Summary
ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए एक सामान्य प्रॉक्सी है और इसका उपयोग विभिन्न रोग मॉडल का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हमने वयस्क चूहों से तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को सीधे मापने के लिए सीहॉर्स एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके एक नई विधि विकसित की है जो अन्य तरीकों की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर एटीपी उत्पादन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के विनियमन और सीए2 + एकाग्रता नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता को पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग और अल्जाइमर रोग सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के रोगजनन में फंसाया गया है। इन बीमारियों के मॉडल में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, हम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए प्रॉक्सी के रूप में ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को माप सकते हैं। ओसीआर को पहले से ही सेल संस्कृतियों में सफलतापूर्वक मापा गया है, साथ ही पृथक माइटोकॉन्ड्रिया भी। हालांकि, ये तकनीक तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में ओसीआर को मापने की तुलना में कम शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, लेखकों ने वयस्क चूहों से तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को सीधे मापने के लिए सीहॉर्स एक्सएफ विश्लेषक का उपयोग करके एक नई विधि विकसित की। तकनीक को स्ट्रिएटम पर ध्यान केंद्रित करने के साथ अनुकूलित किया गया है, जो पीडी और हंटिंगटन रोग में शामिल मस्तिष्क क्षेत्र है। विश्लेषक 24-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके एक लाइव सेल परख करता है, जो 24 नमूनों के एक साथ गतिज माप की अनुमति देता है। विधि नमूने के रूप में स्ट्रेटल मस्तिष्क स्लाइस के परिपत्र-छिद्रित टुकड़ों का उपयोग करती है। हम पीडी के माउस मॉडल के स्ट्रेटल स्लाइस में कम बेसल ओसीआर की पहचान करके इस तकनीक की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं। यह विधि पीडी और हंटिंगटन रोग के क्षेत्र में काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए व्यापक रुचि होगी।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग और अल्जाइमर रोग 1,2,3 सहित कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में फंसाया गया है। पीडी मॉडल जैसे पिंक 1 नॉकआउट (केओ) चूहों और चूहों ने बिगड़ा हुआ माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन 4,5,6,7,8,9,10,11 प्रदर्शित किया। माइटोकॉन्ड्रिया स्ट्रिएटम (एसटीआर) या वृद्ध पिंक 1 केओ माउस के पूरे मस्तिष्क से पृथक जटिल मैं 7,10,12,13 में दोष प्रदर्शित करता है। ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) को सीधे मापना माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है क्योंकि ओसीआर एटीपी उत्पादन के साथ युग्मित है, माइटोकॉन्ड्रिया14 का प्रमुख कार्य। इसलिए, रोग मॉडल या रोगी-व्युत्पन्न नमूनों / ऊतक में ओसीआर को मापने से यह जांचने में मदद मिल सकती है कि माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता बीमारी की ओर कैसे ले जाती है।
वर्तमान में, माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर को मापने के कई तरीके हैं, जिनमें क्लार्क इलेक्ट्रोड और अन्य ओ2 इलेक्ट्रोड, ओ2 फ्लोरोसेंट डाई और बाह्य प्रवाह विश्लेषक 15,16,17,18,19 शामिल हैं। एक लाभ के रूप में, ओ2 इलेक्ट्रोड-आधारित विधियां विभिन्न सब्सट्रेट को आसानी से जोड़ने की अनुमति देती हैं। हालांकि, वे एक साथ कई नमूनों को मापने के लिए अपर्याप्त हैं। पारंपरिक ओ 2 इलेक्ट्रोड-आधारित तरीकों की तुलना में, बाह्यप्रवाह विश्लेषक, सेल संस्कृतियों या शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया में ओसीआर के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला उपकरण, बेहतर थ्रूपुट 15,18,20 प्रदान करता है। फिर भी, इन सभी विधियों को आमतौर पर पृथक माइटोकॉन्ड्रिया या सेल संस्कृतियों 6,16,17,19,20,21 में ओसीआर को मापने के लिए लागू किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया का अलगाव अनजाने में क्षति का कारण बनता है, और निकाले गए माइटोकॉन्ड्रिया या सेल संस्कृतियां बरकरार मस्तिष्क स्लाइस22 की तुलना में शारीरिक रूप से कम प्रासंगिक हैं। यहां तक कि जब स्लाइस में माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है, तो वे सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में कम संवेदनशील और संचालित करने में अधिक कठिन होते हैं23.
इन चुनौतियों का सामना करने के लिए, हमने एक्सएफ 24 बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके एक विधि विकसित की, जो चूहों के तीव्र स्ट्रेटल मस्तिष्क स्लाइस से कई चयापचय मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति देताहै 24. यह तकनीक ओसीआर के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का निरंतर प्रत्यक्ष परिमाणीकरण प्रदान करती है। संक्षेप में, स्ट्राइटल मस्तिष्क स्लाइस के छोटे वर्गों को आइलेट प्लेट के कुओं में रखा जाता है, और विश्लेषक क्रमशः 17,21,25 ओसीआर और बाह्य अम्लीकरण दर को मापने के लिए ऑक्सीजन और प्रोटॉन फ्लोरोसेंट-आधारित बायोसेंसर का उपयोग करता है।
विश्लेषक की अनूठी विशेषताओं में से एक चार इंजेक्शन कुएं हैं, जो क्रमिक रूप से चार यौगिकों या अभिकर्मकों को इंजेक्ट करते समय ओसीआर के निरंतर माप की अनुमति देते हैं; यह बेसल माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर, एटीपी-लिंक्ड ओसीआर और अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर जैसे कई सेलुलर श्वसन मापदंडों के माप को सक्षम बनाता है। यहां दिखाए गए प्रोटोकॉल के लिए माप के दौरान इंजेक्ट किए गए यौगिक पहले समाधान में 10 एमएम पाइरूवेट अच्छी तरह से (पोर्ट ए), दूसरे समाधान में 20 μM ओलिगोमाइसिन अच्छी तरह से (पोर्ट बी), तीसरे कुएं (पोर्ट सी) में 10 μM कार्बोनिल साइनाइड 4- (ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी), और चौथे कुएं में 20 μM एंटीमाइसिन ए की सांद्रता काम कर रहे थे फ्राइड एट अल .25 के आधार पर। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये सांद्रता काम कर रहे थे, और 10x, 11x, 12x और 13x के स्टॉक समाधान क्रमशः डी के माध्यम से समाधान बंदरगाहों ए में इंजेक्ट किए गए थे। प्रत्येक समाधान का उपयोग करने का उद्देश्य निम्नानुसार था: 1) पाइरूवेट आवश्यक था, क्योंकि इसके बिना, एफसीसीपी के अलावा उपलब्ध सब्सट्रेट की सीमा के कारण ओसीआर प्रतिक्रिया में कमी आएगी; 2) ओलिगोमाइसिन एटीपी सिंथेज़ को रोकता है और एटीपी लिंक्ड श्वसन के माप की अनुमति देता है; 3) एफसीसीपी फॉस्फोराइलेशन से ऑक्सीकरण को अनकपल्स करता है और अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता के माप की अनुमति देता है; 4) एंटीमाइसिन ए इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में जटिल III को रोकता है और इसलिए, ओसीआर के माप को माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़ा नहीं होने की अनुमति देता है।
उपयोग किए गए ओलिगोमाइसिन की एकाग्रता निम्नलिखित कारणों के आधार पर निर्धारित की गई थी: 1) अधिकांश सेल प्रकारों (पृथक माइटोकॉन्ड्रिया या सेल संस्कृतियों) के लिए ओलिगोमाइसिन की अनुशंसित खुराक 1.5 μM है। अनुभव से, आमतौर पर पृथक कोशिकाओं की खुराक के 3x-10x टुकड़ा प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि एक ढाल हो सकता है, और स्लाइस में समाधान के प्रवेश में समय लगता है। इसलिए, एकाग्रता 5 μM से 25 μM की सीमा में होनी चाहिए। 2) फ्राइड एट अल.25 के आधार पर एक 20 μM एकाग्रता का चयन किया गया था। ओलिगोमाइसिन की गैर-विशिष्ट विषाक्तता के कारण उच्च सांद्रता की कोशिश नहीं की गई थी। 3) अंडरवुड एट अल .26 की रिपोर्ट में, लेखकों ने ओलिगोमाइसिन के लिए एक अनुमापन प्रयोग किया और पाया कि 6.25, 12.5, 25 और 50 μg / एमएल पर खुराक के परिणामस्वरूप समान निषेध हुआ। ओलिगोमाइसिन (50 μg / एमएल) की उच्च एकाग्रता अधिक बाधित नहीं हुई लेकिन एक बड़ा विचरण था। 4) हमारे अवलोकन में, निर्धारण कारक ओलिगोमाइसिन की मर्मज्ञ क्षमता प्रतीत होता है। ओलिगोमाइसिन के लिए ऊतक में प्रवेश करना मुश्किल है, और यही कारण है कि पठार तक पहुंचने में कम से कम 7 से 8 चक्र लगते हैं, अधिकतम प्रतिक्रिया। जब तक यह पठार तक पहुंचता है, तब तक निषेध को अधिकतम माना जाता है।
स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को मापने के लिए बाह्य प्रवाह विश्लेषक को अनुकूलित करने की एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती ऊतक हाइपोक्सिया को रोकना है। चूंकि माप की पूरी अवधि (लगभग 4 घंटे) के दौरान बफर ऑक्सीजन युक्त नहीं था, इसलिए हाइपोक्सिया एक केंद्रीय मुद्दा था। यह मोटे ऊतक के नमूनों के लिए विशेष रूप से सच है, जहां ऑक्सीजन पूरे नमूनों में फैल नहीं सकता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, स्लाइस को 150 μm मोटाई पर विभाजित किया गया था, ताकि परिवेश ऑक्सीजन मस्तिष्क स्लाइस के बीच में प्रवेश कर सके। एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को पूर्व-ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) बफर में जोड़ा गया था, जिसने अधिकतम ओसीआर के निर्धारण की सुविधा प्रदान की, जैसा कि पहले23 का सुझाव दिया गया था। हमने जांच की कि क्या कोशिकाएं जीवित थीं। सबसे पहले, होचस्ट 33258 (10 μM) और प्रोपिडियम आयोडाइड (10 μM) का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या इन स्थितियों के तहत कोशिकाएं स्वस्थ थीं। फिर हमने जांच की कि पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मध्यम स्पाइनी न्यूरॉन्स कार्यात्मक रूप से स्वस्थ थे या नहीं। हमने आगे मूल्यांकन किया कि स्ट्राइटल स्लाइस में डोपामाइन (डीए) टर्मिनल फास्ट-स्कैन वोल्टामेट्री का उपयोग करके डीए रिलीज को मापकर कार्यात्मक रूप से स्वस्थ थे या नहीं। परिणामों से पता चला कि स्ट्राइटल स्लाइस जो ऑक्सीजन युक्त नहीं थे (एसीएसएफ / बीएसए समूह) ऑक्सीजन युक्त नियंत्रण समूह24 के रूप में स्वस्थ थे।
फिर हमने प्रवाह श्वसन परख के लिए इष्टतम स्ट्रेटल स्लाइस स्थितियों को निर्धारित करने के लिए टुकड़ा मोटाई और पंच आकार के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण किया। विश्लेषक का उपयोग करके ओसीआर विश्लेषण के लिए विभिन्न मोटाई (150 μm और 200 μm) और पंच आकार (1.0 मिमी, 1.5 मिमी और व्यास में 2.0 मिमी) के साथ पृष्ठीय स्ट्राइटल स्लाइस का उपयोग किया गया था। स्ट्रेटल स्लाइस जो व्यास में 1.5 मिमी के पंच आकार के साथ 150 μm मोटे थे, विश्लेषक24 के लिए एक इष्टतम सीमा के भीतर उच्चतम युग्मन दक्षता और ओसीआर थे।
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Protocol
पशु कार्य सहित सभी प्रक्रियाएं राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित की गई थीं और थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गई थीं। 3 से 14 महीने की उम्र में नर एफवीबी / एनटीएसी चूहों का उपयोग किया गया था। निम्नलिखित कदम एक गैर-बाँझ सेटिंग में किए गए थे, लेकिन सब कुछ यथासंभव साफ रखने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए।
नोट: यहां प्रस्तुत विधि की स्थापना की गई थी और झी एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए शोध में उपयोग किया गया था। यहां वर्णित प्रयोगों में एक सीहॉर्स एक्सएफ 24 बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इन विधियों को XFe24 विश्लेषक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और इस विश्लेषक का उपयोग करके कुछ परिणामों की पुष्टि की गई थी।
1. हाइड्रेट कारतूस सेंसर (परख से 1 दिन पहले)
- बाह्य प्रवाह परख किट खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) और सेंसर कारतूस (हरा) और उपयोगिता प्लेट (स्पष्ट) दोनों को हटा दें; चित्रा 1 ए)। सेंसर कारतूस को एक तरफ रखें (सेंसर ऊपर) और सेंसर को स्पर्श न करें।
- उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में कैलिब्रेंट समाधान (पीएच 7.4) के 600 μL जोड़ें। उपयोगिता प्लेट के शीर्ष पर सेंसर कारतूस रखें और कैलिब्रेंट समाधान में सेंसर को डुबोएं। सुनिश्चित करें कि उपयोगिता और सेंसर कारतूस प्लेट के त्रिकोणीय पायदान सही ढंग से गठबंधन कर रहे हैं (चित्रा 1 बी)।
- कैलिब्रेंट समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए सीलिंग फिल्म के साथ बाह्य प्रवाह परख किट सील करें, और फिर इसे 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें जो रात भर सीओ2 या ऑक्सीजन के साथ पूरक नहीं है।
2. ऊतक प्लेट तैयार करें (परख के दिन पर)
- आइलेट कैप्चर माइक्रोप्लेट खोलें और ऊतक बैठने के लिए आइलेट प्लेट को बाहर निकालें।
- पूर्व-ऑक्सीजन युक्त संशोधित कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ, संरचना 140 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 2.4 एमएम सीएसीएल 2, 1.3 एमएम एमजीएसओ4, 0.3 एमएम केएचएसओ 4, 0.3 एमएम केएच 2 पीओ4,25एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.2) बफर की एक उपयुक्त मात्रा (625 μL प्रति अच्छी तरह से) गर्म करें। फिर श्वसन बफर तैयार करने के लिए 4 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता में बीएसए जोड़ें। सामान्य तौर पर, एक प्लेट के लिए 50 एमएल पर्याप्त है।
- आइलेट प्लेट के प्रत्येक कुएं में श्वसन बफर (25 एमएम ग्लूकोज और 4 मिलीग्राम / एमएल बीएसए के साथ पूर्व-ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ बफर) के 625 μL जोड़ें और प्लेट को हिलाने से बचें। सुनिश्चित करें कि सेंसर कारतूस के शीर्ष पर कोई अवशिष्ट बूंदें नहीं हैं और प्रत्येक कुएं के बफर में कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
3. तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस तैयारी और एक्साइज्ड स्लाइस प्लेसमेंट
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद माउस को विघटित करें और तुरंत 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पूर्व-ऑक्सीजन युक्त काटने के समाधान (125 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 26 एमएम एनएएचसीओ3, 3.7 एमएम एमजीएसओ4, 0.3 एमएम केएच2पीओ4, 10 एमएम ग्लूकोज, पीएच 7.4) में मस्तिष्क को विच्छेदित करें।
- बर्फ-ठंडा, पूर्व-ऑक्सीजन युक्त काटने के समाधान में 150 μm की मोटाई पर निर्माता के निर्देश ( सामग्री की तालिका देखें) के बाद एक वाइब्रेटोम के साथ अनुभाग कोरोनल स्ट्रेटल स्लाइस।
- ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ (125 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 26 एमएम एनएएचसीओ 3, 2.4 एमएम सीएसीएल 2,1.3 एमएम एमजीएसओ 4, 0.3 एमएम केएच2 पीओ4, 10 एमएम ग्लूकोज,2एमएम एचईपीईएस, पीएच7.4) के 50 एमएल में स्लाइस पुनर्प्राप्त करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट तक समाधान में रखें।
- वसूली के बाद, श्वसन बफर के 5 एमएल के साथ 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश के लिए स्लाइस हस्तांतरण।
- कटा हुआ मस्तिष्क के वांछित क्षेत्र में ऊतक का एक गोलाकार टुकड़ा बनाने के लिए एक स्टेनलेस स्टील बायोप्सी पंच (जैसे, 1.5 मिमी व्यास) का उपयोग करें। पंच के साथ धीरे से नीचे दबाने के दौरान बफर में टुकड़ा रखें। सुनिश्चित करें कि पंच को ऊतक को काटने के लिए पर्याप्त कठिन धक्का दिया जाता है। बाकी ऊतक निकालें, पंच को दूर उठाएं, और बफर में ऊतक के गोलाकार टुकड़े को हटा दें।
- एक 1.5-2.0 मिमी व्यास के साथ एक छेद बनाने के लिए एक 1 एमएल विंदुक टिप के बहुत अंत में कटौती और पकड़ स्क्रीन के शीर्ष करने के लिए छिद्रित टुकड़ा हस्तांतरण करने के लिए इसका उपयोग करें। छिद्रित मस्तिष्क ऊतक का एक टुकड़ा चूषण और ध्यान से कब्जा स्क्रीन (चित्रा 2 ए) के जाल पक्ष पर ऊतक जगह है। कैप्चर स्क्रीन प्लास्टिक का एक गोलाकार टुकड़ा होगा जिसमें एक तरफ से जुड़ा जाल होगा।
नोट: कैप्चर स्क्रीन माइक्रोप्लेट पैक में शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें) और शूह एट अल .23 में उपयोग किए जाने वाले के समान हैं। - कैप्चर स्क्रीन को संक्षेप में सुखाने के लिए धीरे-धीरे एक पेपर ऊतक का उपयोग करें। नमी को हटाने के साथ, ऊतक चिपचिपा हो जाता है, जो टुकड़ा को जाल के केंद्र से जुड़ने की अनुमति देता है। स्लाइस को बहुत ज्यादा न सुखाएं, अन्यथा, यह क्षतिग्रस्त हो जाएगा।
- चिमटी के साथ कैप्चर स्क्रीन स्लाइस पक्ष को पकड़ो और इसे इनक्यूबेटिंग आइलेट प्लेट (चित्रा 2 बी) के कुओं में से एक में रखें। स्लाइस को छोड़ने के लिए सावधान रहें; यदि हां, तो स्क्रीन को बाहर निकालें और उस पर एक नया टुकड़ा रखें।
नोट: आइलेट प्लेट में दो पृष्ठभूमि सुधार कुओं (ए 1 और डी 6) में मस्तिष्क स्लाइस न रखें। - परख चलाने से पहले तापमान और पीएच संतुलन की अनुमति देने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर आइलेट प्लेट सेते हैं।
4. वांछित यौगिकों के साथ कारतूस की लोडिंग
- संशोधित एसीएसएफ (37 डिग्री सेल्सियस) में वांछित यौगिकों को क्रमशः बंदरगाहों ए से डी के लिए काम करने वाली एकाग्रता के 10x, 11x, 12x, और 13x की अंतिम स्टॉक एकाग्रता में पतला करें, और पीएच 7.4 में समायोजित करें। परीक्षण पोर्ट ए से डी तक यौगिकों को प्रशासित करेगा। इस प्रयोग के लिए, निम्नलिखित समाधानों का उपयोग किया गया था, उनके सामने उल्लिखित उनके संबंधित कामकाजी एकाग्रता के साथ: 10 एमएम पाइरूवेट (पोर्ट ए), 20 μM ओलिगोमाइसिन (पोर्ट बी), 10 μM या एफसीसीपी (पोर्ट सी) की अन्य सांद्रता, और 20 μM एंटीमाइसिन ए (पोर्ट डी)।
- सेंसर कारतूस के उपयुक्त इंजेक्शन बंदरगाहों में पतला यौगिकों के धीरे-धीरे 75 μL प्रीलोड करें। इंजेक्शन बंदरगाह की दीवार के खिलाफ टिप के साथ 45 ° कोण पर इंजेक्शन बंदरगाहों में आधे रास्ते में युक्तियां रखें। युक्तियों को इंजेक्शन बंदरगाहों के नीचे पूरी तरह से नहीं डाला जाना चाहिए क्योंकि इससे बंदरगाह के माध्यम से यौगिक रिसाव हो सकता है।
- हवाई बुलबुले बनाने से बचने के लिए बंदरगाहों से युक्तियों को सावधानीपूर्वक वापस लें। हवा के बुलबुले को कम करने से बचने के लिए कारतूस के किसी भी हिस्से को टैप न करें।
- नेत्रहीन भी लोड हो रहा है के लिए इंजेक्शन बंदरगाहों का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि सभी तरल बंदरगाह में हैं और कारतूस के शीर्ष पर कोई अवशिष्ट बूंदें मौजूद नहीं हैं।
- उपयोगिता प्लेट पर सेंसर कारतूस रखें और इसे 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (गैर-सीओ2) में डाल दें ताकि इसे फिर से 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति मिल सके। केवल उपयोगिता प्लेट पर पकड़कर सावधानी से संभालें। जितना हो सके उतना कम चलें।
5. अंशांकन और परख प्रदर्शन
- सॉफ्टवेयर में परख टेम्पलेट लोड करें। हरे रंग का स्टार्ट बटन दबाएं।
- सही प्रोटोकॉल लोड करना सुनिश्चित करें। प्रोटोकॉल 3 मिनट मिश्रण, 3 मिनट प्रतीक्षा, और 2 मिनट उपाय अनुक्रम (इन तीन चरणों एक माप फार्म) का एक संयोजन शामिल है। उपकरण सेटिंग्स25 के तहत हार्डवेयर सेटिंग्स में जांच सिर की दूरी 26,600 से 27,800 तक बदलें। एक्सएफई 24 विश्लेषक के लिए जांच सिर को बदलने की कोई आवश्यकता नहीं है। प्रारंभ दबाएँ।
- उपकरण ट्रे में उपयोगिता प्लेट पर सेंसर कारतूस लोड करें। पायदान सामने, बाएं कोने में जाता है। सुनिश्चित करें कि प्लेट सही ढंग से बैठती है और सपाट है। अंशांकन के लिए विश्लेषक में दवा से भरे सेंसर कारतूस लोड करें।
- सेंसर को कैलिब्रेट और संतुलित करने के लिए स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें। इसमें लगभग 30 मिनट लगते हैं।
- एक बार अंशांकन कदम हो जाने के बाद, अंशांकन प्लेट को हटा दें और इसे आइलेट प्लेट (जाल और ऊतक स्लाइस युक्त) के साथ बदलें।
- परख प्रोटोकॉल का उपयोग प्लेट के प्रत्येक कुएं में ऑक्सीजन की खपत को मापने। प्रोटोकॉल में 3 मिनट मिश्रण, 3 मिनट प्रतीक्षा, और 2 मिनट माप अनुक्रम (ये तीन चरण एक माप बनाते हैं) का संयोजन होता है, जिस बिंदु पर ओसीआर की गणना की जाती है।
- पूरे प्रयोग के लिए, एक आधाररेखा बनाने के लिए 4x OCR माप शामिल करें, इसके बाद 4x माप के साथ पोर्ट ए (पाइरूवेट) का इंजेक्शन, फिर 8x माप के साथ पोर्ट बी (ओलिगोमाइसिन) का इंजेक्शन, फिर 5x माप के साथ पोर्ट सी (एफसीसीपी) का इंजेक्शन, और अंत में, 6x माप के साथ पोर्ट डी (एंटीमाइसिन ए) का इंजेक्शन।
नोट: प्रत्येक यौगिक इंजेक्शन के बाद माप की यह संख्या इस बात पर निर्भर करती है कि माप पठार तक कब पहुंचता है। - ओसीआर माप डेटा और युग्मन दक्षता डेटा का विश्लेषण करें।
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Representative Results
इस अध्ययन का पहला कदम टुकड़ा मोटाई और पंच आकार का अनुकूलन करना था जिसका उपयोग स्लाइस (चित्रा 3 ए) से स्ट्रिएटम के एक खंड को उत्पादित करने के लिए किया जाता था। 150 μm मोटाई और एक 1.5 मिमी पंच आकार पर एक टुकड़ा युग्मन दक्षता (चित्रा 3 बी-सी) द्वारा निर्धारित सर्वोत्तम परिणाम दिया। जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, ओसीआर 10% से कम रन डाउन के साथ 5 घंटे के लिए अपेक्षाकृत स्थिर है। इसके अलावा, कार्यात्मक माप का उपयोग किया गया था, साथ ही स्ट्रिएटम में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स और मध्यम स्पाइनी न्यूरॉन्स की पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, और डीए रिलीज के फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टामेट्री (एफएससीवी) माप, यह प्रदर्शित करने के लिए कि न्यूरॉन्स और टर्मिनल इस तैयारी में पूरी तरह कार्यात्मक थे, जैसा कि झी एट अल 24 में दिखाया गया है। इसके साथ शामिल, हमने तब एफसीसीपी की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण किया ताकि यह पता लगाया जा सके कि कौन सी सबसे अच्छी प्रतिक्रिया देगी; 10 μM FCCP अतिरिक्त श्वसन क्षमता द्वारा निर्धारित सबसे अच्छा रीडआउट (चित्रा 3 डी 1, डी 2) दिया:
अतिरिक्त श्वसन क्षमता = अधिकतम श्वसन - बेसल श्वसन
इन स्लाइस स्थितियों का उपयोग पिंक 1 केओ चूहों और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) लिटरमेट्स से स्ट्रेटल स्लाइस के ओसीआर में अंतर को मापने के लिए किया गया था। पिंक 1 केओ और डब्ल्यूटी चूहों के परिणामों के लिए, 3-4 चूहों का उपयोग किया गया था और प्रति माउस 4-6 प्रतिकृतियों का उपयोग किया गया था और एक डेटा बिंदु प्राप्त करने के लिए औसत किया गया था। चूंकि पिंक 1 माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का एक प्रमुख नियामक है, इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता को केओ चूहों में पाए जाने की उम्मीद थी, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर में कमी से मापा जाता है। दरअसल, ओसीआर में एक आयु-निर्भर कमी उनके डब्ल्यूटी नियंत्रण (चित्रा 4 ए, डी) की तुलना में केओ चूहों में स्पष्ट थी। बेसल ओसीआर युवा चूहों (3-4 महीने) के लिए केओ और डब्ल्यूटी दोनों समूहों में समान था; हालांकि, पुराने समूह (10-14 महीने) में केओ चूहों के लिए बेसल ओसीआर में कमी आई; चित्रा 4 बी, ई)। युग्मन दक्षता, नीचे के रूप में निर्धारित,
युग्मन दक्षता = [एटीपी उत्पादन दर] / [बेसल श्वसन दर] 100 ×
हालांकि, युवा और बूढ़े दोनों समूहों (चित्रा 4 सी, एफ) के लिए केओ चूहों में कमी आई है। यह डेटा दर्शाता है कि पिंक 1 केओ चूहों से स्ट्रेटल ऊतक के वर्गों में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता थी। केओ चूहों में यह शिथिलता भी कम उम्र से शुरू हुई, जो कम युग्मन दक्षता से संकेत मिलता है, हालांकि बेसल ओसीआर केवल पुराने समूह में कम हो गया था। यह आयु-निर्भर कमी संभवतः पिंक 1 के नॉकआउट के कारण माइटोकॉन्ड्रियल दोषों को जमा करने का परिणाम थी।
चित्रा 1: बाह्य प्रवाह विश्लेषक हाइड्रेट कारतूस सेंसर और प्लेट दिखा छवियों। (ए) सेंसर कारतूस एक अंशांकन प्लेट (उपयोगिता प्लेट) के शीर्ष पर बैठे। (बी) उपयोगिता प्लेट और सेंसर कारतूस प्लेट का साइड व्यू। उपयोगिता और सेंसर कारतूस प्लेट के त्रिकोणीय पायदान को सही ढंग से संरेखित किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: छिद्रित टुकड़ा लगाव और प्लेसमेंट ( ए ) छिद्रित टुकड़ा कैप्चर स्क्रीन के जाल डालने से जुड़ा हुआ है, और फिर (बी) इनक्यूबेटिंग आइलेट प्लेट के कुओं में से एक में सावधानीपूर्वक रखा जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि टुकड़ा माप के दौरान अलग या स्थानांतरित नहीं होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रवाह श्वसन परख के लिए इष्टतम स्ट्रेटल स्लाइस स्थिति ( ए) विश्लेषण के लिए प्राप्त किए गए क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले लाल हलकों के साथ स्ट्रिएटम (एसटीआर) के लिए ऊतक पंच आकार (1.0 मिमी, 1.5 मिमी और व्यास में 2.0 मिमी) का आरेख। (बी 1) नियंत्रण समूह में स्लाइस की विभिन्न मोटाई और पंच आकारों के लिए ओ2 खपत दर (ओसीआर) ने पूरे माप (4 घंटे) पर स्थिर बेसल श्वसन दिखाया, और ओसीआर स्लाइस की मात्रा के आनुपातिक था। ओसीआर को 1.0 मिमी, 1.5 मिमी और 2.0 मिमी पंच द्वारा छिद्रित 150 μm और 200 μm मोटाई स्लाइस में मापा गया था। उपयोग किए गए संयोजनों का उल्लेख किंवदंतियों में मोटाई * पंच आकार (जैसे, 150 μm * 1 मिमी) के रूप में किया गया है। (बी 2) 1.5 मिमी पंच द्वारा छिद्रित 150 μm मोटाई स्लाइस में मापा गया औसत ओसीआर; एन = 7। (सी 1) 10 एमएम पाइरूवेट (पी), 20 μM ओलिगोमाइसिन (ओ), 10 μM एफसीसीपी (एफ), और 20 μM एंटीमाइसिन ए (ए) के साथ विभिन्न मोटाई और व्यास पर स्लाइस के प्रतिनिधि ओसीआर प्रतिक्रियाओं को क्रमिक रूप से इंजेक्ट किया गया। तीर इन यौगिकों के इंजेक्शन के समय बिंदु को इंगित करते हैं। (सी 2) माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन दक्षता की तुलना विभिन्न समूहों के बीच की गई थी। 150 μm * 1.5 मिमी के स्लाइस में उच्च युग्मन दक्षता थी लेकिन सबसे छोटा विचरण था; एन = 4। (डी 1) एफसीसीपी के लिए अनुमापन प्रयोग किया गया था, और 10 μM एफसीसीपी ने सबसे बड़ी अतिरिक्त क्षमता दी; प्रत्येक समूह के लिए एन = 4। (डी 2) एफसीसीपी के लिए अनुमापन प्रयोगएक विश्लेषक के साथ किए गए थे, और 10 μM एफसीसीपी ने सबसे बड़ी अतिरिक्त क्षमता दी; प्रत्येक समूह के लिए एन = 4। आंकड़ों में दिए गए मान माध्य ± माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि हैं। इस आंकड़े को झी एट अल 24 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: पुराने समूह से पिंक 1 केओ स्लाइस काफी कम ओसीआर दिखा रहा है। युवा (ए, बी, और सी) और पुराने समूहों (डी, ई, और एफ) में चूहों से तीव्र एसटीआर स्लाइस (150 μm * 1.5 मिमी) के ओसीआर, श्वसन मॉड्यूलेटर के क्रमिक परिवर्धन के संपर्क में (तीर का उपयोग करके दिखाया गया)। युवा समूह का ओसीआर विभिन्न जीनोटाइप (बी) के बीच काफी भिन्न नहीं था, जबकि युग्मन दक्षता (ऊपर उल्लिखित सूत्र का उपयोग करके प्रतिशत मूल्य के रूप में निर्धारित) पिंक 1 केओ स्लाइस (सी) में कम हो गई थी। पुराने समूह में, पिंक 1 कोस्लाइसेस ने बेसल श्वसन स्तर (ई) और युग्मन दक्षता (एफ) में काफी कमी दिखाई। निम्नलिखित समाधान, 10 एमएम पाइरूवेट (पी), 20 μM ओलिगोमाइसिन (ओ), 10 μM एफसीसीपी (एफ), और 20 μM एंटीमाइसिन ए (ए), क्रमिक रूप से इंजेक्ट किया गया था। प्रत्येक जीनोटाइप और उम्र के लिए एन = 4। आंकड़ों में दिए गए मान एसईएम ± माध्य हैं। अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता था जब पी 0.05 (*) <। इस आंकड़े को झी एट अल से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हमारे द्वारा विकसित विधि ने एक्सएफ विश्लेषक को 4 घंटे की अवधि में वयस्क चूहों से स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर को मापने के लिए उपयोग करने की अनुमति दी। यह विधि शारीरिक रूप से परिभाषित मस्तिष्क संरचनाओं से निकलने वाले घूंसे में सेलुलर बायोएनर्जेटिक्स को मापने का एक नया तरीका प्रदान करती है। चूंकि विश्लेषण किए जा रहे ऊतक के नमूने बल्कि छोटे होते हैं, इसलिए किसी बीमारी में शामिल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के चयापचय मापदंडों की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, तीव्र स्लाइस का उपयोग शारीरिक सेलुलर वातावरण की अधिक बारीकी से नकल करता है, जिसे पृथक माइटोकॉन्ड्रिया या सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, एक जानवर से या एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में कई जानवरों में कई मस्तिष्क क्षेत्रों में ओसीआर को मापने से इस नई तकनीक को लागू करने वाले अध्ययनों की सांख्यिकीय शक्ति बढ़ जाती है।
यह वयस्क चूहों से तीव्र स्ट्रेटल स्लाइस में ओसीआर माप का पहला प्रोटोकॉल है। ध्यान एसटीआर पर था क्योंकि यह मुख्य रूप से पीडी और हंटिंगटन रोग में शामिल मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक है। हमारे अध्ययन में बेसल ओसीआर और युग्मन दक्षता एक्सएफ विश्लेषक25,26,27 का उपयोग करके तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में ओसीआर को मापने वाले अन्य अध्ययनों के बराबर है। हालांकि, हमारे अध्ययन में स्ट्रेटल स्लाइस की अतिरिक्त श्वसन क्षमता अन्य रिपोर्टों की तुलना में छोटी लगती है जो अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों को मापती हैं। अभी भी अज्ञात है कि क्या यह अंतर मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच अतिरिक्त श्वसन क्षमता में सच्चे अंतर या टुकड़ा तैयारी, एक्साइज्ड स्लाइस प्लेसमेंट या माउस तनाव में मामूली अंतर को दर्शाता है। ये मतभेद आगे की जांच की आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं, जिनमें तीव्र मस्तिष्क स्लाइस तैयार करना, छिद्रित स्लाइस को कैप्चर स्क्रीन के शीर्ष पर स्थानांतरित करना और स्लाइस को कुएं में रखना शामिल है। माप के दौरान स्लाइस को कैप्चर स्क्रीन से जुड़ा रखा जाना चाहिए। अन्यथा, यदि टुकड़ा स्क्रीन से अलग हो जाता है और प्लेट के कुएं में बैठता है, तो यह ऑक्सीजन सेंसर से बहुत दूर होगा, जिसके परिणामस्वरूप ओसीआर का बहुत कम रीडआउट और दवाओं के प्रति प्रतिक्रियाएं होंगी। हम प्रत्येक स्थिति के लिए कम से कम चार प्रतिकृतियों (एक ही क्षेत्र में चार उत्सर्जित मस्तिष्क स्लाइस) की सलाह देते हैं और अलग स्लाइस के परिणामों को छोड़कर। ओसीआर ऊतक सामग्री के लिए आनुपातिक होना चाहिए। इस अध्ययन ने ऊतक राशि को मापा नहीं क्योंकि मस्तिष्क को एक ही मोटाई पर कटा हुआ था, और टुकड़ा एक ही पंचर का उपयोग करके छिद्रित किया गया था। इस प्रकार, ऊतक की मात्रा स्थिर थी, और ऊतक सामग्री निर्धारित करने की कोई आवश्यकता नहीं थी। तीखेपन को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्लेट (24 स्लाइस) के लिए एक नए पंचर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है और इस प्रकार, ऊतक की समान मात्रा। इसके अलावा, सेक्शनिंग, ऊतक घूंसे तैयार करना, और माउस प्रति स्लाइस संलग्न करने में लगभग 30 मिनट लगते हैं और चूहों के दो जोड़े के लिए कुल मिलाकर लगभग 2 घंटे लगते हैं। तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की स्थिरता इष्टतम स्थितियों में भी सेक्शनिंग के बाद केवल 7-8 घंटे के लिए अच्छी है (न्यूरॉन्स की स्वस्थ स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए संवेदनशील कार्यात्मक परख-पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया) और इस प्रकार, 96 अच्छी तरह से सेटअप का उपयोग करना व्यावहारिक नहीं हो सकता है।
तकनीक की उपयोगिता को स्पष्ट करने के लिए, हमने पिंक 1 केओ चूहों और उनके डब्ल्यूटी लिटरमेट्स से स्ट्राइटल स्लाइस से ओसीआर को मापा। आयु-मिलान डब्ल्यूटी नियंत्रणों की तुलना में वृद्ध पिंक 1 केओ चूहों के बेसल श्वसन में एक महत्वपूर्ण कमी पाई गई, जो आयु-निर्भर डीए रिलीज घाटे24 के अनुरूप थी। यह अवलोकन पहले प्रकाशित अध्ययनों के साथ भी संरेखित करता है, इस प्रोटोकॉल की वैधता की पुष्टि करता है। विधियों की सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, ओसीआर को तीव्र स्ट्रेटल मस्तिष्क के टुकड़े से मापा गया था, जो संभवतः मस्तिष्क गतिविधि-स्वतंत्र है और ज्यादातर निष्क्रिय मध्यम स्पाइनी न्यूरॉन्स और डोपामिनर्जिक टर्मिनलों, साथ ही एस्ट्रोसाइट्स प्रदान करता है। इसके अलावा, विधि में सेल प्रकार-विशिष्ट रिज़ॉल्यूशन नहीं है।
संक्षेप में, यह उपन्यास विधि वयस्क चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में ओसीआर को मापती है और दर्शाती है कि पिंक 1, एक पीडी से संबंधित जीन, चूहों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को कैसे प्रभावित करता है। यह विधि पीडी और हंटिंगटन रोग के क्षेत्र में काम करने वाले शोधकर्ताओं के लिए लागू करना आसान है और व्यापक रूप से लागू है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम वांगचेन त्सेरिंग और पामेला वाल्टर को इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) (एनएस 054773 से सीजेएल और एनएस 0 9 83 9 3 से एचजेड) और थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय में तंत्रिका विज्ञान विभाग (एचजेड के लिए स्टार्टअप फंड) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
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