Summary
We presenteren een model van neonatale intraventriculaire bloeding met rattenpups die de pathologie nabootst die bij mensen wordt gezien.
Abstract
Neonatale intraventriculaire bloeding (IVH) is een veel voorkomend gevolg van vroeggeboorte en leidt tot hersenletsel, posthemorragische hydrocephalus (PHH) en levenslange neurologische tekorten. Hoewel PHH kan worden behandeld door tijdelijke en permanente cerebrospinale vloeistof (CSF) afleidingsprocedures (respectievelijk ventriculaire reservoir en ventriculoperitoneale shunt), zijn er geen farmacologische strategieën om IVH-geïnduceerd hersenletsel en hydrocefalie te voorkomen of te behandelen. Diermodellen zijn nodig om de pathofysiologie van IVH beter te begrijpen en farmacologische behandelingen te testen. Hoewel er bestaande modellen van neonatale IVH zijn, worden die welke betrouwbaar resulteren in hydrocephalus vaak beperkt door de noodzaak van injecties met een groot volume, wat de modellering van de pathologie kan bemoeilijken of variabiliteit in het waargenomen klinische fenotype kan introduceren.
Recente klinische studies hebben hemoglobine en ferritine betrokken bij het veroorzaken van ventriculaire vergroting na IVH. Hier ontwikkelen we een eenvoudig diermodel dat het klinische fenotype van PHH nabootst met behulp van intraventriculaire injecties met een klein volume van het bloedafbraakproduct hemoglobine. Naast het betrouwbaar induceren van ventriculaire vergroting en hydrocefalie, resulteert dit model in witte stofletsel, ontsteking en immuuncelinfiltratie in periventriculaire en witte stofgebieden. Dit artikel beschrijft deze klinisch relevante, eenvoudige methode voor het modelleren van IVH-PHH bij neonatale ratten met behulp van intraventriculaire injectie en presenteert methoden voor het kwantificeren van de ventrikelgrootte na injectie.
Introduction
Neonatale IVH is afkomstig van de kiemmatrix, een plaats van snelle celdeling die grenst aan de laterale ventrikels van de zich ontwikkelende hersenen. Deze zeer vasculaire structuur is kwetsbaar voor hemodynamische instabiliteit gerelateerd aan vroeggeboorte. Bloed wordt vrijgegeven in de laterale ventrikels in germinale matrixbloeding (GMH) -IVH wanneer fragiele bloedvaten in de kiemmatrix scheuren. In het geval van graad IVH kan periventriculaire hemorragische infarct ook bijdragen aan de afgifte van bloedproducten in de hersenen. 1 De combinatie van GMH-IVH kan PHH veroorzaken, vooral na een hooggradige bloeding (graad III en IV)1. PHH kan worden behandeld met de plaatsing van een ventriculoperitoneale shunt, maar shuntplaatsing keert het hersenletsel dat kan optreden door IVH niet om. Hoewel moderne neonatale intensive care de tarieven van IVH2, 3 heeft verlaagd, zijn er geen specifieke behandelingen voor het hersenletsel of hydrocefalie veroorzaakt door IVH zodra het is opgetreden. Een belangrijke beperking bij het ontwikkelen van preventieve behandelingen voor IVH-geïnduceerd hersenletsel en PHH is het onvolledige begrip van IVH-pathofysiologie.
Onlangs is aangetoond dat vroege csf-niveaus van het belangrijkste bloedafbraakproduct hemoglobine geassocieerd zijn met de latere ontwikkeling van PHH bij pasgeborenen met hooggradige IVH4. Bovendien zijn CSF-niveaus van ijzerverwerkingsroute-eiwitten - hemoglobine, ferritine en bilirubine - geassocieerd met ventrikelgrootte bij neonatale IVH. Dit werd ook aangetoond in een multicenter cohort van zuigelingen met premature PHH, waar hogere ventriculaire CSF-niveaus van ferritine geassocieerd waren met grotere ventrikelgrootte5.
In deze studie ontwikkelden we een klinisch relevant model van IVH-geïnduceerd hersenletsel en hydrocefalie met behulp van hemoglobine-injectie in de hersenkamers, wat kwantificering van hersenletsel en PHH mogelijk maakt en het testen van nieuwe therapeutische strategieën (figuur 1) 6, 7. Dit IVH-model maakt gebruik van neonatale rattenpups, die voor de duur van de procedure onder algemene anesthesie worden geplaatst. Een middellijnincisie wordt op de hoofdhuid gemaakt en coördinaten afgeleid van schedeloriëntatiepunten - de bregma of lambda - worden gebruikt om de laterale ventrikels te richten voor injectie. Langzame injectie met behulp van een infusiepomp levert hemoglobine in de ventrikel. Dit protocol is eenvoudig te gebruiken, veelzijdig en kan verschillende componenten van IVH modelleren die resulteren in PHH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de instelling. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Bereiding van hemoglobine- en csf-oplossingen
- Bereid een steriele kunstmatige CSF (aCSF) oplossing door 500 μL van de aCSF-oplossing toe te voegen aan een microbuisje van 1,5 ml en op ijs te bewaren.
- Bereid een steriele 150 mg / ml hemoglobineoplossing door 75 mg hemoglobine toe te voegen aan 500 μL aCSF in een microbuisje van 1,5 ml en bewaar op ijs.
2. Voorbereiding van het dier voor injectie
- Draai het verwarmingskussen op de mediuminstelling om de lichaamstemperatuur van de rat te handhaven.
- Anesthetiseer postnatale dag 4 (P4) ratten in een inductiekamer gevuld met 3% isofluraan.
OPMERKING: Bevestig voldoende anesthesie met behulp van de teen / staart-knijpreactie om de 15 minuten. Controleer anesthesie met visuele observatie van weefselkleur, lichaamstemperatuur en ademhalingsfrequentie. - Dien pijnverlichting met een subcutane carprofeninjectie van 5 mg/kg toe aan de verdoofde rat.
- Plaats de verdoofde rat in het stereotactische apparaat met de neus in de anesthesieadapter met een constante stroom van 1,5% isofluraan.
- Span niet-gescheurde oorstangen op de externe auditieve meatus aan om het hoofd vast te zetten.
OPMERKING: Breng dierenartszalf aan om de ogen gehydrateerd te houden als de ogen open zijn op de leeftijd van injectie. - Reinig de kop, afgewisseld met steriele applicators met katoenpunt gedrenkt in betadine en 70% ethanol.
- Raak de met betadine doordrenkte applicator aan in het midden van de hoofdhuid en verspreid de betadine in cirkels en beweeg naar buiten.
- Herhaal stap 2.6.1.1 met de met ethanol doordrenkte applicator.
- Herhaal stap 2.6.1.1 en stap 2.6.1.2 3x.
- Breng een steriel chirurgisch gordijn aan om het chirurgische veld te beschermen.
- Maak met behulp van een steriel scalpel een incisie van 0,3 cm verticaal in het midden van het hoofd om de bregma van de schedel bloot te leggen.
OPMERKING: Als u vanuit de lambda injecteert, stel dan de lambda van de schedel bloot in plaats van de bregma. - Gebruik een steriele applicator met katoenpunt om het gebied te drogen.
3. De stereotactische injector instellen
- Trek de in stap 1.2 bereide hemoglobineoplossing in een steriele spuit van 0,3 ml met een naald van 30 G en plaats de spuit in het stereotactische injectorsysteem.
OPMERKING: Als u controleomstandigheden genereert, trekt u de in stap 1.1 bereide ACSF-oplossing in een steriele spuit van 0,3 ml en gaat u verder met het protocol. - Schakel de stereotactische injectorinterface in en klik op de knop Configuratie om het injectievolume en de snelheidsinstellingen in te voeren.
- Klik op Volume en stel het volume in op 20.000 nL (20 μL).
- Klik op Infusiesnelheid en stel de snelheid in op 8.000 nL/min (8 μL/min).
- Sluit Configuratie af door op de knop Pos opnieuw instellen te klikken.
- Spoel de naaldpunt door op de knop Infuse te klikken totdat een kleine kraal van hemoglobine-oplossing aan de naaldpunt verschijnt.
- Voer de hemoglobine-oplossing voorzichtig uit de naaldpunt met een steriele applicator met katoenen punt.
4. Dierlijke injectie
- Stel de bregma in op nul op het stereotactische injectorsysteem door de middellaterale en anteroposteriorposities van de spuit aan te passen voordat u de punt van de gespoelde spuitnaald laat zakken om de schedel voorzichtig bij de bregma aan te raken.
OPMERKING: Als u vanuit de lambda injecteert, stelt u lambda in op nul. - Identificeer de coördinaten van keuze.
- Als u injecteert vanuit de bregma, bij P4-ratten die hier worden beschreven, gebruikt u 1,5 mm lateraal, 0,4 mm voorste en 2,0 mm diep van bregma.
- Als u vanuit de lambda injecteert, gebruikt u de volgende coördinaten voor P4-ratten: 1,1 mm lateraal, 4,6 mm voorste en 3,3 mm diep van lambda.
- Til de naald van de spuit 1 cm boven de schedel op om de hoofdhuid te verwijderen. Wanneer de spuit wordt opgetild, gaat u verder met het instellen van de middellaterale en anteroposteriorcoördinaten.
- Laat de naald van de spuit zakken om de schedel voorzichtig aan te raken. Controleer of de naald de schedel raakt.
- Stel de dorsoventrale coördinaat in over een periode van 30 s.
OPMERKING: Tijdens het instellen van de dorsoventrale coördinaat zal de naald de schedel doorboren. Er moet voor worden gezorgd dat de spuit door de schedel gaat zonder de schedel te vervormen. Schedelvervorming wordt vermeden door de naald langzaam terug te trekken langs de dorsoventrale coördinaat als vervorming optreedt en vervolgens de naald langs hetzelfde traject terug te plaatsen. Hierdoor kan de naald met minder kracht en zonder vervorming door het gat in de schedel. - Klik op de stereotactische injectorinterface op de knop Uitvoeren om de injectie te starten.
- Nadat de injectie is voltooid, laat u de naald van de spuit gedurende 2 minuten op zijn plaats om de terugstroom van de oplossing te minimaliseren.
- Trek de spuit langzaam op langs de dorsoventrale coördinaat gedurende 2 minuten totdat de naaldpunt zich 2 cm boven de hoofdhuid bevindt.
- Draai de stereotactische injectorarm weg van het operatieveld.
5. Postoperatieve zorg
- Sluit de hoofdhuid met een 6-0 monofilament hechting. Maak een eenvoudige onderbroken hechting in het midden van de incisie van 0,3 cm.
- Haal de pup uit de narcose en plaats hem op een veilige plek op het verwarmingskussen.
- Breng het knaagdier terug naar de thuiskooi om te herstellen van de anesthesie onder de zorg van zijn moeder.
OPMERKING: Tijdige terugkeer naar de zorg voor de moeder vermindert vroege postoperatieve sterfte. - Controleer de dieren op anesthesie door verlies van de rechtzettingsreflex per uur na de operatie gedurende 3 uur.
- Controleer de dieren dagelijks gedurende 7 dagen voor normale activiteit, voedselinname en gewichtstoename. Controleer de incisieplaats voor wondgenezing, sluiting en terugkeer van bont op de plaats van de operatie.
OPMERKING: In het zeldzame geval dat neurologische veranderingen zoals epileptische aanvallen, centrale depressie of verminderde eetlust worden waargenomen tijdens de monitoring, euthanaseer het dier met behulp van intravasculaire perfusie of cervicale dislocatie onder anesthesie. - Om infectie te voorkomen zodra de hechting is gesloten en de wond geneest, brengt u topisch drievoudig antibioticum aan op de incisieplaats.
6. MRI-acquisitie en kwantificering
- Voer MRI uit op een 4,7T- of 9,4T-scanner voor kleine dieren.
- Draai het verwarmingskussen op de mediuminstelling om de lichaamstemperatuur van de rat te handhaven.
- Induceer anesthesie in een kamer met behulp van 3% isofluraan.
OPMERKING: Bevestig voldoende anesthesie met behulp van de teen / staart-knijpreactie om de 15 minuten. Controleer anesthesie met visuele observatie van weefselkleur, lichaamstemperatuur en ademhalingsfrequentie. - Plaats de verdoofde rat in de MRI met de neus in de anesthesieadapter met een constante stroom van 1,5% isofluraan.
- Voer T2-gewogen beeldvorming uit door een T2-gewogen snelle spin-echosequentie te selecteren.
- Als u een 4,7T MRI-scanner gebruikt, voert u de volgende parameters in de MRI-software in: herhalingstijd = 3.000 ms, echotijd = 27,50 ms, aantal gemiddelden = 3, gezichtsveld = 18,0 mm x 18,0 mm, matrix = 128 x 128, aantal axiale plakjes = 24, dikte = 0,50 mm.
- Als u een 9,4T MRI-scanner gebruikt, voert u de volgende parameters in de MRI-software in: herhalingstijd = 5.000 ms, echotijd = 66,00 ms, echoafstand = 16,50 ms, aantal gemiddelden = 2, herhalingen = 1, zeldzame factor = 8, gezichtsveld = 16,0 mm x 16,0 mm, matrix = 256 x 256, aantal axiale plakjes = 32, dikte = 0,50 mm.
- Klik op de knop Doorgaan om de reeks te starten.
7. Beeldverwerking en -analyse
- Gebruik native T2-gewogen gegevens om het hersenvolume te analyseren. Gebruik segmentatiesoftware om de laterale ventrikels handmatig af tebakenen 6. Klik op Paintbrush Mode en selecteer vierkante penseelstijl . Stel de penseelgrootte in op 1. Klik op Lay-outcontrole en selecteer de axiale weergave. Klik op zoomen om te passen. Plaats de cursor op de afbeelding; traceer en vul de laterale ventrikelruimte.
- Klik op Segmentatie in de werkbalk | Volume en statistieken om de gesegmenteerde volumes te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succes van de injectie werd bevestigd door radiologische en immunohistochemische middelen. Dieren die hemoglobine-injectie ondergingen, ontwikkelden matige acute ventriculomegalie bij beoordeling via MRI (figuur 2A), met significant grotere laterale ventrikels op 24 uur en 72 uur na hemoglobine-injectie in vergelijking met aCSF-geïnjecteerde dieren (figuur 2B, C). Hoewel er geen significant verschil was in lateraal ventrikelvolume tussen hemoglobine-geïnjecteerde en aCSF-geïnjecteerde dieren 38 dagen na injectie (figuur 2D), is het belangrijk op te merken dat 44% (4/9) van de dieren in de hemoglobine-geïnjecteerde groep die werden gevolgd tot 38 dagen na injectie op dit tijdstip onopgeloste ventriculomegalie vertoonde (figuur 2D ). Deze brede verdeling in ventrikelmaten is een patroon dat consistent is met het klinische beloop van IVH-PHH. Bovendien werd het volume van de witte stof gekwantificeerd 38 dagen na injectie (figuur 3) en was het significant afgenomen in de hemoglobine-geïnjecteerde groep in vergelijking met de aCSF-geïnjecteerde groep (figuur 3B).
We hebben eerder een studie gepubliceerd over de acute ontstekingsreactie die optreedt na hemoglobine-injectie9. In deze huidige studie werden pro-inflammatoire cytokines geëvalueerd op tumornecrosefactor-alfa (TNFα) productie in vivo (figuur 4), en immuuncelinfiltratie in de periventriculaire gebieden en witte stof werden geëvalueerd met behulp van gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) immunofluorescentie (figuur 5). Injectie van 15 μL hemoglobine, volbloed of zoutoplossing in de laterale ventrikel van postnatale dag 5 ratten resulteerde in hogere niveaus van pro-inflammatoir cytokine TNFα 3 uur na hemoglobine-injectie in vergelijking met volbloed en zoutoplossing (figuur 4). Er waren significant meer reactieve astrocyten in het corpus callosum van hemoglobine-geïnjecteerde dieren in vergelijking met aCSF-geïnjecteerde dieren (figuur 5). Ten slotte zijn andere bloedafbraakproducten op deze manier gebruikt, waaronder ijzer en ferritine om betrouwbaar te resulteren in ventriculomegalie en hydrocephalus 6,7.
Figuur 1: Experimentele tijdlijn en schematische van het neonatale rat IVH-model. (A) Schematische weergave van hemoglobine-injectie en MRI-tijdlijn die wordt gebruikt voor gegevens die in deze studie zijn gegenereerd. (B) Schematische opstelling voor injectie (links) en hemoglobine-injectielocatie in de rechter laterale ventrikel (rechts). Afkortingen: IVH = intraventriculaire bloeding; MRI = magnetische resonantie beeldvorming; PN = postnatale dag N. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Laterale ventrikelvolumes in het intraventriculaire bloedingsrattenmodel. (A) Representatieve in vivo T2 coronale MRI-beelden van rattenhersenen 24 uur, 72 uur en 38 dagen na intraventriculaire injectie van aCSF (links) of 150 mg / ml Hb (rechts) in de rechter laterale ventrikel op postnatale dag 4. Schaalstaven = 1 mm. (B-D) Kwantificering van laterale ventrikelvolumes (B) 24 uur, (C) 72 uur en (D) 38 dagen na aCSF- of Hb-injectie. Hb-geïnjecteerde dieren hadden significant grotere ventrikels na 24 uur en 72 uur. De gegevens in B en C zijn gemiddeld ± s.e.m., n = 13 per groep, ongepaarde tweestaartige t-test. Gegevens in D zijn gemiddelde ± SEM, n = 3 in aCSF-groep en n = 9 in Hb-groep, ongepaarde tweestaartige t-test. Afkortingen: MRI = magnetic resonance imaging; PN = postnatale dag N; aCSF = kunstmatige hersenvocht; Hb = hemoglobine; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Wittestofletsel in het intraventriculaire bloedingsrattenmodel. (A) Representatieve in vivo T2 coronale MRI-beelden van rattenhersenen 38 dagen na intraventriculaire injectie van aCSF (links) of 150 mg/ml Hb (rechts) in de rechter laterale ventrikel op postnatale dag 4. Witte stof is rood omlijnd. Schaalstaven = 1 mm. (B) Kwantificering van volumes witte stof 38 dagen na aCSF- of Hb-injectie. Hb-geïnjecteerde dieren hadden verminderde witte stofvolumes. Gegevens in B zijn gemiddeld ± SEM, n = 3 in aCSF-groep, n = 9 in Hb-groep. Ongepaarde tweestaartige t-test. Afkortingen: MRI = magnetic resonance imaging; PN = postnatale dag N; aCSF = kunstmatige hersenvocht; Hb = hemoglobine; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hemoglobine induceert meer TNFα-productie dan volbloed in vivo. Toediening van 15 μL hemoglobine, volbloed of zoutoplossing in de laterale ventrikel van postnatale dag 5 ratten resulteerde in hogere niveaus van het pro-inflammatoire cytokine TNFα 3 uur na hemoglobine-injectie in vergelijking met volbloed en zoutoplossing. Gegevens zijn gemiddeld ± SEM, n = 4 in alle groepen, eenrichtings-ANOVA met post-hoc Tukey's test. Afkortingen: Hb = hemoglobine; TNFα = tumornecrosefactor-alfa; WB = volbloed; ANOVA = variantieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Activering van astrocyten in het corpus callosum na hemoglobine-injectie in de laterale ventrikel. (A) GFAP-immunostaining toont hemoglobine-injectie in de laterale ventrikel van postnatale dag 4 knaagdieren resulteerde in astrocytenactivatie in het corpus callosum en subventriculaire zone 72 uur na injectie. Schaalstaven = 50 μm. (B) Het aantal reactieve astrocyten was significant verhoogd bij hemoglobine-geïnjecteerde dieren in vergelijking met aCSF-geïnjecteerde dieren. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM, n = 3 in de aCSF-groep, n = 4 in de Hb-groep, de ongepaarde tweezijdige t-test. Afkortingen: GFAP = glial fibrillary acidic protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; LV = laterale ventrikel; SVZ = subventriculaire zone; cc = corpus callosum; aCSF = kunstmatige hersenvocht; Hb = hemoglobine; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Vergelijking van 4,7T en 9,4T MRI-beeldkwaliteit. (A) 4,7T en 9,4T T2-gewogen MRI genomen 72 uur na hemoglobine-injectie in de rechter laterale ventrikel van postnatale dag 4 ratten. Schaalstaven = 1 mm. Afkorting: MRI = magnetic resonance imaging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit IVH-model met behulp van hemoglobine-injectie maakt de studie mogelijk van de pathologie van IVH specifiek gemedieerd door hemoglobine. Voor complementaire studies kan hemoglobine ook gemakkelijk in vitro worden toegediend en verstoort het geen biochemische testen voor eiwitten gemaakt door microglia / macrofagen die aanwezig zijn in volbloed.
De leidende theorieën van IVH-PHH omvatten de mechanische obstructie van de CSF-circulatie, de verstoring van trilharen langs de ependymale wanden, ontsteking, fibrose en ijzertoxiciteit10. Bestaande diermodellen voor IVH zoals het collagenase-geïnduceerde rattenjongmodel induceren IVH door direct letsel en verstoring van de extracellulaire matrix11, terwijl andere zoals het door glycerol geïnduceerde konijnenjongmodel IVH induceren als een effect van intracraniale hypotensie12. Aanvullende modellen gebruiken autologe en donorrattenbloedinjectie in de laterale ventrikels13, 14. Hoewel deze en andere bestaande modellen belangrijke kenmerken vertonen voor de studie van IVH-PHH, richten ze zich op de impact van bloed in de ventrikel zonder rekening te houden met de rol van specifieke componenten van het bloed die vrijkomen tijdens bloeding op de ontwikkeling van neurologische gevolgen na IVH.
Vroege CSF-niveaus van hemoglobine na IVH zijn geassocieerd met PHH, en CSF-niveaus van ijzermetabolismeroute-eiwitten - hemoglobine, ferritine en bilirubine - zijn geassocieerd met ventrikelgrootte na IVH4. Dit suggereert dat de pathogenese van PHH specifiek kan worden geassocieerd met de hemoglobine- en ijzercomponenten van het bloed dat tijdens IVH in de ventrikels wordt vrijgegeven. Dit model presenteert dus een belangrijke weg voor gericht onderzoek naar de rol van hemoglobine op de ontwikkeling van PHH en maakt verdere studies mogelijk naar therapeutica gericht op hemoglobine- en ijzermetabolismeroutes na IVH.
Ventriculaire vergroting na IVH bij de mens kan te wijten zijn aan hersenparenchymaal verlies (soms hydrocephalus ex vacuo genoemd) of hydrocephalus, wat wijst op verhoogde CSF-druk. Deze processen kunnen samen optreden15 en het kan moeilijk zijn om te bepalen in hoeverre ventriculaire veranderingen te wijten zijn aan verhoogde CSF-druk versus volumeverlies zonder invasieve procedures. Dit model, dat zowel de beoordeling van de ventriculaire grootte radiologisch bij levende dieren als de beoordeling van weefselbeschadiging via histologie mogelijk maakt, kan onderzoekers helpen de relatie tussen de twee te begrijpen en, nog belangrijker, te beoordelen in hoeverre potentiële therapieën hersenletsel omkeren.
Traditioneel zijn interspecies vergelijkingen van hersenontwikkeling voornamelijk gebaseerd op postmortale hersenmassa. Een baanbrekende studie door Dobbing en Sands uitgevoerd met deze methode schatte P7 als een belangrijke periode van hersengroei bij knaagdieren, vergelijkbaar met de veranderingen waargenomen bij menselijke pasgeborenen geboren op termijn16. Meer recent hebben studies die ontwikkelingsmijlpalen vergelijken, zoals oligodendrocytenrijping en vestiging van de bloed-hersenbarrière, P1-P3 bij knaagdieren gedefinieerd als analoog aan 23-32 weken zwangerschap bij menselijke pasgeborenen 17,18,19,20,21. Bovendien involueert de kiemmatrix niet tot P7 bij ratten22. Daarom komen de P4-ratten die in dit model worden gebruikt overeen met een periode van hersenrijping waarin de kiemmatrix aanwezig is, met kenmerken waarvan wij denken dat ze representatief zijn voor de menselijke populatie die risico loopt op IVH-PHH. Bovendien is de snelheid van onopgeloste ventriculomegalie 38 dagen na hemoglobine-injectie in deze studie (44%) vergelijkbaar met klinische percentages phh na IVH (30%)23.
Beperkingen van ons postnatale rat IVH-model omvatten het gebruik van een lissencefalisch dier en het ontbreken van direct letsel aan de kiemmatrix en/of periventriculaire parenchym. Dit model heeft echter verschillende voordelen, waaronder een goede reproduceerbaarheid, lage kosten en veelzijdigheid die het gebruik van verschillende oudere dieren en radiologische (figuur 6), biochemische en histologische analyses mogelijk maakt. Toekomstig laboratoriumwerk aan de pathofysiologie van IVH kan leiden tot betere behandelingen voor deze aandoening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
JMS ontving financiering van NIH / NINDS R01 NS110793 en K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM ontving financiering van NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award en een Hydrocephalus Association Innovator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
References
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php (2022).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B.
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
