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Neuroscience

Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63345
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 1, 3, 3, 2, 3,4,5
1Department of Neurosurgery, University of Kentucky, 2Department of Pediatric Surgery, University of Texas, 3Department of Neurological Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 4Department of Orthopedic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis School of Medicine

Summary

Nous présentons un modèle d’hémorragie intraventriculaire néonatale utilisant des ratons qui imite la pathologie observée chez l’homme.

Abstract

L’hémorragie intraventriculaire néonatale (hémorragie intraventriculaire) est une conséquence fréquente de la naissance prématurée et entraîne des lésions cérébrales, une hydrocéphalie posthémorragique (HPH) et des déficits neurologiques à vie. Bien que l’HPH puisse être traitée par des procédures temporaires et permanentes de dérivation du liquide céphalorachidien (LCR) (réservoir ventriculaire et shunt ventriculopéritonéal, respectivement), il n’existe aucune stratégie pharmacologique pour prévenir ou traiter les lésions cérébrales et l’hydrocéphalie induites par l’hémorragie intraveineuse. Des modèles animaux sont nécessaires pour mieux comprendre la physiopathologie de l’hémorragie intraveineuse et tester les traitements pharmacologiques. Bien qu’il existe des modèles d’hémorragie intranatale néonatale, ceux qui entraînent de manière fiable une hydrocéphalie sont souvent limités par la nécessité d’injections de grand volume, ce qui peut compliquer la modélisation de la pathologie ou introduire une variabilité dans le phénotype clinique observé.

Des études cliniques récentes ont impliqué l’hémoglobine et la ferritine dans l’hypertrophie ventriculaire après une hémorragie intraveineuse. Ici, nous développons un modèle animal simple qui imite le phénotype clinique de PHH en utilisant des injections intraventriculaires de petit volume de l’hémoglobine, produit de dégradation du sang. En plus d’induire de manière fiable l’élargissement ventriculaire et l’hydrocéphalie, ce modèle entraîne des lésions de la substance blanche, une inflammation et une infiltration de cellules immunitaires dans les régions périventriculaires et de la substance blanche. Cet article décrit cette méthode simple et cliniquement pertinente pour modéliser l’HPH-IV chez les rats néonatals par injection intraventriculaire et présente des méthodes pour quantifier la taille du ventricule après l’injection.

Introduction

L’hémorragie intranatale néonatale provient de la matrice germinale, un site de division cellulaire rapide adjacent aux ventricules latéraux du cerveau en développement. Cette structure hautement vasculaire est vulnérable à l’instabilité hémodynamique liée à une naissance prématurée. Le sang est libéré dans les ventricules latéraux lors de l’hémorragie de la matrice germinale (GMH)-IVH lorsque des vaisseaux sanguins fragiles dans la matrice germinale se rompent. Dans le cas de l’hémorragie de grade IV, l’infarctus hémorragique périventriculaire peut également contribuer à la libération de produits sanguins dans le cerveau. 1 L’association GMH-IVH peut provoquer une HTP, en particulier après une hémorragie de haut grade (grades III et IV)1. L’HPH peut être traitée avec la mise en place d’un shunt ventriculopéritonéal, mais la mise en place d’un shunt n’inverse pas la lésion cérébrale qui peut survenir à partir de l’hémorragie intraveineuse. Bien que les soins intensifs néonatals modernes aient réduit les taux d’HVN2, 3, il n’existe aucun traitement spécifique pour la lésion cérébrale ou l’hydrocéphalie causée par l’hémorragie intraveineuse une fois qu’elle s’est produite. Une limitation importante dans le développement de traitements préventifs pour les lésions cérébrales induites par l’HIV et l’HPH est la compréhension incomplète de la physiopathologie de l’HVN.

Récemment, il a été démontré que les taux précoces de LCR de l’hémoglobine, produit clé de dégradation du sang, étaient associés au développement ultérieur de l’HPH chez les nouveau-nés atteints d’HVN de haut grade4. De plus, les taux de LCR de protéines de la voie de traitement du fer – hémoglobine, ferritine et bilirubine – sont associés à la taille du ventricule dans l’hémorragie intranatale néonatale. Cela a également été montré dans une cohorte multicentrique de nourrissons atteints d’HPH prématurée, où des taux de ferritine ventriculaire plus élevés dans le LCR étaient associés à une taille de ventricule plus grande5.

Dans cette étude, nous avons développé un modèle cliniquement pertinent de lésion cérébrale et d’hydrocéphalie induite par l’hémoglobine en utilisant l’injection d’hémoglobine dans les ventricules cérébraux, ce qui permet de quantifier les lésions cérébrales et l’HPH et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques (Figure 1)6, 7. Ce modèle d’hémorragie intraveineuse utilise des ratons nouveau-nés, qui sont placés sous anesthésie générale pendant toute la durée de la procédure. Une incision médiane est pratiquée sur le cuir chevelu et les coordonnées dérivées des repères du crâne – le bregma ou lambda – sont utilisées pour cibler les ventricules latéraux pour l’injection. L’injection lente à l’aide d’une pompe à perfusion délivre de l’hémoglobine dans le ventricule. Ce protocole est facile à utiliser, polyvalent et peut modéliser différents composants de l’HIV qui aboutissent à l’HPH.

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Protocol

REMARQUE : Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux des établissements. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Préparation de solutions d’hémoglobine et de LCR

  1. Préparer une solution artificielle stérile de LCR (aLCR) en ajoutant 500 μL de la solution de LCRa à un microtube de 1,5 mL et conserver sur de la glace.
  2. Préparer une solution stérile d’hémoglobine à 150 mg/mL en ajoutant 75 mg d’hémoglobine à 500 μL de LCRa dans un microtube de 1,5 mL et conserver sur de la glace.

2. Préparation de l’animal pour injection

  1. Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.
  2. Anesthésier les rats du jour 4 postnatal (P4) dans une chambre d’induction remplie d’isoflurane à 3 %.
    REMARQUE : Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse de pincement des orteils et de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.
  3. Administrer un soulagement de la douleur avec une injection sous-cutanée de carprofène de 5 mg/kg au rat anesthésié.
  4. Placez le rat anesthésié couché dans l’appareil stéréotaxique avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant d’isoflurane à 1,5%.
  5. Serrez les barres auriculaires anti-rupture sur le méat auditif externe pour sécuriser la tête.
    REMARQUE: Appliquez une pommade vétérinaire pour garder les yeux hydratés si les yeux sont ouverts au moment de l’injection.
  6. Nettoyez la tête en alternant avec des applicateurs stériles à embout de coton imbibés de bétadine et d’éthanol à 70%.
    1. Touchez l’applicateur imbibé de bétadine au centre du cuir chevelu et étalez la bétadine en cercles, en vous déplaçant vers l’extérieur.
    2. Répétez l’étape 2.6.1.1 avec l’applicateur imbibé d’éthanol.
    3. Répétez l’étape 2.6.1.1 et l’étape 2.6.1.2 3x.
  7. Appliquez un champ chirurgical stérile pour protéger le champ chirurgical.
  8. À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision verticale de 0,3 cm au centre de la tête pour exposer le bregma du crâne.
    REMARQUE: Si vous injectez à partir du lambda, exposez le lambda du crâne au lieu du bregma.
  9. Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour sécher la zone.

3. Mise en place de l’injecteur stéréotaxique

  1. Prélever la solution d’hémoglobine préparée à l’étape 1.2 dans une seringue stérile de 0,3 mL à l’aide d’une aiguille 30G et placer la seringue dans le système d’injection stéréotaxique.
    REMARQUE : Si vous générez des conditions de contrôle, aspirer une solution de LCR préparée à l’étape 1.1 dans une seringue stérile de 0,3 mL et suivre le protocole.
  2. Allumez l’interface de l’injecteur stéréotaxique et cliquez sur le bouton Configuration pour entrer les paramètres de volume et de débit d’injection.
    1. Cliquez sur Volume et réglez le volume à 20 000 nL (20 μL).
    2. Cliquez sur Débit de perfusion et réglez le débit à 8 000 nL/min (8 μL/min).
  3. Quittez la configuration en cliquant sur le bouton Réinitialiser le PDV.
  4. Rincez l’extrémité de l’aiguille en cliquant sur le bouton Infuser jusqu’à ce qu’un petit cordon de solution d’hémoglobine émerge à l’extrémité de l’aiguille.
  5. Évacuez doucement la solution d’hémoglobine de l’extrémité de l’aiguille avec un applicateur stérile à embout de coton.

4. Injection animale

  1. Réglez le bregma à zéro sur le système d’injection stéréotaxique en ajustant les positions médiolatérale et antéropostérieure de la seringue avant d’abaisser l’extrémité de l’aiguille de la seringue rincée pour toucher doucement le crâne au niveau du bregma.
    REMARQUE : Si vous effectuez une injection à partir du lambda, définissez lambda sur zéro.
  2. Identifiez les coordonnées de votre choix.
    1. En cas d’injection à partir du bregma, chez les rats P4 décrits ici, utiliser 1,5 mm latéral, 0,4 mm antérieur et 2,0 mm de profondeur à partir de bregma.
    2. En cas d’injection à partir du lambda, utilisez les coordonnées suivantes pour les rats P4 : 1,1 mm latéral, 4,6 mm antérieur et 3,3 mm de profondeur à partir du lambda.
  3. Soulevez l’aiguille de la seringue à 1 cm au-dessus du crâne pour dégager le cuir chevelu. Lorsque la seringue est soulevée, procédez au réglage des coordonnées médiolatérales et antéropostérieures.
  4. Abaissez l’aiguille de la seringue pour toucher doucement le crâne. Vérifiez que l’aiguille touche le crâne.
  5. Réglez la coordonnée dorso-ventrale sur une période de 30 s.
    REMARQUE: Lors du réglage de la coordonnée dorso-ventrale, l’aiguille percera le crâne. Il faut veiller à ce que la seringue traverse le crâne sans déformer le crâne. La déformation du crâne est évitée en retirant lentement l’aiguille le long de la coordonnée dorso-ventrale si une déformation se produit, puis en replaçant l’aiguille le long de la même trajectoire. Cela permet à l’aiguille de passer à travers le trou dans le crâne avec moins de force et sans déformation.
  6. Sur l’interface de l’injecteur stéréotaxique, cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l’injection.
  7. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille de la seringue en place pendant 2 minutes pour minimiser le reflux de la solution.
  8. Retirer lentement la seringue le long de la coordonnée dorso-ventrale pendant 2 min jusqu’à ce que l’extrémité de l’aiguille soit à 2 cm au-dessus du cuir chevelu.
  9. Faites pivoter le bras de l’injecteur stéréotaxique loin du champ opératoire.

5. Soins postopératoires

  1. Fermez le cuir chevelu avec une suture monofilament 6-0. Faites une simple suture interrompue au centre de l’incision de 0,3 cm.
  2. Retirez le chiot de l’anesthésie et placez-le dans un endroit sûr du coussin chauffant.
  3. Retourner le rongeur dans la cage de la maison pour se remettre de l’anesthésie sous la garde de sa mère.
    REMARQUE : Le retour rapide aux soins de la mère réduit la mortalité postopératoire précoce.
  4. Surveiller les animaux pour l’anesthésie en perdant le réflexe de redressement toutes les heures après la chirurgie pendant 3 heures.
  5. Surveillez les animaux quotidiennement pendant 7 jours pour une activité normale, un apport alimentaire et un gain de poids. Surveillez le site d’incision pour la cicatrisation, la fermeture et la réapparition de la fourrure au site de la chirurgie.
    REMARQUE : Dans les rares cas où des changements neurologiques tels que des convulsions, une dépression centrale ou une diminution de l’appétit sont observés pendant la surveillance, euthanasier l’animal en utilisant une perfusion intravasculaire ou une luxation cervicale sous anesthésie.
  6. Pour prévenir l’infection une fois que la suture est fermée et que la plaie guérit, appliquez un triple antibiotique topique au site d’incision.

6. Acquisition et quantification de l’IRM

  1. Effectuez une IRM sur un scanner pour petits animaux de 4,7 T ou 9,4 T.
  2. Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.
  3. Induire l’anesthésie dans une chambre en utilisant 3% d’isoflurane.
    REMARQUE : Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse de pincement des orteils et de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.
  4. Placez le rat anesthésié couché dans l’IRM avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant de 1,5% d’isoflurane.
  5. Effectuez une imagerie pondérée T2 en sélectionnant une séquence d’écho de rotation rapide pondérée T2.
    1. Si vous utilisez un scanner IRM 4,7T, entrez les paramètres suivants dans le logiciel IRM : temps de répétition = 3 000 ms, temps d’écho = 27,50 ms, nombre de moyennes = 3, champ de vision = 18,0 mm x 18,0 mm, matrice = 128 x 128, nombre de tranches axiales = 24, épaisseur = 0,50 mm.
    2. Si vous utilisez un scanner IRM 9,4T, entrez les paramètres suivants dans le logiciel IRM : temps de répétition = 5 000 ms, temps d’écho = 66,00 ms, espacement des échos = 16,50 ms, nombre de moyennes = 2, répétitions = 1, facteur rare = 8, champ de vision = 16,0 mm x 16,0 mm, matrice = 256 x 256, nombre de tranches axiales = 32, épaisseur = 0,50 mm.
  6. Cliquez sur le bouton Continuer pour démarrer la séquence.

7. Traitement et analyse d’images

  1. Utilisez des données natives pondérées en T2 pour analyser le volume cérébral. Utilisez un logiciel de segmentation pour délimiter manuellement les ventricules latéraux6. Cliquez sur Mode pinceau et sélectionnez le style de pinceau carré . Ajustez la taille du pinceau à 1. Cliquez sur Inspecteur de mise en page et sélectionnez Vue axiale. Cliquez sur zoom pour l’ajuster. Placez le curseur sur l’image; tracer et remplir l’espace ventricule latéral.
  2. Cliquez sur Segmentation dans la barre d’outils | Volume et statistiques pour afficher les volumes segmentés.

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Representative Results

Le succès de l’injection a été confirmé par des moyens radiologiques et immunohistochimiques. Les animaux ayant reçu une injection d’hémoglobine ont développé une ventriculomégalie aiguë modérée lors de l’évaluation par IRM (figure 2A), avec des ventricules latéraux significativement plus grands à 24 h et 72 h après l’injection d’hémoglobine par rapport aux animaux injectés par aLCR (figure 2B,C). Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative dans le volume du ventricule latéral entre les animaux ayant reçu une injection d’hémoglobine et un aLCR 38 jours après l’injection (figure 2D), il est important de noter que 44 % (4/9) des animaux du groupe ayant reçu une injection d’hémoglobine qui ont été suivis jusqu’à 38 jours après l’injection présentaient une ventriculomégalie non résolue à ce moment (figure 2D ). Cette large distribution dans la taille des ventricules est un modèle qui est cohérent avec l’évolution clinique de l’HHV-HPV. De plus, le volume de substance blanche a été quantifié 38 jours après l’injection (Figure 3) et a été significativement diminué dans le groupe où l’hémoglobine a été injectée par rapport au groupe injecté par aLCR (Figure 3B).

Nous avons précédemment publié une étude détaillant la réaction inflammatoire aiguë qui se produit après l’injection d’hémoglobine9. Dans cette étude, les cytokines pro-inflammatoires ont été évaluées pour la production in vivo de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) (Figure 4), et l’infiltration des cellules immunitaires dans les zones périventriculaires et la substance blanche a été évaluée à l’aide de l’immunofluorescence de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) (Figure 5). L’injection de 15 μL d’hémoglobine, de sang total ou de solution saline dans le ventricule latéral de rats postnataux du jour 5 a entraîné des taux plus élevés de cytokine pro-inflammatoire TNFα 3 h après l’injection d’hémoglobine par rapport au sang total et à la solution saline (Figure 4). Il y avait significativement plus d’astrocytes réactifs dans le corps calleux des animaux injectés de l’hémoglobine que des animaux injectés par aLCR (Figure 5). Enfin, d’autres produits de dégradation du sang ont été utilisés de cette manière, notamment le fer et la ferritine, pour entraîner de manière fiable une ventriculomégalie et une hydrocéphalie 6,7.

Figure 1
Figure 1 : Chronologie expérimentale et schéma du modèle d’hémorragie intraveineuse chez le rat nouveau-né. (A) Schéma montrant l’injection d’hémoglobine et le calendrier d’IRM utilisés pour les données générées dans cette étude. (B) Schéma de la configuration stéréotaxique pour l’injection (à gauche) et de l’emplacement de l’injection d’hémoglobine dans le ventricule latéral droit (à droite). Abréviations : IVH = hémorragie intraventriculaire; IRM = imagerie par résonance magnétique; PN = jour postnatal N. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Volumes des ventricules latéraux dans le modèle d’hémorragie intraventriculaire chez le rat. (A) Images IRM coronales T2 in vivo représentatives de cerveaux de rats 24 heures, 72 h et 38 jours après l’injection intraventriculaire d’aLCR (gauche) ou de 150 mg/mL d’Hb (à droite) dans le ventricule latéral droit au jour 4 postnatal. Barres d’échelle = 1 mm. (B-D) Quantification des volumes ventricules latéraux (B) 24 h, (C) 72 h et (D) 38 jours après l’injection d’aLCR ou d’Hb. Les animaux injectés d’Hb avaient des ventricules significativement plus gros à 24 h et 72 h. Les données en B et C sont des moyennes ± s.e.m., n = 13 par groupe, test t bilatéral non apparié. Les données dans D sont des moyennes ± SEM, n = 3 dans le groupe aCSF et n = 9 dans le groupe Hb, test t bilatéral non apparié. Abréviations : IRM = imagerie par résonance magnétique; NP = jour N postnatal; aCSF = liquide céphalorachidien artificiel; Hb = hémoglobine; SEM = erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Lésion de la substance blanche dans le modèle d’hémorragie intraventriculaire chez le rat. (A) Images IRM coronales T2 in vivo représentatives de cerveaux de rats 38 jours après l’injection intraventriculaire d’aLCR (à gauche) ou de 150 mg/mL d’Hb (à droite) dans le ventricule latéral droit au jour 4 postnatal. La matière blanche est soulignée en rouge. Barres d’échelle = 1 mm. (B) Quantification des volumes de substance blanche 38 jours après l’injection d’aLCR ou d’Hb. Les animaux injectés d’Hb présentaient une diminution des volumes de substance blanche. Les données dans B sont moyennes ± SEM, n = 3 dans le groupe aCSF, n = 9 dans le groupe Hb. Test t bilatéral non apparié. Abréviations : IRM = imagerie par résonance magnétique; NP = jour N postnatal; aCSF = liquide céphalorachidien artificiel; Hb = hémoglobine; SEM = erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : L’hémoglobine induit plus de production de TNFα que le sang total in vivo. L’administration de 15 μL d’hémoglobine, de sang total ou de solution saline dans le ventricule latéral de rats postnataux du jour 5 a entraîné des niveaux plus élevés de la cytokine pro-inflammatoire TNFα 3 h après l’injection d’hémoglobine par rapport au sang total et à la solution saline. Les données sont moyennes ± SEM, n = 4 dans tous les groupes, ANOVA unidirectionnelle avec test de Tukey post-hoc. Abréviations : Hb = hémoglobine; TNFα = facteur de nécrose tumorale alpha; WB = sang total; ANOVA = analyse de la variance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Activation des astrocytes dans le corps calleux après injection d’hémoglobine dans le ventricule latéral. (A) L’immunomarquage au GFAP montre que l’injection d’hémoglobine dans le ventricule latéral de rongeurs postnatals du jour 4 a entraîné l’activation des astrocytes dans le corps calleux et la zone sous-ventriculaire 72 heures après l’injection. Barres d’échelle = 50 μm. (B) Le nombre d’astrocytes réactifs a été significativement augmenté chez les animaux injectés dans l’hémoglobine par rapport aux animaux injectés par aLCR. Les données sont des moyennes ± SEM, n = 3 dans le groupe aCSF, n = 4 dans le groupe Hb, test t bilatéral non apparié. Abréviations : GFAP = protéine acide fibrillaire gliale; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; VG = ventricule latéral; SVZ = zone sous-ventriculaire; cc = corps calleux; aCSF = liquide céphalorachidien artificiel; Hb = hémoglobine; SEM = erreur type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Comparaison de la qualité d’image IRM 4.7T et 9.4T. (A) IRM pondérée en T2 4,7T et 9,4T prise 72 heures après l’injection d’hémoglobine dans le ventricule latéral droit de rats postnataux du jour 4. Barres d’échelle = 1 mm. Abréviation : IRM = imagerie par résonance magnétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce modèle d’hémoglobine utilisant l’injection d’hémoglobine permet l’étude de la pathologie de l’hémoglobine intraveineuse spécifiquement médiée par l’hémoglobine. Pour les études complémentaires, l’hémoglobine peut également être facilement administrée in vitro et ne confond pas les tests biochimiques pour les protéines fabriquées par les microglies / macrophages présents dans le sang total.

Les principales théories de l’HNV-PHH comprennent l’obstruction mécanique de la circulation du LCR, la perturbation des cils tapissant les parois épendymaires, l’inflammation, la fibrose et la toxicité du fer10. Les modèles animaux existants pour l’hémorragie intracrânienne, tels que le modèle de ratons induit par la collagénase, induisent l’hémorragie intracellulaire par une lésion directe et une perturbation de la matrice extracellulaire11, tandis que d’autres, tels que le modèle de lapin induit par le glycérol, induisent l’hémorragie intracrânienne en tant qu’effet de l’hypotension intracrânienne12. D’autres modèles utilisent l’injection de sang de rat autologue et de donneur dans les ventricules latéraux13, 14. Bien que ces modèles et d’autres modèles existants présentent des caractéristiques importantes pour l’étude de l’HHV-HPV, ils se concentrent sur l’impact du sang dans le ventricule sans tenir compte du rôle des composants spécifiques du sang libéré lors d’une hémorragie sur le développement des séquelles neurologiques après l’hémorragie intraveineuse.

Il a été démontré que les taux précoces d’hémoglobine dans le LCR après l’HHV sont associés à l’HPH, et les taux de LCR des protéines de la voie du métabolisme du fer – hémoglobine, ferritine et bilirubine – sont associés à la taille du ventricule après l’HVN4. Cela suggère que la pathogenèse de PHH peut être associée spécifiquement aux composants hémoglobine et fer du sang libérés dans les ventricules pendant l’hémorragie intraveineuse. Ainsi, ce modèle présente une avenue importante pour l’investigation ciblée du rôle de l’hémoglobine sur le développement de l’HPH et permet d’autres études thérapeutiques ciblant les voies du métabolisme de l’hémoglobine et du fer après une hémorragie intraveineuse.

L’élargissement ventriculaire après une hémorragie intraveineuse chez l’homme peut être dû à une perte parenchymateuse cérébrale (parfois appelée hydrocéphalie ex vacuo) ou à une hydrocéphalie, ce qui indique une augmentation de la pression du LCR. Ces processus peuvent se produire ensemble15 et il peut être difficile de déterminer dans quelle mesure les changements ventriculaires sont dus à une augmentation de la pression du LCR par rapport à la perte de volume sans procédures invasives. Ce modèle, qui permet à la fois l’évaluation radiologique de la taille ventriculaire chez les animaux vivants et l’évaluation des lésions tissulaires par histologie, peut aider les chercheurs à comprendre la relation entre les deux et, plus important encore, à évaluer dans quelle mesure les thérapies potentielles inversent les lésions cérébrales.

Traditionnellement, les comparaisons interspécifiques du développement du cerveau reposaient principalement sur la masse cérébrale post-mortem. Une étude séminale de Dobbing et Sands menée avec cette méthode a estimé que P7 était une période majeure de croissance cérébrale chez les rongeurs, comparable aux changements observés chez les nouveau-nés humains nés à terme16. Plus récemment, des études comparant des étapes du développement telles que la maturation des oligodendrocytes et l’établissement de la barrière hémato-encéphalique ont défini P1-P3 chez les rongeurs comme étant analogue à 23-32 semaines de gestation chez les nouveau-nés humains 17,18,19,20,21. De plus, la matrice germinale n’involue pas avant P7 chez le rat22. Par conséquent, les rats P4 utilisés dans ce modèle correspondent à une période de maturation cérébrale dans laquelle la matrice germinale est présente, avec des caractéristiques que nous croyons représentatives de la population humaine à risque d’HPH-IVH. De plus, le taux de ventriculomégalie non résolue 38 jours après l’injection d’hémoglobine dans cette étude (44 %) est comparable aux taux cliniques d’HPH après une hémoglobine intraveineuse (30 %)23.

Les limites de notre modèle d’hémorragie intraveineuse postnatale chez le rat comprennent l’utilisation d’un animal lissencéphale et l’absence de lésions directes de la matrice germinale et/ou du parenchyme périventriculaire. Cependant, ce modèle présente plusieurs avantages, notamment une bonne reproductibilité, un faible coût et une polyvalence qui permet l’utilisation d’animaux d’âge différent et des analyses radiologiques (Figure 6), biochimiques et histologiques. Les futurs travaux de laboratoire sur la physiopathologie de l’hémorragie intraveineuse pourraient conduire à de meilleurs traitements pour cette maladie.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

JMS a reçu un financement des NIH/NINDS R01 NS110793 et K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM a reçu un financement du NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, du prix du domaine prioritaire de recherche en neurosciences de l’Université du Kentucky et du prix de l’innovation de l’Hydrocephalus Association .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3 mL insulin syringe BD Microfine + Insulin Syringe 230-4533 0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube USA Scientific 1615-5500 Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI Agilent/Varian 4.7T/33 cm Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture ETHICON 667G
9.4T MRI Bruker BioSpec 94/20 Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance CCURIS Instruments W3200-320
Artificial CSF (aCSF) Tocris Bioscience 3525 Batch No: 72A
Betadine Purdue Products L.P. 301005-00 NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable) Zoetis Inc.  PI 4019448 Rimadyl
Ethanol Decon Laboratories 2701
Heating pad Sunbeam E12107-819 UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin MP Biomedicals 100714 LOT NO. SR02321
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer VETEQUIP 911103
Light for stereotactic insturment Dolan-Jenner industries Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump World Precision Instruments MICRO21 Serial 184034 T08K
MRI software Bruker BioSpin Paravision 360 3.2
Oxygen Airgas Healthcare UN1072 LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats Charles River Laboratories Strain code: 001
Stereotactic instrument KOPF Instuments Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator Fischerbrand 23-400-118
Surgical blade covetrus #10
Topical triple antibiotic Triple Antibiotic Ointment NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software ITK-SNAP ITK-SNAP 4.0.0 beta

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References

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Neurosciences numéro 186
Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine
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Miller, B. A., Pan, S., Yang, P. H., … More

Miller, B. A., Pan, S., Yang, P. H., Wang, C., Trout, A. L., DeFreitas, D., Ramagiri, S., Olson, S. D., Strahle, J. M. Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin. J. Vis. Exp. (186), e63345, doi:10.3791/63345 (2022).

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