Summary
耗氧率（OCR）是线粒体功能的常见代理，可用于研究不同的疾病模型。我们开发了一种使用Seahorse XF分析仪的新方法，直接测量成年小鼠急性纹状体切片中的OCR，该方法比其他方法更具生理相关性。
Abstract
线粒体在细胞ATP产生，活性氧调节和Ca2 + 浓度控制中起重要作用。线粒体功能障碍与多种神经退行性疾病的发病机制有关，包括帕金森病（PD），亨廷顿病和阿尔茨海默病。为了研究线粒体在这些疾病的模型中的作用，我们可以通过耗氧率（OCR）作为线粒体功能的代表来测量线粒体呼吸。OCR已经在细胞培养物以及分离的线粒体中成功测量。然而，与在急性脑切片中测量OCR相比，这些技术在生理上的相关性较低。为了克服这一限制，作者开发了一种使用Seahorse XF分析仪的新方法，直接测量成年小鼠急性纹状体切片中的OCR。该技术经过优化，重点是纹状体，纹状体是参与PD和亨廷顿舞蹈症的大脑区域。该分析仪使用24孔板进行活细胞测定，允许同时测量24个样品的动力学。该方法使用圆形打孔的纹状体脑切片作为样品。我们通过鉴定PD小鼠模型纹状体切片中较低的基础OCR来证明该技术的有效性。这种方法将引起从事PD和亨廷顿舞蹈症研究领域的研究人员的广泛兴趣。
Introduction
线粒体功能障碍与几种神经系统疾病有关，包括帕金森病（PD），亨廷顿病和阿尔茨海默病1，2，3。PD模型如PINK1敲除（KO）小鼠和大鼠显示线粒体功能受损4，5，6，7，8，9，10，11。从纹状体（STR）或老年PINK1 KO小鼠的全脑分离的线粒体在复合物I7，10，12，13中表现出缺陷。直接测量耗氧率（OCR）是评估线粒体功能的最常用方法之一，因为OCR与ATP产生相结合，ATP是线粒体14的主要功能。因此，在疾病模型或患者来源的样本/组织中测量OCR可以帮助研究线粒体功能障碍如何导致疾病。
目前，测量线粒体OCR的方法有几种，包括Clark电极和其他O2电极，O2荧光染料，以及细胞外通量分析仪15，16，17，18，19。作为一个优点，基于O2电极的方法允许轻松添加各种基板。然而，它们不足以同时测量多个样品。与传统的基于O2电极的方法相比，细胞外通量分析仪是细胞培养物或纯化线粒体中常用的OCR工具，可提高通量15，18，20。然而，所有这些方法通常用于测量分离的线粒体或细胞培养物6，16，17，19，20，21中的OCR。线粒体的分离导致无意的损害，并且提取的线粒体或细胞培养物在生理上的相关性低于完整的脑切片22。即使将微电极用于切片中，它们也比培养细胞23更不敏感且更难以操作。
为了应对这些挑战，我们开发了一种使用XF24细胞外通量分析仪的方法，该方法允许分析来自小鼠24急性纹状体脑切片的多种代谢参数。该技术通过OCR提供线粒体呼吸的连续直接定量。简而言之，将小部分纹状体脑切片放入胰岛板的孔中，分析仪使用基于氧和质子荧光的生物传感器测量OCR和细胞外酸化速率，分别为17，21，25。
分析仪的独特功能之一是四个进样孔，允许继续测量OCR，同时按顺序进样多达四种化合物或试剂。这样可以测量几个细胞呼吸参数，例如基础线粒体OCR，ATP连接OCR和最大线粒体OCR。在测量此处显示的方案期间注入的化合物是第一个溶液孔（端口A）中10 mM丙酮酸盐的工作浓度，第二个溶液孔（端口B）中20μM寡霉素的工作浓度，第三孔（端口C）中的10μM羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）和第四孔（端口D）中20μM抗霉素A， 基于弗里德等人25。必须注意的是，这些浓度是工作浓度，分别将10x，11x，12x和13x的储备溶液注入溶液端口A至D。使用每种溶液的目的是：1）丙酮酸盐是必要的，因为没有它，FCCP的添加将因可用底物的限制而降低OCR响应;2）寡霉素抑制ATP合酶并允许测量ATP连锁呼吸;3）FCCP将氧化与磷酸化解耦，并允许测量最大线粒体容量;4）抗霉素A抑制电子传递链中的复合物III，因此允许测量与线粒体无关的OCR。
根据以下原因确定使用的寡霉素浓度：1）大多数细胞类型（分离的线粒体或细胞培养物）的寡霉素推荐剂量为1.5μM。根据经验，通常将解离细胞剂量的3x-10x用于切片实验，因为可能存在梯度，并且切片中溶液的渗透需要时间。因此，浓度应在5μM至25μM的范围内。由于寡霉素的非特异性毒性，没有尝试更高的浓度。3）在Underwood等人的报告中，作者对寡霉素进行了滴定实验，发现6.25，12.5，25和50μg/ mL的剂量导致类似的抑制。较高浓度的寡霉素（50μg/mL）不会抑制更多，但具有更大的差异。4）在我们的观察中，决定因素似乎是寡霉素的穿透能力。寡霉素很难穿透组织，这就是为什么至少需要7到8个周期才能达到平台，最大的反应。只要它到达高原，就假定抑制是最大的。
调整细胞外通量分析仪以测量纹状体切片中的OCR的一个关键技术挑战是防止组织缺氧。由于缓冲液在整个测量期间（约4小时）没有含氧，缺氧是一个核心问题。对于较厚的组织样品尤其如此，其中氧气不能扩散到整个样品中。为了克服这个问题，切片以150μm的厚度切片，以便环境氧气可以穿透大脑切片的中间。此外，将4 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）加入到预含氧人工脑脊液（ACSF）缓冲液中，这有助于测定最大OCR，如前所述23。我们检查了细胞是否存活。首先，使用Hoechst 33258（10μM）和碘化丙啶（10μM）来检查细胞在这些条件下是否健康。然后，我们使用膜片钳记录检查中等多棘神经元的功能是否健康。我们通过使用快速扫描伏安法测量DA释放，进一步评估纹状体切片中的多巴胺（DA）末端是否功能健康。结果显示，未含氧的纹状体切片（ACSF/BSA组）与含氧对照组24一样健康。
然后，我们测试了切片厚度和冲头尺寸的不同组合，以确定通量呼吸测定的最佳纹状体切片条件。使用分析仪对不同厚度（150 μm和200 μm）和冲头尺寸（直径为1.0 mm、1.5 mm和2.0 mm）的背纹状体切片进行OCR分析。直径为1.5 mm的纹状体切片厚150 μm，具有最高的耦合效率，OCR在分析仪24的最佳范围内。
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Protocol
包括动物工作在内的所有程序都是根据国家和国际准则进行的，并得到了托马斯杰斐逊大学动物护理和使用委员会的批准。使用3至14个月大的雄性FVB / NTac小鼠。以下步骤是在非无菌环境中执行的，但应谨慎行事，以保持一切尽可能干净。
注：此处介绍的方法已在Zhi等人报告的研究中建立和使用。这里描述的实验使用了海马XF24细胞外通量分析仪（参见 材料表）。这些方法可以适用于XFe24分析仪，并且使用该分析仪证实了一些结果。
1. 水合物墨盒传感器（测定前 1 天）
- 打开细胞外通量测定试剂盒（参见 材料表），取出传感器盒（绿色）和实用板（透明; 图 1A）。将传感器盒放在一边（传感器向上），不要触摸传感器。
- 向实用板的每个孔中加入600μL校准液（pH 7.4）。将传感器盒放在实用板的顶部，然后将传感器浸入校准液中。确保实用程序和传感器盒板的三角形凹口正确对齐（图1B）。
- 用密封膜密封细胞外通量测定试剂盒，以防止口径溶液蒸发，然后将其置于未补充CO2 或氧气的37°C培养箱中过夜。
2.准备组织板（在测定当天）
- 打开胰岛捕获微孔板，取出胰岛板进行组织坐下。
- 将适当体积（每孔625μL）的预氧改性人工脑脊液（ACSF，组成140mM NaCl，2.5mM氯化物，2.4mM氯化钙2，1.3mMMgSO4，0.3mM KH2PO4，25mM葡萄糖，10mM HEPES，pH 7.2）缓冲液在50 mL管中加热至37°C。然后将BSA加入终浓度为4mg / mL以制备呼吸缓冲液。一般来说，50 mL足以容纳一个板。
- 小心地向胰岛板的每个孔中加入625μL呼吸缓冲液（具有25mM葡萄糖和4mg / mL BSA的预氧化ACSF缓冲液），并避免摇动板。确保传感器滤芯顶部没有残留液滴，并且每个孔的缓冲液中没有气泡。
3. 急性纹状体切片制备及切除切片放置
- 颈椎脱位后将小鼠斩首，并立即在10mL冰冷的预氧切割液（125mM氯化钠，2.5mM KCl，26mM NaHCO 3，3.7mMMgSO4，0.3mM KH2PO4，10mM葡萄糖，pH 7.4）中解剖大脑。
- 使用振动仪在150μm的冰冷预含氧切割溶液中以150μm的厚度使用振动仪切片。
- 在50毫升含氧的ACSF（125毫升氯化钠，2.5毫摩尔氯化物，26毫升纳氏3，2.4毫升钙氯化物2，1.3毫升MgSO4，0.3米M KH2PO4，10毫升葡萄糖，2毫升HEPES，pH 7.4）中回收切片，并在室温（RT）下保持在溶液中长达30分钟。
- 回收后，将切片转移到带有5 mL呼吸缓冲液的35 mm x 10 mm培养皿中。
- 使用不锈钢活检冲头（例如，直径1.5毫米）在切片大脑的所需区域创建一个圆形组织块。将切片保持在缓冲液中，同时用冲头轻轻向下按压。确保将冲头向下推足够用力以切割组织。取出组织的其余部分，将冲头抬起，然后将圆形组织片取出到缓冲液中。
- 切开1 mL移液器吸头的最末端，形成一个直径为1.5-2.0 mm的孔，并用它来固定并将打孔切片转移到捕获屏幕的顶部。抽取一块打孔的脑组织，并将组织小心地放在捕获屏幕的网状侧（图2A）。捕获屏幕将是一块圆形塑料，一侧连接有网格。
注意：捕获屏幕包含在微孔板包装中（参见 材料表），类似于Schuh等人23中使用的捕获屏幕。 - 轻轻地使用纸巾短暂干燥捕获屏幕。随着水分的去除，组织变得粘稠，这使得切片附着在网的中心。不要将切片过多地干燥，否则会损坏。
- 用镊子将捕获屏幕切片面朝下，然后将其放入孵育胰岛板的一个孔中（图2B）。注意不要掉落切片;如果是这样，请取出屏幕并在其上放置一个新切片。
注意：不要将脑切片放入胰岛板中的两个背景校正孔（A1和D6）中。 - 在运行测定之前，将胰岛板在37°C下孵育至少30分钟，以使温度和pH平衡。
4. 装载含有所需化合物的墨盒
- 将所需化合物在改性ACSF（37°C）中稀释至最终储备浓度分别为端口A至D的工作浓度的10倍、11倍、12倍和13倍，并调节至pH 7.4。该测试将按从端口A到D的顺序管理化合物。对于该实验，使用以下溶液，其各自的工作浓度在它们之前提到：10mM丙酮酸盐（端口A），20μM寡霉素（端口B），10μM或其他浓度的FCCP（端口C）和20μM抗霉素A（端口D）。
- 轻轻地将75μL稀释的化合物预装到传感器盒的适当进样口中。将吸头以45°角将吸头放在注射口的一半，吸头靠在注射口壁上。吸头不应完全插入注射口的底部，因为这可能会导致化合物通过进样口泄漏。
- 小心地从端口中取出吸头，以避免产生气泡。请勿轻触滤芯的任何部分，以免产生气泡。
- 目视检查注射口是否均匀装载。确保所有液体都在端口中，并且墨盒顶部没有残留物。
- 将传感器盒放在实用板上，将其放入培养箱（非CO2）中30分钟，使其再次加热至37°C。只需抓住实用板即可小心处理。尽可能少地移动。
5. 校准和执行测定
- 在软件中加载测定模板。按绿色的 “开始” 按钮。
- 确保加载正确的协议。该协议包含3分钟混合，3分钟等待和2分钟测量序列的组合（这三个步骤形成一个测量）。在仪器设置 25 下的硬件设置中，将探头的距离从 26，600 更改为27，800。无需更换 XFe24 分析仪的探头。按 开始。
- 将实用程序板上的传感器盒装入仪器托盘。缺口位于前方左下角。确保板正确放置且平整。将充满药物的电极盒装入分析仪进行校准。
- 按照屏幕上的说明校准和平衡传感器。这大约需要30分钟。
- 校准步骤完成后，取出校准板并用胰岛板（包含网状和组织切片）替换它。
- 使用测定方案测量板每个孔中的氧气消耗量。该协议包含3分钟混合，3分钟等待和2分钟测量序列的组合（这三个步骤形成一个测量），此时计算OCR。
- 对于整个实验，包括4x OCR测量以创建基线，然后以4x测量值注射端口A（丙酮酸盐），然后以8x测量值注射端口B（寡霉素），然后以5x测量值注入端口C（FCCP），最后以6x测量值注入端口D（抗霉素A）。
注意：每次复合进样后的测量次数取决于测量到达平台的时间。 - 分析OCR测量数据和耦合效率数据。
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Representative Results
本研究的第一步是优化切片厚度和冲头尺寸，用于从切片中切除纹状体的一部分（图3A）。厚度为 150 μm 的切片和 1.5 mm 的冲头尺寸可获得最佳结果，由耦合效率决定（图 3B-C）。如图3B所示，OCR在5小时内相对稳定，运行速度小于10%。此外，使用功能测量，以及纹状体中皮质神经元和中多棘神经元的膜片钳记录，以及DA释放的快速扫描循环伏安法（FSCV）测量，以证明该制备中的神经元和末端功能齐全，如Zhi等人24所示。与此一起，我们随后测试了不同浓度的FCCP，以发现哪种能给出最佳响应;10 μM FCCP给出了最佳读数（图3D1，D2），由备用呼吸能力决定：
备用呼吸能力 = 最大呼吸 - 基础呼吸
这些切片条件用于测量PINK1 KO小鼠和野生型（WT）幼崽的纹状体切片的OCR差异。对于PINK1 KO和WT小鼠的结果，使用3-4只小鼠，每只小鼠使用4-6个重复并取平均值以获得一个数据点。由于PINK1是线粒体功能的关键调节剂，因此预计在KO小鼠中会发现线粒体功能障碍，通过线粒体OCR降低来测量。事实上，与WT对照组相比，KO小鼠的OCR的年龄依赖性降低是显而易见的（图4A，D）。年轻小鼠（3-4个月）的KO组和WT组的基础OCR相似;然而，老组KO小鼠的基础OCR降低（10-14个月; 图 4B，E）。耦合效率，确定如下，
耦合效率=[ATP生产率]/[基础呼吸速率]× 100
然而，年轻和老年组的KO小鼠减少（图4C，F）。该数据表明，来自PINK1 KO小鼠的纹状体组织切片具有线粒体功能障碍。KO小鼠的这种功能障碍也从年轻时开始，由耦合效率降低表示，尽管基础OCR仅在老年组中降低。这种年龄依赖性下降可能是由于PINK1的敲除引起的线粒体缺陷累积的结果。
图 1：显示细胞外通量分析仪水合物盒式传感器和板的图像。 （A） 传感器滤芯位于校准板（实用板）的顶部。（B） 实用板和传感器插装板的侧视图。实用程序和传感器盒板的三角形凹口应正确对齐。 请点击此处查看此图的大图。
（A）将冲孔切片附着在捕获屏幕的网格插入物上，然后（B）小心地放入孵化胰岛板的一个孔中，以确保切片在测量过程中不会脱落或移动。请点击此处查看此图的大图。
图3：通量呼吸测定的最佳纹状体切片条件 （A）纹状体（直径1.0mm，1.5mm和2.0mm）的组织冲孔尺寸（直径1.0mm，1.5mm和2.0mm）图，红色圆圈代表为分析获得的区域。（B1）对照组不同厚度和冲孔尺寸的切片O2 消耗率（OCR）在整个测量过程中（4 h）表现出稳定的基础呼吸，OCR与切片体积成正比。OCR在150μm和200μm厚度的切片中测量，冲孔1.0毫米，1.5毫米和2.0毫米冲头。所使用的组合在图例中称为厚度 * 冲头尺寸（例如，150 μm * 1 mm）。（二）在1.5毫米冲孔的150μm厚度切片中测量的平均OCR;n = 7。（C1）依次注射10mM丙酮酸（P），20μM寡霉素（O），10μM FCCP（F）和20μM抗霉素A（A）的不同厚度和直径切片的代表性OCR响应。箭头表示这些化合物的注射时间点。（三）比较不同组的线粒体偶联效率。150 μm * 1.5 mm的切片具有高耦合效率但变化最小;n = 4。（D1）对燃料电池氧丙烷进行了滴定实验，10 μM燃料氯化石蜡的剩余容量最大;n = 4（每个组）。（二）使用分析仪对 FCCP 进行滴定实验，10 μM FCCP 的备用容量最大;n = 4（每个组）。图中给出的值是平均值±平均值的标准误差（SEM）。这个数字是从Zhi等人24修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：来自旧组的 PINK1 KO 切片显示出明显较低的 OCR。 来自年轻（A， B和 C）和老年组（D， E和 F）小鼠的急性STR切片（150μm * 1.5mm）的OCR，暴露于连续添加的呼吸调节剂（使用箭头显示）。年轻组的OCR在不同基因型（B）之间没有显着差异，而PINK1 KO切片（C）的偶联效率（使用上述公式确定为百分比值）降低。在旧组中，PINK1 KOslices显示基础呼吸水平（E）和耦合效率（F）显着降低。依次注射以下溶液10mM丙酮酸（P），20μM寡霉素（O），10μM FCCP（F）和20μM抗霉素A（A）。n = 4，每种基因型和年龄。图中给出的值是SEM±平均值。当p<0.05 （*）时，差异被认为是显着的。这个数字是从Zhi等人24修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
我们开发的方法允许使用XF分析仪在4小时的时间跨度内测量成年小鼠纹状体切片中的OCR。这种方法提供了一种测量从解剖学定义的大脑结构中切除的冲头中的细胞生物能量学的新方法。由于正在分析的组织样本相当小，因此可以研究与疾病有关的特定脑区域的代谢参数。此外，使用急性切片更接近于模拟生理细胞环境，这是分离的线粒体或培养的细胞和有机类型切片无法实现的。此外，在单个动物的多个大脑区域或在一个24孔板中测量多个动物的OCR大大增加了实施这项新技术的研究的统计能力。
这是成年小鼠急性纹状体切片OCR测量的第一个方案。重点是STR，因为它是主要参与PD和亨廷顿舞蹈症的大脑区域之一。我们研究中的基础OCR和耦合效率与使用XF分析仪25，26，27测量急性脑切片OCR的其他研究相当。然而，在我们的研究中，与其他测量其他大脑区域的报告相比，纹状体切片的备用呼吸能力似乎更小。目前尚不清楚这种差异是否反映了大脑区域之间备用呼吸能力的真正差异，还是切片制备，切除切片放置或小鼠菌株的微小差异。这些差异值得进一步研究。
该协议中有几个关键步骤，包括准备急性脑切片，将打孔切片转移到捕获屏幕的顶部，以及将切片放入孔中。在测量过程中，切片应保持附着在捕获屏幕上。否则，如果切片从屏幕上分离并位于板的孔中，它将远离氧传感器，从而导致OCR读数和对药物的反应低得多。我们建议每种情况至少进行四次重复（在同一区域进行四次切除的脑切片），并排除分离切片的结果。OCR 应与组织含量成比例。这项研究没有测量组织量，因为大脑以相同的厚度切片，并且使用相同的打孔机打孔切片。因此，组织量是恒定的，并且不需要确定组织含量。对于每个板（24片）使用新的打孔机以确保锋利度，从而确保相同数量的组织，这一点至关重要。此外，切片，准备组织冲头和附着每只小鼠的切片大约需要30分钟，两对小鼠总共需要大约2小时。即使在最佳条件下（使用敏感功能测定 -膜片-膜片记录评估神经元的健康状态），急性脑切片的稳定性也仅在切片后 7-8 小时内有效，因此，使用 96 孔设置可能不切实际。
为了说明该技术的实用性，我们从PINK1 KO小鼠及其WT幼崽的纹状体切片中测量了OCR。与年龄匹配的WT对照组相比，发现老年PINK1 KO小鼠的基础呼吸显着降低，与年龄依赖性DA释放缺陷一致24。这一观察结果也与先前发表的研究一致，证实了该协议的有效性。这些方法也有局限性。例如，OCR是从急性纹状体脑切片测量的，该切片可能与大脑活动无关，并且主要提供非活性的中等多棘神经元和多巴胺能终端以及星形胶质细胞。此外，该方法不具有细胞类型特异性分辨率。
总之，这种新方法测量成年小鼠急性脑切片中的OCR，并演示PED相关基因PINK1如何影响小鼠的线粒体功能。这种方法易于实施，并广泛适用于在PD和亨廷顿舞蹈症领域工作的研究人员。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢旺钦次仁和帕梅拉·沃尔特对这份手稿的批判性阅读和编辑。这项工作得到了国家神经疾病和中风研究所（NINDS）（NS054773至C.J.L.和NS098393至H.Z.）和托马斯杰斐逊大学神经科学系（H.Z.的启动基金）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
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