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Neuroscience

Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63345
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 1, 3, 3, 2, 3,4,5
1Department of Neurosurgery, University of Kentucky, 2Department of Pediatric Surgery, University of Texas, 3Department of Neurological Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 4Department of Orthopedic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis School of Medicine

Summary

Presentamos un modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando crías de rata que imita la patología observada en humanos.

Abstract

La hemorragia intraventricular neonatal (Hiv) es una consecuencia común del nacimiento prematuro y conduce a lesión cerebral, hidrocefalia poshemorrágica (HPH) y déficits neurológicos de por vida. Si bien la PHH se puede tratar mediante procedimientos de derivación temporal y permanente del líquido cefalorraquídeo (LCR) (reservorio ventricular y derivación ventriculoperitoneal, respectivamente), no existen estrategias farmacológicas para prevenir o tratar la lesión cerebral inducida por la hemorragia intraventricular y la hidrocefalia. Se necesitan modelos animales para comprender mejor la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y probar tratamientos farmacológicos. Si bien existen modelos de Hiv neonatal, aquellos que resultan confiablemente en hidrocefalia a menudo están limitados por la necesidad de inyecciones de gran volumen, lo que puede complicar el modelado de la patología o introducir variabilidad en el fenotipo clínico observado.

Estudios clínicos recientes han implicado a la hemoglobina y la ferritina en causar agrandamiento ventricular después de la hemorragia intraventricular. Aquí, desarrollamos un modelo animal sencillo que imita el fenotipo clínico de PHH utilizando inyecciones intraventriculares de pequeño volumen del producto de degradación sanguínea hemoglobina. Además de inducir de manera confiable el agrandamiento ventricular y la hidrocefalia, este modelo produce lesiones en la sustancia blanca, inflamación e infiltración de células inmunes en regiones periventriculares y de la sustancia blanca. Este artículo describe este método simple y clínicamente relevante para modelar la HPH-IVH en ratas neonatas mediante inyección intraventricular y presenta métodos para cuantificar el tamaño del ventrículo después de la inyección.

Introduction

La hemorragia intraventricular neonatal se origina en la matriz germinal, un sitio de división celular rápida que se encuentra adyacente a los ventrículos laterales del cerebro en desarrollo. Esta estructura altamente vascular es vulnerable a la inestabilidad hemodinámica relacionada con el nacimiento prematuro. La sangre se libera en los ventrículos laterales en la hemorragia de la matriz germinal (GMH)-FIV cuando los vasos sanguíneos frágiles dentro de la matriz germinal se rompen. En el caso de la Hiv de grado IV, el infarto hemorrágico periventricular también puede contribuir a la liberación de productos sanguíneos dentro del cerebro. 1 La combinación de GMH-IVH puede causar PHH, particularmente después de hemorragia de alto grado (grados III y IV)1. La PHH se puede tratar con la colocación de una derivación ventriculoperitoneal, pero la colocación de la derivación no revierte la lesión cerebral que puede ocurrir por la IVH. Aunque los cuidados intensivos neonatales modernos han reducido las tasas de Hiv2, 3, no existen tratamientos específicos para la lesión cerebral o hidrocefalia causada por la Hiv una vez que ha ocurrido. Una limitación significativa en el desarrollo de tratamientos preventivos para la lesión cerebral inducida por IVH y PHH es la comprensión incompleta de la fisiopatología de la IVH.

Recientemente, se ha demostrado que los niveles tempranos de LCR del producto clave de degradación sanguínea hemoglobina están asociados con el desarrollo posterior de PHH en neonatos con HVI4 de alto grado. Además, los niveles de LCR de proteínas de la vía de manipulación del hierro (hemoglobina, ferritina y bilirrubina) se asocian con el tamaño del ventrículo en la Hiv neonatal. Esto también se demostró en una cohorte multicéntrica de lactantes con PHH prematura, donde los niveles más altos de ferritina en el LCR ventricular se asociaron con un tamaño de ventrículo5 más grande.

En este estudio, desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por IVH e hidrocefalia utilizando inyección de hemoglobina en los ventrículos cerebrales, lo que permite la cuantificación de la lesión cerebral y la PHH y la prueba de nuevas estrategias terapéuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo de IVH utiliza cachorros de rata neonatal, que se colocan bajo anestesia general durante la duración del procedimiento. Se realiza una incisión en la línea media en el cuero cabelludo y se utilizan coordenadas derivadas de los puntos de referencia del cráneo, el bregma o lambda, para apuntar a los ventrículos laterales para la inyección. La inyección lenta con una bomba de infusión libera hemoglobina en el ventrículo. Este protocolo es fácil de usar, versátil y puede modelar diferentes componentes de IVH que resultan en PHH.

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Protocol

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de las instituciones. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Preparación de soluciones de hemoglobina y LCR

  1. Prepare una solución artificial estéril de LCR (aCSF) agregando 500 μL de la solución de aCSF a un microtubo de 1,5 ml y guárdela en hielo.
  2. Prepare una solución estéril de hemoglobina de 150 mg/ml agregando 75 mg de hemoglobina a 500 μL de aCSF en un microtubo de 1,5 ml y guárdela en hielo.

2. Preparación del animal para inyección

  1. Gire la almohadilla térmica a la configuración media para mantener la temperatura corporal de la rata.
  2. Anestesiar ratas postnatales del día 4 (P4) en una cámara de inducción llena de isoflurano al 3%.
    NOTA: Confirme la anestesia suficiente usando la respuesta de pellizco del dedo del pie / cola cada 15 minutos. Monitoree la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.
  3. Administrar alivio del dolor con una inyección subcutánea de carprofeno de 5 mg/kg a la rata anestesiada.
  4. Coloque la rata anestesiada propensa en el aparato estereotáctico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.
  5. Apriete las barras auditivas sin ruptura en el meato auditivo externo para asegurar la cabeza.
    NOTA: Aplique ungüento veterinario para mantener los ojos hidratados si los ojos están abiertos a la edad de la inyección.
  6. Limpie el cabezal, alternando con aplicadores estériles con punta de algodón empapados en betadina y etanol al 70%.
    1. Toque el aplicador empapado en betadina en el centro del cuero cabelludo y extienda la betadina en círculos, moviéndose hacia afuera.
    2. Repita el paso 2.6.1.1 con el aplicador empapado en etanol.
    3. Repita los pasos 2.6.1.1 y 2.6.1.2 3x.
  7. Aplique una cortina quirúrgica estéril para proteger el campo quirúrgico.
  8. Usando un bisturí estéril, haga una incisión de 0,3 cm verticalmente por el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo.
    NOTA: Si inyecta desde la lambda, exponga la lambda del cráneo en lugar de la bregma.
  9. Use un aplicador estéril con punta de algodón para secar el área.

3. Configuración del inyector estereotáctico

  1. Extraiga la solución de hemoglobina preparada en el paso 1.2 en una jeringa estéril de 0,3 ml con una aguja de 30 G y coloque la jeringa en el sistema de inyección estereotáctica.
    NOTA: Si genera condiciones de control, extraiga una solución de LCR preparada en el paso 1.1 en una jeringa estéril de 0,3 ml y proceda con el protocolo.
  2. Encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón Configuración para ingresar los ajustes de volumen y velocidad de inyección.
    1. Haga clic en Volumen y establezca el volumen en 20.000 nL (20 μL).
    2. Haga clic en Velocidad de infusión y establezca la velocidad en 8.000 nL /min (8 μL/min).
  3. Salga de Configuración haciendo clic en el botón Restablecer punto de venta.
  4. Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón Infundir hasta que surja una pequeña gota de solución de hemoglobina en la punta de la aguja.
  5. Absorba suavemente la solución de hemoglobina de la punta de la aguja con un aplicador estéril con punta de algodón.

4. Inyección animal

  1. Coloque el bregma como cero en el sistema de inyección estereotáctica ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa antes de bajar la punta de la aguja de la jeringa enrojecida para tocar suavemente el cráneo en el bregma.
    NOTA: Si inyecta desde lambda, establezca lambda como cero.
  2. Identifique las coordenadas de su elección.
    1. Si inyecta desde el bregma, en ratas P4 descritas aquí, use 1.5 mm lateral, 0.4 mm anterior y 2.0 mm de profundidad de bregma.
    2. Si inyecta desde la lambda, use las siguientes coordenadas para ratas P4: 1.1 mm lateral, 4.6 mm anterior y 3.3 mm de profundidad desde lambda.
  3. Levante la aguja de la jeringa 1 cm por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Cuando se levante la jeringa, proceda a establecer las coordenadas mediolateral y anteroposterior.
  4. Baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo. Compruebe que la aguja está tocando el cráneo.
  5. Establezca la coordenada dorsoventral durante un período de 30 s.
    NOTA: Al ajustar la coordenada dorsoventral, la aguja perforará el cráneo. Se debe tener cuidado para asegurar que la jeringa pase a través del cráneo sin deformar el cráneo. La deformación del cráneo se evita retirando lentamente la aguja a lo largo de la coordenada dorsoventral si se produce deformación, y luego colocando la aguja de nuevo a lo largo de la misma trayectoria. Esto permite que la aguja pase a través del orificio en el cráneo con menos fuerza y sin deformación.
  6. En la interfaz del inyector estereotáctico, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la inyección.
  7. Una vez finalizada la inyección, deje la aguja de la jeringa en su lugar durante 2 minutos para minimizar el reflujo de la solución.
  8. Extraiga la jeringa lentamente a lo largo de la coordenada dorsoventral durante 2 minutos hasta que la punta de la aguja esté 2 cm por encima del cuero cabelludo.
  9. Gire el brazo del inyector estereotáctico lejos del campo operatorio.

5. Cuidados postoperatorios

  1. Cierre el cuero cabelludo con una sutura de monofilamento 6-0. Haga una sutura interrumpida simple en el centro de la incisión de 0,3 cm.
  2. Retire al cachorro de la anestesia y colóquelo en un área segura en la almohadilla térmica.
  3. Devuelva el roedor a la jaula de la casa para recuperarse de la anestesia bajo el cuidado de su madre.
    NOTA: El retorno oportuno al cuidado de la presa reduce la mortalidad postoperatoria temprana.
  4. Monitoree a los animales para la anestesia mediante la pérdida del reflejo de enderezamiento cada hora después de la cirugía durante 3 h.
  5. Controle a los animales diariamente durante 7 días para la actividad normal, la ingesta de alimentos y el aumento de peso. Controle el sitio de la incisión para la cicatrización de heridas, el cierre y la reaparición del pelaje en el sitio de la cirugía.
    NOTA: En el raro caso de que se observen cambios neurológicos como convulsiones, depresión central o disminución del apetito durante el monitoreo, eutanasia al animal usando perfusión intravascular o dislocación cervical bajo anestesia.
  6. Para prevenir la infección una vez que la sutura está cerrada y la herida está sanando, aplique triple antibiótico tópico en el sitio de la incisión.

6. Adquisición y cuantificación de MRI

  1. Realice una resonancia magnética en un escáner de animales pequeños de 4.7T o 9.4T.
  2. Gire la almohadilla térmica a la configuración media para mantener la temperatura corporal de la rata.
  3. Inducir la anestesia en una cámara utilizando isoflurano al 3%.
    NOTA: Confirme la anestesia suficiente usando la respuesta de pellizco del dedo del pie / cola cada 15 minutos. Monitoree la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.
  4. Coloque la rata anestesiada propensa en la resonancia magnética con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.
  5. Realice imágenes ponderadas en T2 seleccionando una secuencia de eco de giro rápido ponderada en T2.
    1. Si utiliza un escáner de resonancia magnética de 4,7 T, introduzca los siguientes parámetros en el software de resonancia magnética: tiempo de repetición = 3.000 ms, tiempo de eco = 27,50 ms, número de promedios = 3, campo de visión = 18,0 mm x 18,0 mm, matriz = 128 x 128, número de cortes axiales = 24, espesor = 0,50 mm.
    2. Si utiliza un escáner de resonancia magnética de 9,4T, introduzca los siguientes parámetros en el software de resonancia magnética: tiempo de repetición = 5.000 ms, tiempo de eco = 66,00 ms, espaciado de eco = 16,50 ms, número de promedios = 2, repeticiones = 1, factor raro = 8, campo de visión = 16,0 mm x 16,0 mm, matriz = 256 x 256, número de cortes axiales = 32, grosor = 0,50 mm.
  6. Haga clic en el botón Continuar para iniciar la secuencia.

7. Procesamiento y análisis de imágenes

  1. Utilice datos nativos ponderados en T2 para analizar el volumen cerebral. Utilice software de segmentación para delinear manualmente los ventrículos laterales6. Haga clic en Modo Pincel y seleccione el estilo de pincel cuadrado . Ajuste el tamaño del pincel a 1. Haga clic en Inspector de diseño y seleccione vista axial. Haga clic en zoom para ajustar. Coloque el cursor sobre la imagen; Trazar y llenar el espacio del ventrículo lateral.
  2. Haga clic en Segmentación en la barra de herramientas | Volumen y estadísticas para ver los volúmenes segmentados.

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Representative Results

El éxito de la inyección se confirmó por medios radiológicos e inmunohistoquímicos. Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia aguda moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética (Figura 2A), con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 h y 72 h después de la inyección de hemoglobina en comparación con los animales inyectados en LCR (Figura 2B, C). Si bien no hubo diferencias significativas en el volumen del ventrículo lateral entre los animales inyectados con hemoglobina y los inyectados con LCR 38 días después de la inyección (Figura 2D), es importante tener en cuenta que el 44% (4/9) de los animales en el grupo inyectado con hemoglobina que fueron seguidos hasta 38 días después de la inyección mostraron ventriculomegalia no resuelta en este punto temporal (Figura 2D ). Esta amplia distribución en los tamaños de los ventrículos es un patrón que es consistente con el curso clínico de la HPV-IVH. Además, el volumen de sustancia blanca se cuantificó a los 38 días después de la inyección (Figura 3) y disminuyó significativamente en el grupo inyectado con hemoglobina en comparación con el grupo inyectado con LCR (Figura 3B).

Anteriormente publicamos un estudio que detalla la reacción inflamatoria aguda que ocurre después de la inyección de hemoglobina9. En este estudio, las citocinas proinflamatorias fueron evaluadas para la producción in vivo del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) (Figura 4), y la infiltración de células inmunes en las áreas periventriculares y la sustancia blanca se evaluaron utilizando inmunofluorescencia de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Figura 5). La inyección de 15 μL de hemoglobina, sangre total o solución salina en el ventrículo lateral de ratas postnatales del día 5 dio como resultado niveles más altos de citoquina proinflamatoria TNFα 3 h después de la inyección de hemoglobina en comparación con sangre total y solución salina (Figura 4). Hubo significativamente más astrocitos reactivos en el cuerpo calloso de los animales inyectados con hemoglobina en comparación con los animales inyectados con LCR (Figura 5). Finalmente, otros productos de degradación de la sangre se han utilizado de esta manera, incluyendo hierro y ferritina para producir de manera confiable ventriculomegalia e hidrocefalia 6,7.

Figure 1
Figura 1: Línea de tiempo experimental y esquema del modelo de hemorragia intraventricular en rata neonatal . (A) Esquema que muestra la inyección de hemoglobina y la línea de tiempo de resonancia magnética utilizada para los datos generados en este estudio. (B) Esquema de la configuración estereotáctica para la inyección (izquierda) y la ubicación de la inyección de hemoglobina en el ventrículo lateral derecho (derecha). Abreviaturas: IVH = hemorragia intraventricular; RM = resonancia magnética; PN = día postnatal N. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Volúmenes del ventrículo lateral en el modelo de rata con hemorragia intraventricular. (A) Imágenes representativas in vivo de resonancia magnética coronal T2 de cerebros de ratas 24 h, 72 h y 38 días después de la inyección intraventricular de aCSF (izquierda) o 150 mg / ml Hb (derecha) en el ventrículo lateral derecho en el día postnatal 4. Barras de escala = 1 mm. (B-D) Cuantificación de los volúmenes del ventrículo lateral (B) 24 h, (C) 72 h y (D) 38 días después de la inyección de aCSF o Hb. Los animales inyectados con Hb tenían ventrículos significativamente más grandes a las 24 h y 72 h. Los datos en B y C son medias ± s.e.m., n = 13 por grupo, prueba t de dos colas no pareada. Los datos en D son la media ± SEM, n = 3 en el grupo aCSF y n = 9 en el grupo Hb, prueba t de dos colas no pareada. Abreviaturas: MRI = resonancia magnética; NP = día N postnatal; aCSF = líquido cefalorraquídeo artificial; Hb = hemoglobina; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Lesión de la sustancia blanca en el modelo de rata con hemorragia intraventricular. (A) Imágenes representativas de resonancia magnética coronal T2 in vivo de cerebros de ratas 38 días después de la inyección intraventricular de aCSF (izquierda) o 150 mg / ml Hb (derecha) en el ventrículo lateral derecho en el día postnatal 4. La materia blanca está delineada en rojo. Barras de escala = 1 mm. (B) Cuantificación de volúmenes de sustancia blanca 38 días después de la inyección de aCSF o Hb. Los animales inyectados con Hb habían disminuido los volúmenes de materia blanca. Los datos en B son medias ± SEM, n = 3 en el grupo aCSF, n = 9 en el grupo Hb. Prueba t de dos colas no pareada. Abreviaturas: MRI = resonancia magnética; NP = día N postnatal; aCSF = líquido cefalorraquídeo artificial; Hb = hemoglobina; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La hemoglobina induce más producción de TNFα que la sangre entera in vivo. La administración de 15 μL de hemoglobina, sangre total o solución salina en el ventrículo lateral de ratas postnatales del día 5 dio lugar a niveles más altos de la citoquina proinflamatoria TNFα 3 h después de la inyección de hemoglobina en comparación con sangre total y solución salina. Los datos son media ± SEM, n = 4 en todos los grupos, ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post-hoc. Abreviaturas: Hb = hemoglobina; TNFα = factor de necrosis tumoral alfa; WB = sangre total; ANOVA = análisis de varianza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Activación de astrocitos en el cuerpo calloso después de la inyección de hemoglobina en el ventrículo lateral. (A) La inmunotinción GFAP muestra que la inyección de hemoglobina en el ventrículo lateral de roedores postnatales del día 4 resultó en la activación de astrocitos en el cuerpo calloso y la zona subventricular 72 h después de la inyección. Barras de escala = 50 μm. (B) El número de astrocitos reactivos aumentó significativamente en los animales inyectados con hemoglobina en comparación con los animales inyectados con LCR. Los datos son la media ± SEM, n = 3 en el grupo de LCCa, n = 4 en el grupo de Hb, prueba t de dos colas no pareada. Abreviaturas: GFAP = proteína ácida fibrilar glial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; VI = ventrículo lateral; SVZ = zona subventricular; cc = cuerpo calloso; aCSF = líquido cefalorraquídeo artificial; Hb = hemoglobina; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Comparación de la calidad de imagen de resonancia magnética de 4.7T y 9.4T. (A) Resonancia magnética ponderada en T2 de 4,7T y 9,4T tomada 72 h después de la inyección de hemoglobina en el ventrículo lateral derecho de ratas postnatales del día 4. Barras de escala = 1 mm. Abreviatura: MRI = resonancia magnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este modelo de Hiv que utiliza inyección de hemoglobina permite el estudio de la patología de la Hiv específicamente mediada por la hemoglobina. Para estudios complementarios, la hemoglobina también se puede administrar fácilmente in vitro y no confunde los ensayos bioquímicos para proteínas producidas por microglia / macrófagos que están presentes en la sangre total.

Las principales teorías de IVH-PHH incluyen la obstrucción mecánica de la circulación del LCR, la interrupción de los cilios que recubren las paredes ependimarias, la inflamación, la fibrosis y la toxicidad del hierro10. Los modelos animales existentes para la Hiv, como el modelo de cría de rata inducida por colagenasa, inducen la Hiv a través de la lesión directa y la interrupción de la matriz extracelular11, mientras que otros, como el modelo de cría de conejo inducida por glicerol, inducen la Hiv como efecto de la hipotensión intracraneal12. Modelos adicionales utilizan inyección de sangre de rata autóloga y donante en los ventrículos laterales13, 14. Si bien estos y otros modelos existentes presentan características importantes para el estudio de la HPI, se centran en el impacto de la sangre dentro del ventrículo sin considerar el papel de los componentes específicos de la sangre liberada durante la hemorragia en el desarrollo de secuelas neurológicas después de la hemorragia.

Se ha demostrado que los niveles tempranos de hemoglobina en LCR después de la hemorragia intraventricular están asociados con la HPH, y los niveles en LCR de las proteínas de la vía del metabolismo del hierro (hemoglobina, ferritina y bilirrubina) se asocian con el tamaño del ventrículo después de la hemorragia intraventricular4. Esto sugiere que la patogénesis de la PHH puede estar asociada específicamente con los componentes de hemoglobina y hierro de la sangre liberada en los ventrículos durante la hemorragia intraventricular. Por lo tanto, este modelo presenta una vía importante para la investigación dirigida sobre el papel de la hemoglobina en el desarrollo de PHH y permite estudios adicionales sobre terapias dirigidas a las vías del metabolismo de la hemoglobina y el hierro después de la IVH.

El agrandamiento ventricular después de la hemorragia intraventricular en humanos puede deberse a la pérdida del parénquima cerebral (a veces denominada hidrocefalia ex vacuo) o hidrocefalia, lo que indica un aumento de la presión sobre el LCR. Estos procesos pueden ocurrir juntos15 y puede ser difícil determinar en qué medida los cambios ventriculares se deben al aumento de la presión del LCR frente a la pérdida de volumen sin procedimientos invasivos. Este modelo, que permite tanto la evaluación radiológica del tamaño ventricular en animales vivos como la evaluación de la lesión tisular a través de la histología, puede ayudar a los investigadores a comprender la relación entre los dos y, lo que es más importante, evaluar en qué medida las terapias potenciales revierten la lesión cerebral.

Tradicionalmente, las comparaciones entre especies del desarrollo del cerebro se han basado principalmente en la masa cerebral postmortem. Un estudio seminal realizado por Dobbing y Sands con este método estimó que P7 es un período importante de crecimiento cerebral en roedores, comparable a los cambios observados en neonatos humanos nacidos a término16. Más recientemente, estudios que comparan hitos del desarrollo como la maduración de oligodendrocitos y el establecimiento de la barrera hematoencefálica han definido que P1-P3 en roedores es análogo a las 23-32 semanas de gestación en neonatos humanos 17,18,19,20,21. Además, la matriz germinal no involuciona hasta P7 en ratas22. Por lo tanto, las ratas P4 utilizadas en este modelo corresponden a un período de maduración cerebral en el que está presente la matriz germinal, con características que creemos que son representativas de la población humana en riesgo de HPV. Además, la tasa de ventriculomegalia no resuelta a los 38 días después de la inyección de hemoglobina en este estudio (44%) es comparable con las tasas clínicas de HPH después de la hemorragia intraventricular (30%)23.

Las limitaciones de nuestro modelo postnatal de HVI en ratas incluyen el uso de un animal lisencefálico y la falta de lesión directa a la matriz germinal y / o parénquima periventricular. Sin embargo, este modelo tiene varios beneficios que incluyen buena reproducibilidad, bajo costo y versatilidad que permite el uso de diferentes animales envejecidos y análisis radiológicos (Figura 6), bioquímicos e histológicos. El trabajo de laboratorio futuro sobre la fisiopatología de la hemorragia intraventricular puede conducir a mejores tratamientos para esta afección.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

JMS recibió fondos de NIH/NINDS R01 NS110793 y K12 (Programa de Desarrollo de Carrera de Investigación de Neurocirujanos). BAM recibió fondos de NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, Premio al Área Prioritaria de Investigación de Neurociencia de la Universidad de Kentucky y un Premio al Innovador de la Asociación de Hidrocefalia .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3 mL insulin syringe BD Microfine + Insulin Syringe 230-4533 0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube USA Scientific 1615-5500 Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI Agilent/Varian 4.7T/33 cm Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture ETHICON 667G
9.4T MRI Bruker BioSpec 94/20 Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance CCURIS Instruments W3200-320
Artificial CSF (aCSF) Tocris Bioscience 3525 Batch No: 72A
Betadine Purdue Products L.P. 301005-00 NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable) Zoetis Inc.  PI 4019448 Rimadyl
Ethanol Decon Laboratories 2701
Heating pad Sunbeam E12107-819 UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin MP Biomedicals 100714 LOT NO. SR02321
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer VETEQUIP 911103
Light for stereotactic insturment Dolan-Jenner industries Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump World Precision Instruments MICRO21 Serial 184034 T08K
MRI software Bruker BioSpin Paravision 360 3.2
Oxygen Airgas Healthcare UN1072 LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats Charles River Laboratories Strain code: 001
Stereotactic instrument KOPF Instuments Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator Fischerbrand 23-400-118
Surgical blade covetrus #10
Topical triple antibiotic Triple Antibiotic Ointment NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software ITK-SNAP ITK-SNAP 4.0.0 beta

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociencia Número 186
Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina
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Miller, B. A., Pan, S., Yang, P. H., … More

Miller, B. A., Pan, S., Yang, P. H., Wang, C., Trout, A. L., DeFreitas, D., Ramagiri, S., Olson, S. D., Strahle, J. M. Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin. J. Vis. Exp. (186), e63345, doi:10.3791/63345 (2022).

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