגיעה בחומר הלבן, דלקת וחדירת תאי מערכת החיסון באזורי החומר הלבן והחומר הלבן. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ורלוונטית קלינית זו למידול IVH-PHH בחולדות ילודים באמצעות הזרקה תוך-חדרית ומציג שיטות לכימות גודל החדר לאחר ההזרקה.
Introduction
IVH ילודים מקורו במטריצת הנבטה, אתר של חלוקת תאים מהירה הסמוכה לחדרים הצדדיים של המוח המתפתח. מבנה כלי דם זה פגיע לחוסר יציבות המודינמית הקשורה ללידה מוקדמת. הדם משתחרר לחדרים הצדדיים בדימום מטריצה נבטית (GMH)-IVH כאשר כלי דם שבירים בתוך המטריקס הנבט נקרעים. במקרה של דרגה IVH IVH, אוטם דימומי periventricular עשוי גם לתרום לשחרור של מוצרי דם בתוך המוח. 1 השילוב של GMH-IVH עלול לגרום ל-PHH, במיוחד לאחר דימום בדרגה גבוהה (דרגות III ו-IV)1. ניתן לטפל ב- PHH עם מיקום של shunt חדרי, אך מיקום shunt אינו הופך את הפגיעה המוחית שעלולה להתרחש מ- IVH. למרות שטיפול נמרץ יילודים מודרני הוריד את שיעורי IVH2, 3, אין טיפולים ספציפיים לפגיעה מוחית או הידרוצפלוס הנגרמת על ידי IVH לאחר התרחשותה. מגבלה משמעותית בפיתוח טיפולים מונעים לפגיעה מוחית הנגרמת על ידי IVH ו- PHH היא ההבנה החלקית של פתופיזיולוגיה של IVH.
לאחרונה, רמות CSF מוקדמות של המוגלובין תוצר פירוק דם מרכזי הוכחו כקשורות להתפתחות מאוחרת יותר של PHH בילודים עם IVH4 בדרגה גבוהה. יתר על כן, רמות CSF של חלבונים במסלול הטיפול בברזל – המוגלובין, פריטין ובילירובין – נקשרות לגודל החדר בהפריה חוץ גופית בילודים. זה הוכח גם בקבוצה רב-מרכזית של תינוקות עם PHH פג, שם רמות גבוהות יותר של פריטין CSF בחדר נקשרו לגודל חדר גדוליותר 5.
במחקר זה פיתחנו מודל רלוונטי מבחינה קלינית של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי IVH והידרוצפלוס באמצעות הזרקת המוגלובין לחדרי המוח, המאפשר כימות של פגיעה מוחית ו-PHH ובדיקת אסטרטגיות טיפוליות חדשות (איור 1)6, 7. מודל IVH זה משתמש בגורי חולדות ילודים, אשר ממוקמים תחת הרדמה כללית למשך ההליך. חתך בקו האמצע נעשה בקרקפת, וקואורדינטות הנגזרות מציוני דרך בגולגולת – ברגמה או למבדה – משמשות למיקוד החדרים הצדדיים להזרקה. הזרקה איטית באמצעות משאבת עירוי מעבירה המוגלובין לחדר. פרוטוקול זה קל לשימוש, רב-תכליתי ויכול ליצור מודלים של רכיבים שונים של IVH שמביאים ל-PHH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסדות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת פתרונות המוגלובין ו- CSF
- הכן תמיסת CSF מלאכותית סטרילית (aCSF) על ידי הוספת 500 μL של תמיסת aCSF למיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל ואחסן על קרח.
- הכינו תמיסת המוגלובין סטרילית של 150 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 75 מ"ג המוגלובין ל-500 מיקרו-ליטר של aCSF במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל ואחסנו על קרח.
2. הכנת החיה להזרקה
- סובבו את כרית החימום לסביבה הבינונית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה.
- הרדימו חולדות לאחר הלידה ביום 4 (P4) בתא אינדוקציה מלא ב-3% איזופלורן.
הערה: יש לוודא הרדמה מספקת באמצעות תגובת כיווץ הבוהן/הזנב כל 15 דקות. עקוב אחר ההרדמה עם תצפית חזותית על צבע הרקמה, טמפרטורת הגוף וקצב הנשימה. - מתן שיכוך כאבים באמצעות הזרקת קרפרופן תת עורי של 5 מ"ג/ק"ג לחולדה המורדמת.
- מקם את החולדה המורדמת נוטה במנגנון הסטריאוטקטי כאשר האף ממוקם במתאם ההרדמה עם זרימה קבועה של 1.5% איזופלורן.
- הדקו את מוטות האוזניים שאינם נקרעים על הבשר השמיעתי החיצוני כדי לאבטח את הראש.
הערה: יש למרוח משחה וטרינרית כדי לשמור על לחות העיניים אם העיניים פקוחות בגיל ההזרקה. - נקו את הראש, לסירוגין עם אפליקטורים סטריליים בעלי קצוות כותנה ספוגים בבטאדין ו-70% אתנול.
- גע באפליקטור ספוג הבטאדין למרכז הקרקפת ופזר את הבטאדין במעגלים, תוך תנועה החוצה.
- חזור על שלב 2.6.1.1 עם המוליך ספוג האתנול.
- חזור על שלב 2.6.1.1 ועל שלב 2.6.1.2 3x.
- יש למרוח וילון כירורגי סטרילי כדי להגן על שדה הניתוח.
- באמצעות אזמל סטרילי, לבצע חתך של 0.3 ס"מ אנכית במרכז הראש כדי לחשוף את bregma של הגולגולת.
הערה: אם מזריקים מהלמבדה, חושפים את הלמבדה של הגולגולת במקום את הברגמה. - השתמש באפליקטור סטרילי עם קצה כותנה כדי לייבש את האזור.
3. הגדרת המזרק הסטריאוטקטי
- צייר את תמיסת ההמוגלובין שהוכנה בשלב 1.2 לתוך מזרק סטרילי של 0.3 מ"ל עם מחט 30G והנח את המזרק למערכת המזרקים הסטריאוטקטית.
הערה: אם אתה יוצר תנאי בקרה, צייר תמיסת aCSF שהוכנה בשלב 1.1 לתוך מזרק סטרילי של 0.3 מ"ל והמשך עם הפרוטוקול. - הפעל את ממשק המזרק הסטריאוטקטי ולחץ על כפתור התצורה כדי להזין את עוצמת הקול והקצב של ההזרקה.
- לחץ על עוצמת קול והגדר את עוצמת הקול על 20,000 nL (20 μL).
- לחץ על קצב עירוי והגדר את הקצב על 8,000 nL /min (8 μL/min).
- צא מהתצורה על ידי לחיצה על אפס קופה לחצן.
- שטפו את קצה המחט על ידי לחיצה על כפתור ההחדרה עד שצץ חרוז קטן של תמיסת המוגלובין בקצה המחט.
- לפות בעדינות את תמיסת ההמוגלובין מקצה המחט עם אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.
4. הזרקת בעלי חיים
- הגדר את הברגמה כאפס במערכת המזרקים הסטריאוטקטית על ידי התאמת התנוחות הבינוניות והאנטרופוסטריות של המזרק לפני הורדת קצה מחט המזרק הסמוק כדי לגעת בעדינות בגולגולת בברגמה.
הערה: אם מזריקים מהלמבדה, מגדירים את למבדה כאפס. - זהה את קואורדינטות הבחירה.
- אם מזריקים מהברגמה, בחולדות P4 המתוארות כאן, השתמשו ב-1.5 מ"מ לרוחב, 0.4 מ"מ קדמיים ו-2.0 מ"מ עומק מברגמה.
- אם מזריקים מהלמבדה, השתמשו בקואורדינטות הבאות עבור חולדות P4: 1.1 מ"מ לרוחב, 4.6 מ"מ קדמי ועומק 3.3 מ"מ מלמבדה.
- הרם את מחט המזרק 1 ס"מ מעל הגולגולת כדי לנקות את הקרקפת. כאשר המזרק מורם, המשך להגדיר את הקואורדינטות הבינוניות והאנטרופוסטריות.
- הורידו את מחט המזרק כדי לגעת בעדינות בגולגולת. בדוק שהמחט נוגעת בגולגולת.
- הגדר את הקואורדינטות הגבי על פני תקופה של 30 שניות.
הערה: בעת קביעת הקואורדינטות הדורסובנטרליות, המחט תנקב את הגולגולת. יש להקפיד על כך שהמזרק יעבור דרך הגולגולת מבלי לעוות את הגולגולת. דפורמציה בגולגולת נמנעת על ידי משיכה איטית של המחט לאורך הקואורדינטות הגבי אם מתרחש דפורמציה, ולאחר מכן החזרת המחט לאורך אותו מסלול. זה מאפשר למחט לעבור דרך החור בגולגולת עם פחות כוח וללא עיוות. - בממשק המזרק הסטריאוטקטי, לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בהזרקה.
- לאחר סיום ההזרקה, השאירו את מחט המזרק במקומה למשך 2 דקות כדי למזער את זרימת התמיסה.
- מושכים את המזרק באיטיות לאורך הקואורדינציה הגבית במשך 2 דקות עד שקצה המחט נמצא 2 ס"מ מעל הקרקפת.
- סובב את זרוע המזרק הסטריאוטקטית הרחק מהשדה המבצעי.
5. טיפול לאחר הניתוח
- סגור את הקרקפת עם תפר מונופילמנט 6-0. הכינו תפר אחד פשוט שנקטע במרכז החתך באורך 0.3 ס"מ.
- הוציאו את הגור מההרדמה והניחו אותו על אזור בטוח על כרית החימום.
- החזירו את המכרסם לכלוב הביתי כדי להתאושש מההרדמה תחת טיפול הסכר שלו.
הערה: חזרה בזמן לטיפול בסכר מפחיתה את התמותה המוקדמת לאחר הניתוח. - עקוב אחר בעלי החיים להרדמה על ידי אובדן רפלקס התיקון מדי שעה לאחר הניתוח במשך 3 שעות.
- עקוב אחר בעלי החיים מדי יום במשך 7 ימים עבור פעילות רגילה, צריכת מזון, ועלייה במשקל. עקוב אחר אתר החתך לריפוי פצעים, סגירה והופעה חוזרת של פרווה באתר הניתוח.
הערה: במקרה הנדיר כי שינויים נוירולוגיים כגון התקפים, דיכאון מרכזי, או ירידה בתיאבון נצפים במהלך הניטור, להרדים את החיה באמצעות זלוף תוך וסקולרי או פריקת צוואר הרחם תחת הרדמה. - כדי למנוע זיהום ברגע שהתפר נסגר והפצע מחלים, יש למרוח אנטיביוטיקה משולשת מקומית באתר החתך.
6. רכישה וכימות MRI
- בצע MRI בסורק 4.7T או 9.4T של בעלי חיים קטנים.
- סובבו את כרית החימום לסביבה הבינונית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה.
- לגרום הרדמה בתא באמצעות 3% isoflurane.
הערה: יש לוודא הרדמה מספקת באמצעות תגובת כיווץ הבוהן/הזנב כל 15 דקות. עקוב אחר ההרדמה עם תצפית חזותית על צבע הרקמה, טמפרטורת הגוף וקצב הנשימה. - מקם את החולדה המורדמת נוטה ב- MRI כאשר האף ממוקם במתאם ההרדמה עם זרימה קבועה של 1.5% איזופלורן.
- בצע הדמיה משוקללת T2 על-ידי בחירת רצף הד ספין מהיר במשקל T2.
- אם אתה משתמש בסורק MRI 4.7T, הזן את הפרמטרים הבאים לתוכנת MRI: זמן חזרה = 3,000 אלפיות השנייה, זמן הד = 27.50 אלפיות השנייה, מספר ממוצעים = 3, שדה ראייה = 18.0 מ"מ x 18.0 מ"מ, מטריצה = 128 x 128, מספר פרוסות ציריות = 24, עובי = 0.50 מ"מ.
- אם אתה משתמש בסורק MRI 9.4T, הזן את הפרמטרים הבאים בתוכנת MRI: זמן חזרה = 5,000 אלפיות השנייה, זמן הד = 66.00 אלפיות השנייה, מרווח הד = 16.50 אלפיות השנייה, מספר ממוצעים = 2, חזרות = 1, גורם נדיר = 8, שדה ראייה = 16.0 מ"מ x 16.0 מ"מ, מטריצה = 256 x 256, מספר פרוסות ציריות = 32, עובי = 0.50 מ"מ.
- לחץ על הלחצן המשך כדי להתחיל את הרצף.
7. עיבוד וניתוח תמונה
- השתמש בנתונים מקוריים משוקללים של T2 כדי לנתח את נפח המוח. השתמש בתוכנת סגמנטציה כדי להגדיר באופן ידני את החדרים הצדדיים6. לחצו על 'מצב מברשת צבע' ובחרו סגנון מברשת מרובעת . התאימו את גודל המברשת ל-1. לחץ על מפקח הפריסה ובחר תצוגה צירית. לחץ על זום כדי להתאים. מקם את הסמן על התמונה; לעקוב ולמלא את חלל החדר לרוחב.
- לחץ על סגמנטציה בסרגל הכלים | נפח וסטטיסטיקה כדי להציג את אמצעי האחסון המפולחים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצלחת ההזרקה אושרה באמצעים רדיולוגיים ואימונוהיסטוכימיים. בעלי חיים שעברו הזרקת המוגלובין פיתחו חדריות חריפה בינונית כאשר הוערכו באמצעות MRI (איור 2A), עם חדרים רוחביים גדולים יותר באופן משמעותי ב-24 שעות ו-72 שעות לאחר הזרקת המוגלובין בהשוואה לבעלי חיים שהוזרקו על-ידי aCSF (איור 2B,C). אמנם לא היה הבדל משמעותי בנפח החדרים הלטרליים בין בעלי חיים שהוזרקו בהמוגלובין לבין בעלי חיים שהוזרקו על-ידי aCSF 38 יום לאחר ההזרקה (איור 2D), אך חשוב לציין ש-44% (4/9) מבעלי החיים בקבוצת ההזרקה המוגלובין, שעקבו אחריהם עד 38 יום לאחר ההזרקה, הציגו בנקודת זמן זו חדר לא פתור (איור 2D ). התפלגות רחבה זו בגודלי החדרים היא דפוס העולה בקנה אחד עם המהלך הקליני של IVH-PHH. בנוסף, נפח החומר הלבן כומת ב-38 ימים לאחר ההזרקה (איור 3) וירד משמעותית בקבוצת הזרקת המוגלובין בהשוואה לקבוצה שהוזרקה aCSF (איור 3B).
בעבר פרסמנו מחקר המפרט את התגובה הדלקתית החריפה המתרחשת לאחר הזרקת המוגלובין9. במחקר הנוכחי, ציטוקינים פרו-דלקתיים הוערכו עבור ייצור in vivo של גורם נמק גידולי (TNFα) (איור 4), וחדירת תאי מערכת החיסון לאזורים הפריוונטריקולריים ולחומר הלבן הוערכה באמצעות חלבון חומצי גליאלי (GFAP) אימונופלואורסצנציה (איור 5). הזרקה של 15 μL של המוגלובין, דם שלם או מי מלח לחדר הצדדי של חולדות יום 5 לאחר הלידה הביאה לרמות גבוהות יותר של ציטוקין פרו-דלקתי TNFα 3 שעות לאחר הזרקת המוגלובין בהשוואה לדם מלא ומלוח (איור 4). באופן משמעותי היו יותר אסטרוציטים תגובתיים בקורפוס קלוסום של בעלי חיים שהוזרקו להם המוגלובין בהשוואה לבעלי חיים שהוזרקו על-ידי aCSF (איור 5). לבסוף, באופן זה נעשה שימוש במוצרים אחרים לפירוק הדם, כולל ברזל ופריטין, כדי לגרום באופן אמין להחדרת חדריות ולהידרוצפלוס 6,7.
איור 1: ציר הזמן הניסויי והסכימה של מודל IVH של חולדה ילודים. (A) סכמטי המציג את ציר הזמן של הזרקת המוגלובין ו-MRI המשמשים לנתונים שנוצרו במחקר זה. (B) סכמטי של הגדרה סטריאוטקטית להזרקה (משמאל) ומיקום הזרקת המוגלובין לחדר הצדדי הימני (מימין). קיצורים: IVH = דימום תוך חדרי; MRI = הדמיית תהודה מגנטית; PN = יום לאחר הלידה N. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: נפחי חדרים רוחביים במודל חולדות הדימום התוך-חדרי. (A) תמונות MRI קורונליות מייצגות in vivo T2 של מוחות חולדות 24 שעות, 72 שעות ו-38 ימים לאחר הזרקה תוך-חדרית של aCSF (משמאל) או 150 מ"ג/מ"ל Hb (מימין) לחדר הצדדי הימני ביום 4 שלאחר הלידה. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. (B-D) כימות נפחי החדרים הצדדיים (B) 24 שעות, (C) 72 שעות ו- (D) 38 ימים לאחר הזרקת aCSF או Hb. לבעלי חיים שהוזרקו Hb היו חדרים גדולים משמעותית ב-24 שעות ו-72 שעות. הנתונים ב- B ו- C הם ממוצעים ± s.e.m., n = 13 לכל קבוצה, מבחן t דו-זנבי לא מזווג. הנתונים ב-D ממוצעים ± SEM, n = 3 בקבוצת aCSF ו- n = 9 בקבוצת Hb, מבחן t דו-זנבי לא מזווג. קיצורים: MRI = הדמיית תהודה מגנטית; PN = יום לאחר הלידה N; aCSF = נוזל מוחי מלאכותי; Hb = המוגלובין; SEM = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פגיעה בחומר הלבן במודל חולדות הדימום התוך-חדריות . (A) תמונות MRI קורונליות מייצגות in vivo T2 של מוחות חולדות 38 יום לאחר הזרקה תוך-חדרית של aCSF (משמאל) או 150 מ"ג/מ"ל Hb (מימין) לחדר הצדדי הימני ביום 4 שלאחר הלידה. החומר הלבן מסומן באדום. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. (B) כימות נפחי החומר הלבן 38 יום לאחר הזרקת aCSF או Hb. בעלי חיים שהוזרקו להם Hb הפחיתו את נפחי החומר הלבן. נתונים ב - B הם ממוצעים ± SEM, n = 3 בקבוצת aCSF, n = 9 בקבוצת Hb. מבחן t דו-זנבי לא מזווג. קיצורים: MRI = הדמיית תהודה מגנטית; PN = יום לאחר הלידה N; aCSF = נוזל מוחי מלאכותי; Hb = המוגלובין; SEM = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: המוגלובין משרה יותר ייצור TNFα מאשר דם שלם in vivo. מתן של 15 μL של המוגלובין, דם שלם או מי מלח לחדר הצדדי של חולדות יום 5 לאחר הלידה הביא לרמות גבוהות יותר של ציטוקין פרו-דלקתי TNFα 3 שעות לאחר הזרקת המוגלובין בהשוואה לדם מלא ומלוחים. הנתונים ממוצעים ± SEM, n = 4 בכל הקבוצות, ANOVA חד כיווני עם המבחן של טוקי לאחר הוק. קיצורים: Hb = המוגלובין; TNFα = גורם נמק גידול-אלפא; WB = דם שלם; ANOVA = ניתוח שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הפעלת אסטרוציטים בקורפוס קלוסום לאחר הזרקת המוגלובין לחדר הלטרלי. (A) חיסון GFAP מראה הזרקת המוגלובין לחדר הלטרלי של מכרסמים לאחר יום 4 הביאה להפעלת אסטרוציטים בקורפוס קלוסום ובאזור התת-חדרי 72 שעות לאחר ההזרקה. מוטות קשקשים = 50 מיקרומטר. (B) מספר האסטרוציטים הריאקטיביים גדל באופן משמעותי בבעלי חיים שהוזרקו המוגלובין בהשוואה לבעלי חיים שהוזרקו aCSF. הנתונים ממוצעים ± SEM, n = 3 בקבוצת aCSF, n = 4 בקבוצת Hb, מבחן t דו-זנבי לא מזווג. קיצורים: GFAP = חלבון חומצי פיברילרי גליאלי; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; LV = חדר לרוחב; SVZ = אזור תת-חדרי; cc = קורפוס קלוסום; aCSF = נוזל מוחי מלאכותי; Hb = המוגלובין; SEM = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: השוואה בין איכות התמונה של 4.7T ו-9.4T MRI. (A) MRI משוקלל 4.7T ו-9.4T T2 נלקח 72 שעות לאחר הזרקת המוגלובין לחדר הלטרלי הימני של חולדות לאחר הלידה ביום 4. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. קיצור: MRI = הדמיית תהודה מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל IVH זה המשתמש בהזרקת המוגלובין מאפשר לחקור את הפתולוגיה של IVH בתיווך ספציפי על ידי המוגלובין. עבור מחקרים משלימים, המוגלובין יכול גם להיות מועבר בקלות במבחנה ואינו מבלבל בדיקות ביוכימיות עבור חלבונים המיוצרים על ידי microglia / מקרופאגים הנמצאים בדם שלם.
התיאוריות המובילות של IVH-PHH כוללות חסימה מכנית של זרימת CSF, הפרעה של ריסונים המרפדים את דפנות האפנדימלים, דלקת, פיברוזיס ורעילות ברזל10. מודלים קיימים של בעלי חיים עבור IVH כגון מודל גור החולדות המושרה על ידי קולגן גורמים ל- IVH באמצעות פגיעה ישירה ושיבוש של המטריצה החוץ-תאית11, בעוד שאחרים כגון מודל גור הארנב המושרה על ידי גליצרול גורמים ל- IVH כהשפעה של תת-לחץ דם תוך גולגולתי12. מודלים נוספים משתמשים בהזרקת דם אוטולוגית ותורמת חולדה לחדרים הצדדיים13, 14. בעוד מודלים קיימים אלה ואחרים מציגים תכונות חשובות לחקר IVH-PHH, הם מתמקדים בהשפעת הדם בתוך החדר מבלי לקחת בחשבון את תפקידם של מרכיבים ספציפיים של הדם המשתחררים במהלך דימום על התפתחות sequelae נוירולוגית לאחר IVH.
הודגם כי רמות מוקדמות של המוגלובין CSF לאחר IVH קשורות ל-PHH, ורמות CSF של חלבוני מסלול חילוף החומרים של ברזל – המוגלובין, פריטין ובילירובין – נקשרות לגודל החדר לאחר IVH4. זה מצביע על כך שהפתוגנזה של PHH עשויה להיות קשורה באופן ספציפי למרכיבי ההמוגלובין והברזל של הדם המשתחררים לחדרים במהלך IVH. לפיכך, מודל זה מהווה אפיק חשוב לחקירה ממוקדת של תפקיד ההמוגלובין בפיתוח PHH ומאפשר מחקרים נוספים על טיפולים המכוונים למסלולי חילוף החומרים של המוגלובין וברזל לאחר IVH.
הגדלת חדרים לאחר IVH בבני אדם יכולה לנבוע מאובדן פרנכימלי במוח (המכונה לעתים הידרוצפלוס ex vacuo) או הידרוצפלוס, מה שמעיד על לחץ CSF מוגבר. תהליכים אלה יכולים להתרחש יחד15 וזה יכול להיות קשה לקבוע באיזו מידה שינויים חדריים נובעים לחץ CSF מוגבר לעומת אובדן נפח ללא הליכים פולשניים. מודל זה, המאפשר הן הערכה רדיולוגית של גודל החדר בבעלי חיים חיים והן הערכה של פגיעה ברקמות באמצעות היסטולוגיה, יכול לסייע לחוקרים להבין את הקשר בין השניים, וחשוב מכך, להעריך באיזו מידה טיפולים פוטנציאליים הופכים פגיעה מוחית.
באופן מסורתי, השוואות בין-מיניות של התפתחות המוח הסתמכו בעיקר על מסת המוח שלאחר המוות. מחקר מכונן של Dobbing and Sands שנערך בשיטה זו העריך כי P7 הוא תקופה מרכזית של צמיחת מוח במכרסמים, בדומה לשינויים שנצפו בילודים אנושיים שנולדו במונח16. לאחרונה, מחקרים שהשוו אבני דרך התפתחותיות כגון הבשלת אוליגודנדרוציטים והקמת מחסום הדם-מוח הגדירו את P1–P3 במכרסמים כמקביל להריון של 23–32 שבועות בילודים אנושיים 17,18,19,20,21. בנוסף, מטריצת הנביטה אינה מסתובבת עד P7 בחולדות22. לכן, חולדות P4 המשמשות במודל זה מתאימות לתקופה של התבגרות מוחית שבה המטריצה הנבטית נמצאת, עם מאפיינים שאנו מאמינים שהם מייצגים את האוכלוסייה האנושית בסיכון ל- IVH-PHH. יתר על כן, שיעור חדרי החדר הלא פתורים ב-38 ימים לאחר הזרקת המוגלובין במחקר זה (44%) דומה לשיעורים הקליניים של PHH לאחר IVH (30%)23.
המגבלות של מודל ה-IVH של החולדה לאחר הלידה כוללות שימוש בחיה ליסנצפלית והיעדר פגיעה ישירה במטריצת הנביטה ו/או בפרנכימה הפריונטריקולרית. עם זאת, למודל הזה יש כמה יתרונות, כולל יכולת שכפול טובה, עלות נמוכה ורב-תכליתיות שמאפשרת שימוש בבעלי חיים מזדקנים שונים ובניתוחים רדיולוגיים שונים (איור 6), ניתוחים ביוכימיים והיסטולוגיים. עבודת מעבדה עתידית על הפתופיזיולוגיה של IVH עשויה להוביל לטיפולים טובים יותר במצב זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
JMS קיבלה מימון מ-NIH/NINDS R01 NS110793 ו-K12 (תוכנית לפיתוח קריירה במחקר נוירוכירורגי). BAM קיבל מימון מ- NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, פרס אזור עדיפות למחקר במדעי המוח של אוניברסיטת קנטקי, ופרס חדשני של איגוד הידרוצפלוס .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
References
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php (2022).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
