Summary
Oxygenforbrugshastighed (OCR) er en fælles proxy for mitokondriefunktion og kan bruges til at studere forskellige sygdomsmodeller. Vi udviklede en ny metode ved hjælp af en Seahorse XF-analysator til direkte måling af OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus, der er mere fysiologisk relevant end andre metoder.
Abstract
Mitokondrier spiller en vigtig rolle i cellulær ATP-produktion, reaktiv iltartsregulering og Ca2+ koncentrationskontrol. Mitokondrie dysfunktion har været impliceret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons sygdom og Alzheimers sygdom. For at studere mitokondriernes rolle i modeller af disse sygdomme kan vi måle mitokondrie respiration via iltforbrugshastighed (OCR) som en proxy for mitokondriefunktion. OCR er allerede blevet målt med succes i cellekulturer såvel som isolerede mitokondrier. Disse teknikker er imidlertid mindre fysiologisk relevante end at måle OCR i akutte hjerneskiver. For at overvinde denne begrænsning udviklede forfatterne en ny metode ved hjælp af en Seahorse XF-analysator til direkte at måle OCR i akutte striatale skiver fra voksne mus. Teknikken er optimeret med fokus på striatum, et hjerneområde involveret i PD og Huntingtons Sygdom. Analysatoren udfører et levende celleassay ved hjælp af en 24-brøndplade, som muliggør samtidig kinetisk måling af 24 prøver. Metoden bruger cirkulære stansede stykker striatale hjerneskiver som prøver. Vi demonstrerer effektiviteten af denne teknik ved at identificere en lavere basal OCR i striatale skiver af en musemodel af PD. Denne metode vil være af bred interesse for forskere, der arbejder inden for PD og Huntingtons Sygdom.
Introduction
Mitokondrie dysfunktion har været impliceret i flere neurologiske sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons sygdom og Alzheimers sygdom 1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) mus og rotter viser nedsat mitokondriefunktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isoleret fra striatum (STR) eller helhjerne hos alderen PINK1 KO mus udviser defekter i kompleks I 7,10,12,13. Direkte måling af iltforbrugshastigheden (OCR) er en af de mest almindelige metoder til at evaluere mitokondriefunktionen, da OCR er kombineret med ATP-produktion, mitokondriernes hovedfunktion14. Derfor kan måling af OCR i sygdomsmodeller eller patientafledte prøver/væv hjælpe med at undersøge, hvordan mitokondrie dysfunktion fører til sygdom.
I øjeblikket er der flere måder at måle mitokondrie OCR på, herunder Clark-elektroden og andreO2-elektroder,O2 fluorescerende farvestof og den ekstracellulære fluxanalysator 15,16,17,18,19. Som en fordel tilladerO2-elektrodebaserede metoder, at forskellige substrater let kan tilsættes. De er imidlertid utilstrækkelige til samtidig måling af flere prøver. Sammenlignet med traditionelleO2-elektrodebaserede metoder tilbyder den ekstracellulære fluxanalysator, et almindeligt anvendt værktøj til OCR i cellekulturer eller rensede mitokondrier, forbedret gennemstrømning 15,18,20. Ikke desto mindre anvendes alle disse metoder normalt til at måle OCR i isolerede mitokondrier eller cellekulturer 6,16,17,19,20,21. Isoleringen af mitokondrier forårsager utilsigtet skade, og ekstraherede mitokondrier eller cellekulturer er mindre fysiologisk relevante end intakte hjerneskiver22. Selv når mikroelektroder anvendes i skiver, er de mindre følsomme og vanskeligere at betjene end i dyrkede celler23.
For at imødekomme disse udfordringer udviklede vi en metode ved hjælp af XF24 ekstracellulær fluxanalysator, som giver mulighed for analyse af flere metaboliske parametre fra akutte striatale hjerneskiver af mus24. Denne teknik giver kontinuerlig direkte kvantificering af mitokondrie respiration via OCR. Kort sagt placeres små sektioner af striatale hjerneskiver i brønde på øpladen, og analysatoren bruger ilt- og protonfluorescerende baserede biosensorer til at måle OCR og ekstracellulær forsuringshastighed henholdsvis 17,21,25.
Et af de unikke træk ved analysatoren er de fire injektionsbrønde, som tillader fortsat måling af OCR, mens der sekventielt injiceres op til fire forbindelser eller reagenser; dette muliggør måling af flere cellulære respirationsparametre, såsom basal mitokondrie OCR, ATP-bundet OCR og maksimal mitokondrie OCR. De forbindelser, der blev injiceret under målingerne for protokollen vist her, var arbejdskoncentrationer på 10 mM pyruvat i den første opløsningsbrønd (port A), 20 μM oligomycin i den anden opløsningsbrønd (port B), 10 μM carbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) i den tredje brønd (port C) og 20 μM antimycin A i den fjerde brønd (port D), baseret på Fried et al.25. Det skal bemærkes, at disse koncentrationer var arbejdskoncentrationer, og stamopløsninger på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x blev injiceret i opløsningsportene A til D. Formålet med at anvende hver opløsning var som følger: 1) Pyruvat var nødvendigt, da tilsætning af FCCP uden det ville have et nedsat OCR-respons forårsaget af en begrænsning af tilgængelige substrater; 2) Oligomycin hæmmer ATP-syntase og tillader måling af ATP-bundet respiration; 3) FCCP afkobler oxidation fra phosphorylering og tillader måling af maksimal mitokondriekapacitet; 4) Antimycin A hæmmer kompleks III i elektrontransportkæden og tillader derfor måling af OCR, der ikke er knyttet til mitokondrierne.
Koncentrationen af anvendt oligomycin blev bestemt ud fra følgende årsager: 1) Den anbefalede dosis oligomycin for de fleste celletyper (isolerede mitokondrier eller cellekulturer) er 1,5 μM. Erfaringsmæssigt anvendes normalt 3x-10x af den dissocierede celledosis til skiveforsøgene, da der kan være en gradient, og indtrængningen af opløsning i skiverne tager tid. Derfor bør koncentrationen ligge i området fra 5 μM til 25 μM. 2) En 20 μM koncentration blev valgt baseret på Fried et al.25. Højere koncentrationer blev ikke forsøgt på grund af oligomycins ikke-specifikke toksicitet. 3) I rapporten fra Underwood et al.26 lavede forfatterne et titreringseksperiment for oligomycin og fandt ud af, at doser ved 6,25, 12,5, 25 og 50 μg / ml resulterede i lignende hæmning. Den højere koncentration af oligomycin (50 μg/ml) hæmmede ikke mere, men havde en større varians. 4) I vores observation synes den afgørende faktor at være oligomycins penetrerende evne. Det er svært for oligomycin at trænge ind i vævet, og derfor tager det mindst 7 til 8 cyklusser at nå plateauet, det maksimale respons. Så længe det når plateauet, antages inhiberingen at være maksimal.
En vigtig teknisk udfordring ved at tilpasse den ekstracellulære fluxanalysator til måling af OCR i striatale skiver er at forhindre vævshypoxi. Da bufferen ikke blev iltet i hele målingens varighed (ca. 4 timer), var hypoxi et centralt problem. Dette gælder især for tykkere vævsprøver, hvor ilt ikke kan diffundere gennem prøverne. For at overvinde dette problem blev skiverne snittet i en tykkelse på 150 μm, så omgivende ilt kunne trænge ind i midten af hjerneskiverne. Derudover blev der tilsat 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) til den præ-oxygenerede kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) buffer, hvilket lettede bestemmelsen af maksimal OCR, som tidligere foreslået23. Vi undersøgte, om cellerne var i live. For det første blev Hoechst 33258 (10 μM) og propidiumiodid (10 μM) anvendt til at undersøge, om cellerne var sunde under disse forhold. Vi undersøgte derefter, om mellemstore spiny neuroner var funktionelt sunde ved hjælp af patch-clamp-optagelse. Vi evaluerede yderligere, om dopamin (DA) terminaler i striatalskiverne var funktionelt sunde ved at måle DA-frigivelse ved hjælp af hurtigscanningsvolammetri. Resultaterne viste, at striatale skiver, der ikke var iltet (ACSF / BSA-gruppen), var lige så sunde som den iltede kontrolgruppe24.
Vi testede derefter forskellige kombinationer af skivetykkelse og stansstørrelse for at bestemme optimale striatale skivebetingelser for flux respirationsassay. Dorsale striatale skiver med forskellige tykkelser (150 μm og 200 μm) og stansestørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) blev anvendt til OCR-analyse ved hjælp af analysatoren. Striatale skiver, der var 150 μm tykke med en slagstørrelse på 1,5 mm i diameter, havde den højeste koblingseffektivitet og OCR'er inden for et optimalt område for analysatoren24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, herunder dyrearbejde, blev udført i henhold til nationale og internationale retningslinjer og blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved Thomas Jefferson University. FVB/NTac-hanmus i en alder af 3 til 14 måneder blev anvendt. Følgende trin blev udført i en ikke-steril indstilling, men der skal udvises forsigtighed for at holde alt så rent som muligt.
BEMÆRK: Metoden, der præsenteres her, blev etableret og brugt i den forskning, der blev rapporteret af Zhi et al.24. De her beskrevne eksperimenter anvendte en Seahorse XF24 ekstracellulær fluxanalysator (se Materialetabel). Disse metoder kan tilpasses XFe24-analysatoren, og nogle resultater blev bekræftet ved hjælp af denne analysator.
1. Hydreringspatronsensorer (1 dag før analysen)
- Åbn det ekstracellulære fluxassaysæt (se Materialetabel), og fjern både sensorpatronen (grøn) og hjælpepladen (klar; Figur 1A). Placer sensorpatronen til side (sensorer op), og rør ikke ved sensorerne.
- Der tilsættes 600 μL kalibrantopløsning (pH 7.4) til hver brønd på hjælpepladen. Placer sensorpatronen oven på brugspladen, og nedsænk sensorerne i kalibreringsopløsningen. Sørg for, at det trekantede hak på hjælpeprogrammet og sensorens patronplade er korrekt justeret (figur 1B).
- Forsegl det ekstracellulære fluxassaysæt med tætningsfilm for at forhindre fordampning af kalibrantopløsningen, og anbring det derefter i en 37 °C inkubator, der ikke er suppleret med CO2 eller ilt natten over.
2. Forbered vævspladen (på dagen for analysen)
- Åbn ø-opsamlingsmikropladen, og tag øpladen ud til vævssit.
- Et passende volumen (625 μL pr. brønd) af præ-oxygeneret modificeret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, sammensætning 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7,2) buffer til 37 °C i et 50 ml rør. Derefter tilsættes BSA til en slutkoncentration på 4 mg/ml for at forberede respirationsbufferen. Generelt er 50 ml nok til en plade.
- Der tilsættes 625 μL respirationsbuffer (præ-oxygeneret ACSF-buffer med 25 mM glucose og 4 mg/ml BSA) til hver brønd på øpladen omhyggeligt, og undgå at ryste pladen. Sørg for, at der ikke er rester oven på sensorpatronen, og at der ikke er luftbobler i bufferen i hver brønd.
3. Akut striatal skiveforberedelse og udskåret skiveplacering
- Udhug musen efter cervikal dislokation og disseker straks hjernen i 10 ml iskold præ-oxygeneret skæreopløsning (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glucose, pH 7,4).
- Sektion koronale striatale skiver med en vibratom efter producentens anvisninger (se materialetabel) i en tykkelse på 150 μm i iskold, for-iltet skæreopløsning.
- Skiverne genvindes i 50 ml iltet ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glucose, 2 mM HEPES, pH 7,4) og opbevares i opløsning i op til 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Efter genopretning overføres skiverne til en 35 mm x 10 mm petriskål med 5 ml respirationsbuffer.
- Brug en biopsistans i rustfrit stål (f.eks. 1,5 mm i diameter) til at skabe et cirkulært stykke væv i det ønskede område af den skivede hjerne. Hold skiven i bufferen, mens du forsigtigt trykker ned med slag. Sørg for, at slaget skubbes hårdt nok ned til at skære vævet. Fjern resten af vævet, løft stansen væk, og fjern det cirkulære stykke væv i bufferen.
- Skær enden af en 1 ml pipettespids for at lave et hul med en diameter på 1,5-2,0 mm, og brug den til at holde og overføre den stansede skive til toppen af optagelsesskærmen. Ug et stykke stanset hjernevæv, og placer forsigtigt vævet på maskesiden af optagelsesskærmen (figur 2A). Optagelsesskærmen vil være et cirkulært stykke plast med masken fastgjort til den ene side.
BEMÆRK: Optagelsesskærmene er inkluderet i mikropladepakken (se Materialetabel) og ligner den, der blev brugt i Schuh et al.23. - Brug forsigtigt et papirserviet til at tørre optagelsesskærmen kort. Når fugtigheden fjernes, bliver vævet klæbrigt, hvilket gør det muligt for skiven at fastgøre til midten af masken. Tør ikke skiven for meget, da den ellers vil blive beskadiget.
- Hold udsnitsskivesiden nedad med en pincet, og placer den i en af brøndene på den rugende øplade (figur 2B). Pas på ikke at tabe skiven; Hvis det er tilfældet, skal du tage skærmen ud og placere en ny skive på den.
BEMÆRK: Anbring ikke hjerneskiver i de to baggrundskorrektionsbrønde (A1 og D6) i øpladen. - Øpladen inkuberes ved 37 °C i en inkubator i mindst 30 minutter for at tillade temperatur- og pH-ækvilibrering, inden analysen gennemføres.
4. Indlæsning af patroner med ønskede forbindelser
- De ønskede forbindelser fortyndes i modificeret ACSF (37 °C) til den endelige lagerkoncentration på henholdsvis 10x, 11x, 12x og 13x af arbejdskoncentrationen for port A til D, og der justeres til pH 7,4. Testen administrerer forbindelserne i rækkefølge fra port A til D. Til dette forsøg blev følgende opløsninger anvendt med deres respektive arbejdskoncentration nævnt før dem: 10 mM pyruvat (port A), 20 μM oligomycin (port B), 10 μM eller andre koncentrationer af FCCP (port C) og 20 μM antimycin A (port D).
- Forindlæs forsigtigt 75 μL af de fortyndede forbindelser i sensorpatronens passende injektionsporte. Placer spidserne halvvejs ind i injektionsportene i en vinkel på 45° med spidsen mod injektionsportens væg. Spidser bør ikke indsættes helt i bunden af injektionsportene, da dette kan forårsage sammensat lækage gennem porten.
- Træk spidserne forsigtigt ud af portene for at undgå at skabe luftbobler. Tryk ikke på nogen del af patronen for at undgå at lindre luftbobler.
- Undersøg visuelt injektionsportene for jævn lastning. Sørg for, at al væske er i porten, og at der ikke er rester oven på patronen.
- Anbring sensorpatronen på brugspladen, og læg den i en inkubator (ikke-CO2) i 30 minutter, så den kan varme op til 37 °C igen. Håndter forsigtigt ved kun at holde fast i brugspladen. Bevæg dig så lidt som muligt.
5. Kalibrering og udførelse af analysen
- Indlæs analyseskabelonen i softwaren. Tryk på den grønne START-knap .
- Sørg for at indlæse den korrekte protokol. Protokollen indeholder en kombination af 3 min mix, 3 min ventetid og 2 min målesekvenser (disse tre trin danner en måling). Skift sondehovedets afstand fra 26.600 til 27.800 i hardwareindstillingerne under instrumentindstillinger25. Det er ikke nødvendigt at skifte sondehovedet til XFe24-analysatoren. Tryk på START.
- Læg sensorpatronen på brugspladen i instrumentbakken. Hakket går i forreste, venstre hjørne. Sørg for, at pladen sidder korrekt og er flad. Læg den lægemiddelfyldte sensorpatron i analysatoren til kalibrering.
- Følg instruktionerne på skærmen for at kalibrere og afbalancere sensorerne. Dette tager ca. 30 min.
- Når kalibreringstrinnet er udført, skal du fjerne kalibreringspladen og erstatte den med øpladen (indeholdende maske- og vævsskiverne).
- Mål iltforbruget i hver brønd på pladen ved hjælp af analyseprotokollerne. Protokollen indeholder en kombination af 3 min mix, 3 min ventetid og 2 min målesekvenser (disse tre trin danner en måling), hvorefter OCR beregnes.
- For hele eksperimentet skal du inkludere 4x OCR-målinger for at skabe en baseline efterfulgt af injektion af port A (pyruvat) med 4x målinger, derefter injektion af port B (oligomycin) med 8x målinger, derefter injektion af port C (FCCP) med 5x målinger og endelig injektion af port D (antimycin A) med 6x målinger.
BEMÆRK: Dette antal målinger efter hver sammensat injektion bestemmes afhængigt af, hvornår målingen når plateauet. - Analyser OCR-måledataene og koblingseffektivitetsdataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første trin i denne undersøgelse var at optimere skivetykkelsen og stansestørrelsen, der blev brugt til at fjerne en del af striatum fra skiven (figur 3A). En skive med en tykkelse på 150 μm og en 1,5 mm stansestørrelse gav de bedste resultater bestemt af koblingseffektiviteten (figur 3B-C). Som vist i figur 3B er OCR relativt stabil i 5 timer med mindre end 10% nedslidt. Derudover blev der anvendt funktionelle målinger samt patch-clamp-registrering af kortikale neuroner og medium spiny neuroner i striatum og hurtigscanningscyklisk voltammetri (FSCV) måling af DA-frigivelse for at demonstrere, at neuronerne og terminalerne var fuldt funktionelle i dette præparat, som vist i Zhi et al.24. Inkluderet i dette testede vi derefter forskellige koncentrationer af FCCP for at finde ud af, hvilken der ville give det bedste svar; 10 μM FCCP gav den bedste udlæsning (figur 3D1,D2) bestemt af den ekstra åndedrætskapacitet:
Ekstra åndedrætskapacitet = maksimal respiration - basal respiration
Disse skivebetingelser blev brugt til at måle forskellene i OCR for striatale skiver fra PINK1 KO-mus og vildttype (WT) kuldkammerater. Til resultaterne af PINK1 KO- og WT-mus blev der anvendt 3-4 mus, og der blev anvendt 4-6 replikater pr. mus og i gennemsnit for at opnå et datapunkt. Da PINK1 er en vigtig regulator for mitokondriefunktionen, forventedes mitokondrie dysfunktion at blive fundet i KO-musene målt ved nedsat mitokondrie OCR. Faktisk var et aldersafhængigt fald i OCR tydeligt hos KO-musene sammenlignet med deres WT-kontroller (figur 4A, D). Basal OCR var ens i både KO- og WT-grupperne for unge mus (3-4 måneder); imidlertid faldt basal OCR for KO-musene i den gamle gruppe (10-14 måneder; Figur 4B,E). Koblingseffektivitet, bestemt som nedenfor,
Koblingseffektivitet = [ATP-produktionshastighed] / [basal respirationshastighed] × 100
dog faldt i KO-musene for både de unge og gamle grupper (figur 4C,F). Disse data viser, at sektionerne af striatalvæv fra PINK1 KO-mus havde mitokondrie dysfunktion. Denne dysfunktion i KO-musene startede også fra en ung alder, indikeret af den nedsatte koblingseffektivitet, selvom den basale OCR kun blev nedsat i den gamle gruppe. Dette aldersafhængige fald var sandsynligvis et resultat af akkumulerende mitokondriefejl forårsaget af knockout af PINK1.
Figur 1: Billeder, der viser den ekstracellulære fluxanalysatorhydratpatronsensorer og plade. (A) Sensorpatronen, der sidder oven på en kalibreringsplade (brugsplade). (B) Sidebillede af brugspladen og sensorens patronplade. Det trekantede hak på hjælpeprogrammet og sensorpatronpladen skal være korrekt justeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fastgørelse og placering af udstansede skiver. (A) Udstanset skive fastgøres til maskeindsatsen på fangstskærmen og placeres derefter (B) omhyggeligt i en af brøndene på den rugende øplade for at sikre, at skiven ikke løsner sig eller bevæger sig under målingen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Optimal striatal skivetilstand for flux respiration assay. (A) Diagram over vævsstansstørrelser (1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm i diameter) for striatum (STR) med røde cirkler, der repræsenterer de områder, der blev opnået til analysen. (B1) O2 forbrugshastigheder (OCR'er) for forskellige tykkelser og stansestørrelser af skiver i kontrolgruppen viste stabil basal respiration over hele målingen (4 timer), og OCR var proportional med skivens volumen. OCR'er blev målt i skiver med en tykkelse på 150 μm og 200 μm stanset med 1,0 mm, 1,5 mm og 2,0 mm slag. De anvendte kombinationer er nævnt i legenderne som tykkelse * stansestørrelse (f.eks. 150 μm * 1 mm). (B2) Gennemsnitlige OCR'er målt i skiver med en tykkelse på 150 μm stanset med 1,5 mm slag; n = 7. (C1) Repræsentativ OCR-respons af skiver i forskellige tykkelser og diametre med 10 mM pyruvat (P), 20 μM oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) og 20 μM antimycin A (A) injiceret sekventielt. Pilene angiver tidspunktet for injektion af disse forbindelser. (C2) Mitokondriekoblingseffektiviteten blev sammenlignet mellem forskellige grupper. Skiver på 150 μm * 1,5 mm havde den høje koblingseffektivitet, men den mindste varians; n = 4. (D1) Titreringseksperiment for FCCP blev udført, og 10 μM FCCP gav den største uudnyttede kapacitet; n = 4 for hver gruppe. (D2) Titreringseksperimenter for FCCP blev udført med en analysator, og 10 μM FCCP gav den største uudnyttede kapacitet; n = 4 for hver gruppe. Værdierne i tallene er middelværdier ± standardfejl i middelværdien (SEM). Dette tal er blevet ændret fra Zhi et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: PINK1 KO skiver fra den gamle gruppe, der viser signifikant lavere OCR. OCR'er af akutte STR-skiver (150 μm * 1,5 mm) fra mus hos de unge (A, B og C) og de gamle grupper (D, E og F), udsat for successive tilføjelser af respiratoriske modulatorer (vist ved hjælp af pile). OCR for den unge gruppe var ikke signifikant forskellig mellem forskellige genotyper (B), mens koblingseffektiviteten (bestemt som en procentværdi ved hjælp af ovennævnte formel%) blev reduceret i PINK1 KO-skiver (C). I den gamle gruppe viste PINK1 KO'er signifikant nedsat basal respirationsniveau (E) og koblingseffektivitet (F). Følgende opløsning, 10 mM pyruvat (P), 20 μM oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) og 20 μM antimycin A (A), blev injiceret sekventielt. n = 4 for hver genotype og alder. Værdierne i tallene er middelværdier ± SEM. Forskellen blev anset for signifikant, da p < 0,05 (*). Dette tal er blevet ændret fra Zhi et al.24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden, vi udviklede, gjorde det muligt at bruge en XF-analysator til måling af OCR i striatale skiver fra voksne mus over et tidsrum på 4 timer. Denne metode giver en ny måde at måle cellulær bioenergetik i slag udskåret fra anatomisk definerede hjernestrukturer. Da vævsprøverne, der analyseres, er ret små, kan de metaboliske parametre for specifikke hjerneområder, der er involveret i en sygdom, undersøges. Derudover efterligner anvendelse af akutte skiver tættere det fysiologiske cellulære miljø, hvilket ikke kan opnås med isolerede mitokondrier eller dyrkede celler og organotypiske skiver. Endvidere øger måling af OCR i flere hjerneområder fra et enkelt dyr eller på tværs af flere dyr i en 24-brøndplade i høj grad den statistiske kraft af undersøgelser, der implementerer denne nye teknik.
Dette er den første protokol for OCR-måling i akutte striatale skiver fra voksne mus. Fokus var på STR, da det er et af de hjerneområder, der hovedsageligt er involveret i PD og Huntingtons Sygdom. Den basale OCR og koblingseffektiviteten i vores undersøgelse er sammenlignelige med de andre undersøgelser, der måler OCR i akutte hjerneskiver ved hjælp af XF-analysatoren 25,26,27. Imidlertid synes den ekstra åndedrætskapacitet af striatale skiver i vores undersøgelse mindre sammenlignet med de andre rapporter, der målte andre hjerneområder. Stadig ukendt er, om denne forskel afspejler sande forskelle i ledig åndedrætskapacitet mellem hjerneområder eller små forskelle i skiveforberedelse, udskåret skiveplacering eller musestamme. Disse forskelle kræver yderligere undersøgelse.
Der er flere kritiske trin i denne protokol, herunder forberedelse af akutte hjerneskiver, overførsel af den stansede skive til toppen af optagelsesskærmen og placering af skiven i brønden. Skiverne skal holdes fastgjort til optagelsesskærmen under målingen. Ellers, hvis skiven løsner sig fra skærmen og sidder i pladens brønd, vil den være langt væk fra iltføleren, hvilket resulterer i en meget lavere aflæsning af OCR og reaktioner på stofferne. Vi anbefaler mindst fire replikater (fire udskårne hjerneskiver i samme område) for hver tilstand og eksklusive resultaterne af de løsrevne skiver. OCR bør være proportional med vævsindholdet. Denne undersøgelse målte ikke vævsmængden, da hjernen blev skåret i samme tykkelse, og skiven blev stanset ved hjælp af den samme puncher. Således var vævsmængden konstant, og der var ikke behov for at bestemme vævsindholdet. Det er afgørende at bruge en ny puncher til hver plade (24 skiver) for at sikre skarpheden og dermed den samme mængde væv. Derudover tager sektionering, forberedelse af vævsslag og fastgørelse af skiverne pr. mus ca. 30 minutter og tager ca. 2 timer i alt for to par mus. Stabiliteten af akutte hjerneskiver er kun god i 7-8 timer efter sektionering selv under optimale forhold (vurderet ved hjælp af følsomme funktionelle assays-patch-clamp-optagelse for at evaluere neuronernes sunde tilstand) og derfor er det måske ikke praktisk at bruge en 96 brøndopsætning.
For at illustrere nytten af teknikken målte vi OCR fra striatale skiver fra PINK1 KO-mus og deres WT-kuldkammerater. Et signifikant fald blev fundet i basal respiration hos alderen PINK1 KO-mus sammenlignet med aldersmatchede WT-kontroller, i overensstemmelse med aldersafhængig DA-frigivelsesunderskud24. Denne observation stemmer også overens med tidligere offentliggjorte undersøgelser, hvilket bekræfter gyldigheden af denne protokol. Der er også begrænsninger af metoderne. For eksempel blev OCR målt fra den akutte striatale hjerneskive, som sandsynligvis er hjerneaktivitetsuafhængig og for det meste tilbyder inaktive mellemstore spiny neuroner og dopaminerge terminaler samt astrocytter. Derudover har metoden ikke en celletypespecifik opløsning.
Sammenfattende måler denne nye metode OCR i akutte hjerneskiver fra voksne mus og demonstrerer, hvordan PINK1, et PD-relateret gen, påvirker mitokondriefunktionen hos mus. Denne metode er nem at implementere og bredt anvendelig for forskere, der arbejder inden for PD og Huntingtons Sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Wangchen Tsering og Pamela Walter for deres kritiske læsning og redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 til C.J. L. og NS098393 til H.Z.) og Institut for Neurovidenskab ved Thomas Jefferson University (Startup Funds til H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
