Summary
A taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um proxy comum para a função mitocondrial e pode ser usada para estudar diferentes modelos de doenças. Desenvolvemos um novo método usando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos que é mais fisiologicamente relevante do que outros métodos.
Abstract
Mitocôndrias desempenham um papel importante na produção de ATP celular, regulação reativa de espécies de oxigênio e controle de concentração de Ca2+ . A disfunção mitocondrial tem sido implicada na patogênese de múltiplas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Huntington e a doença de Alzheimer. Para estudar o papel das mitocôndrias em modelos dessas doenças, podemos medir a respiração mitocondrial via taxa de consumo de oxigênio (OCR) como proxy para a função mitocondrial. OCR já foi medido com sucesso em culturas celulares, bem como mitocôndrias isoladas. No entanto, essas técnicas são menos fisiologicamente relevantes do que medir OCR em fatias cerebrais agudas. Para superar essa limitação, os autores desenvolveram um novo método utilizando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos. A técnica é otimizada com foco no estriato, uma área cerebral envolvida na DP e na doença de Huntington. O analisador realiza um ensaio de célula viva usando uma placa de 24 poços, o que permite a medição cinética simultânea de 24 amostras. O método usa pedaços circulares de fatias cerebrais estriatais como amostras. Demonstramos a eficácia desta técnica identificando um OCR basal inferior em fatias estriais de um modelo de rato de DP. Este método será de amplo interesse para pesquisadores que trabalham no campo da DP e da doença de Huntington.
Introduction
A disfunção mitocondrial tem sido implicada em várias doenças neurológicas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Huntington e doença de Alzheimer 1,2,3. Modelos PD como camundongos e ratos pink1 knockout (KO) exibem função mitocondrial prejudicadafunção 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitocôndrias isoladas do estrias (STR) ou cérebro inteiro do camundongo PINK1 KO envelhecem exibem defeitos no complexo I 7,10,12,13. Medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um dos métodos mais comuns para avaliar a função mitocondrial, uma vez que o OCR está associado à produção de ATP, a principal função das mitocôndrias14. Portanto, medir o OCR em modelos de doenças ou amostras/tecidos derivados do paciente pode ajudar a investigar como a disfunção mitocondrial leva à doença.
Atualmente, existem várias maneiras de medir o OCR mitocondrial, incluindo o eletrodo Clark e outros eletrodos O2, corante fluorescente O2, e o analisador de fluxo extracelular 15,16,17,18,19. Como vantagem, os métodos baseados em eletrodos O2 permitem que vários substratos sejam facilmente adicionados. No entanto, são insuficientes para medir simultaneamente várias amostras. Comparado aos métodos tradicionais baseados em eletrodos O2, o analisador de fluxo extracelular, uma ferramenta comumente usada para OCR em culturas celulares ou mitocôndrias purificadas, oferece melhor throughput 15,18,20. No entanto, todos esses métodos são geralmente aplicados para medir o OCR em mitocôndrias isoladas ou culturas celulares 6,16,17,19,20,21. O isolamento das mitocôndrias causa danos inadvertidos, e mitocôndrias extraídas ou culturas celulares são menos relevantes fisiologicamente do que as fatias cerebrais intactas22. Mesmo quando microeletrodos são usados em fatias, eles são menos sensíveis e mais difíceis de operar do que em células cultivadas23.
Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um método utilizando o analisador de fluxo extracelular XF24, que permite a análise de múltiplos parâmetros metabólicos a partir de fatias cerebrais estriais agudas de camundongos24. Esta técnica fornece quantificação contínua direta da respiração mitocondrial através do OCR. Em suma, pequenas seções de fatias cerebrais striatais são colocadas em poços da placa de ilhota, e o analisador usa biosensores à base de oxigênio e prótons fluorescentes para medir a taxa de acidificação OCR e extracelular, respectivamente 17,21,25.
Uma das características únicas do analisador são os quatro poços de injeção, que permitem a medição contínua do OCR enquanto injetam sequencialmente até quatro compostos ou reagentes; isso permite a medição de vários parâmetros de respiração celular, como OCR mitocondrial basal, OCR ligado a ATP e OCR mitocondrial máximo. Os compostos injetados durante as medições para o protocolo aqui mostrado foram concentrações de trabalho de piruvato de 10 mM na primeira solução bem (porta A), 20 μM de oligomicina na segunda solução bem (porta B), 10 μM cianeto de carbonil 4-(trifluorometoxy) fenilhidrazone (FCCP) no terceiro poço (porta C), e 20 μM antimicina A no quarto poço (porta D), com base em Fried et al.25. Deve-se notar que essas concentrações foram concentrações de trabalho, e soluções de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x foram injetadas nas portas de solução A a D, respectivamente. O objetivo de utilizar cada solução foi o seguinte: 1) O piruvato foi necessário, pois, sem ela, a adição de FCCP teria uma resposta OCR reduzida causada por uma limitação dos substratos disponíveis; 2) A oligomicina inibe a synthase ATP e permite a medição da respiração ligada ao ATP; 3) A FCCP desacoplula a oxidação da fosforilação e permite a medição da capacidade mitocondrial máxima; 4) A antimicina inibe o complexo III na cadeia de transporte de elétrons e, portanto, permite a medição do OCR não ligado às mitocôndrias.
A concentração de oligomicina utilizada foi determinada com base nas seguintes razões: 1) A dose recomendada de oligomicina para a maioria dos tipos de células (mitocôndrias isoladas ou culturas celulares) é de 1,5 μM. Pela experiência, geralmente 3x-10x da dose de células dissociadas é usado para os experimentos de fatia, uma vez que pode haver um gradiente, e a penetração da solução nas fatias leva tempo. Portanto, a concentração deve estar na faixa de 5 μM a 25 μM. 2) Foi selecionada uma concentração de 20 μM com base em Fried et al.25. Maiores concentrações não foram tentadas devido à toxicidade não específica da oligomicina. 3) No relatório de Underwood et al.26, os autores fizeram um experimento de titulação para oligomicina e descobriram que as doses em 6,25, 12,5, 25 e 50 μg/mL resultaram em inibição semelhante. A maior concentração de oligomicina (50 μg/mL) não inibiu mais, mas apresentou maior variância. 4) Em nossa observação, o fator determinante parece ser a capacidade penetrante da oligomicina. É difícil para a oligomicina penetrar no tecido, e é por isso que leva pelo menos 7 a 8 ciclos para chegar ao planalto, a resposta máxima. Desde que atinja o planalto, a inibição é assumida como máxima.
Um dos principais desafios técnicos da adaptação do analisador de fluxo extracelular para medir OCR em fatias estriais é prevenir a hipóxia tecidual. Como o tampão não foi oxigenado durante toda a duração das medições (cerca de 4h), a hipóxia foi um problema central. Isso é especialmente verdadeiro para amostras de tecido mais espessas, onde o oxigênio não pode se difundir em todas as amostras. Para superar esse problema, as fatias foram seccionadas com 150 μm de espessura, para que o oxigênio ambiente pudesse penetrar no meio das fatias cerebrais. Além disso, 4 mg/mL de soro bovino albumina (BSA) foi adicionado ao buffer de fluido cerebrospinal artificial pré-oxigenado (ACSF), o que facilitou a determinação do OCR máximo, como sugerido anteriormente23. Examinamos se as células estavam vivas. Primeiro, hoechst 33258 (10 μM) e iodeto de propidium (10 μM) foram usados para examinar se as células eram saudáveis nessas condições. Em seguida, examinamos se os neurônios espinhosos médios eram funcionalmente saudáveis usando a gravação de grampo de remendo. Avaliamos ainda se os terminais de dopamina (DA) nas fatias estriais eram funcionalmente saudáveis, medindo a liberação de DA usando voltammemetria de varredura rápida. Os resultados mostraram que as fatias estriais que não estavam oxigenadas (grupo ACSF/BSA) eram tão saudáveis quanto o grupo de controle oxigenado24.
Em seguida, testamos diferentes combinações de espessura de fatia e tamanho do soco para determinar as condições ideais de fatia striatal para o ensaio de respiração de fluxo. Foram utilizadas fatias estriais dorsais com espessuras diferentes (150 μm e 200 μm) e tamanhos de perfuração (1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm de diâmetro) para análise de OCR utilizando o analisador. As fatias striatais de 150 μm de espessura com um tamanho de soco de 1,5 mm de diâmetro tiveram a maior eficiência de acoplamento e OCRs dentro de uma faixa ideal para o analisador24.
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Protocol
Todos os procedimentos, incluindo o trabalho animal, foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Thomas Jefferson. Foram utilizados camundongos FVB/NTac masculinos de 3 a 14 meses. As etapas a seguir foram realizadas em um ambiente não estéril, mas deve-se tomar cuidado para manter tudo o mais limpo possível.
NOTA: O método aqui apresentado foi estabelecido e utilizado na pesquisa relatada por Zhi et al.24. Os experimentos descritos aqui utilizaram um analisador de fluxo extracelular Seahorse XF24 (ver Tabela de Materiais). Esses métodos podem ser adaptados para o analisador XFe24, e alguns resultados foram confirmados usando este analisador.
1. Hidrate os sensores do cartucho (1 dia antes do ensaio)
- Abra o kit de ensaio de fluxo extracelular (ver Tabela de Materiais) e remova tanto o cartucho do sensor (verde) quanto a placa de utilidade (claro; Figura 1A). Coloque o cartucho do sensor de lado (sensores para cima) e não toque nos sensores.
- Adicione 600 μL de solução calibrante (pH 7.4) a cada poço da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor em cima da placa de utilidade e submerse os sensores na solução calibrante. Certifique-se de que o entalhe triangular do utilitário e da placa do cartucho do sensor estejam corretamente alinhados (Figura 1B).
- Sele o kit de ensaio de fluxo extracelular com filme de vedação para evitar a evaporação da solução calibrante e, em seguida, coloque-o em uma incubadora de 37 °C não suplementada com CO2 ou oxigênio durante a noite.
2. Prepare a placa de tecido (no dia do ensaio)
- Abra a microplacão de captura de ilhotas e tire a placa de ilhota para sentar o tecido.
- Aqueça um volume apropriado (625 μL por poço) de fluido cerebrospinal artificial modificado pré-oxigenado (ACSF, composição 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM de glicose, 10 mM HEPES, pH 7,2) tampão a 37 °C em um tubo de 50 mL. Em seguida, adicione BSA a uma concentração final de 4 mg/mL para preparar o tampão de respiração. Em geral, 50 mL é suficiente para uma placa.
- Adicione 625 μL de tampão de respiração (tampão ACSF pré-oxigenado com glicose de 25 mM e 4 mg/mL BSA) a cada poço da placa de ilhota cuidadosamente e evite agitar a placa. Certifique-se de que não há gotas residuais em cima do cartucho do sensor e que não há bolhas de ar no buffer de cada poço.
3. Preparação aguda de fatia striatal e colocação de fatias extirpadas
- Decapitar o camundongo após a luxação cervical e dissecar imediatamente o cérebro em 10 mL de solução de corte pré-oxigenada gelada (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glicose, pH 7.4).
- Seção de estrias coronárias com um vibratome seguindo a instrução do fabricante (ver Tabela de Materiais) a uma espessura de 150 μm em solução de corte pré-oxigenada e gelada.
- Recupere as fatias em 50 mL de ACSF oxigenado (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glicose, 2 mM HEPES, pH 7.4) e manter em solução até 30 min à temperatura ambiente (RT).
- Após a recuperação, transfira as fatias para uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm com 5 mL de tampão de respiração.
- Use um soco de biópsia de aço inoxidável (por exemplo, 1,5 mm de diâmetro) para criar um pedaço circular de tecido na área desejada do cérebro fatiado. Mantenha a fatia no buffer enquanto pressione suavemente com o soco. Certifique-se de que o soco é empurrado para baixo com força suficiente para cortar o tecido. Remova o resto do tecido, levante o soco e remova o pedaço circular de tecido no tampão.
- Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para fazer um orifício com um diâmetro de 1,5-2,0 mm e use-o para segurar e transferir a fatia perfurada para a parte superior da tela de captura. Sucção um pedaço de tecido cerebral perfurado e coloque cuidadosamente o tecido no lado da malha da tela de captura (Figura 2A). A tela de captura será um pedaço circular de plástico com a malha presa a um lado.
NOTA: As telas de captura estão incluídas no pacote de microplacões (ver Tabela de Materiais) e são semelhantes às usadas em Schuh et al.23. - Use suavemente um tecido de papel para secar brevemente a tela de captura. Com a umidade removida, o tecido fica pegajoso, o que permite que a fatia se anexe ao centro da malha. Não seque muito a fatia, pois, caso contrário, ela será danificada.
- Segure a tela de captura lado para baixo com pinças e coloque-a em um dos poços da placa de ilhota incubadora (Figura 2B). Tenha cuidado para não soltar a fatia; se assim for, tire a tela e coloque uma nova fatia sobre ela.
NOTA: Não coloque fatias cerebrais nos dois poços de correção de fundo (A1 e D6) na placa de ilhota. - Incubar a placa de ilhota a 37 °C em uma incubadora por pelo menos 30 minutos para permitir a temperatura e o equilíbrio do pH antes de executar o ensaio.
4. Carregamento de cartuchos com compostos desejados
- Diluir os compostos desejados em ACSF modificado (37 °C) para a concentração final de estoque de 10x, 11x, 12x e 13x da concentração de trabalho para as portas A a D, respectivamente, e ajustar-se ao pH 7.4. O teste administrará os compostos em ordem da porta A ao D. Para este experimento foram utilizadas as seguintes soluções, com suas respectivas concentrações de trabalho mencionadas antes delas: piruvato de 10 mM (porta A), 20 μM de oligomicina (porta B), 10 μM ou outras concentrações de FCCP (porta C) e 20 μM de antimicina A (porta D).
- Precarreça suavemente 75 μL dos compostos diluídos nas portas de injeção apropriadas do cartucho do sensor. Coloque as pontas no meio do caminho para as portas de injeção em um ângulo de 45° com a ponta contra a parede da porta de injeção. As pontas não devem ser inseridas completamente na parte inferior das portas de injeção, pois isso pode causar vazamento composto através da porta.
- Retire as pontas das portas cuidadosamente para evitar a criação de bolhas de ar. Não toque em nenhuma porção do cartucho para evitar aliviar bolhas de ar.
- Inspecione visualmente as portas de injeção para até mesmo carregar. Certifique-se de que todo o líquido está na porta e não há gotas residuais em cima do cartucho.
- Coloque o cartucho do sensor sobre a placa do utilitário e coloque-o em uma incubadora (não-CO2) por 30 minutos para permitir que ele aqueça até 37 °C novamente. Manuseie cuidadosamente apenas segurando a placa de utilidade. Mova-se o mínimo possível.
5. Calibração e execução do ensaio
- Carregue o modelo de ensaio no software. Pressione o botão START verde.
- Certifique-se de carregar o protocolo correto. O protocolo contém uma combinação de 3 min de mix, 3 min de espera e 2 min de sequências de medida (estes três passos formam uma medição). Altere a distância da cabeça da sonda de 26.600 para 27.800 nas configurações de hardware em configurações de instrumentos25. Não há necessidade de mudar a cabeça da sonda para o analisador XFe24. Pressione start.
- Carregue o cartucho do sensor na placa do utilitário na bandeja do instrumento. O entalhe vai para a frente, canto esquerdo. Certifique-se de que a placa está bem e está plana. Coloque o cartucho do sensor cheio de drogas no analisador para calibração.
- Siga as instruções na tela para calibrar e equilibrar os sensores. Isso leva cerca de 30 min.
- Uma vez feito o passo de calibração, remova a placa de calibração e substitua-a pela placa de ilhota (contendo a malha e as fatias de tecido).
- Meça o consumo de oxigênio em cada poço da placa usando os protocolos de ensaio. O protocolo contém uma combinação de 3 min de mix, 3 min de espera e sequências de medida de 2 min (estes três passos formam uma medição), momento em que o OCR é calculado.
- Para todo o experimento, incluam medições de OCR 4x para criar uma linha de base, seguidas pela injeção da porta A (piruvato) com medições de 4x, depois a injeção da porta B (oligomicina) com medições de 8x, depois a injeção da porta C (FCCP) com medições de 5x e, finalmente, a injeção da porta D (antimicina A) com medições de 6x.
NOTA: Este número de medidas após cada injeção composta é determinado dependendo de quando a medição atinge o platô. - Analise os dados de medição do OCR e os dados de eficiência de acoplamento.
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Representative Results
O primeiro passo deste estudo foi otimizar a espessura da fatia e o tamanho do soco usado para extirver uma seção do estriato da fatia (Figura 3A). Uma fatia com 150 μm de espessura e um tamanho de soco de 1,5 mm deu os melhores resultados determinados pela eficiência do acoplamento (Figura 3B-C). Como mostrado na Figura 3B, o OCR é relativamente estável por 5 h com menos de 10% de execução. Além disso, foram utilizadas medidas funcionais, bem como o registro de grampos de remendo de neurônios corticais e neurônios espinhosos médios no estriado, e a medição da voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) da liberação do DA, para demonstrar que os neurônios e terminais estavam totalmente funcionais nesta preparação, como mostrado em Zhi et al.24. Incluído com isso, testamos diferentes concentrações de FCCP para descobrir qual daria a melhor resposta; 10 μM FCCP deu a melhor leitura (Figura 3D1,D2) determinada pela capacidade respiratória sobressalente:
Capacidade respiratória sobressalente = respiração máxima - respiração basal
Estas condições de fatia foram utilizadas para medir as diferenças no OCR de fatias estriatais de camundongos KO PINK1 e ninhadas do tipo selvagem (WT). Para os resultados de camundongos PINK1 KO e WT, foram utilizados 3-4 camundongos e 4-6 réplicas por mouse e média para obter um ponto de dados. Uma vez que o PINK1 é um regulador-chave da função mitocondrial, esperava-se que a disfunção mitocondrial fosse encontrada nos camundongos ko, medido pela diminuição do OCR mitocondrial. De fato, uma diminuição dependente da idade no OCR foi evidente nos camundongos KO em comparação com seus controles WT (Figura 4A,D). Basal OCR foi semelhante nos grupos KO e WT para camundongos jovens (3-4 meses); no entanto, o OCR basal diminuiu para os ratos KO no grupo antigo (10-14 meses; Figura 4B,E). Eficiência de acoplamento, determinada como abaixo,
Eficiência de acoplamento = [taxa de produção ATP] / [taxa de respiração basal] × 100
no entanto, diminuiu nos camundongos ko para os grupos jovens e antigos (Figura 4C,F). Esses dados demonstram que as seções de tecido striatal de camundongos KO PINK1 tinham disfunção mitocondrial. Essa disfunção nos camundongos ko também começou desde cedo, indicada pela diminuição da eficiência do acoplamento, embora o OCR basal só tenha diminuído no grupo antigo. Essa diminuição dependente da idade foi provavelmente resultado do acúmulo de defeitos mitocondriais causados pelo nocaute do PINK1.
Figura 1: Imagens que mostram o analisador de fluxo extracelular hidratam sensores e placa do cartucho. (A) O cartucho do sensor sentado em cima de uma placa de calibração (placa de utilidade). (B) Visão lateral da placa de utilidade e da placa do cartucho do sensor. O entalhe triangular da placa do utilitário e do cartucho do sensor deve estar corretamente alinhado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fixação e colocação da fatia perfurada. (A) A fatia perfurada é anexada à inserção de malha da tela de captura e, em seguida, (B) colocada em um dos poços da placa de ilhota incubadora cuidadosamente para garantir que a fatia não se desprende ou se mova durante a medição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Condição ideal de fatia estriartal para ensaio de respiração de fluxo. (A) Diagrama de tamanhos de perfuração tecidual (1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm de diâmetro) para o estriado (STR) com círculos vermelhos representando as áreas obtidas para a análise. (B1) As taxas de consumo O2 (OCRs) para diferentes espessuras e tamanhos de perfuração de fatias no grupo controle mostraram respiração basal estável ao longo de toda a medição (4h), e o OCR foi proporcional ao volume da fatia. Os OCRs foram medidos em fatias de espessura de 150 μm e 200 μm perfuradas por 1,0 mm, 1,5 mm e 2,0 mm de perfuração. As combinações utilizadas são mencionadas nas lendas como espessura * tamanho do soco (por exemplo, 150 μm * 1 mm). (B2) OCRs médios medidos em fatias de espessura de 150 μm perfuradas por soco de 1,5 mm; n = 7. (C1) Respostas OCR representativas de fatias em diferentes espessuras e diâmetros com piruvato de 10 mM (P), oligomicina 20 μM (O), 10 μM FCCP (F) e 20 μM de antimicina A (A) injetadas sequencialmente. As setas indicam o ponto de tempo de injeção desses compostos. (C2) A eficiência do acoplamento mitocondrial foi comparada entre diferentes grupos. Fatias de 150 μm * 1,5 mm tiveram a alta eficiência de acoplamento, mas a menor variância; n = 4. (D1) Foi realizado experimento de titulação para FCCP, e 10 μM FCCP deu a maior capacidade de reposição; n = 4 para cada grupo. (D2) Os experimentos de titulação para FCCP foram realizados com um analisador, e 10 μM FCCP deu a maior capacidade de reposição; n = 4 para cada grupo. Os valores dados nos números são médios ± erro padrão da média (SEM). Este número foi modificado a partir de Zhi et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fatias DE KO PINK1 do grupo antigo mostrando OCR significativamente mais baixo. OCRs de fatias str agudas (150 μm * 1,5 mm) de camundongos nos jovens (A, B e C) e nos grupos antigos (D, E e F), expostos a sucessivas adições de moduladores respiratórios (mostrados usando setas). O OCR do grupo jovem não foi significativamente diferente entre diferentes genótipos (B), enquanto a eficiência de acoplamento (determinada como valor percentual utilizando a fórmula mencionada acima %) foi diminuída nas fatias de KO PINK1 (C). No grupo antigo, as KOslices PINK1 apresentaram redução significativa do nível de respiração basal (E) e eficiência de acoplamento (F). A seguinte solução, piruvato de 10 mM (P), oligomicina de 20 μM (O), 10 μM FCCP (F) e 20 μM de antimicina A (A), foi injetada sequencialmente. n = 4 para cada genótipo e idade. Os valores dados nos números são médios ± SEM. A diferença foi considerada significativa quando p < 0,05 (*). Este número foi modificado a partir de Zhi et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método que desenvolvemos permitiu que um analisador XF fosse usado para medir OCR em fatias estriais de camundongos adultos durante um período de tempo de 4 h. Este método fornece uma nova maneira de medir bioenergésicos celulares em socos extirpados de estruturas cerebrais anatomicamente definidas. Como as amostras de tecido que estão sendo analisadas são bastante pequenas, os parâmetros metabólicos de áreas cerebrais específicas envolvidas em uma doença podem ser investigados. Além disso, o uso de fatias agudas imita mais de perto o ambiente celular fisiológico, que não pode ser alcançado com mitocôndrias isoladas ou células cultivadas e fatias organotípicas. Além disso, medir o OCR em múltiplas regiões cerebrais de um único animal ou em vários animais em uma placa de 24 poços aumenta consideravelmente o poder estatístico dos estudos que implementam essa nova técnica.
Este é o primeiro protocolo de medição de OCR em fatias estriais agudas de camundongos adultos. O foco estava no STR, pois é uma das áreas cerebrais envolvidas principalmente na DP e na doença de Huntington. O OCR basal e a eficiência do acoplamento em nosso estudo são comparáveis aos outros estudos que medem o OCR em fatias cerebrais agudas usando o analisador XF 25,26,27. No entanto, a capacidade respiratória sobressal de fatias estriais em nosso estudo parece menor em comparação com os outros relatórios que mediram outras áreas cerebrais. Ainda não se sabe se essa diferença reflete diferenças reais na capacidade respiratória de reposição entre as áreas cerebrais ou pequenas diferenças na preparação de fatias, colocação de fatias excisadas ou cepa de camundongos. Essas diferenças justificam uma investigação mais aprofundada.
Existem várias etapas críticas neste protocolo, incluindo preparar fatias cerebrais agudas, transferir a fatia perfurada para o topo da tela de captura, e colocar a fatia no poço. As fatias devem ser mantidas presas à tela de captura durante a medição. Caso contrário, se a fatia se desprender da tela e se sentar no poço da placa, ela estará longe do sensor de oxigênio, resultando em uma leitura muito menor do OCR e respostas às drogas. Recomendamos pelo menos quatro réplicas (quatro fatias cerebrais extirpadas na mesma área) para cada condição e excluindo os resultados das fatias separadas. OCR deve ser proporcional ao teor de tecido. Este estudo não mediu a quantidade de tecido, uma vez que o cérebro foi cortado na mesma espessura, e a fatia foi perfurada usando o mesmo perfurador. Assim, a quantidade de tecido era constante, e não havia necessidade de determinar o conteúdo do tecido. É fundamental usar um novo perfurador para cada placa (24 fatias) para garantir a nitidez e, assim, a mesma quantidade de tecido. Além disso, a secção, preparação de socos teciduais e a fixação das fatias por rato leva cerca de 30 minutos e leva cerca de 2h no total para dois pares de ratos. A estabilidade das fatias cerebrais agudas só é boa para 7-8 h após a secção mesmo em condições ideais (avaliadas usando ensaios funcionais sensíveis-patch-clamp para avaliar o estado saudável dos neurônios) e, portanto, usar uma configuração de poço 96 pode não ser prático.
Para ilustrar a utilidade da técnica, medimos o OCR a partir de fatias estriais de ratos KO PINK1 e seus companheiros de lixo WT. Uma redução significativa foi encontrada na respiração basal de camundongos PINK1 KO envelhecidos em comparação com os controles de WT com correspondência etária, consistente com déficits de liberação de DA dependentes da idade24. Esta observação também se alinha com estudos publicados anteriormente, confirmando a validade deste protocolo. Há também limitações dos métodos. Por exemplo, o OCR foi medido a partir da fatia cerebral estriatal aguda, que é provavelmente independente da atividade cerebral e oferece principalmente neurônios espinhosos médios inativos e terminais dopaminérgicos, bem como astrócitos. Além disso, o método não possui uma resolução específica do tipo celular.
Em resumo, este novo método mede o OCR em fatias cerebrais agudas de camundongos adultos e demonstra como o PINK1, um gene relacionado à DP, afeta a função mitocondrial em camundongos. Este método é fácil de implementar e amplamente aplicável aos pesquisadores que trabalham no campo da DP e da doença de Huntington.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Wangchen Tsering e Pamela Walter por sua leitura crítica e edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) (NS054773 a C.J. L. e NS098393 a H.Z.) e pelo Departamento de Neurociência da Universidade Thomas Jefferson (Startup Funds to H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
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