Summary
معدل استهلاك الأكسجين (OCR) هو وكيل شائع لوظيفة الميتوكوندريا ويمكن استخدامه لدراسة نماذج الأمراض المختلفة. لقد طورنا طريقة جديدة باستخدام محلل Seahorse XF لقياس OCR مباشرة في شرائح مخططة حادة من الفئران البالغة التي هي أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية من الطرق الأخرى.
Abstract
تلعب الميتوكوندريا دورا مهما في إنتاج ATP الخلوي ، وتنظيم أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتحكمفي تركيز Ca 2 +. وقد تورط خلل الميتوكوندريا في التسبب في العديد من الأمراض العصبية التنكسية، بما في ذلك مرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون، ومرض الزهايمر. لدراسة دور الميتوكوندريا في نماذج هذه الأمراض ، يمكننا قياس تنفس الميتوكوندريا عن طريق معدل استهلاك الأكسجين (OCR) كوكيل لوظيفة الميتوكوندريا. وقد تم بالفعل قياس OCR بنجاح في مزارع الخلايا ، وكذلك الميتوكوندريا المعزولة. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات أقل أهمية من الناحية الفسيولوجية من قياس OCR في شرائح الدماغ الحادة. للتغلب على هذا القيد ، طور المؤلفون طريقة جديدة باستخدام محلل Seahorse XF لقياس OCR مباشرة في شرائح المخططين الحادة من الفئران البالغة. تم تحسين هذه التقنية مع التركيز على المخطط ، وهي منطقة في الدماغ تشارك في مرض باركنسون ومرض هنتنغتون. يقوم المحلل بإجراء فحص للخلايا الحية باستخدام لوحة من 24 بئرا ، مما يسمح بالقياس الحركي المتزامن ل 24 عينة. تستخدم هذه الطريقة قطعا دائرية مثقوبة من شرائح الدماغ المخططة كعينات. نحن نثبت فعالية هذه التقنية من خلال تحديد OCR القاعدي السفلي في شرائح مخططة لنموذج الماوس من PD. ستكون هذه الطريقة ذات أهمية واسعة للباحثين العاملين في مجال PD ومرض هنتنغتون.
Introduction
تورط خلل الميتوكوندريا في العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون (PD) ، ومرض هنتنغتون ، ومرض الزهايمر1،2،3. تعرض نماذج PD مثل الفئران والجرذان بالضربة القاضية PINK1 (KO) ضعف وظيفة الميتوكوندريا4،5،6،7،8،9،10،11. الميتوكوندريا المعزولة من المخطط (STR) أو الدماغ الكامل لفأر PINK1 KO القديم تظهر عيوبا في المجمع I 7,10,12,13. يعد القياس المباشر لمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) أحد أكثر الطرق شيوعا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا نظرا لأن OCR يقترن بإنتاج ATP ، وهي الوظيفة الرئيسية للميتوكوندريا14. لذلك ، يمكن أن يساعد قياس OCR في نماذج الأمراض أو العينات / الأنسجة المشتقة من المريض في التحقيق في كيفية تسبب خلل الميتوكوندريا في المرض.
حاليا ، هناك عدة طرق لقياس التعرف الضوئي على الحروف الميتوكوندريا ، بما في ذلك قطب كلارك والأقطاب الكهربائية الأخرى O 2 ، وصبغة الفلورسنت O2 ، ومحلل التدفق خارج الخلية15،16،17،18،19. كميزة ، تسمح الطرق القائمة على القطب الكهربائي O2 بإضافة ركائز مختلفة بسهولة. ومع ذلك ، فهي غير كافية لقياس عدة عينات في وقت واحد. بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على القطب الكهربائي O2 ، فإن محلل التدفق خارج الخلية ، وهو أداة شائعة الاستخدام للتعرف الضوئي على الحروف في مزارع الخلايا أو الميتوكوندريا النقية ، يوفر إنتاجية محسنة15،18،20. ومع ذلك ، عادة ما يتم تطبيق كل هذه الطرق لقياس OCR في الميتوكوندريا المعزولة أو مزارع الخلايا6،16،17،19،20،21. تسبب عزلة الميتوكوندريا أضرارا غير مقصودة ، والميتوكوندريا المستخرجة أو مزارع الخلايا أقل أهمية من الناحية الفسيولوجية من شرائح الدماغ السليمة22. حتى عندما يتم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة في شرائح ، فهي أقل حساسية وأكثر صعوبة في العمل من الخلايا المستزرعة23.
ولمواجهة هذه التحديات، طورنا طريقة باستخدام محلل التدفق خارج الخلية XF24، والذي يسمح بتحليل معلمات التمثيل الغذائي المتعددة من شرائح الدماغ المخططة الحادة للفئران24. توفر هذه التقنية تحديد كمي مباشر مستمر لتنفس الميتوكوندريا عبر OCR. باختصار ، يتم وضع أجزاء صغيرة من شرائح الدماغ المخططة في آبار صفيحة الجزيرة ، ويستخدم المحلل أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الأكسجين والبروتون الفلورسنت لقياس معدل التعرف الضوئي على الحروف والتحمض خارج الخلية ، على التوالي17،21،25.
واحدة من السمات الفريدة للمحلل هي آبار الحقن الأربعة ، والتي تسمح باستمرار قياس OCR مع حقن ما يصل إلى أربعة مركبات أو كواشف بالتتابع. وهذا يتيح قياس العديد من معلمات التنفس الخلوي ، مثل التعرف الضوئي على الحروف للميتوكوندريا القاعدية ، والتعرف الضوئي على الحروف المرتبط ب ATP ، والتعرف الضوئي على الحروف للميتوكوندريا القصوى. كانت المركبات التي تم حقنها أثناء قياسات البروتوكول الموضح هنا تركيزات عمل تبلغ 10 ميكرومتر بيروفات في بئر المحلول الأول (المنفذ A) ، و 20 ميكرومتر أوليغومايسين في بئر المحلول الثاني (المنفذ B) ، و 10 ميكرومتر من سيانيد الكربونيل 4-(trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP) في البئر الثالث (المنفذ C) ، و 20 ميكرومتر مضاد للمايسين A في البئر الرابع (الميناء D) ، استنادا إلى Fried et al.25. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التركيزات كانت تركيزات عاملة، وتم حقن محاليل المخزون من 10x و 11x و 12x و 13x في منافذ المحلول من A إلى D على التوالي. وكان الغرض من استخدام كل حل على النحو التالي: 1) كان البيروفات ضروريا لأنه بدونه سيكون لإضافة FCCP استجابة OCR منخفضة ناجمة عن الحد من الركائز المتاحة. 2) Oligomycin يمنع ATP synthase ويسمح بقياس التنفس المرتبط ب ATP ؛ 3) FCCP يفصل الأكسدة من الفسفرة ويسمح بقياس قدرة الميتوكوندريا القصوى ؛ 4) يمنع Antimycin A المركب III في سلسلة نقل الإلكترون ، وبالتالي يسمح بقياس OCR غير المرتبط بالميتوكوندريا.
تم تحديد تركيز الأوليغوميسين المستخدم بناء على الأسباب التالية: 1) الجرعة الموصى بها من الأوليغوميسين لمعظم أنواع الخلايا (الميتوكوندريا المعزولة أو مزارع الخلايا) هي 1.5 ميكرومتر. من التجربة ، عادة ما يتم استخدام 3x-10x من جرعة الخلايا المنفصلة لتجارب الشرائح نظرا لأنه قد يكون هناك تدرج ، ويستغرق تغلغل المحلول في الشرائح وقتا. لذلك ، يجب أن يكون التركيز في حدود 5 ميكرومتر إلى 25 ميكرومتر. 2) تم اختيار تركيز 20 ميكرومتر بناء على Fried et al.25. لم يتم تجربة تركيزات أعلى بسبب السمية غير المحددة للأوليغومايسين. 3) في تقرير أندروود وآخرون 26 ، أجرى المؤلفون تجربة معايرة للأوليغوميسين ووجدوا أن الجرعات عند 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكروغرام / مل أدت إلى تثبيط مماثل. التركيز العالي للأوليغومايسين (50 ميكروغرام / مل) لم يمنع أكثر ولكن كان له تباين أكبر. 4) في ملاحظتنا ، يبدو أن العامل الحاسم هو القدرة على اختراق الأوليغومايسين. من الصعب على oligomycin اختراق الأنسجة ، وهذا هو السبب في أن الأمر يستغرق ما لا يقل عن 7 إلى 8 دورات للوصول إلى الهضبة ، وهي الاستجابة القصوى. طالما أنه يصل إلى الهضبة ، يفترض أن يكون التثبيط هو الحد الأقصى.
يتمثل أحد التحديات التقنية الرئيسية لتكييف محلل التدفق خارج الخلية لقياس OCR في الشرائح المخططة في منع نقص الأكسجة في الأنسجة. نظرا لأن المخزن المؤقت لم يكن مؤكسجا طوال مدة القياسات (حوالي 4 ساعات) ، كان نقص الأكسجة مشكلة مركزية. وينطبق هذا بشكل خاص على عينات الأنسجة الأكثر سمكا، حيث لا يمكن للأكسجين أن ينتشر في جميع أنحاء العينات. للتغلب على هذه المشكلة ، تم تقسيم الشرائح بسماكة 150 ميكرومتر ، بحيث يمكن للأكسجين المحيط اختراق منتصف شرائح الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة 4 ملغ / مل من ألبومين المصل البقري (BSA) إلى المخزن المؤقت للسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي قبل الأكسجين (ACSF) ، مما سهل تحديد الحد الأقصى من OCR ، كما اقترح سابقا23. فحصنا ما إذا كانت الخلايا على قيد الحياة. أولا ، تم استخدام Hoechst 33258 (10 ميكرومتر) ويوديد البروبيديوم (10 ميكرومتر) لفحص ما إذا كانت الخلايا صحية في ظل هذه الظروف. ثم فحصنا ما إذا كانت الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة صحية وظيفيا باستخدام تسجيل المشبك التصحيحي. قمنا بتقييم ما إذا كانت محطات الدوبامين (DA) في الشرائح المخططة صحية وظيفيا من خلال قياس إطلاق DA باستخدام قياس الفولتامتر سريع المسح. أظهرت النتائج أن الشرائح المخططة التي لم تكن مؤكسجة (مجموعة ACSF / BSA) كانت صحية مثل المجموعة الضابطة المؤكسجة24.
ثم اختبرنا مجموعات مختلفة من سمك الشريحة وحجم اللكمة لتحديد ظروف الشريحة المخططة المثلى لفحص التنفس التدفقي. تم استخدام شرائح المخططية الظهرية بسماكات مختلفة (150 ميكرومتر و 200 ميكرومتر) وأحجام الثقب (1.0 مم و 1.5 مم و 2.0 مم في القطر) لتحليل OCR باستخدام المحلل. كانت شرائح Striatal التي كان سمكها 150 ميكرومتر مع حجم لكمة قطرها 1.5 مم تتمتع بأعلى كفاءة اقتران و OCRs ضمن نطاق مثالي للمحلل24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات بما في ذلك العمل الحيواني وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والدولية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها بجامعة توماس جيفرسون. تم استخدام ذكور الفئران FVB / NTac في سن 3 إلى 14 شهرا. تم تنفيذ الخطوات التالية في بيئة غير معقمة ، ولكن يجب توخي الحذر للحفاظ على نظافة كل شيء قدر الإمكان.
ملاحظة: تم إنشاء الطريقة المعروضة هنا واستخدامها في البحث الذي أبلغ عنه Zhi et al.24. استخدمت التجارب الموصوفة هنا محلل التدفق خارج الخلية Seahorse XF24 (انظر جدول المواد). يمكن تكييف هذه الطرق مع محلل XFe24 ، وتم تأكيد بعض النتائج باستخدام هذا المحلل.
1. أجهزة استشعار خرطوشة الترطيب (قبل يوم واحد من الفحص)
- افتح مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية (انظر جدول المواد) وقم بإزالة كل من خرطوشة المستشعر (باللون الأخضر) ولوحة الأدوات المساعدة (واضحة; الشكل 1 ألف). ضع خرطوشة المستشعر جانبا (المستشعرات لأعلى) ولا تلمس المستشعرات.
- أضف 600 ميكرولتر من محلول العيار (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل بئر من لوحة المرافق. ضع خرطوشة المستشعر أعلى لوحة الأداة المساعدة واغمر المستشعرات في محلول المعايرة. تأكد من محاذاة الشق الثلاثي للوحة خرطوشة الأداة المساعدة والمستشعر بشكل صحيح (الشكل 1B).
- قم بإغلاق مجموعة فحص التدفق خارج الخلية بفيلم مانع للتسرب لمنع تبخر محلول العيار ، ثم ضعه في حاضنة 37 درجة مئوية غير مكملة بثاني أكسيد الكربون2 أو الأكسجين بين عشية وضحاها.
2. إعداد لوحة الأنسجة (في يوم الفحص)
- افتح الصفيحة الدقيقة لالتقاط الجزيرة وأخرج لوحة الجزيرة لجلوس الأنسجة.
- قم بتسخين حجم مناسب (625 ميكرولتر لكل بئر) من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المعدل مسبقا (ACSF ، تكوين 140 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 2.4 mM CaCl 2 ، 1.3 mM MgSO 4 ، 0.3 mM KH 2 PO4 ، 25 mM glucose ، 10 mM HEPES ، pH7.2) العازلة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب 50 مل. ثم أضف BSA إلى تركيز نهائي قدره 4 ملغ / مل لإعداد المخزن المؤقت للتنفس. بشكل عام ، يكفي 50 مل للوحة واحدة.
- أضف 625 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنفس (مخزن ACSF العازل المؤكسج مسبقا مع 25 mM glucose و 4 mg / mL BSA) إلى كل بئر من صفيحة الجزيرة بعناية وتجنب هز اللوحة. تأكد من عدم وجود قطرات متبقية أعلى خرطوشة المستشعر وعدم وجود فقاعات هواء في المخزن المؤقت لكل بئر.
3. إعداد شريحة مخططة حادة ووضع شريحة مقتطعة
- قطع رأس الفأر بعد خلع عنق الرحم وتشريح الدماغ على الفور في 10 مل من محلول القطع المؤكسج مسبقا (125 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملليمتر KCl ، 26 ملم ناهكو 3 ، 3.7 ملليمتر MgSO 4 ،0.3 مللي متر KH2PO 4 ، 10 ملم جلوكوز ، درجة الحموضة7.4).
- مقطع شرائح مخططة إكليلية مع اهتزاز يتبع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) بسماكة 150 ميكرومتر في محلول القطع المثلج البارد مسبقا بالأكسجين.
- استرجع الشرائح في 50 مل من ACSF المؤكسج (125 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 26 mM NaHCO 3 ، 2.4 mM CaCl 2 ، 1.3 mM MgSO 4 ،0.3 mM KH 2 PO 4 ، 10 mM glucose ،2mM HEPES ، pH 7.4) واحتفظ بها في محلول لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- بعد الاسترداد ، انقل الشرائح إلى طبق بتري 35 مم × 10 مم مع 5 مل من المخزن المؤقت للتنفس.
- استخدم لكمة خزعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (على سبيل المثال، قطرها 1.5 مم) لإنشاء قطعة دائرية من الأنسجة في المنطقة المطلوبة من الدماغ المقطع. احتفظ بالشريحة في المخزن المؤقت مع الضغط برفق لأسفل باستخدام اللكمة. تأكد من دفع اللكمة لأسفل بقوة كافية لقطع الأنسجة. قم بإزالة بقية الأنسجة ، وارفع اللكمة بعيدا ، وقم بإزالة القطعة الدائرية من الأنسجة في المخزن المؤقت.
- قم بقص طرف ماصة سعة 1 مل لعمل ثقب بقطر 1.5-2.0 مم واستخدمه لتثبيت الشريحة المثقوبة ونقلها إلى أعلى شاشة الالتقاط. شفط قطعة واحدة من أنسجة المخ المثقوبة ووضع الأنسجة بعناية على الجانب الشبكي من شاشة الالتقاط (الشكل 2A). ستكون شاشة الالتقاط عبارة عن قطعة دائرية من البلاستيك مع شبكة متصلة بجانب واحد.
ملاحظة: يتم تضمين شاشات الالتقاط في حزمة الصفائح الدقيقة (انظر جدول المواد) وهي مشابهة لتلك المستخدمة في Schuh et al.23. - استخدم منديلا ورقيا برفق لتجفيف شاشة الالتقاط لفترة وجيزة. مع إزالة الرطوبة ، يصبح النسيج لزجا ، مما يسمح للشريحة بالالتصاق بمركز الشبكة. لا تجفف الشريحة كثيرا ، وإلا فسوف تتلف.
- امسك شريحة شاشة الالتقاط جانبا باستخدام ملاقط وضعها في أحد آبار لوحة الجزيرة المحتضنة (الشكل 2B). احرص على عدم إسقاط الشريحة ؛ إذا كان الأمر كذلك ، أخرج الشاشة وضع شريحة جديدة عليها.
ملاحظة: لا تضع شرائح الدماغ في بئري تصحيح الخلفية (A1 و D6) في لوحة الجزيرة. - احتضن صفيحة الجزيرة عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بتوازن درجة الحرارة ودرجة الحموضة قبل تشغيل الفحص.
4. تحميل الخراطيش مع المركبات المطلوبة
- قم بتخفيف المركبات المطلوبة في ACSF المعدل (37 درجة مئوية) إلى تركيز المخزون النهائي البالغ 10x و 11x و 12x و 13x من تركيز العمل للمنافذ A إلى D ، على التوالي ، وضبط الرقم الهيدروجيني 7.4. سيقوم الاختبار بإدارة المركبات بالترتيب من المنفذ A إلى D. بالنسبة لهذه التجربة ، تم استخدام المحاليل التالية ، مع تركيز عمل كل منها المذكور قبلها: 10 mM pyruvate (المنفذ A) ، 20 μM oligomycin (المنفذ B) ، 10 μM أو تركيزات أخرى من FCCP (المنفذ C) ، و 20 μM antimycin A (المنفذ D).
- قم بالتحميل المسبق بلطف 75 ميكرولتر من المركبات المخففة في منافذ الحقن المناسبة لخرطوشة المستشعر. ضع الأطراف في منتصف الطريق في منافذ الحقن بزاوية 45 درجة مع وضع الطرف على جدار منفذ الحقن. لا ينبغي إدخال التلميحات بالكامل في الجزء السفلي من منافذ الحقن لأن هذا قد يسبب تسربا مركبا عبر المنفذ.
- اسحب النصائح من المنافذ بعناية لتجنب إنشاء فقاعات هواء. لا تنقر على أي جزء من الخرطوشة لتجنب تخفيف فقاعات الهواء.
- افحص منافذ الحقن بصريا للتحميل المتساوي. تأكد من وجود جميع السوائل في المنفذ وعدم وجود أي قطرات متبقية أعلى الخرطوشة.
- ضع خرطوشة المستشعر على لوحة الأداة المساعدة وضعها في حاضنة (غير CO2) لمدة 30 دقيقة للسماح لها بتسخين ما يصل إلى 37 درجة مئوية مرة أخرى. تعامل بعناية عن طريق التمسك فقط بلوحة المرافق. تحرك بأقل قدر ممكن.
5. معايرة وإجراء الفحص
- قم بتحميل قالب الفحص في البرنامج. اضغط على الزر START (ابدأ ) الأخضر.
- تأكد من تحميل البروتوكول الصحيح. يحتوي البروتوكول على مزيج من 3 دقائق ، و 3 دقائق انتظار ، و 2 دقيقة قياس تسلسلات (هذه الخطوات الثلاث تشكل قياسا واحدا). قم بتغيير مسافة رأس المسبار من 26,600 إلى 27,800 في إعدادات الأجهزة ضمن إعدادات الأداة25. ليست هناك حاجة لتغيير رأس المسبار لمحلل XFe24. اضغط على START.
- قم بتحميل خرطوشة المستشعر على لوحة الأدوات المساعدة في درج الأجهزة. الشق يذهب في الأمام ، الزاوية اليسرى. تأكد من أن اللوحة تجلس بشكل صحيح ومسطحة. قم بتحميل خرطوشة المستشعر المملوءة بالأدوية في المحلل للمعايرة.
- اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لمعايرة المستشعرات وموازنتها. يستغرق هذا حوالي 30 دقيقة.
- بمجرد الانتهاء من خطوة المعايرة ، قم بإزالة لوحة المعايرة واستبدلها بلوحة الجزيرة (التي تحتوي على شرائح الشبكة والأنسجة).
- قم بقياس استهلاك الأكسجين في كل بئر من الطبق باستخدام بروتوكولات المقايسة. يحتوي البروتوكول على مزيج من 3 دقائق ، و 3 دقائق انتظار ، و 2 دقيقة من تسلسلات القياس (هذه الخطوات الثلاث تشكل قياسا واحدا) ، وعند هذه النقطة يتم حساب OCR.
- بالنسبة للتجربة بأكملها ، قم بتضمين قياسات 4x OCR لإنشاء خط أساس ، يليه حقن المنفذ A (pyruvate) بقياسات 4x ، ثم حقن المنفذ B (oligomycin) بقياسات 8x ، ثم حقن المنفذ C (FCCP) بقياسات 5x ، وأخيرا حقن المنفذ D (antimycin A) بقياسات 6x.
ملاحظة: يتم تحديد هذا العدد من القياسات بعد كل حقن مركب اعتمادا على وقت وصول القياس إلى الهضبة. - تحليل بيانات قياس التعرف الضوئي على الحروف وبيانات كفاءة الاقتران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانت الخطوة الأولى من هذه الدراسة هي تحسين سمك الشريحة وحجم اللكمة المستخدمة لاستئصال جزء من المخطط من الشريحة (الشكل 3A). أعطت شريحة بسماكة 150 ميكرومتر وحجم لكمة 1.5 مم أفضل النتائج التي تحددها كفاءة الاقتران (الشكل 3B-C). كما هو موضح في الشكل 3B ، فإن التعرف الضوئي على الحروف مستقر نسبيا لمدة 5 ساعات مع تشغيل أقل من 10٪. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام القياسات الوظيفية ، وكذلك تسجيل المشبك الرقعي للخلايا العصبية القشرية والخلايا العصبية الشوكية المتوسطة في المخطط ، وقياس قياس الفولتامتر الدوري السريع (FSCV) لإطلاق DA ، لإثبات أن الخلايا العصبية والطرفية كانت تعمل بكامل طاقتها في هذا التحضير ، كما هو موضح في Zhi et al.24. وشملت مع هذا، ثم اختبرنا تركيزات مختلفة من FCCP لاكتشاف التي من شأنها أن تعطي أفضل استجابة. أعطى 10 μM FCCP أفضل قراءة (الشكل 3D1 ، D2) تحددها القدرة التنفسية الاحتياطية:
القدرة التنفسية الاحتياطية = التنفس الأقصى - التنفس القاعدي
تم استخدام ظروف الشرائح هذه لقياس الاختلافات في التعرف الضوئي على الحروف للشرائح المخططة من الفئران PINK1 KO والقمامة من النوع البري (WT). بالنسبة لنتائج الفئران PINK1 KO و WT ، تم استخدام 3-4 فئران و 4-6 نسخ متماثلة لكل فأر وتم حسابها في المتوسط للحصول على نقطة بيانات واحدة. نظرا لأن PINK1 هو منظم رئيسي لوظيفة الميتوكوندريا ، كان من المتوقع العثور على خلل وظيفي في الميتوكوندريا في فئران KO ، مقاسة بانخفاض OCR الميتوكوندريا. في الواقع ، كان الانخفاض المعتمد على العمر في OCR واضحا في فئران KO مقارنة بضوابط WT الخاصة بهم (الشكل 4A ، D). كان التعرف الضوئي على الحروف القاعدي مشابها في كل من مجموعات KO و WT للفئران الصغيرة (3-4 أشهر) ؛ ومع ذلك ، انخفض OCR القاعدي للفئران KO في المجموعة القديمة (10-14 شهرا; الشكل 4 ب ، هاء). كفاءة الاقتران ، المحددة على النحو التالي ،
كفاءة الاقتران = [معدل إنتاج ATP] / [معدل التنفس القاعدي] × 100
ومع ذلك ، انخفض في الفئران KO لكل من المجموعات الصغيرة والكبيرة (الشكل 4C ، F). توضح هذه البيانات أن أقسام الأنسجة المخططة من فئران PINK1 KO كانت تعاني من خلل وظيفي في الميتوكوندريا. بدأ هذا الخلل الوظيفي في فئران KO أيضا منذ سن مبكرة ، مما يدل عليه انخفاض كفاءة الاقتران ، على الرغم من أن OCR القاعدي انخفض فقط في المجموعة القديمة. من المحتمل أن يكون هذا الانخفاض المعتمد على العمر نتيجة لتراكم عيوب الميتوكوندريا الناجمة عن الضربة القاضية ل PINK1.
الشكل 1: صور تظهر مستشعرات خرطوشة الهيدرات واللوحة الخاصة بمحلل التدفق خارج الخلية. (أ) خرطوشة المستشعر الموجودة أعلى لوحة المعايرة (لوحة المرافق). (ب) منظر جانبي للوحة المرافق ولوحة خرطوشة المستشعر. يجب محاذاة الشق الثلاثي للوحة خرطوشة الأداة المساعدة والمستشعر بشكل صحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مرفق الشريحة المثقوبة ووضعها. (أ) يتم إرفاق الشريحة المثقوبة بإدراج الشبكة لشاشة الالتقاط ، ثم (ب) توضع في أحد آبار صفيحة الجزيرة الحاضنة بعناية لضمان عدم انفصال الشريحة أو تحركها أثناء القياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حالة الشريحة المخططة المثلى لفحص التنفس التدفقي . (أ) رسم تخطيطي لأحجام ثقب الأنسجة (قطرها 1.0 مم و 1.5 مم و 2.0 مم) للمخطط (STR) مع دوائر حمراء تمثل المناطق التي تم الحصول عليها للتحليل. (ب1) أظهرت معدلات استهلاك O2 (OCRs) لمختلف السماكات وأحجام اللكمات للشرائح في المجموعة الضابطة التنفس القاعدي المستقر على كامل القياس (4 ساعات) ، وكان OCR متناسبا مع حجم الشريحة. تم قياس OCRs في شرائح سمك 150 ميكرومتر و 200 ميكرومتر مثقوبة بمقدار 1.0 مم و 1.5 مم و 2.0 مم. تم ذكر المجموعات المستخدمة في الأساطير على أنها سمك * حجم لكمة (على سبيل المثال ، 150 ميكرومتر * 1 مم). (ب2) متوسط التعرف الضوئي على الحروف المقاسة بشرائح سمك 150 ميكرومتر مثقوبة بواسطة لكمة 1.5 مم ؛ ن = 7. (ج1) استجابات OCR التمثيلية للشرائح بسماكات وأقطار مختلفة مع 10 mM pyruvate (P) ، 20 μM oligomycin (O) ، 10 μM FCCP (f) ، و 20 μM antimycin A (A) يتم حقنها بالتتابع. تشير الأسهم إلى النقطة الزمنية لحقن هذه المركبات. (ج2) تمت مقارنة كفاءة اقتران الميتوكوندريا بين مجموعات مختلفة. شرائح من 150 ميكرومتر * 1.5 ملم لديها كفاءة اقتران عالية ولكن أصغر التباين ؛ ن = 4. (دال-1) تم إجراء تجربة المعايرة بالتحليل الحجمي ل FCCP ، وأعطى 10 ميكرومتر FCCP أكبر سعة احتياطية ؛ n = 4 لكل مجموعة. (دال-2) تم إجراء تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي ل FCCP باستخدام محلل ، وأعطى 10 ميكرومتر FCCP أكبر سعة احتياطية ؛ n = 4 لكل مجموعة. القيم الواردة في الأرقام هي متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). وقد عدل هذا الرقم من Zhi et al.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: شرائح PINK1 KO من المجموعة القديمة تظهر OCR أقل بكثير. التعرف الضوئي على الحروف من شرائح STR الحادة (150 ميكرومتر * 1.5 ملم) من الفئران في الشباب (A و B و C) والمجموعات القديمة (D و E و F) ، المعرضة للإضافات المتتالية من المعدلات التنفسية (أظهرت باستخدام الأسهم). لم يكن التعرف الضوئي على الحروف للمجموعة الشابة مختلفا بشكل كبير بين الأنماط الجينية المختلفة (B) ، في حين انخفضت كفاءة الاقتران (المحددة كقيمة مئوية باستخدام الصيغة المذكورة أعلاه) في شرائح PINK1 KO (C). في المجموعة القديمة ، أظهرت شرائح PINK1 KOslices انخفاضا كبيرا في مستوى التنفس القاعدي (E) وكفاءة الاقتران (F). تم حقن المحلول التالي ، 10 mM pyruvate (P) ، 20 μM oligomycin (O) ، 10 μM FCCP (F) ، و 20 μM antimycin A (A) ، بالتتابع. n = 4 لكل نمط وراثي وعمر. القيم الواردة في الأرقام هي متوسط ± SEM. واعتبر الفرق معنويا عند p < 0.05 (*). وقد عدل هذا الرقم من Zhi et al.24. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سمحت الطريقة التي طورناها باستخدام محلل XF لقياس OCR في شرائح مخططة من الفئران البالغة على مدى فترة زمنية تبلغ 4 ساعات. توفر هذه الطريقة طريقة جديدة لقياس الطاقة الحيوية الخلوية في اللكمات المستأصلة من هياكل الدماغ المحددة تشريحيا. نظرا لأن عينات الأنسجة التي يتم تحليلها صغيرة إلى حد ما ، يمكن التحقيق في المعلمات الأيضية لمناطق معينة من الدماغ تشارك في المرض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الشرائح الحادة يحاكي عن كثب البيئة الخلوية الفسيولوجية ، والتي لا يمكن تحقيقها باستخدام الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا المستزرعة والشرائح العضوية. علاوة على ذلك ، فإن قياس OCR في مناطق دماغية متعددة من واحد أو عبر متعددة في لوحة واحدة من 24 بئرا يزيد بشكل كبير من القوة الإحصائية للدراسات التي تنفذ هذه التقنية الجديدة.
هذا هو البروتوكول الأول لقياس OCR في شرائح المخططين الحادة من الفئران البالغة. كان التركيز على STR لأنها واحدة من مناطق الدماغ التي تشارك بشكل رئيسي في مرض باركنسون ومرض هنتنغتون. يمكن مقارنة OCR القاعدي وكفاءة الاقتران في دراستنا بالدراسات الأخرى التي تقيس OCR في شرائح الدماغ الحادة باستخدام محلل XF25،26،27. ومع ذلك ، فإن القدرة التنفسية الاحتياطية للشرائح المخططة في دراستنا تبدو أصغر مقارنة بالتقارير الأخرى التي تقيس مناطق الدماغ الأخرى. لا يزال من غير المعروف ما إذا كان هذا الاختلاف يعكس اختلافات حقيقية في القدرة التنفسية الاحتياطية بين مناطق الدماغ أو اختلافات طفيفة في إعداد الشريحة أو وضع الشريحة المستثناة أو سلالة الفأر. وتستدعي هذه الاختلافات مزيدا من التحقيق.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول ، بما في ذلك إعداد شرائح الدماغ الحادة ، ونقل الشريحة المثقوبة إلى أعلى شاشة الالتقاط ، ووضع الشريحة في البئر. يجب أن تبقى الشرائح متصلة بشاشة الالتقاط أثناء القياس. خلاف ذلك ، إذا انفصلت الشريحة عن الشاشة وجلست في بئر اللوحة ، فستكون بعيدة عن مستشعر الأكسجين ، مما يؤدي إلى قراءة أقل بكثير من OCR والاستجابات للأدوية. نوصي بأربع نسخ متماثلة على الأقل (أربع شرائح دماغية مقتطعة في نفس المنطقة) لكل حالة واستبعاد نتائج الشرائح المنفصلة. يجب أن يكون التعرف الضوئي على الحروف متناسبا مع محتوى الأنسجة. لم تقيس هذه الدراسة كمية الأنسجة حيث تم تقطيع الدماغ بنفس السماكة ، وتم لكم الشريحة باستخدام نفس المثقب. وبالتالي ، كانت كمية الأنسجة ثابتة ، ولم تكن هناك حاجة لتحديد محتوى الأنسجة. من الأهمية بمكان استخدام مثقاب جديد لكل طبق (24 شريحة) لضمان الحدة ، وبالتالي ، نفس الكمية من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق تقسيم وإعداد لكمات الأنسجة وإرفاق الشرائح لكل فأر حوالي 30 دقيقة ويستغرق حوالي 2 ساعة في المجموع لزوجين من الفئران. استقرار شرائح الدماغ الحادة جيد فقط لمدة 7-8 ساعات بعد التقسيم حتى في الظروف المثلى (يتم تقييمه باستخدام فحص وظيفي حساس - تسجيل المشبك - التصحيح لتقييم الحالة الصحية للخلايا العصبية) ، وبالتالي ، قد لا يكون استخدام إعداد 96 جيدا عمليا.
لتوضيح فائدة هذه التقنية ، قمنا بقياس OCR من شرائح مخططة من فئران PINK1 KO وزملائها في WT. تم العثور على انخفاض كبير في التنفس القاعدي لفئران PINK1 KO القديمة مقارنة بضوابط WT المتطابقة مع العمر ، بما يتفق مع عجز إطلاق DA المعتمد على العمر24. تتوافق هذه الملاحظة أيضا مع الدراسات المنشورة سابقا ، مما يؤكد صحة هذا البروتوكول. هناك أيضا قيود على الأساليب. على سبيل المثال ، تم قياس OCR من شريحة الدماغ المخططة الحادة ، والتي من المحتمل أن تكون مستقلة عن نشاط الدماغ وتقدم في الغالب خلايا عصبية شوكية متوسطة غير نشطة ومحطات دوبامين ، وكذلك الخلايا النجمية. بالإضافة إلى ذلك ، لا تحتوي الطريقة على دقة خاصة بنوع الخلية.
باختصار ، تقيس هذه الطريقة الجديدة OCR في شرائح الدماغ الحادة من الفئران البالغة وتوضح كيف يؤثر PINK1 ، وهو جين مرتبط ب PD ، على وظيفة الميتوكوندريا في الفئران. هذه الطريقة سهلة التنفيذ وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للباحثين العاملين في مجال PD ومرض هنتنغتون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر وانغتشين تسيرينغ وباميلا والتر على قراءتهما النقدية وتحريرهما لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (NS054773 إلى C.J. L. و NS098393 إلى H.Z.) وقسم علم الأعصاب في جامعة توماس جيفرسون (صناديق بدء التشغيل إلى H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
