Summary
ラットの仔を用いた新生児脳室内出血のモデルを提示し、ヒトに見られる病態を模倣した。
Abstract
新生児脳室内出血(IVH)は早産の一般的な結果であり、脳損傷、出血後水頭症(PHH)、および生涯にわたる神経学的欠損につながります。PHHは一時的および恒久的な脳脊髄液(CSF)の迂回手順(それぞれ心室リザーバーと心室腹腔シャント)で治療できますが、IVH誘発性脳損傷と水頭症を予防または治療するための薬理学的戦略はありません。IVHの病態生理学をよりよく理解し、薬理学的治療をテストするには、動物モデルが必要です。新生児IVHの既存のモデルがありますが、水頭症を確実にもたらすモデルは、大量の注射の必要性によって制限されることが多く、病状のモデリングを複雑にしたり、観察される臨床表現型の変動を引き起こしたりする可能性があります。
最近の臨床研究では、ヘモグロビンとフェリチンがIVH後の心室肥大を引き起こすことが示唆されています。ここでは、血液破壊産物ヘモグロビンの少量の脳室内注射を利用して、PHHの臨床表現型を模倣した簡単な動物モデルを開発します。このモデルは、心室肥大と水頭症を確実に誘発することに加えて、脳室周囲および白質領域に白質損傷、炎症、および免疫細胞浸潤をもたらします。この論文では、脳室内注射を使用して新生児ラットのIVH-PHHをモデル化するためのこの臨床的に関連する簡単な方法について説明し、注射後の心室サイズを定量化する方法を示します。
Introduction
新生児IVHは、発達中の脳の側脳室に隣接する急速な細胞分裂の部位である胚マトリックスに由来します。この高度に血管構造は、早産に関連する血行動態不安定性に対して脆弱である。胚基質出血(GMH)-IVHでは、胚基質内の脆弱な血管が破裂すると、血液が側脳室に放出されます。グレードIVのIVHの場合、脳室周囲出血性梗塞も脳内の血液製剤の放出に寄与する可能性があります。1 GMH-IVHの組み合わせは、特に高悪性度出血(グレードIIIおよびIV)1の後にPHHを引き起こす可能性があります。PHHは心室腹腔シャントの留置で治療できますが、シャントの留置はIVHから発生する可能性のある脳損傷を元に戻すものではありません。現代の新生児集中治療室ではIVH 2,3の発生率が低下していますが、一度発生したIVHによって引き起こされる脳損傷や水頭症に対する特定の治療法はありません。IVH誘発性脳損傷およびPHHの予防的治療法の開発における重大な制限は、IVH病態生理学の不完全な理解である。
最近、主要な血液分解産物ヘモグロビンの初期CSFレベルは、高悪性度のIVH4を有する新生児におけるPHHの後期発症と関連していることが示されている。さらに、鉄処理経路タンパク質(ヘモグロビン、フェリチン、ビリルビン)のCSFレベルは、新生児IVHの心室サイズに関連しています。これは、早産PHHの乳児の多施設コホートでも示され、フェリチンの心室CSFレベルが高いほど、心室サイズが大きくなりました5。
本研究では、脳室へのヘモグロビン注入を利用したIVH誘発性脳損傷と水頭症の臨床的関連モデルを開発し、脳損傷とPHHの定量化と新しい治療戦略の検証を可能にしました(図1)6、 7。このIVHモデルは、処置期間中全身麻酔下に置かれる新生児ラットの子犬を利用します。頭皮に正中線切開を行い、頭蓋骨のランドマーク(ブレグマまたはラムダ)に由来する座標を使用して、側脳室を注射の対象にします。輸液ポンプを使用したゆっくりとした注射は、ヘモグロビンを心室に送達します。このプロトコルは使いやすく、用途が広く、PHHをもたらすIVHのさまざまなコンポーネントをモデル化できます。
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Protocol
注:すべての動物プロトコルは、施設の動物管理および使用委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.ヘモグロビンおよびCSF溶液の調製
- 500 μLのaCSF溶液を1.5 mLマイクロチューブに加えて滅菌人工CSF(aCSF)溶液を調製し、氷上で保存します。
- 1.5 mLマイクロチューブ中の500 μLのaCSFに75 mgのヘモグロビンを加えて滅菌済みの150 mg/mLヘモグロビン溶液を調製し、氷上で保存します。
2.注射用動物の準備
- ラットの体温を維持するために、加熱パッドを中程度の設定に回します。
- 生後4日目(P4)ラットを3%イソフルランで満たされた誘導チャンバーで麻酔します。
注意: 15分ごとにつま先/尾のピンチ応答を使用して十分な麻酔を確認します。組織の色、体温、呼吸数を目視観察して麻酔を監視します。 - 麻酔をかけたラットに5 mg / kgの皮下カルプロフェン注射で痛みを和らげます。.
- 麻酔をかけたラットを定位装置に入れ、鼻を麻酔アダプターに配置し、1.5%イソフルランの一定の流れで配置します。
- 外耳道の破裂しないイヤーバーを締めて、頭を固定します。
注:注射の年齢で目が開いている場合は、目を潤いを保つために獣医軟膏を塗布してください。 - ベタジンと70%エタノールに浸した滅菌綿先端アプリケーターと交互に頭をきれいにします。
- ベタジンに浸したアプリケーターを頭皮の中心に触れ、ベタジンを円を描くように広げ、外側に移動します。
- エタノールに浸したアプリケーターで手順2.6.1.1を繰り返します。
- ステップ 2.6.1.1 とステップ 2.6.1.2 を 3 回繰り返します。
- 手術野を保護するために、滅菌手術用ドレープを適用します。
- 滅菌メスを使用して、頭の中央を垂直に0.3 cm切開し、頭蓋骨のブレグマを露出させます。
注:ラムダから注入する場合は、ブレグマの代わりに頭蓋骨のラムダを露出させます。 - 滅菌綿先端のアプリケーターを使用して、その領域を乾燥させます。
3.定位インジェクターのセットアップ
- ステップ1.2で調製したヘモグロビン溶液を30G針付きの0.3mL滅菌シリンジに引き込み、シリンジを定位インジェクターシステムに入れます。
注:制御条件を生成する場合は、手順1.1で調製したaCSF溶液を0.3 mL滅菌シリンジに引き込み、プロトコルに進みます。 - 定位インジェクターインターフェースをオンにし、 構成 ボタンをクリックして、注入量と速度の設定を入力します。
- 容量をクリックし、容量を20,000 nL(20 μL)に設定します。
- 注入速度をクリックし、 速度 を 8,000 nL /分(8 μL/分)に設定します。
- [Posのリセット]ボタンをクリックして構成を終了します。
- ヘモグロビン溶液の小さなビーズが針先に現れるまで、 Infuse ボタンをクリックして針先を洗い流します。
- 滅菌綿先端のアプリケーターで針先からヘモグロビン溶液をそっと吸い取ります。
4.動物注射
- シリンジの中外側と前後の位置を調整して定位インジェクターシステムでブレグマをゼロに設定してから、フラッシュしたシリンジ針の先端を下げてブレグマの頭蓋骨にそっと触れます。
注: ラムダから注入する場合は、 ラムダ を ゼロに設定します。 - 選択した座標を特定します。
- ブレグマから注射する場合、ここに記載の P4ラット では、 ブレグマから外側1.5 mm、前方0.4 mm、深さ2.0 mmを使用します。
- ラムダから注射する場合は、P4ラットに次の座標を使用します :ラムダから1.1 mmの外側、4.6 mm前方、および3.3 mmの深さ。
- シリンジ針を頭蓋骨から1 cm上に上げて頭皮をきれいにします。シリンジが上がったら、中外側座標と前後座標の設定に進みます。
- 注射針を下げて頭蓋骨にそっと触れます。針が頭蓋骨に触れていることを確認します。
- 背腹座標を30秒の期間に設定します。
注意: 背腹座標を設定している間、針は頭蓋骨に穴を開けます。注射器が頭蓋骨を変形させることなく頭蓋骨を通過するように注意する必要があります。頭蓋骨の変形は、変形が発生した場合に背腹座標に沿って針をゆっくりと引き抜き、同じ軌道に沿って針を戻すことで回避されます。これにより、針はより少ない力と変形なしに頭蓋骨の穴を通過することができます。 - 定位インジェクターインターフェースで、[ 実行 ]ボタンをクリックしてインジェクションを開始します。
- 注入が終了したら、溶液の逆流を最小限に抑えるために、シリンジ針を2分間そのままにします。
- 針先が頭皮から2cm上になるまで、背腹座標に沿って2分間ゆっくりと注射器を引き出します。
- 定位インジェクターアームを回転させて術野から離します。
5.術後ケア
- 6-0モノフィラメント縫合糸で頭皮を閉じます。0.3 cmの切開の中心に1つの簡単な中断縫合糸を作成します。
- 子犬を麻酔から外し、加熱パッドの安全な場所に置きます。
- げっ歯類をホームケージに戻し、ダムの世話の下で麻酔から回復します。
注:ダムのケアにタイムリーに戻ると、術後早期死亡率が低下します。 - 手術後3時間ごとに右反射が失われ、動物の麻酔を監視します。
- 通常の活動、食物摂取、および体重増加について、動物を7日間毎日監視します。手術部位での創傷治癒、閉鎖、および毛皮の再現について切開部位を監視します。
注:モニタリング中に発作、中枢性うつ病、食欲減退などの神経学的変化が観察されるまれなケースでは、麻酔下で血管内灌流または頸部脱臼を使用して動物を安楽死させます。. - 縫合糸が閉じられ、創傷が治癒した後の感染を防ぐために、切開部位に局所トリプル抗生物質を適用します。
6. MRIの取得と定量
- 4.7Tまたは9.4T小動物スキャナーでMRIを実行します。
- ラットの体温を維持するために、加熱パッドを中程度の設定に回します。
- 3%イソフルランを使用してチャンバー内で麻酔を誘発する。
注意: 15分ごとにつま先/尾のピンチ応答を使用して十分な麻酔を確認します。組織の色、体温、呼吸数を目視観察して麻酔を監視します。 - 麻酔をかけたラットをMRIにうつ伏せにして、鼻を麻酔アダプターに配置し、1.5%イソフルランの一定の流れで配置します。
- T2強調高速スピンエコーシーケンスを選択して、T2強調イメージングを実行します。
- 4.7T MRIスキャナーを使用する場合は、MRIソフトウェアに次のパラメータを入力します:繰り返し時間= 3,000ミリ秒、エコー時間= 27.50ミリ秒、平均数= 3、視野= 18.0 mm x 18.0 mm、マトリックス= 128 x 128、軸方向スライスの数= 24、厚さ= 0.50 mm。
- 9.4T MRIスキャナーを使用する場合は、MRIソフトウェアに次のパラメータを入力します:繰り返し時間= 5,000ミリ秒、エコー時間= 66.00ミリ秒、エコー間隔= 16.50ミリ秒、平均数= 2、繰り返し= 1、まれ係数= 8、視野= 16.0 mm x 16.0 mm、マトリックス= 256 x 256、軸方向スライスの数= 32、厚さ= 0.50 mm。
- [ 続行 ]ボタンをクリックして、シーケンスを開始します。
7. 画像処理・解析
- ネイティブのT2強調データを使用して、脳の体積を分析します。セグメンテーションソフトウェアを使用して、側脳室6を手動で描写します。ペイントブラシ モード をクリックして、 正方形のブラシ スタイルを選択します。ブラシサイズを 1に調整します。 [レイアウトインスペクター] をクリックし 、 軸方向ビューを選択します。 [ズーム] をクリックして合わせます。画像にカーソルを置きます。側脳室腔をトレースして埋めます。
- ツールバーの [セグメンテーション ]をクリックします |ボリュームと統計 : セグメント化されたボリュームを表示します。
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Representative Results
注射の成功は、放射線学的および免疫組織化学的手段によって確認された。ヘモグロビン注射を受けた動物は、MRIで評価すると中等度の急性心室腫大を発症し(図2A)、ヘモグロビン注射後24時間および72時間で側脳室が有意に大きくなりました(図2B、C)。注射後38日目のヘモグロビン注射動物とCSF注射動物の間で側脳室容積に有意差はありませんでしたが(図2D)、注射後38日目まで追跡されたヘモグロビン注射群の動物の44%(4/9)がこの時点で未解決の心室腫大を示したことに注意することが重要です(図2D).心室サイズのこの広い分布は、IVH-PHHの臨床経過と一致するパターンです。また、注射後38日目の時点で白質体積を定量したところ(図3)、ヘモグロビン注入群ではaCSF注入群と比較して有意に減少した(図3B)。
我々は以前、ヘモグロビン注射後に起こる急性炎症反応を詳述した研究を発表しました9。本研究では、炎症誘発性サイトカインのin vivoでの腫瘍壊死因子-α(TNFα)産生を評価し(図4)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)免疫蛍光を用いて脳室周囲および白質への免疫細胞浸潤を評価しました(図5)。生後5日目のラットの側脳室に15 μLのヘモグロビン、全血、または生理食塩水を注射すると、全血および生理食塩水と比較して、ヘモグロビン注射の3時間後に炎症誘発性サイトカインTNFαのレベルが高くなりました(図4)。ヘモグロビンを注入した動物の脳梁には、aCSFを注射した動物と比較して、有意に多くの反応性アストロサイトがありました(図5)。最後に、鉄およびフェリチンを含む他の血液分解生成物がこのように利用され、心室腫大および水頭症を確実にもたらす6,7。
図1:新生児ラットIVHモデルの実験タイムラインと概略図 。 (A)本研究で生成されたデータに用いたヘモグロビン注射とMRIタイムラインを示す模式図。(B)注射のための定位設定の概略図(左)と右側脳室へのヘモグロビン注入位置(右)。略語:IVH =脳室内出血;MRI =磁気共鳴画像法;PN = 生後 N. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脳室内出血ラットモデルにおける側脳室容積。 (A)生後4日目にaCSF(左)または150 mg / mL Hb(右)を右側脳室に脳室内注射してから24時間、72時間、および38日後のラット脳の代表的なin vivo T2コロナMRI画像。スケールバー= 1 mm。 (B-D)側脳室容積の定量化 (B)24時間、(C)72時間、および(D)aCSFまたはHb注射後38日。Hb注射された動物は、24時間および72時間で有意に大きな心室を有した。BとCのデータは平均±s.e.m.、グループあたりn = 13、対応のない両側t検定です。DのデータはSEM±平均であり、aCSF群ではn=3、Hb群ではn=9である、対応のない両側t検定である。略語:MRI =磁気共鳴画像法;PN =出生後N日目;aCSF =人工脳脊髄液;Hb =ヘモグロビン;SEM = 平均の標準誤差この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脳室内出血ラットモデルにおける白質損傷 。 (A)生後4日目にaCSF(左)または150 mg / mL Hb(右)を右側脳室に脳室内注射してから38日後のラット脳の代表的な in vivoT2 コロナMRI画像。白質は赤で囲まれています。スケールバー= 1 mm。 (B)aCSFまたはHb注入の38日後の白質体積の定量。Hb注射動物は白質体積が減少していた。 B のデータはSEM±平均値であり、aCSF群ではn=3、Hb群ではn=9である。対応のない両側 t検定。略語:MRI =磁気共鳴画像法;PN =出生後N日目;aCSF =人工脳脊髄液;Hb =ヘモグロビン;SEM = 平均の標準誤差 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヘモグロビンは、 生体内で全血よりも多くのTNFα産生を誘導します。 生後5日目のラットの側脳室に15μLのヘモグロビン、全血、または生理食塩水を投与すると、ヘモグロビン注射の3時間後に全血および生理食塩水と比較して炎症誘発性サイトカインTNFαのレベルが高くなりました。データはSEM±平均、すべてのグループでn = 4、事後テューキー検定による一元配置分散分析です。略語:Hb =ヘモグロビン;TNFα =腫瘍壊死因子-アルファ;WB =全血;ANOVA = 分散分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:側脳室へのヘモグロビン注入後の脳梁における星状細胞の 活性化。 (A)GFAP免疫染色は、生後4日目のげっ歯類の側脳室へのヘモグロビン注射が、注射後72時間後に脳梁および脳室下帯でアストロサイト活性化をもたらしたことを示しています。スケールバー = 50 μm。 (B)反応性アストロサイトの数は、ヘモグロビン注射動物では、CSF注射動物と比較して有意に増加した。データはSEM±平均値、aCSF群ではn=3、Hb群ではn=4、対応のない両側 t検定である。略語:GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;LV =側脳室;SVZ =脳室下帯;cc =脳梁;aCSF =人工脳脊髄液;Hb =ヘモグロビン;SEM = 平均の標準誤差 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:4.7Tと9.4TのMRI画質の比較 。 (A)生後4日目ラットの右側脳室へのヘモグロビン注射の72時間後に撮影された4.7Tおよび9.4T2強調MRI。スケールバー= 1 mm。略称:MRI =磁気共鳴画像法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヘモグロビン注射を利用するこのIVHモデルは、ヘモグロビンによって特異的に媒介されるIVHの病理学の研究を可能にする。補完的な研究のために、ヘモグロビンは in vitro でも簡単に送達することができ、全血中に存在するミクログリア/マクロファージによって作られたタンパク質の生化学的アッセイを混乱させません。
IVH-PHHの主要な理論には、CSF循環の機械的閉塞、上衣壁の内側を覆う繊毛の破壊、炎症、線維症、および鉄毒性が含まれます10。コラゲナーゼ誘導ラット仔モデルなどのIVHの既存の動物モデルは、細胞外マトリックスの直接損傷および破壊を介してIVHを誘導する11が、グリセロール誘発ウサギ仔モデルなどの他のモデルは、頭蓋内低血圧の効果としてIVHを誘導する12。追加のモデルは、側脳室13、 14への自家およびドナーラット血液注入を使用する。これらおよび他の既存のモデルはIVH-PHHの研究に重要な特徴を示していますが、IVH後の神経学的後遺症の発症に対する出血中に放出される血液の特定の成分の役割を考慮せずに、心室内の血液の影響に焦点を当てています。
IVH後のヘモグロビンの初期CSFレベルはPHHと関連していることが示されており、鉄代謝経路タンパク質(ヘモグロビン、フェリチン、ビリルビン)のCSFレベルはIVH後の心室サイズに関連しています4。これは、PHHの病因が、IVH中に心室に放出される血液のヘモグロビンおよび鉄成分に特異的に関連している可能性があることを示唆している。したがって、このモデルは、PHHの発生に対するヘモグロビンの役割に関する標的を絞った調査のための重要な手段を提示し、IVH後のヘモグロビンおよび鉄代謝経路を標的とする治療法のさらなる研究を可能にします。
ヒトのIVH後の心室肥大は、脳実質喪失(水頭症 exvacuoと呼ばれることもあります)または水頭症が原因である可能性があり、これはCSF圧の上昇を示します。これらのプロセスは一緒に発生する可能性があり15 、心室の変化が侵襲的な手順なしでCSF圧の増加と体積損失によるものである程度を判断するのは難しい場合があります。このモデルは、生きている動物の放射線学的に心室サイズの評価と組織学による組織損傷の評価の両方を可能にし、研究者が2つの間の関係を理解するのに役立ち、さらに重要なことに、潜在的な治療法が脳損傷をどの程度逆転させるかを評価するのに役立ちます。
伝統的に、脳の発達の種間比較は、主に死後の脳量に依存してきました。この方法で実施されたDobbingとSandsによる独創的な研究では、P7がげっ歯類の脳成長の主要な期間であると推定され、16期に生まれた人間の新生児で観察された変化に匹敵します。最近では、希突起膠細胞の成熟や血液脳関門の確立などの発生マイルストーンを比較する研究では、げっ歯類のP1〜P3は、ヒト新生児の妊娠23〜32週と類似していると定義されています17、18、19、20、21。さらに、胚マトリックスはラット22においてP7までインボリュートしない。したがって、このモデルで使用されたP4ラットは、胚マトリックスが存在する脳成熟の期間に対応し、IVH-PHHのリスクがあるヒト集団を代表すると思われる特徴を備えています。さらに、この研究におけるヘモグロビン注射後38日目の未解決の心室腫大の割合(44%)は、IVH後のPHHの臨床率(30%)に匹敵します23。
出生後のラットIVHモデルの制限には、間脳症動物の使用と、胚基質および/または脳室周囲実質への直接的な損傷の欠如が含まれます。ただし、このモデルには、優れた再現性、低コスト、さまざまな高齢動物の使用を可能にする汎用性(図6)、生化学的、および組織学的分析など、いくつかの利点があります。IVHの病態生理学に関する将来の実験室研究は、この状態のより良い治療につながる可能性があります。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
JMSは、NIH/NINDS R01 NS110793およびK12(脳神経外科医研究キャリア開発プログラム)から資金提供を受けました。BAMは、NIH / NINDS K08 NS112580-01A1、ケンタッキー大学神経科学研究優先地域賞、および 水頭症協会 イノベーター賞から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
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