Summary
Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.
Abstract
A hemorragia intraventricular neonatal (IVH) é uma consequência comum do parto prematuro e leva a lesão cerebral, hidrocefalia pós-hemorrágica (HPH) e déficits neurológicos ao longo da vida. Embora a PHH possa ser tratada por procedimentos de desvio temporários e permanentes do líquido cefalorraquidiano (LCR) (reservatório ventricular e shunt ventriculoperitoneal, respectivamente), não há estratégias farmacológicas para prevenir ou tratar lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia. Modelos animais são necessários para entender melhor a fisiopatologia da IVH e testar tratamentos farmacológicos. Embora existam modelos existentes de HVI neonatal, aqueles que resultam de forma confiável em hidrocefalia são frequentemente limitados pela necessidade de injeções de grande volume, o que pode complicar a modelagem da patologia ou introduzir variabilidade no fenótipo clínico observado.
Estudos clínicos recentes implicaram hemoglobina e ferritina na causa de aumento ventricular após IVH. Aqui, desenvolvemos um modelo animal simples que imita o fenótipo clínico da PHH utilizando injeções intraventriculares de pequeno volume do produto de degradação do sangue hemoglobina. Além de induzir de forma confiável o aumento ventricular e a hidrocefalia, esse modelo resulta em lesão da substância branca, inflamação e infiltração de células imunes nas regiões periventricular e da substância branca. Este trabalho descreve este método clinicamente relevante e simples para modelar a HPH-IV em ratos neonatais usando injeção intraventricular e apresenta métodos para quantificar o tamanho do ventrículo após a injeção.
Introduction
A IVH neonatal origina-se da matriz germinativa, um local de rápida divisão celular adjacente aos ventrículos laterais do cérebro em desenvolvimento. Essa estrutura altamente vascular é vulnerável à instabilidade hemodinâmica relacionada ao parto prematuro. O sangue é liberado nos ventrículos laterais na hemorragia da matriz germinativa (GMH)-IVH quando os vasos sanguíneos frágeis dentro da matriz germinativa se rompem. No caso da IV IV de grau IV, o infarto hemorrágico periventricular também pode contribuir para a liberação de hemoderivados dentro do cérebro. 1 A combinação de GMH-IVH pode causar HPH, particularmente após hemorragia de alto grau (graus III e IV)1. A HPH pode ser tratada com a colocação de um shunt ventriculoperitoneal, mas a colocação do shunt não reverte a lesão cerebral que pode ocorrer a partir da IVH. Embora a terapia intensiva neonatal moderna tenha reduzido as taxas de IVH2, 3, não há tratamentos específicos para a lesão cerebral ou hidrocefalia causada pela IVH uma vez que tenha ocorrido. Uma limitação significativa no desenvolvimento de tratamentos preventivos para lesão cerebral induzida por HIV e HPH é a compreensão incompleta da fisiopatologia da HIV.
Recentemente, os níveis iniciais do LCR de hemoglobina de produto chave de degradação do sangue demonstraram estar associados ao desenvolvimento posterior de PHH em neonatos com IVH de alto grau4. Além disso, os níveis de proteínas da via de manipulação de ferro no LCR – hemoglobina, ferritina e bilirrubina – estão associados ao tamanho do ventrículo na IVH neonatal. Isso também foi demonstrado em uma coorte multicêntrica de lactentes com HPH pré-termo, onde níveis mais elevados de ferritina no LCR ventricular foram associados a um tamanho maior do ventrículo5.
Neste estudo, desenvolvemos um modelo clinicamente relevante de lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia utilizando injeção de hemoglobina nos ventrículos cerebrais, que permite quantificar a lesão cerebral e a HPH e testar novas estratégias terapêuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo IVH utiliza filhotes de ratos neonatais, que são colocados sob anestesia geral durante o procedimento. Uma incisão na linha média é feita no couro cabeludo, e coordenadas derivadas de marcos do crânio - o bregma ou lambda - são usadas para atingir os ventrículos laterais para injeção. A injeção lenta usando uma bomba de infusão fornece hemoglobina no ventrículo. Este protocolo é fácil de usar, versátil e pode modelar diferentes componentes da IVH que resultam em PHH.
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Protocol
NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais das instituições. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo.
1. Preparação de soluções de hemoglobina e LCR
- Preparar uma solução estéril de LCR artificial (aCSF) adicionando 500 μL da solução de aCSF a um microtubo de 1,5 ml e conservar em gelo.
- Preparar uma solução estéril de hemoglobina de 150 mg/mL adicionando 75 mg de hemoglobina a 500 μL de aCSF em um microtubo de 1,5 mL e armazenar no gelo.
2. Preparação do animal para injeção
- Gire a almofada de aquecimento para a configuração média para manter a temperatura corporal do rato.
- Anestesiar ratos pós-natais do dia 4 (P4) em uma câmara de indução preenchida com isoflurano a 3%.
NOTA: Confirme anestesia suficiente usando a resposta dedo do pé/pinça da cauda a cada 15 minutos. Monitore a anestesia com observação visual da cor do tecido, temperatura corporal e frequência respiratória. - Administrar alívio da dor com uma injeção subcutânea de carprofeno de 5 mg/kg no rato anestesiado.
- Colocar o rato anestesiado propenso no aparelho estereotáxico com o nariz posicionado no adaptador anestésico com fluxo constante de isoflurano a 1,5%.
- Aperte as barras auriculares não rupturas no conduto auditivo externo para prender a cabeça.
NOTA: Aplique pomada veterinária para manter os olhos hidratados se os olhos estiverem abertos na idade da injeção. - Limpe a cabeça, alternando com aplicadores estéreis com ponta de algodão embebidos em betadina e etanol a 70%.
- Toque o aplicador embebido em betadine no centro do couro cabeludo e espalhe o betadine em círculos, movendo-se para fora.
- Repetir o passo 2.6.1.1 com o aplicador embebido em etanol.
- Repita a etapa 2.6.1.1 e a etapa 2.6.1.2 3x.
- Aplique uma cortina cirúrgica estéril para proteger o campo cirúrgico.
- Usando um bisturi estéril, faça uma incisão de 0,3 cm verticalmente no centro da cabeça para expor o bregma do crânio.
NOTA: Se injetar a partir do lambda, exponha o lambda do crânio em vez do bregma. - Use um aplicador estéril com ponta de algodão para secar a área.
3. Configuração do injetor estereotáxico
- Retirar a solução de hemoglobina preparada no passo 1.2 para uma seringa estéril de 0,3 ml com uma agulha de 30G e colocar a seringa no sistema injetor estereotáxico.
NOTA: Se gerar condições de controlo, retire uma solução de CSF preparada no passo 1.1 para uma seringa estéril de 0,3 ml e prossiga com o protocolo. - Ative a interface do injetor estereotáxico e clique no botão Configuração para inserir as configurações de volume e taxa de injeção.
- Clique em Volume e defina o volume em 20.000 nL (20 μL).
- Clique em Taxa de infusão e defina a taxa em 8.000 nL /min (8 μL/min).
- Saia da Configuração clicando no botão Redefinir Pós.
- Lave a ponta da agulha clicando no botão Infundir até que uma pequena gota de solução de hemoglobina surja na ponta da agulha.
- Tire suavemente a solução de hemoglobina da ponta da agulha com um aplicador estéril com ponta de algodão.
4. Injeção animal
- Defina o bregma como zero no sistema injetor estereotáxico ajustando as posições mediolateral e anteroposterior da seringa antes de abaixar a ponta da agulha da seringa lavada para tocar suavemente o crânio no bregma.
NOTA: Se injetar a partir do lambda, defina lambda como zero. - Identifique as coordenadas de escolha.
- Se injetar a partir do bregma, em ratos P4 aqui descritos , use 1,5 mm lateral, 0,4 mm anterior e 2,0 mm de profundidade do bregma.
- Se injetar a partir do lambda, use as seguintes coordenadas para ratos P4: 1,1 mm lateral, 4,6 mm anterior e 3,3 mm de profundidade do lambda.
- Levante a agulha da seringa 1 cm acima do crânio para limpar o couro cabeludo. Quando a seringa estiver levantada, proceda à definição das coordenadas mediolateral e anteroposterior.
- Abaixe a agulha da seringa para tocar suavemente o crânio. Verifique se a agulha está tocando o crânio.
- Defina a coordenada dorsoventral ao longo de um período de 30 s.
NOTA: Ao definir a coordenada dorsoventral, a agulha perfurará o crânio. Deve-se tomar cuidado para garantir que a seringa passe pelo crânio sem deformar o crânio. A deformação do crânio é evitada retirando lentamente a agulha ao longo da coordenada dorsoventral se ocorrer deformação e, em seguida, colocando a agulha de volta ao longo da mesma trajetória. Isso permite que a agulha passe através do orifício no crânio com menos força e sem deformação. - Na interface do injetor estereotáxico, clique no botão Executar para iniciar a injeção.
- Após o término da injeção, deixe a agulha da seringa no lugar por 2 minutos para minimizar o refluxo da solução.
- Retire a seringa lentamente ao longo da coordenada dorsoventral durante 2 minutos até que a ponta da agulha esteja 2 cm acima do couro cabeludo.
- Gire o braço injetor estereotáxico para longe do campo operatório.
5. Cuidados pós-operatórios
- Feche o couro cabeludo com uma sutura de monofilamento 6-0. Faça uma sutura simples interrompida no centro da incisão de 0,3 cm.
- Retire o filhote da anestesia e coloque-o em uma área segura na almofada de aquecimento.
- Devolva o roedor à gaiola de casa para se recuperar da anestesia sob os cuidados de sua represa.
NOTA: O retorno oportuno aos cuidados da barragem reduz a mortalidade pós-operatória precoce. - Monitorar os animais para anestesia por perda do reflexo de endireitamento de hora em hora após a cirurgia por 3 h.
- Monitore os animais diariamente por 7 dias para atividade normal, ingestão de alimentos e ganho de peso. Monitore o local da incisão para cicatrização, fechamento e reaparecimento de pelos no local da cirurgia.
NOTA: No caso raro de alterações neurológicas, como convulsões, depressão central ou diminuição do apetite, serem observadas durante o monitoramento, eutanasie o animal usando perfusão intravascular ou luxação cervical sob anestesia. - Para prevenir a infecção, uma vez que a sutura é fechada e a ferida está cicatrizando, aplique antibiótico triplo tópico no local da incisão.
6. Aquisição e quantificação por RM
- Faça ressonância magnética em um scanner de pequenos animais de 4,7T ou 9,4T.
- Gire a almofada de aquecimento para a configuração média para manter a temperatura corporal do rato.
- Induzir anestesia em uma câmara usando isoflurano a 3%.
NOTA: Confirme anestesia suficiente usando a resposta dedo do pé/pinça da cauda a cada 15 minutos. Monitore a anestesia com observação visual da cor do tecido, temperatura corporal e frequência respiratória. - Coloque o rato anestesiado propenso na RM com o nariz posicionado no adaptador anestésico com fluxo constante de isoflurano a 1,5%.
- Realize imagens ponderadas em T2 selecionando uma sequência de eco de spin rápido ponderada em T2.
- Se estiver usando um scanner de RM de 4,7T, insira os seguintes parâmetros no software de RM: tempo de repetição = 3.000 ms, tempo de eco = 27,50 ms, número de médias = 3, campo de visão = 18,0 mm x 18,0 mm, matriz = 128 x 128, número de cortes axiais = 24, espessura = 0,50 mm.
- Se estiver usando um scanner de ressonância magnética de 9,4T, insira os seguintes parâmetros no software de RM: tempo de repetição = 5.000 ms, tempo de eco = 66,00 ms, espaçamento de eco = 16,50 ms, número de médias = 2, repetições = 1, fator raro = 8, campo de visão = 16,0 mm x 16,0 mm, matriz = 256 x 256, número de cortes axiais = 32, espessura = 0,50 mm.
- Clique no botão Continuar para iniciar a sequência.
7. Processamento e análise de imagens
- Use dados nativos ponderados em T2 para analisar o volume cerebral. Utilizar software de segmentação para delinear manualmente os ventrículos laterais6. Clique em Modo Pincel e selecione o estilo de pincel quadrado . Ajuste o tamanho do pincel para 1. Clique em Inspetor de layout e selecione modo de exibição axial. Clique em zoom para ajustar. Coloque o cursor sobre a imagem; traçar e preencher o espaço do ventrículo lateral.
- Clique em Segmentação na barra de ferramentas | Volume e Estatísticas para exibir os volumes segmentados.
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Representative Results
O sucesso da injeção foi confirmado por meios radiológicos e imuno-histoquímicos. Os animais submetidos à injeção de hemoglobina desenvolveram ventriculomegalia aguda moderada quando avaliados por RM (Figura 2A), com ventrículos laterais significativamente maiores às 24 h e 72 h após a injeção de hemoglobina em comparação aos animais injetados no LCR (Figura 2B,C). Embora não tenha havido diferença significativa no volume do ventrículo lateral entre os animais injetados com hemoglobina e injetados com aLCR 38 dias após a injeção (Figura 2D), é importante notar que 44% (4/9) dos animais do grupo injetado com hemoglobina que foram seguidos até 38 dias após a injeção apresentaram ventriculomegalia não resolvida neste momento (Figura 2D ). Essa ampla distribuição no tamanho dos ventrículos é um padrão consistente com o curso clínico da HPH-IVH. Além disso, o volume da substância branca foi quantificado aos 38 dias após a injeção (Figura 3) e diminuiu significativamente no grupo injetado com hemoglobina em comparação com o grupo injetado no LCR (Figura 3B).
Publicamos anteriormente um estudo detalhando a reação inflamatória aguda que ocorre após a injeção de hemoglobina9. Neste estudo, citocinas pró-inflamatórias foram avaliadas quanto à produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNFα) in vivo (Figura 4), e a infiltração de células imunes nas áreas periventricular e substância branca foi avaliada por imunofluorescência de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) (Figura 5). A injeção de 15 μL de hemoglobina, sangue total ou soro fisiológico no ventrículo lateral de ratos pós-natais do dia 5 resultou em níveis mais elevados de citocina pró-inflamatória TNFα 3 h após a injeção de hemoglobina em comparação com sangue total e soro fisiológico (Figura 4). Houve significativamente mais astrócitos reativos no corpo caloso de animais injetados com hemoglobina em comparação com animais injetados em ACSF (Figura 5). Finalmente, outros produtos de degradação do sangue têm sido utilizados dessa maneira, incluindo ferro e ferritina, para resultar de forma confiável em ventriculomegalia e hidrocefalia 6,7.
Figura 1: Linha do tempo experimental e esquema do modelo de IVH de rato neonatal . (A) Esquema mostrando a injeção de hemoglobina e a linha do tempo de RM utilizadas para os dados gerados neste estudo. (B) Esquema da configuração estereotáxica para injeção (esquerda) e localização da injeção de hemoglobina no ventrículo lateral direito (direita). Abreviaturas: IVH = hemorragia intraventricular; RM = ressonância magnética; PN = dia pós-natal N. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Volumes do ventrículo lateral no modelo de hemorragia intraventricular de ratos. (A) Imagens representativas de RM coronal T2 in vivo de cérebros de ratos 24 h, 72 h e 38 dias após a injeção intraventricular de aCSF (esquerda) ou 150 mg/mL de Hb (direita) no ventrículo lateral direito no dia pós-natal 4. Barras de escala = 1 mm. (B-D) Quantificação dos volumes laterais do ventrículo (B) 24 h, (C) 72 h e (D) 38 dias após a injeção de aCSF ou Hb. Os animais injetados com Hb apresentaram ventrículos significativamente maiores às 24 h e 72 h. Os dados em B e C são médios ± s.e.m., n = 13 por grupo, teste t bicaudal não pareado. Os dados em D são médios ± EPM, n = 3 no grupo aCSF e n = 9 no grupo Hb, teste t bicaudal não pareado. Abreviaturas: RM = ressonância magnética; PN = dia pós-natal N; aCSF = líquido cefalorraquidiano artificial; Hb = hemoglobina; MEV = erro padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Lesão da substância branca no modelo de hemorragia intraventricular em ratos. (A) Imagens representativas de RM coronal T2 in vivo de cérebros de ratos 38 dias após a injeção intraventricular de aCSF (esquerda) ou 150 mg/mL de Hb (direita) no ventrículo lateral direito no dia pós-natal 4. A substância branca é delineada em vermelho. Barras de escala = 1 mm. (B) Quantificação dos volumes de substância branca 38 dias após a injeção de aCSF ou Hb. Os animais injetados com Hb apresentaram diminuição dos volumes de substância branca. Os dados em B são médias ± EPM, n = 3 no grupo aCSF, n = 9 no grupo Hb. Teste t bicaudal não pareado. Abreviaturas: RM = ressonância magnética; PN = dia pós-natal N; aCSF = líquido cefalorraquidiano artificial; Hb = hemoglobina; MEV = erro padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A hemoglobina induz mais produção de TNFα do que o sangue total in vivo. A administração de 15 μL de hemoglobina, sangue total ou solução salina no ventrículo lateral de ratos pós-natais do dia 5 resultou em níveis mais elevados da citocina pró-inflamatória TNFα 3 h após a injeção de hemoglobina em comparação com o sangue total e a solução salina. Os dados são médios ± EPM, n = 4 em todos os grupos, ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey. Abreviaturas: Hb = hemoglobina; TNFα = fator de necrose tumoral-alfa; WB = sangue total; ANOVA = análise de variância. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A ativação de astrócitos no corpo caloso após injeção de hemoglobina no ventrículo lateral. (A) A imunomarcação GFAP mostra que a injeção de hemoglobina no ventrículo lateral de roedores pós-natal do dia 4 resultou em ativação de astrócitos no corpo caloso e zona subventricular 72 h após a injeção. Barras de escala = 50 μm. (B) O número de astrócitos reativos foi significativamente aumentado em animais injetados com hemoglobina em comparação com animais injetados em aCSF. Os dados são médios ± EPM, n = 3 no grupo aCSF, n = 4 no grupo Hb, teste t bicaudal não pareado. Abreviaturas: GFAP = proteína glial fibrilar ácida; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; VE = ventrículo lateral; SVZ = zona subventricular; cc = corpo caloso; aCSF = líquido cefalorraquidiano artificial; Hb = hemoglobina; MEV = erro padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Comparação da qualidade da imagem da RM 4,7T e 9,4T. (A) Ressonância nuclear magnética (A) 4,7T e 9,4T ponderada em T2 realizada 72 h após a injeção de hemoglobina no ventrículo lateral direito de ratos pós-natais do dia 4. Barras de escala = 1 mm. Abreviação: RM = ressonância magnética. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este modelo de IVH utilizando injeção de hemoglobina permite o estudo da patologia da IVH especificamente mediada pela hemoglobina. Para estudos complementares, a hemoglobina também pode ser facilmente administrada in vitro e não confunde ensaios bioquímicos para proteínas produzidas por micróglias / macrófagos que estão presentes no sangue total.
As principais teorias da HIF-IV incluem a obstrução mecânica da circulação do LCR, a ruptura dos cílios que revestem as paredes ependimárias, inflamação, fibrose e toxicidade do ferro10. Modelos animais existentes para IVH, como o modelo de filhote de rato induzido por colagenase, induzem IVH por meio de lesão direta e ruptura da matriz extracelular11, enquanto outros, como o modelo de filhote de coelho induzido por glicerol, induzem IVH como efeito da hipotensão intracraniana12. Modelos adicionais utilizam injeção de sangue autólogo e doador de ratos nos ventrículos laterais13,14. Embora esses e outros modelos existentes apresentem características importantes para o estudo da HPIV-HPH, eles se concentram no impacto do sangue dentro do ventrículo sem considerar o papel de componentes específicos do sangue liberados durante a hemorragia no desenvolvimento de sequelas neurológicas após a IVH.
Os níveis iniciais de hemoglobina no LCR após a HIV demonstraram estar associados à HPH, e os níveis de proteínas da via do metabolismo do ferro no LCR – hemoglobina, ferritina e bilirrubina – estão associados ao tamanho do ventrículo após a HIV4. Isso sugere que a patogênese da HPH pode estar associada especificamente à hemoglobina e aos componentes de ferro do sangue liberados nos ventrículos durante a IVH. Assim, este modelo apresenta uma importante via para a investigação direcionada sobre o papel da hemoglobina no desenvolvimento da HPH e permite novos estudos sobre terapêuticas visando as vias metabólicas da hemoglobina e do ferro após a IVH.
O aumento ventricular após a IVH em humanos pode ser devido à perda do parênquima cerebral (às vezes referida como hidrocefalia ex vacuo) ou hidrocefalia, o que indica aumento da pressão no LCR. Esses processos podem ocorrer em conjunto15 e pode ser difícil determinar em que medida as alterações ventriculares são devidas ao aumento da pressão liquórica versus perda de volume sem procedimentos invasivos. Este modelo, que permite tanto a avaliação do tamanho ventricular radiologicamente em animais vivos quanto a avaliação da lesão tecidual via histologia, pode ajudar os pesquisadores a entender a relação entre os dois e, mais importante, avaliar até que ponto as terapias potenciais revertem a lesão cerebral.
Tradicionalmente, as comparações interespécies do desenvolvimento cerebral têm se baseado principalmente na massa cerebral post-mortem. Um estudo seminal de Dobbing e Sands realizado com este método estimou que o P7 é um período importante de crescimento cerebral em roedores, comparável às mudanças observadas em neonatos humanos nascidos a termo16. Mais recentemente, estudos comparando marcos de desenvolvimento, como a maturação de oligodendrócitos e o estabelecimento da barreira hematoencefálica, definiram que P1–P3 em roedores é análogo a 23–32 semanas de gestação em neonatos humanos 17,18,19,20,21. Além disso, a matriz germinativa não involui até P7 em ratos22. Portanto, os ratos P4 utilizados neste modelo correspondem a um período de maturação cerebral em que a matriz germinativa está presente, com características que acreditamos serem representativas da população humana em risco para IVH-PHH. Além disso, a taxa de ventriculomegalia não resolvida aos 38 dias após a injeção de hemoglobina neste estudo (44%) é comparável com as taxas clínicas de HPH após a IVH (30%)23.
As limitações do nosso modelo de IVH pós-natal em ratos incluem o uso de um animal lissencéfalo e a ausência de lesão direta da matriz germinativa e/ou parênquima periventricular. No entanto, esse modelo apresenta diversos benefícios, incluindo boa reprodutibilidade, baixo custo e versatilidade que permite o uso de diferentes animais idosos e análises radiológicas (Figura 6), bioquímicas e histológicas. Futuros trabalhos laboratoriais sobre a fisiopatologia da IVH podem levar a melhores tratamentos para esta condição.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
O JMS recebeu financiamento do NIH/NINDS R01 NS110793 e K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). A BAM recebeu financiamento do NIH/NINDS K08 NS112580-01A1, Prêmio da Área Prioritária de Pesquisa em Neurociência da Universidade de Kentucky e um Prêmio Inovador da Associação de Hidrocefalia .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
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