Summary
Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist ein gängiger Proxy für die mitochondriale Funktion und kann zur Untersuchung verschiedener Krankheitsmodelle verwendet werden. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die einen Seahorse XF-Analysator verwendet, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen, die physiologisch relevanter ist als andere Methoden.
Abstract
Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären ATP-Produktion, der reaktiven Regulierung der Sauerstoffspezies und der Ca2 + - Konzentrationskontrolle. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), der Huntington-Krankheit und der Alzheimer-Krankheit. Um die Rolle der Mitochondrien in Modellen dieser Krankheiten zu untersuchen, können wir die mitochondriale Atmung über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Proxy für die mitochondriale Funktion messen. OCR wurde bereits erfolgreich in Zellkulturen sowie isolierten Mitochondrien gemessen. Diese Techniken sind jedoch physiologisch weniger relevant als die Messung der OCR in akuten Hirnschnitten. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickelten die Autoren eine neue Methode mit einem Seahorse XF-Analysator, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen. Die Technik ist optimiert mit einem Fokus auf das Striatum, ein Gehirnareal, das an PD und der Huntington-Krankheit beteiligt ist. Der Analysator führt einen Live-Cell-Assay mit einer 24-Well-Platte durch, der die gleichzeitige kinetische Messung von 24 Proben ermöglicht. Die Methode verwendet kreisförmig gestanzte Stücke von striatalen Hirnschnitten als Proben. Wir demonstrieren die Wirksamkeit dieser Technik, indem wir eine niedrigere basale OCR in striatalen Schnitten eines Mausmodells von PD identifizieren. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der PD und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein.
Introduction
Mitochondriale Dysfunktion wurde mit mehreren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit und Alzheimer-Krankheit 1,2,3. PD-Modelle wie PINK1 Knockout (KO) Mäuse und Ratten zeigen eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondrien, die aus dem Striatum (STR) oder dem ganzen Gehirn der gealterten PINK1 KO-Maus isoliert wurden, weisen Defekte im Komplex I 7,10,12,13 auf. Die direkte Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Funktion, da die OCR mit der ATP-Produktion, der Hauptfunktion der Mitochondrien14, gekoppelt ist. Daher kann die Messung der OCR in Krankheitsmodellen oder von Patienten abgeleiteten Proben / Geweben helfen zu untersuchen, wie mitochondriale Dysfunktion zu Krankheiten führt.
Derzeit gibt es mehrere Möglichkeiten, die mitochondriale OCR zu messen, einschließlich der Clark-Elektrode und anderer O2-Elektroden, desO2-Fluoreszenzfarbstoffs und des extrazellulären Flussanalysators 15,16,17,18,19. Als Vorteil ermöglichen O2-Elektroden-basierte Verfahren die einfache Zugabe verschiedener Substrate. Sie reichen jedoch nicht aus, um mehrere Proben gleichzeitig zu messen. Im Vergleich zu herkömmlichen O2-Elektroden-basierten Methoden bietet der extrazelluläre Flussanalysator, ein häufig verwendetes Werkzeug für OCR in Zellkulturen oder gereinigten Mitochondrien, einen verbesserten Durchsatz15,18,20. Dennoch werden alle diese Methoden in der Regel angewendet, um OCR in isolierten Mitochondrien oder Zellkulturen 6,16,17,19,20,21 zu messen. Die Isolierung von Mitochondrien verursacht unbeabsichtigte Schäden, und extrahierte Mitochondrien oder Zellkulturen sind physiologisch weniger relevant als intakte Hirnschnitte22. Selbst wenn Mikroelektroden in Schnitten verwendet werden, sind sie weniger empfindlich und schwieriger zu bedienen als in kultivierten Zellen23.
Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir mit dem XF24 extrazellulären Flussanalysator eine Methode entwickelt, die die Analyse mehrerer Stoffwechselparameter aus akuten striatalen Hirnschnitten von Mäusen24 ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche direkte Quantifizierung der mitochondrialen Atmung über die OCR. Kurz gesagt, kleine Abschnitte von striatalen Hirnschnitten werden in Vertiefungen der Inselplatte platziert, und der Analysator verwendet Sauerstoff- und Protonenfluoreszenz-basierte Biosensoren, um die OCR und die extrazelluläre Versauerungsrate zu messen, bzw. 17,21,25.
Eines der einzigartigen Merkmale des Analysators sind die vier Injektionsquellen, die die kontinuierliche Messung der OCR ermöglichen, während nacheinander bis zu vier Verbindungen oder Reagenzien injiziert werden; Dies ermöglicht die Messung mehrerer zellulärer Atmungsparameter, wie z. B. basale mitochondriale OCR, ATP-verknüpfte OCR und maximale mitochondriale OCR. Die Verbindungen, die während der Messungen für das hier gezeigte Protokoll injiziert wurden, waren Arbeitskonzentrationen von 10 mM Pyruvat in der ersten Lösungsvertiefung (Port A), 20 μM Oligomycin in der zweiten Lösungsvertiefung (Port B), 10 μM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP) in der dritten Vertiefung (Port C) und 20 μM Antimycin A in der vierten Vertiefung (Port D), basierend auf Fried et al.25. Es muss beachtet werden, dass diese Konzentrationen Arbeitskonzentrationen waren, und Stammlösungen von 10x, 11x, 12x und 13x wurden in die Lösungsports A bis D injiziert. Der Zweck der Verwendung jeder Lösung war wie folgt: 1) Pyruvat war notwendig, da ohne es die Zugabe von FCCP eine verringerte OCR-Reaktion hätte, die durch eine Einschränkung der verfügbaren Substrate verursacht wurde; 2) Oligomycin hemmt die ATP-Synthase und ermöglicht die Messung der ATP-verknüpften Atmung; 3) FCCP entkoppelt die Oxidation von der Phosphorylierung und ermöglicht die Messung der maximalen mitochondrialen Kapazität; 4) Antimycin A hemmt den Komplex III in der Elektronentransportkette und ermöglicht daher die Messung von OCR, die nicht mit den Mitochondrien verbunden sind.
Die verwendete Konzentration von Oligomycin wurde aus folgenden Gründen bestimmt: 1) Die empfohlene Dosis von Oligomycin für die meisten Zelltypen (isolierte Mitochondrien oder Zellkulturen) beträgt 1,5 μM. Aus Erfahrung wird normalerweise 3x-10x der dissoziierten Zelldosis für die Scheibenexperimente verwendet, da es einen Gradienten geben kann und das Eindringen von Lösung in die Scheiben Zeit in Anspruch nimmt. Daher sollte die Konzentration im Bereich von 5 μM bis 25 μM liegen. 2) Basierend auf Fried et al.25 wurde eine Konzentration von 20 μM ausgewählt. Höhere Konzentrationen wurden aufgrund der unspezifischen Toxizität von Oligomycin nicht ausprobiert. 3) In dem Bericht von Underwood et al.26 führten die Autoren ein Titrationsexperiment für Oligomycin durch und fanden heraus, dass Dosen bei 6,25, 12,5, 25 und 50 μg / ml zu einer ähnlichen Hemmung führten. Die höhere Konzentration von Oligomycin (50 μg/ml) hemmte nicht mehr, hatte aber eine größere Varianz. 4) Nach unserer Beobachtung scheint der bestimmende Faktor die Durchdringungsfähigkeit von Oligomycin zu sein. Es ist schwierig für Oligomycin, das Gewebe zu durchdringen, und deshalb dauert es mindestens 7 bis 8 Zyklen, um das Plateau, die maximale Reaktion, zu erreichen. Solange es das Plateau erreicht, wird die Hemmung als maximal angenommen.
Eine zentrale technische Herausforderung bei der Anpassung des extrazellulären Flussanalysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten besteht darin, Gewebehypoxie zu verhindern. Da der Puffer während der gesamten Messdauer (ca. 4 h) nicht mit Sauerstoff angereichert war, war die Hypoxie ein zentrales Thema. Dies gilt insbesondere für dickere Gewebeproben, bei denen Sauerstoff nicht durch die Proben diffundieren kann. Um dieses Problem zu lösen, wurden Scheiben mit einer Dicke von 150 μm geschnitten, so dass Umgebungssauerstoff die Mitte der Gehirnscheiben durchdringen konnte. Darüber hinaus wurden 4 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) dem voroxygenierten Puffer der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zugesetzt, was die Bestimmung der maximalen OCR erleichterte, wie zuvor vorgeschlagen23. Wir untersuchten, ob Zellen am Leben waren. Zunächst wurden Hoechst 33258 (10 μM) und Propidiumiodid (10 μM) verwendet, um zu untersuchen, ob Zellen unter diesen Bedingungen gesund sind. Wir untersuchten dann, ob mittelstachelige Neuronen funktionell gesund waren, indem wir Patch-Clamp-Recording verwendeten. Wir bewerteten weiter, ob Dopamin (DA) -Terminals in den striatalen Scheiben funktionell gesund waren, indem wir die DA-Freisetzung mittels Fast-Scan-Voltammetrie maßen. Die Ergebnisse zeigten, dass striatale Scheiben, die nicht mit Sauerstoff angereichert waren (ACSF/BSA-Gruppe), genauso gesund waren wie die sauerstoffhaltige Kontrollgruppe24.
Anschließend testeten wir verschiedene Kombinationen von Schichtdicke und Stanzgröße, um optimale striatale Schichtbedingungen für den Flussmittel-Atmungsassay zu bestimmen. Für die OCR-Analyse mit dem Analysator wurden dorsale Striatalscheiben mit unterschiedlichen Dicken (150 μm und 200 μm) und Stanzgrößen (1,0 mm, 1,5 mm und 2,0 mm Durchmesser) verwendet. Striatalscheiben, die 150 μm dick waren und eine Stanzgröße von 1,5 mm Durchmesser hatten, hatten die höchste Kopplungseffizienz und OCRs in einem optimalen Bereich für den Analysator24.
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Protocol
Alle Verfahren, einschließlich der Tierarbeit, wurden nach nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Thomas Jefferson University genehmigt. Männliche FVB/NTac-Mäuse im Alter von 3 bis 14 Monaten wurden verwendet. Die folgenden Schritte wurden in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt, aber Vorsicht ist geboten, um alles so sauber wie möglich zu halten.
HINWEIS: Die hier vorgestellte Methode wurde in der von Zhi et al.24 berichteten Forschung etabliert und verwendet. Die hier beschriebenen Experimente verwendeten einen extrazellulären Flussanalysator Seahorse XF24 (siehe Materialtabelle). Diese Methoden können für den XFe24-Analysator angepasst werden, und einige Ergebnisse wurden mit diesem Analysator bestätigt.
1. Hydratkartuschensensoren (1 Tag vor dem Assay)
- Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie sowohl die Sensorkartusche (grün) als auch die Utility-Platte (klar; Abbildung 1A). Legen Sie die Sensorpatrone zur Seite (Sensoren hoch) und berühren Sie die Sensoren nicht.
- 600 μL Kalibrantlösung (pH 7,4) in jede Vertiefung der Gebrauchsplatte geben. Legen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte und tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrantlösung. Stellen Sie sicher, dass die dreieckige Kerbe der Versorgungs- und Sensorpatronenplatte korrekt ausgerichtet ist (Abbildung 1B).
- Verschließen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit mit einer Dichtfolie, um eine Verdampfung der Kalibrantlösung zu verhindern, und legen Sie es dann über Nacht in einen 37 °C-Inkubator, der nicht mit CO2 oder Sauerstoff ergänzt wurde.
2. Bereiten Sie die Gewebeplatte vor (am Tag des Assays)
- Öffnen Sie die Insel-Capture-Mikroplatte und nehmen Sie die Inselplatte für das Gewebesitzen heraus.
- Ein geeignetes Volumen (625 μL pro Well) der voroxygenierten modifizierten künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, Zusammensetzung 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4, 0,3 mM KH 2 PO4, 25 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH7,2) Puffer in einem 50 ml Schlauch auf 37 °C erwärmen. Dann fügen Sie BSA zu einer Endkonzentration von 4 mg / ml hinzu, um den Atmungspuffer vorzubereiten. Im Allgemeinen reichen 50 ml für eine Platte.
- Fügen Sie 625 μL Atmungspuffer (voroxygenierter ACSF-Puffer mit 25 mM Glukose und 4 mg / ml BSA) vorsichtig zu jeder Vertiefung der Inselplatte hinzu und vermeiden Sie ein Schütteln der Platte. Stellen Sie sicher, dass sich keine Resttropfen auf der Oberseite der Sensorpatrone befinden und keine Luftblasen im Puffer jedes Bohrlochs vorhanden sind.
3. Akute striatale Scheibenvorbereitung und ausgeschnittene Scheibenplatzierung
- Enthaupten Sie die Maus nach Zervixdislokation und sezieren Sie sofort das Gehirn in 10 ml eiskalter, voroxygenierter Schneidlösung (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 3,7 mMMgSO 4,0,3 mM KH2PO 4, 10 mM Glukose, pH7,4).
- Sektion koronale Striatalscheiben mit einem Vibratom nach Herstellerangaben (siehe Materialtabelle) in einer Dicke von 150 μm in eiskalter, voroxygenierter Schneidlösung.
- Die Scheiben werden in 50 ml sauerstoffhaltigem ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mMNaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4, 0,3 mM KH 2 PO 4, 10 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4,2 mM HEPES, pH7,4) gewonnen und bis zu 30 min bei Raumtemperatur (RT) in Lösung gehalten.
- Nach der Gewinnung die Scheiben in eine 35 mm x 10 mm große Petrischale mit 5 ml Atempuffer geben.
- Verwenden Sie einen Biopsiestempel aus Edelstahl (z. B. 1,5 mm Durchmesser), um ein kreisförmiges Stück Gewebe im gewünschten Bereich des geschnittenen Gehirns zu erzeugen. Halten Sie die Scheibe im Puffer, während Sie mit dem Schlag vorsichtig nach unten drücken. Stellen Sie sicher, dass der Stempel hart genug nach unten gedrückt wird, um das Gewebe zu schneiden. Entfernen Sie den Rest des Gewebes, heben Sie den Schlag weg und entfernen Sie das kreisförmige Stück Gewebe in den Puffer.
- Schneiden Sie das äußerste Ende einer 1-ml-Pipettenspitze, um ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5-2,0 mm zu machen, und verwenden Sie es, um die gestanzte Scheibe zu halten und an die Oberseite des Aufnahmebildschirms zu übertragen. Saugen Sie ein Stück gestanztes Hirngewebe ab und legen Sie das Gewebe vorsichtig auf die Netzseite des Erfassungsbildschirms (Abbildung 2A). Der Aufnahmebildschirm wird ein kreisförmiges Stück Kunststoff sein, an dem das Netz an einer Seite befestigt ist.
HINWEIS: Die Aufnahmebildschirme sind im Mikroplattenpaket enthalten (siehe Materialtabelle) und ähneln der in Schuh et al.23 verwendeten. - Verwenden Sie vorsichtig ein Papiertaschentuch, um den Aufnahmebildschirm kurz zu trocknen. Wenn die Feuchtigkeit entfernt wird, wird das Gewebe klebrig, wodurch die Scheibe an der Mitte des Netzes befestigt werden kann. Trocknen Sie die Scheibe nicht zu sehr, da sie sonst beschädigt wird.
- Halten Sie die Capture-Screen-Scheibe mit einer Pinzette nach unten und legen Sie sie in eine der Vertiefungen der Inkubationsinselplatte (Abbildung 2B). Achten Sie darauf, die Scheibe nicht fallen zu lassen. Wenn ja, nehmen Sie den Bildschirm heraus und legen Sie einen neuen Schnitt darauf.
HINWEIS: Legen Sie keine Gehirnschnitte in die beiden Hintergrundkorrekturtöpfe (A1 und D6) in der Inselplatte. - Die Inselplatte bei 37 °C in einem Inkubator für mindestens 30 min inkubieren, um ein Gleichgewicht zwischen Temperatur und pH-Wert zu ermöglichen, bevor der Assay durchgeführt wird.
4. Beladung von Kartuschen mit gewünschten Mischungen
- Die gewünschten Verbindungen werden in modifiziertem ACSF (37 °C) auf die endgültige Stammkonzentration von 10x, 11x, 12x und 13x der Arbeitskonzentration für die Ports A bis D verdünnt und auf pH 7,4 eingestellt. Der Test verabreicht die Verbindungen in der Reihenfolge von Port A nach D. Für dieses Experiment wurden die folgenden Lösungen verwendet, wobei ihre jeweilige Arbeitskonzentration vor ihnen erwähnt wurde: 10 mM Pyruvat (Port A), 20 μM Oligomycin (Port B), 10 μM oder andere Konzentrationen von FCCP (Port C) und 20 μM Antimycin A (Port D).
- Laden Sie 75 μL der verdünnten Compounds vorsichtig in die entsprechenden Einspritzöffnungen der Sensorkartusche vor. Platzieren Sie die Spitzen halb in den Einspritzöffnungen in einem Winkel von 45° mit der Spitze an der Wand des Einspritzanschlusses. Die Spitzen sollten nicht vollständig an der Unterseite der Einspritzöffnungen eingesetzt werden, da dies zu einem Auslaufen von Verbindungen durch den Anschluss führen kann.
- Ziehen Sie die Trinkgelder vorsichtig aus den Anschlüssen zurück, um Luftblasen zu vermeiden. Tippen Sie nicht auf einen Teil der Patrone, um Luftblasen nicht zu lindern.
- Überprüfen Sie die Einspritzöffnungen visuell auf gleichmäßiges Laden. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Flüssigkeit im Anschluss befindet und keine Resttropfen auf der Oberseite der Patrone vorhanden sind.
- Legen Sie die Sensorpatrone auf die Gebrauchsplatte und legen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator (Nicht-CO2), damit sie sich wieder auf 37 °C erwärmen kann. Vorsichtig handhaben, indem Sie nur das Gebrauchskennzeichen festhalten. Bewegen Sie sich so wenig wie möglich.
5. Kalibrierung und Durchführung des Assays
- Laden Sie die Assay-Vorlage in die Software. Drücken Sie die grüne START-Taste .
- Stellen Sie sicher, dass Sie das richtige Protokoll laden. Das Protokoll enthält eine Kombination aus 3 min Mix, 3 min Wartezeit und 2 min Messsequenzen (diese drei Schritte bilden eine Messung). Ändern Sie den Abstand des Sondenkopfes in den Hardwareeinstellungen unter Geräteeinstellungen25 von 26.600 auf 27.800. Es ist nicht notwendig, den Sondenkopf für den XFe24-Analysator zu wechseln. Drücken Sie START.
- Legen Sie die Sensorkassette auf der Gebrauchsplatte in das Instrumentenfach ein. Die Kerbe geht in die vordere, linke Ecke. Stellen Sie sicher, dass die Platte richtig sitzt und flach ist. Legen Sie die mit Medikamenten gefüllte Sensorkartusche zur Kalibrierung in den Analysator ein.
- Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensoren zu kalibrieren und auszugleichen. Dies dauert ca. 30 min.
- Sobald der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte und ersetzen Sie sie durch die Inselplatte (die das Netz und die Gewebescheiben enthält).
- Messen Sie den Sauerstoffverbrauch in jeder Vertiefung der Platte mit den Assay-Protokollen. Das Protokoll enthält eine Kombination aus 3 min Mix, 3 min Wartezeit und 2 min Messsequenzen (diese drei Schritte bilden eine Messung), an welcher Stelle die OCR berechnet wird.
- Für das gesamte Experiment umfassen 4x OCR-Messungen, um eine Baseline zu erstellen, gefolgt von der Injektion von Port A (Pyruvat) mit 4x-Messungen, dann der Injektion von Port B (Oligomycin) mit 8x-Messungen, dann der Injektion von Port C (FCCP) mit 5x-Messungen und schließlich der Injektion von Port D (Antimycin A) mit 6x-Messungen.
HINWEIS: Diese Anzahl der Messungen nach jeder zusammengesetzten Injektion wird in Abhängigkeit davon bestimmt, wann die Messung das Plateau erreicht. - Analysieren Sie die OCR-Messdaten und die Kopplungseffizienzdaten.
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Representative Results
Der erste Schritt dieser Studie bestand darin, die Schichtdicke und die Stanzgröße zu optimieren, die verwendet wurden, um einen Abschnitt des Striatums aus der Scheibe zu entfernen (Abbildung 3A). Eine Scheibe mit einer Dicke von 150 μm und einer Stanzgröße von 1,5 mm lieferte die besten Ergebnisse, die durch die Kopplungseffizienz bestimmt wurden (Abbildung 3B-C). Wie in Abbildung 3B gezeigt, ist die OCR für 5 Stunden relativ stabil, wobei weniger als 10 % heruntergefahren werden. Darüber hinaus wurden funktionelle Messungen sowie die Patch-Clamp-Aufzeichnung von kortikalen Neuronen und mittelstacheligen Neuronen im Striatum und die schnelle zyklische Voltammetrie (FSCV) -Messung der DA-Freisetzung verwendet, um zu zeigen, dass die Neuronen und Terminals in diesem Präparat voll funktionsfähig waren, wie in Zhi et al.24 gezeigt. Dazu gehört, testeten wir dann verschiedene Konzentrationen von FCCP, um herauszufinden, welche die beste Antwort geben würde; 10 μM FCCP ergaben die beste Anzeige (Abbildung 3D1,D2), die durch die freie Atemkapazität bestimmt wurde:
Freie Atemkapazität = maximale Atmung - Basalatmung
Diese Slice-Bedingungen wurden verwendet, um die Unterschiede in der OCR von striatalen Scheiben von PINK1 KO-Mäusen und Wildtyp-Wurfgeschwistern (WT) zu messen. Für die Ergebnisse von PINK1 KO- und WT-Mäusen wurden 3-4 Mäuse verwendet und 4-6 Replikate pro Maus verwendet und gemittelt, um einen Datenpunkt zu erhalten. Da PINK1 ein wichtiger Regulator der mitochondrialen Funktion ist, wurde erwartet, dass bei den KO-Mäusen eine mitochondriale Dysfunktion gefunden wird, gemessen an einer verminderten mitochondrialen OCR. Tatsächlich zeigte sich bei den KO-Mäusen im Vergleich zu ihren WT-Kontrollen eine altersabhängige Abnahme der OCR (Abbildung 4A,D). Die basale OCR war sowohl in der KO- als auch in der WT-Gruppe für junge Mäuse ähnlich (3-4 Monate); Die basale OCR nahm jedoch bei den KO-Mäusen in der alten Gruppe ab (10-14 Monate; Abbildung 4B,E). Kopplungseffizienz, bestimmt wie folgt,
Kopplungseffizienz = [ATP-Produktionsrate] / [basale Atmungsrate] × 100
nahm jedoch bei den KO-Mäusen sowohl für die junge als auch für die alte Gruppe ab (Abbildung 4C, F). Diese Daten zeigen, dass die Abschnitte des striatalen Gewebes von PINK1 KO-Mäusen eine mitochondriale Dysfunktion aufwiesen. Diese Dysfunktion bei den KO-Mäusen begann ebenfalls in jungen Jahren, was auf die verminderte Kopplungseffizienz hindeutet, obwohl die basale OCR nur in der alten Gruppe erniedrigt war. Diese altersabhängige Abnahme war wahrscheinlich auf die Anhäufung von mitochondrialen Defekten zurückzuführen, die durch den Knockout von PINK1 verursacht wurden.
Abbildung 1: Bilder, die die Sensoren und die Platte des extrazellulären Flussanalysators zeigen. (A) Die Sensorpatrone, die auf einer Kalibrierplatte (Utility-Plate) sitzt. (B) Seitenansicht der Utility-Platte und der Sensorpatronenplatte. Die dreieckige Kerbe der Utility- und Sensorpatronenplatte sollte korrekt ausgerichtet sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Befestigung und Platzierung der gestanzten Scheibe. (A) Die gestanzte Scheibe wird am Netzeinsatz des Erfassungsbildschirms befestigt und dann (B) vorsichtig in eine der Vertiefungen der Inkubationsinselplatte gelegt, um sicherzustellen, dass sich die Scheibe während der Messung nicht löst oder bewegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Optimaler striataler Schichtzustand für den Flussatmungsassay. (A) Diagramm der Gewebestanzgrößen (1,0 mm, 1,5 mm und 2,0 mm Durchmesser) für das Striatum (STR) mit roten Kreisen, die die Bereiche darstellen, die für die Analyse erhalten wurden. (B1) O2-Verbrauchsraten (OCRs) für verschiedene Dicken und Stanzgrößen von Scheiben in der Kontrollgruppe zeigten eine stabile Basalatmung über die gesamte Messung (4 h), und die OCR war proportional zum Volumen der Scheibe. OCRs wurden in Scheiben mit einer Dicke von 150 μm und 200 μm gemessen, die mit 1,0 mm, 1,5 mm und 2,0 mm Stempel gestanzt wurden. Die verwendeten Kombinationen werden in den Legenden als Dicke* Stanzgröße (z.B. 150 μm*1 mm) genannt. (B2) Gemittelte OCRs, gemessen in Scheiben mit einer Dicke von 150 μm, gestanzt mit 1,5 mm; n = 7. (C1) Repräsentative OCR-Reaktionen von Scheiben mit unterschiedlichen Dicken und Durchmessern mit 10 mM Pyruvat (P), 20 μM Oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) und 20 μM Antimycin A (A), die sequentiell injiziert werden. Die Pfeile zeigen den Zeitpunkt der Injektion dieser Verbindungen an. (C2) Die mitochondriale Kopplungseffizienz wurde zwischen verschiedenen Gruppen verglichen. Scheiben von 150 μm * 1,5 mm hatten die hohe Kopplungseffizienz, aber die kleinste Varianz; n = 4. (D1) Es wurde ein Titrationsexperiment für FCCP durchgeführt, und 10 μM FCCP ergaben die größte freie Kapazität; n = 4 für jede Gruppe. (D2) Titrationsexperimente für FCCP wurden mit einem Analysator durchgeführt, und 10 μM FCCP ergaben die größte freie Kapazität; n = 4 für jede Gruppe. Die in den Zahlen angegebenen Werte sind Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Diese Zahl wurde von Zhi et al.24 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: PINK1 KO-Scheiben aus der alten Gruppe, die eine signifikant niedrigere OCR aufweisen. OCRs von akuten STR-Schnitten (150 μm * 1,5 mm) von Mäusen in den jungen (A, B und C) und den alten Gruppen (D, E und F), exponiert bei sukzessiven Additionen von Atmungsmodulatoren (gezeigt mit Pfeilen). Die OCR der jungen Gruppe unterschied sich nicht signifikant zwischen verschiedenen Genotypen (B), während die Kopplungseffizienz (bestimmt als Prozentwert unter Verwendung der oben genannten Formel%) in PINK1 KO-Scheiben (C) verringert wurde. In der alten Gruppe zeigten die PINK1 KOslices eine signifikant verringerte basale Atmung (E) und Kopplungseffizienz (F). Die folgende Lösung, 10 mM Pyruvat (P), 20 μM Oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) und 20 μM Antimycin A (A), wurde nacheinander injiziert. n = 4 für jeden Genotyp und jedes Alter. Die in den Zahlen angegebenen Werte sind Mittelwert ± SEM. Die Differenz wurde als signifikant angesehen, wenn p < 0,05 (*). Diese Zahl wurde von Zhi et al.24 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die von uns entwickelte Methode ermöglichte die Verwendung eines XF-Analysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen über einen Zeitraum von 4 h. Diese Methode bietet eine neue Möglichkeit, zelluläre Bioenergetik in Stempeln zu messen, die aus anatomisch definierten Gehirnstrukturen herausgeschnitten wurden. Da die analysierten Gewebeproben eher klein sind, können die Stoffwechselparameter bestimmter Hirnareale, die an einer Krankheit beteiligt sind, untersucht werden. Darüber hinaus ahmt die Verwendung akuter Scheiben die physiologische Zellumgebung genauer nach, was mit isolierten Mitochondrien oder kultivierten Zellen und organotypischen Schichten nicht erreicht werden kann. Darüber hinaus erhöht die Messung der OCR in mehreren Hirnregionen von einem einzelnen Tier oder über mehrere Tiere in einer 24-Well-Platte die statistische Aussagekraft von Studien, die diese neue Technik implementieren, erheblich.
Dies ist das erste Protokoll der OCR-Messung in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen. Der Fokus lag auf der STR, da sie einer der Gehirnbereiche ist, die hauptsächlich an PD und der Huntington-Krankheit beteiligt sind. Die basale OCR und die Kopplungseffizienz in unserer Studie sind vergleichbar mit den anderen Studien, die OCR in akuten Hirnschnitten mit dem XF-Analysator25,26,27 messen. Die überschüssige Atmungskapazität von striatalen Schnitten in unserer Studie scheint jedoch im Vergleich zu den anderen Berichten, die andere Gehirnbereiche gemessen haben, geringer zu sein. Noch unbekannt ist, ob dieser Unterschied echte Unterschiede in der freien Atmungskapazität zwischen Gehirnbereichen oder leichte Unterschiede in der Scheibenvorbereitung, der Platzierung der ausgeschnittenen Scheibe oder der Mausbelastung widerspiegelt. Diese Unterschiede rechtfertigen weitere Untersuchungen.
Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, einschließlich der Vorbereitung akuter Gehirnschnitte, der Übertragung der gestanzten Scheibe an die Spitze des Erfassungsbildschirms und des Platzierens der Scheibe in den Brunnen. Die Scheiben sollten während der Messung am Erfassungsbildschirm befestigt bleiben. Andernfalls, wenn sich die Scheibe vom Bildschirm löst und im Brunnen der Platte sitzt, ist sie weit vom Sauerstoffsensor entfernt, was zu einem viel niedrigeren Auslesen der OCR und der Reaktionen auf die Medikamente führt. Wir empfehlen mindestens vier Replikate (vier ausgeschnittene Hirnschnitte im selben Bereich) für jede Erkrankung und ohne die Ergebnisse der abgelösten Scheiben. OCR sollte proportional zum Gewebegehalt sein. Diese Studie maß nicht die Gewebemenge, da das Gehirn in der gleichen Dicke geschnitten wurde und die Scheibe mit demselben Puncher gestanzt wurde. Somit war die Gewebemenge konstant, und es bestand keine Notwendigkeit, den Gewebegehalt zu bestimmen. Es ist wichtig, für jede Platte (24 Scheiben) einen neuen Stanzer zu verwenden, um die Schärfe und damit die gleiche Menge an Gewebe zu gewährleisten. Darüber hinaus dauert das Schneiden, Vorbereiten von Gewebestempeln und das Anbringen der Scheiben pro Maus etwa 30 Minuten und dauert insgesamt etwa 2 Stunden für zwei Mäusepaare. Die Stabilität akuter Hirnschnitte ist nur für 7-8 h nach dem Schneiden selbst unter optimalen Bedingungen gut (bewertet mit empfindlichen funktionellen Assays-Patch-Clamp-Aufnahmen, um den gesunden Zustand der Neuronen zu bewerten) und daher ist die Verwendung eines 96-Well-Setups möglicherweise nicht praktikabel.
Um den Nutzen der Technik zu veranschaulichen, haben wir die OCR von striatalen Scheiben von PINK1 KO-Mäusen und ihren WT-Wurfgeschwistern gemessen. Es wurde eine signifikante Abnahme der Basalatmung von gealterten PINK1 KO-Mäusen im Vergleich zu altersangepassten WT-Kontrollen festgestellt, was mit altersabhängigen DA-Freisetzungsdefizitenübereinstimmte 24. Diese Beobachtung stimmt auch mit zuvor veröffentlichten Studien überein, die die Gültigkeit dieses Protokolls bestätigen. Es gibt auch Einschränkungen der Methoden. Zum Beispiel wurde die OCR aus dem akuten striatalen Gehirnschnitt gemessen, der wahrscheinlich unabhängig von der Gehirnaktivität ist und meist inaktive mittlere stachelige Neuronen und dopaminerge Terminals sowie Astrozyten bietet. Darüber hinaus hat die Methode keine zellentypspezifische Auflösung.
Zusammenfassend misst diese neuartige Methode OCR in akuten Hirnschnitten von erwachsenen Mäusen und zeigt, wie PINK1, ein PD-verwandtes Gen, die mitochondriale Funktion bei Mäusen beeinflusst. Diese Methode ist einfach zu implementieren und weit verbreitet für Forscher, die auf dem Gebiet der PD und der Huntington-Krankheit arbeiten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Wangchen Tsering und Pamela Walter für ihre kritische Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 bis C.J. L. und NS098393 bis H.Z.) und dem Department of Neuroscience der Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
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