Summary
Bu yazıda, insanlarda görülen patolojiyi taklit eden sıçan yavrularının kullanıldığı bir yenidoğan intraventriküler kanama modeli sunulmuştur.
Abstract
Yenidoğan intraventriküler kanaması (IVH) erken doğumun yaygın bir sonucudur ve beyin hasarına, posthemorajik hidrosefaliye (PHH) ve yaşam boyu nörolojik defisitlere yol açar. PHH geçici ve kalıcı beyin omurilik sıvısı (BOS) saptırma prosedürleri (sırasıyla ventriküler rezervuar ve ventriküloperitoneal şant) ile tedavi edilebilirken, IVH kaynaklı beyin hasarı ve hidrosefaliyi önlemek veya tedavi etmek için farmakolojik stratejiler yoktur. IVH'nin patofizyolojisini daha iyi anlamak ve farmakolojik tedavileri test etmek için hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Mevcut yenidoğan IVH modelleri olsa da, güvenilir bir şekilde hidrosefali ile sonuçlananlar genellikle patolojinin modellenmesini zorlaştırabilecek veya gözlemlenen klinik fenotipte değişkenlik yaratabilecek büyük hacimli enjeksiyonların gerekliliği ile sınırlıdır.
Son klinik çalışmalar, hemoglobin ve ferritinin IVH sonrası ventrikül genişlemesine neden olduğunu göstermiştir. Burada, kan parçalanma ürünü hemoglobinin küçük hacimli intraventriküler enjeksiyonlarını kullanarak PHH'nin klinik fenotipini taklit eden basit bir hayvan modeli geliştiriyoruz. Ventriküler genişleme ve hidrosefaliyi güvenilir bir şekilde indüklemenin yanı sıra, bu model periventriküler ve beyaz cevher bölgelerinde beyaz cevher hasarı, inflamasyon ve immün hücre infiltrasyonu ile sonuçlanır. Bu yazıda, intraventriküler enjeksiyon kullanılarak yenidoğan sıçanlarda IVH-PHH modellemesi için klinik olarak alakalı, basit bir yöntem açıklanmakta ve enjeksiyon sonrası ventrikül boyutunun ölçülmesi için yöntemler sunulmaktadır.
Introduction
Yenidoğan IVH, gelişmekte olan beynin lateral ventriküllerine bitişik olan hızlı hücre bölünmesi bölgesi olan germinal matriksten kaynaklanır. Bu yüksek vasküler yapı, erken doğuma bağlı hemodinamik instabiliteye karşı savunmasızdır. Germinal matriks kanamasında (GMH)-IVH'de germinal matriks rüptürü içindeki kırılgan kan damarları olduğunda lateral ventriküllere kan salınır. Derece IV IVH durumunda, periventriküler hemorajik enfarktüs de beyindeki kan ürünlerinin salınımına katkıda bulunabilir. 1 GMH-IVH kombinasyonu, özellikle yüksek dereceli kanamadan sonra (derece III ve IV) PHH'ye neden olabilir1. PHH, ventriküloperitoneal şantın yerleştirilmesiyle tedavi edilebilir, ancak şant yerleşimi IVH'den kaynaklanabilecek beyin hasarını tersine çevirmez. Modern yenidoğan yoğun bakımı IVH2, 3 oranlarını düşürmüş olsa da, IVH'nin neden olduğu beyin hasarı veya hidrosefali için spesifik bir tedavi yoktur. IVH kaynaklı beyin hasarı ve PHH için önleyici tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir sınırlama, IVH patofizyolojisinin tam olarak anlaşılamamasıdır.
Son zamanlarda, anahtar kan parçalanma ürünü hemoglobinin erken BOS seviyelerinin, yüksek dereceli IVH4'lü yenidoğanlarda daha sonra PHH gelişimi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, demir işleme yolu proteinlerinin BOS seviyeleri - hemoglobin, ferritin ve bilirubin - yenidoğan IVH'de ventrikül boyutu ile ilişkilidir. Bu aynı zamanda, daha yüksek ventriküler BOS ferritin düzeylerinin daha büyük ventrikül boyutu5 ile ilişkili olduğu preterm PHH'li bebeklerin çok merkezli bir kohortunda da gösterilmiştir.
Bu çalışmada, beyin hasarı ve PHH'nin nicelleştirilmesine ve yeni terapötik stratejilerin test edilmesine olanak tanıyan beyin ventriküllerine hemoglobin enjeksiyonunu kullanarak IVH kaynaklı beyin hasarı ve hidrosefalinin klinik olarak ilgili bir modelini geliştirdik (Şekil 1) 6, 7. Bu IVH modeli, prosedür süresince genel anestezi altına alınan yenidoğan sıçan yavrularını kullanır. Kafa derisinde bir orta hat insizyonu yapılır ve kafatası işaretlerinden (bregma veya lambda) türetilen koordinatlar, enjeksiyon için lateral ventrikülleri hedeflemek için kullanılır. Bir infüzyon pompası kullanılarak yapılan yavaş enjeksiyon, hemoglobini ventriküle iletir. Bu protokolün kullanımı kolaydır, çok yönlüdür ve IVH'nin PHH ile sonuçlanan farklı bileşenlerini modelleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan protokolleri, kurumların Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Hemoglobin ve BOS çözeltilerinin hazırlanması
- 1,5 mL'lik bir mikrotüpe 500 μL aCSF çözeltisi ekleyerek steril bir yapay CSF (aCSF) çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
- 1.5 mL'lik bir mikrotüp içinde 500 μL aCSF'ye 75 mg hemoglobin ekleyerek steril bir 150 mg / mL hemoglobin çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
2. Hayvanın enjeksiyon için hazırlanması
- Sıçanın vücut sıcaklığını korumak için ısıtma yastığını orta ayara getirin.
- Doğum sonrası gün 4 (P4) sıçanları% 3 izofluran ile dolu bir indüksiyon odasında anestezi yapın.
NOT: Her 15 dakikada bir ayak parmağı/kuyruk sıkışması yanıtını kullanarak yeterli anesteziyi onaylayın. Doku renginin, vücut ısısının ve solunum hızının görsel gözlemi ile anesteziyi izleyin. - Anestezi uygulanan sıçana 5 mg/kg deri altı karprofen enjeksiyonu ile ağrı kesici uygulayın.
- Anestezi uygulanan sıçanı stereotaktik aparatın içine yerleştirin ve burnu anestezi adaptöründe %1,5 izofluran sabit bir akışla konumlandırılsın.
- Kafayı sabitlemek için dış işitsel meatus üzerindeki yırtılmayan kulak çubuklarını sıkın.
NOT: Enjeksiyon çağında gözler açıksa gözleri nemli tutmak için veteriner merhemi uygulayın. - Betadin ve% 70 etanol içine batırılmış steril pamuk uçlu aplikatörlerle dönüşümlü olarak kafayı temizleyin.
- Betadin ile ıslatılmış aplikatöre kafa derisinin merkezine dokunun ve betadini dışa doğru hareket ettirerek daireler halinde yayın.
- Adım 2.6.1.1'i etanolle ıslatılmış aplikatör ile tekrarlayın.
- Adım 2.6.1.1 ve adım 2.6.1.2 3x'i yineleyin.
- Cerrahi alanı korumak için steril bir cerrahi örtü uygulayın.
- Steril bir neşter kullanarak, kafatasının bregmasını ortaya çıkarmak için başın ortasından dikey olarak 0,3 cm'lik bir kesi yapın.
NOT: Lambdadan enjekte ediliyorsa, bregma yerine kafatasının lambdasını açığa çıkarın. - Alanı kurutmak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
3. Stereotaktik enjektörün kurulması
- Adım 1.2'de hazırlanan hemoglobin çözeltisini 30G iğneli 0.3 mL'lik steril bir şırıngaya çekin ve şırıngayı stereotaktik enjektör sistemine yerleştirin.
NOT: Kontrol koşulları oluşturuyorsanız, adım 1.1'de hazırlanan aCSF çözeltisini 0,3 mL'lik steril bir şırıngaya çekin ve protokole devam edin. - Stereotaktik enjektör arayüzünü açın ve enjeksiyon ses seviyesi ve hızı ayarlarını girmek için Yapılandırma düğmesine tıklayın.
- Ses seviyesi'ne tıklayın ve ses seviyesini 20.000 nL'ye (20 μL) ayarlayın.
- İnfüzyon hızı'na tıklayın ve hızı 8.000 nL / dak (8 μL / dak) olarak ayarlayın.
- Pos Sıfırla düğmesine tıklayarak Yapılandırmadan çıkın.
- İğne ucunda küçük bir hemoglobin çözeltisi boncuğu ortaya çıkana kadar Demle düğmesine tıklayarak iğne ucunu yıkayın.
- Hemoglobin çözeltisini iğne ucundan steril pamuk uçlu bir aplikatör ile yavaşça fitilleyin.
4. Hayvan enjeksiyonu
- Bregma'daki kafatasına hafifçe dokunmak için kızarmış şırınga iğnesinin ucunu indirmeden önce şırınganın mediolateral ve anteroposterior pozisyonlarını ayarlayarak stereotaktik enjektör sisteminde bregmayı sıfır olarak ayarlayın.
NOT: Lambda'dan enjekte ediliyorsa, lambda'yı sıfır olarak ayarlayın. - Seçtiğiniz koordinatları tanımlayın.
- Bregmadan enjekte ediliyorsa, burada tarif edilen P4 sıçanlarında , bregmadan 1.5 mm yanal, 0.4 mm ön ve 2.0 mm derinlikte kullanın.
- Lambda'dan enjekte ediliyorsa, P4 sıçanları için aşağıdaki koordinatları kullanın: 1.1 mm yanal, 4.6 mm ön ve lambda'dan 3.3 mm derinlik.
- Kafa derisini temizlemek için şırınga iğnesini kafatasının 1 cm yukarısına kaldırın. Şırınga kaldırıldığında, mediolateral ve anteroposterior koordinatları ayarlamaya devam edin.
- Kafatasına hafifçe dokunmak için şırınga iğnesini indirin. İğnenin kafatasına dokunup dokunmadığını kontrol edin.
- Dorsoventral koordinatı 30 s'lik bir periyot boyunca ayarlayın.
NOT: Dorsoventral koordinatı ayarlarken, iğne kafatasını delecektir. Şırınganın kafatasını deforme etmeden kafatasından geçmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Deformasyon meydana gelirse, iğneyi dorsoventral koordinat boyunca yavaşça çekerek, ardından iğneyi aynı yörünge boyunca geri yerleştirerek kafatası deformasyonu önlenir. Bu, iğnenin kafatasındaki delikten daha az kuvvetle ve deformasyon olmadan geçmesini sağlar. - Stereotaktik enjektör arayüzünde, enjeksiyona başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
- Enjeksiyon bittikten sonra, çözeltinin geri akışını en aza indirmek için şırınga iğnesini 2 dakika yerinde bırakın.
- Şırıngayı, iğne ucu kafa derisinin 2 cm yukarısında olana kadar 2 dakika boyunca dorsoventral koordinat boyunca yavaşça çekin.
- Stereotaktik enjektör kolunu ameliyat alanından uzağa döndürün.
5. Postoperatif bakım
- Kafa derisini 6-0 monofilament dikişle kapatın. 0.3 cm'lik insizyonun merkezinde basit bir kesilmiş dikiş yapın.
- Yavruyu anesteziden çıkarın ve ısıtma yastığı üzerindeki güvenli bir alana yerleştirin.
- Barajının bakımı altındaki anesteziden kurtulmak için kemirgeni ev kafesine geri getirin.
NOT: Barajın bakımına zamanında geri dönülmesi, ameliyat sonrası erken mortaliteyi azaltır. - Ameliyat sonrası saatte 3 saat boyunca doğru refleksi kaybederek hayvanları anestezi için izleyin.
- Normal aktivite, yiyecek alımı ve kilo alımı için hayvanları 7 gün boyunca günlük olarak izleyin. Yara iyileşmesi, kapanması ve ameliyat yerinde kürkün yeniden ortaya çıkması için insizyon bölgesini izleyin.
NOT: İzleme sırasında nöbetler, merkezi depresyon veya iştah azalması gibi nörolojik değişikliklerin gözlendiği nadir durumlarda, anestezi altında intravasküler perfüzyon veya servikal çıkık kullanarak hayvanı ötenazi yapın. - Dikiş kapatıldıktan ve yara iyileştikten sonra enfeksiyonu önlemek için, insizyon bölgesine topikal üçlü antibiyotik uygulayın.
6. MRG edinimi ve nicelleştirme
- MRG'yi 4.7T veya 9.4T küçük hayvan tarayıcıda gerçekleştirin.
- Sıçanın vücut sıcaklığını korumak için ısıtma yastığını orta ayara getirin.
- % 3 izofluran kullanarak bir odada anestezi indükleyin.
NOT: Her 15 dakikada bir ayak parmağı/kuyruk sıkışması yanıtını kullanarak yeterli anesteziyi onaylayın. Doku renginin, vücut ısısının ve solunum hızının görsel gözlemi ile anesteziyi izleyin. - Anestezi uygulanan sıçanı MRG'ye yerleştirin, burun anestezi adaptöründe konumlandırılmış% 1.5 izofluran sabit bir akışla yerleştirilmiştir.
- T2 ağırlıklı hızlı dönüş yankı dizisi seçerek T2 ağırlıklı görüntüleme gerçekleştirin.
- 4.7T MRI tarayıcı kullanıyorsanız, MRI yazılımına aşağıdaki parametreleri girin: tekrarlama süresi = 3.000 ms, yankı süresi = 27.50 ms, ortalama sayısı = 3, görüş alanı = 18.0 mm x 18.0 mm, matris = 128 x 128, eksenel dilim sayısı = 24, kalınlık = 0.50 mm.
- 9.4T MRI tarayıcı kullanıyorsanız, MRI yazılımına aşağıdaki parametreleri girin: tekrarlama süresi = 5.000 ms, yankı süresi = 66.00 ms, yankı aralığı = 16.50 ms, ortalama sayısı = 2, tekrarlar = 1, nadir faktör = 8, görüş alanı = 16.0 mm x 16.0 mm, matris = 256 x 256, eksenel dilim sayısı = 32, kalınlık = 0.50 mm.
- Diziyi başlatmak için Devam düğmesine tıklayın.
7. Görüntü işleme ve analizi
- Beyin hacmini analiz etmek için yerel T2 ağırlıklı verileri kullanın. Lateral ventrikülleri manuel olarak tanımlamak için segmentasyon yazılımı kullanın6. Boya Fırçası Modu'na tıklayın ve kare fırça stilini seçin. Fırça boyutunu 1 olarak ayarlayın. Düzen denetçisi'ni tıklatın ve eksenel görünümü seçin. Sığdırmak için yakınlaştır'ı tıklayın. İmleci görüntünün üzerine getirin; lateral ventrikül boşluğunu izleyin ve doldurun.
- Araç çubuğunda Segmentasyon'a tıklayın | Bölümlere ayrılmış birimleri görüntülemek için Hacim ve İstatistikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enjeksiyonun başarısı radyolojik ve immünohistokimyasal yollarla doğrulandı. Hemoglobin enjeksiyonu yapılan hayvanlar, MRG ile değerlendirildiğinde orta derecede akut ventrikülomegali geliştirdi (Şekil 2A), aCSF enjekte edilen hayvanlara kıyasla hemoglobin enjeksiyonundan 24 saat ve 72 saat sonra anlamlı derecede daha büyük lateral ventriküller ile (Şekil 2B, C). Enjeksiyondan 38 gün sonra hemoglobin enjekte edilen ve aCSF enjekte edilen hayvanlar arasında lateral ventrikül hacminde anlamlı bir fark olmamasına rağmen (Şekil 2D), enjeksiyondan 38 gün sonrasına kadar takip edilen hemoglobin enjekte edilen gruptaki hayvanların% 44'ünün (4/9) bu zaman noktasında çözülmemiş ventrikülomegali gösterdiğini belirtmek önemlidir (Şekil 2D ). Ventrikül boyutlarındaki bu geniş dağılım, IVH-PHH'nin klinik seyri ile tutarlı bir paterndir. Ek olarak, beyaz cevher hacmi enjeksiyondan sonraki 38 günde ölçüldü (Şekil 3) ve hemoglobin enjekte edilen grupta aCSF enjekte edilen gruba kıyasla anlamlı derecede azaldı (Şekil 3B).
Daha önce hemoglobin enjeksiyonu 9'dan sonra ortaya çıkan akut enflamatuar reaksiyonu detaylandıran bir çalışmayayınladık. Bu çalışmada, proinflamatuar sitokinler tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa) üretimi in vivo olarak değerlendirildi (Şekil 4) ve glial fibriler asidik protein (GFAP) immünofloresan kullanılarak periventriküler bölgelere ve beyaz cevher immün hücre infiltrasyonu değerlendirildi (Şekil 5). Postnatal gün 5 sıçanlarının lateral ventrikülüne 15 μL hemoglobin, tam kan veya salin enjeksiyonu, hemoglobin enjeksiyonundan 3 saat sonra tam kan ve saline kıyasla daha yüksek proinflamatuar sitokin TNFα seviyeleri ile sonuçlandı (Şekil 4). Hemoglobin enjekte edilen hayvanların korpus kallozumunda, aCSF enjekte edilen hayvanlara kıyasla anlamlı derecede daha fazla reaktif astrosit vardı (Şekil 5). Son olarak, ventrikülomegali ve hidrosefali 6,7 ile güvenilir bir şekilde sonuçlanmak için demir ve ferritin de dahil olmak üzere diğer kan parçalanma ürünleri bu şekilde kullanılmıştır.
Şekil 1: Yenidoğan sıçan IVH modelinin deneysel zaman çizelgesi ve şeması. (A) Bu çalışmada üretilen veriler için kullanılan hemoglobin enjeksiyonunu gösteren şematik ve MRG zaman çizelgesi. (B) Sağ lateral ventriküle (sağda) enjeksiyon (solda) ve hemoglobin enjeksiyon yeri için stereotaktik kurulum şeması. Kısaltmalar: IVH = intraventriküler kanama; MRG = manyetik rezonans görüntüleme; PN = doğum sonrası gün N. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İntraventriküler kanama sıçan modelinde lateral ventrikül hacimleri. (A) Postnatal 4. günde sağ lateral ventriküle aCSF (solda) veya 150 mg/mL Hb (sağda) intraventriküler enjeksiyonundan 24 saat, 72 saat ve 38 gün sonra sıçan beyinlerinin temsili in vivo T2 koronal MRG görüntüleri. Ölçek çubukları = 1 mm. (B-D) LATERAL VENTRIKÜL HACIMLERININ (B) 24 saat, (C) 72 saat ve (D) aCSF veya Hb enjeksiyonundan 38 gün sonra miktarının belirlenmesi. Hb enjekte edilen hayvanlarda 24 saat ve 72 saatte önemli ölçüde daha büyük ventriküller vardı. B ve C'deki veriler ortalama ± s.e.m., n = grup başına 13, eşlenmemiş iki kuyruklu t-testidir. D'deki veriler ortalama SEM ±, aCSF grubunda n = 3 ve Hb grubunda n = 9, eşlenmemiş iki kuyruklu t-testidir. Kısaltmalar: MRI = manyetik rezonans görüntüleme; PN = doğum sonrası gün N; aCSF = yapay beyin omurilik sıvısı; Hb = hemoglobin; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İntraventriküler kanama sıçan modelinde beyaz cevher hasarı . (A) Postnatal 4. günde sağ lateral ventriküle aCSF (solda) veya 150 mg/mL Hb (sağda) intraventriküler enjeksiyonundan 38 gün sonra sıçan beyinlerinin temsili in vivo T2 koronal MRG görüntüleri. Beyaz madde kırmızı renkle özetlenmiştir. Ölçek çubukları = 1 mm. (B) aCSF veya Hb enjeksiyonundan 38 gün sonra beyaz cevher hacimlerinin miktarının belirlenmesi. Hb enjekte edilen hayvanlar beyaz madde hacimlerini azaltmıştı. B'deki veriler ortalama SEM ±, aCSF grubunda n = 3, Hb grubunda n = 9'dur. Eşleşmemiş iki kuyruklu t-testi. Kısaltmalar: MRI = manyetik rezonans görüntüleme; PN = doğum sonrası gün N; aCSF = yapay beyin omurilik sıvısı; Hb = hemoglobin; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hemoglobin, in vivo olarak tam kandan daha fazla TNFa üretimini indükler. Postnatal gün 5 sıçanlarının lateral ventrikülüne 15 μL hemoglobin, tam kan veya salin uygulanması, hemoglobin enjeksiyonundan 3 saat sonra tam kan ve saline kıyasla daha yüksek proinflamatuar sitokin TNFα seviyeleri ile sonuçlanmıştır. Veriler ortalama SEM ±, tüm gruplarda n = 4, post-hoc Tukey testi ile tek yönlü ANOVA'dır. Kısaltmalar: Hb = hemoglobin; TNFα = tümör nekroz faktörü-alfa; Dünya Bankası = tam kan; ANOVA = varyans analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Lateral ventriküle hemoglobin enjeksiyonunu takiben korpus kallozumda astrosit aktivasyonu. (A) GFAP immün boyaması, postnatal gün 4 kemirgenlerinin lateral ventrikülüne hemoglobin enjeksiyonunun, enjeksiyondan 72 saat sonra korpus kallozum ve subventriküler bölgede astrosit aktivasyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Ölçek çubukları = 50 μm. (B) Reaktif astrositlerin sayısı, hemoglobin enjekte edilen hayvanlarda, aCSF enjekte edilen hayvanlara kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Veriler ortalama SEM ±, aCSF grubunda n=3, Hb grubunda n=4, eşlenmemiş iki kuyruklu t-testidir. Kısaltmalar: GFAP = glial fibriler asidik protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; AG = lateral ventrikül; SVZ = subventriküler zon; cc = korpus kallozum; aCSF = yapay beyin omurilik sıvısı; Hb = hemoglobin; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 4.7T ve 9.4T MRG görüntü kalitesinin karşılaştırılması. (A) 4.7T ve 9.4T T2 ağırlıklı MRG, doğum sonrası 4. gün sıçanlarının sağ lateral ventrikülüne hemoglobin enjeksiyonunu takiben 72 saat çekildi. Ölçek çubukları = 1 mm. Kısaltma: MRI = manyetik rezonans görüntüleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemoglobin enjeksiyonunu kullanan bu IVH modeli, özellikle hemoglobinin aracılık ettiği IVH patolojisinin incelenmesine izin verir. Tamamlayıcı çalışmalar için, hemoglobin in vitro olarak da kolayca verilebilir ve tam kanda bulunan mikroglia / makrofajlar tarafından yapılan proteinler için biyokimyasal tahlilleri karıştırmaz.
IVH-PHH'nin önde gelen teorileri arasında BOS dolaşımının mekanik olarak tıkanması, ependimal duvarları kaplayan kirpiklerin bozulması, inflamasyon, fibroz ve demir toksisitesi10 bulunmaktadır. Kollajenaz kaynaklı sıçan yavrusu modeli gibi IVH için mevcut hayvan modelleri, hücre dışı matris11'in doğrudan yaralanması ve bozulması yoluyla IVH'yi indüklerken, gliserol ile indüklenen tavşan yavrusu modeli gibi diğerleri, intrakraniyal hipotansiyonun bir etkisi olarak IVH'yi indükler. Ek modellerde lateral ventriküllere otolog ve donör sıçan kan enjeksiyonukullanılır 13, 14. Bu ve diğer mevcut modeller IVH-PHH çalışması için önemli özellikler sunarken, kanama sırasında salınan kanın spesifik bileşenlerinin IVH sonrası nörolojik sekellerin gelişimi üzerindeki rolünü göz önünde bulundurmadan ventrikül içindeki kanın etkisine odaklanmaktadır.
IVH'yi takiben hemoglobinin erken BOS seviyelerinin PHH ile ilişkili olduğu gösterilmiştir ve demir metabolizması yol proteinlerinin BOS seviyeleri - hemoglobin, ferritin ve bilirubin - IVH4'ü takiben ventrikül boyutu ile ilişkilidir. Bu, PHH'nin patogenezinin, IVH sırasında ventriküllere salınan kanın hemoglobin ve demir bileşenleri ile spesifik olarak ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, bu model hemoglobinin PHH gelişimi üzerindeki rolüne yönelik hedefli araştırma için önemli bir yol sunmakta ve IVH'yi takiben hemoglobin ve demir metabolizması yollarını hedef alan terapötikler üzerine daha ileri çalışmalara izin vermektedir.
İnsanlarda IVH sonrası ventriküler genişleme, beyin parankimal kaybına (bazen hidrosefali ex vacuo olarak adlandırılır) veya artmış BOS basıncını gösteren hidrosefaliye bağlı olabilir. Bu süreçler birlikte gerçekleşebilir15 ve invaziv prosedürler olmadan artan BOS basıncına karşı hacim kaybına bağlı ventriküler değişikliklerin ne ölçüde olduğunu belirlemek zor olabilir. Hem canlı hayvanlarda radyolojik olarak ventrikül boyutunun değerlendirilmesine hem de histoloji yoluyla doku hasarının değerlendirilmesine izin veren bu model, araştırmacıların ikisi arasındaki ilişkiyi anlamalarına ve daha da önemlisi, potansiyel tedavilerin beyin hasarını ne ölçüde tersine çevirdiğini değerlendirmelerine yardımcı olabilir.
Geleneksel olarak, beyin gelişiminin türler arası karşılaştırmaları öncelikle ölüm sonrası beyin kütlesine dayanmaktadır. Dobbing ve Sands tarafından bu yöntemle yapılan ufuk açıcı bir çalışma, P7'nin kemirgenlerde beyin büyümesinin önemli bir dönemi olduğunu ve16. dönemde doğan insan yenidoğanlarda gözlenen değişikliklerle karşılaştırılabilir olduğunu tahmin etmiştir. Daha yakın zamanlarda, oligodendrosit olgunlaşması ve kan-beyin bariyerinin kurulması gibi gelişimsel kilometre taşlarını karşılaştıran çalışmalar, kemirgenlerde P1-P3'ü, insan yenidoğanlarında 23-32 haftalık gebelik17,18,19,20,21'e benzer şekilde tanımlamıştır. Ek olarak, germinal matris, sıçanlarda P722'ye kadar içermez. Bu nedenle, bu modelde kullanılan P4 sıçanları, IVH-PHH riski altındaki insan popülasyonunu temsil ettiğine inandığımız özelliklerle, germinal matrisin mevcut olduğu bir beyin olgunlaşma dönemine karşılık gelir. Ayrıca, bu çalışmada hemoglobin enjeksiyonundan 38 gün sonra çözülmemiş ventrikülomegali oranı (%44), IVH sonrası klinik PHH oranları ile karşılaştırılabilir (%30)23.
Postnatal sıçan IVH modelimizin sınırlamaları arasında lissensefalik bir hayvanın kullanımı ve germinal matriks ve / veya periventriküler parankimin doğrudan yaralanmaması yer almaktadır. Bununla birlikte, bu modelin iyi tekrarlanabilirlik, düşük maliyet ve farklı yaşlı hayvanların ve radyolojik (Şekil 6), biyokimyasal ve histolojik analizlerin kullanılmasına izin veren çok yönlülük gibi çeşitli faydaları vardır. IVH'nin patofizyolojisi üzerine gelecekteki laboratuvar çalışmaları bu durum için daha iyi tedavilere yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
JMS, NIH / NINDS R01 NS110793 ve K12'den (Beyin Cerrahı Araştırma Kariyer Geliştirme Programı) finansman aldı. BAM, NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, Kentucky Üniversitesi Sinirbilim Araştırma Öncelikli Alan Ödülü ve bir Hidrosefali Derneği Yenilikçi Ödülü'nden fon aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
References
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php (2022).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
