Summary
Syreförbrukningshastighet (OCR) är en vanlig proxy för mitokondriell funktion och kan användas för att studera olika sjukdomsmodeller. Vi utvecklade en ny metod med hjälp av en Seahorse XF-analysator för att direkt mäta OCR i akuta striatala skivor från vuxna möss som är mer fysiologiskt relevant än andra metoder.
Abstract
Mitokondrier spelar en viktig roll i cellulär ATP-produktion, reglering av reaktiva syrearter och Ca2+ koncentrationskontroll. Mitokondriell dysfunktion har varit inblandad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom och Alzheimers sjukdom. För att studera mitokondriernas roll i modeller av dessa sjukdomar kan vi mäta mitokondriell andning via syreförbrukningshastighet (OCR) som en proxy för mitokondriell funktion. OCR har redan framgångsrikt mätts i cellkulturer, såväl som isolerade mitokondrier. Dessa tekniker är dock mindre fysiologiskt relevanta än att mäta OCR i akuta hjärnskivor. För att övervinna denna begränsning utvecklade författarna en ny metod med hjälp av en Seahorse XF-analysator för att direkt mäta OCR i akuta striatala skivor från vuxna möss. Tekniken är optimerad med fokus på striatum, ett hjärnområde som är involverat i PD och Huntingtons sjukdom. Analysatorn utför en levande cellanalys med användning av en 24-brunnsplatta, vilket möjliggör samtidig kinetisk mätning av 24 prover. Metoden använder cirkulärstansade bitar av striatala hjärnskivor som prover. Vi demonstrerar effektiviteten av denna teknik genom att identifiera en lägre basal OCR i striatala skivor av en musmodell av PD. Denna metod kommer att vara av brett intresse för forskare som arbetar inom området PD och Huntingtons sjukdom.
Introduction
Mitokondriell dysfunktion har varit inblandad i flera neurologiska sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom och Alzheimers sjukdom 1,2,3. PD-modeller som PINK1 knockout (KO) möss och råttor visar nedsatt mitokondriell funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitokondrier isolerade från striatum (STR) eller hela hjärnan hos åldrad PINK1 KO-mus uppvisar defekter i komplex I 7,10,12,13. Direkt mätning av syreförbrukningshastigheten (OCR) är en av de vanligaste metoderna för att utvärdera mitokondriell funktion eftersom OCR är kopplat till ATP-produktion, mitokondriernas huvudsakliga funktion14. Därför kan mätning av OCR i sjukdomsmodeller eller patientbaserade prover/vävnad hjälpa till att undersöka hur mitokondriell dysfunktion leder till sjukdom.
För närvarande finns det flera sätt att mäta mitokondriell OCR, inklusive Clark-elektroden och andraO2-elektroder,O2 fluorescerande färgämne och den extracellulära flödesanalysatorn 15,16,17,18,19. Som en fördel tillåterO2 elektrodbaserade metoder att olika substrat enkelt kan tillsättas. De är emellertid otillräckliga för att samtidigt mäta flera prover. Jämfört med traditionellaO2-elektrodbaserade metoder erbjuder den extracellulära flödesanalysatorn, ett vanligt verktyg för OCR i cellkulturer eller renade mitokondrier, förbättrad genomströmning 15,18,20. Ändå används alla dessa metoder vanligtvis för att mäta OCR i isolerade mitokondrier eller cellkulturer 6,16,17,19,20,21. Isoleringen av mitokondrier orsakar oavsiktlig skada, och extraherade mitokondrier eller cellkulturer är mindre fysiologiskt relevanta än intakta hjärnskivor22. Även när mikroelektroder används i skivor är de mindre känsliga och svårare att använda än i odlade celler23.
För att möta dessa utmaningar utvecklade vi en metod med hjälp av XF24 extracellulär flödesanalysator, som möjliggör analys av flera metaboliska parametrar från akuta striatala hjärnskivor av möss24. Denna teknik ger kontinuerlig direkt kvantifiering av mitokondriell andning via OCR. I korthet placeras små delar av striatala hjärnskivor i brunnar på öplattan, och analysatorn använder syre- och protonfluorescerande baserade biosensorer för att mäta OCR respektive extracellulär försurningshastighet 17,21,25.
En av analysatorns unika egenskaper är de fyra injektionsbrunnarna, som möjliggör fortsatt mätning av OCR medan sekventiellt injicerar upp till fyra föreningar eller reagenser; detta möjliggör mätning av flera cellulära andningsparametrar, såsom basal mitokondriell OCR, ATP-länkad OCR och maximal mitokondriell OCR. De föreningar som injicerades under mätningarna för protokollet som visas här var arbetskoncentrationer av 10 mM pyruvat i den första lösningsbrunnen (port A), 20 μM oligomycin i den andra lösningsbrunnen (port B), 10 μM karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) i den tredje brunnen (port C) och 20 μM antimycin A i den fjärde brunnen (port D), baserat på Fried et al.25. Det måste noteras att dessa koncentrationer var arbetskoncentrationer och stamlösningar av 10x, 11x, 12x och 13x injicerades i lösningsportarna A till D. Syftet med att använda varje lösning var följande: 1) Pyruvat var nödvändigt eftersom utan det skulle tillsatsen av FCCP ha ett minskat OCR-svar orsakat av en begränsning av tillgängliga substrat; 2) Oligomycin hämmar ATP-syntas och möjliggör mätning av ATP-länkad andning; 3) FCCP frikopplar oxidation från fosforylering och möjliggör mätning av maximal mitokondriell kapacitet; 4) Antimycin A hämmar komplex III i elektrontransportkedjan och möjliggör därför mätning av OCR som inte är kopplad till mitokondrierna.
Koncentrationen av oligomycin som användes bestämdes baserat på följande skäl: 1) Den rekommenderade dosen oligomycin för de flesta celltyper (isolerade mitokondrier eller cellkulturer) är 1,5 μM. Av erfarenhet används vanligtvis 3x-10x av dissocierad celldos för skivexperimenten eftersom det kan finnas en gradient och penetreringen av lösningen i skivorna tar tid. Därför bör koncentrationen ligga i intervallet 5 μM till 25 μM. 2) En 20 μM koncentration valdes baserat på Fried et al.25. Högre koncentrationer prövades inte på grund av oligomycinets icke-specifika toxicitet. 3) I rapporten från Underwood et al.26 gjorde författarna ett titreringsexperiment för oligomycin och fann att doser vid 6,25, 12,5, 25 och 50 μg / ml resulterade i liknande hämning. Den högre koncentrationen av oligomycin (50 μg/ml) hämmade inte mer utan hade en större varians. 4) I vår observation verkar den avgörande faktorn vara oligomycinets penetrerande förmåga. Det är svårt för oligomycin att tränga in i vävnaden, och det är därför det tar minst 7 till 8 cykler för att nå platån, det maximala svaret. Så länge den når platån antas hämningen vara maximal.
En viktig teknisk utmaning med att anpassa den extracellulära flödesanalysatorn för mätning av OCR i striatala skivor är att förhindra vävnadshypoxi. Eftersom bufferten inte syresattes under hela mättiden (ca 4 h) var hypoxi en central fråga. Detta gäller särskilt för tjockare vävnadsprover, där syre inte kan diffundera genom proverna. För att övervinna detta problem delades skivor med en tjocklek på 150 μm, så att omgivande syre kunde tränga in i mitten av hjärnskivorna. Dessutom tillsattes 4 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) till den pre-oxygenerade artificiella cerebrospinalvätskan (ACSF), vilket underlättade bestämningen av maximal OCR, som tidigareföreslagits 23. Vi undersökte om cellerna levde. Först användes Hoechst 33258 (10 μM) och propidiumjodid (10 μM) för att undersöka om cellerna var friska under dessa förhållanden. Vi undersökte sedan om medelstora taggiga nervceller var funktionellt friska med hjälp av patch-clamp-inspelning. Vi utvärderade vidare om dopamin (DA) terminaler i striatalskivorna var funktionellt friska genom att mäta DA-frisättning med hjälp av snabbskannadvoltametri. Resultaten visade att striatala skivor som inte syresattes (ACSF/BSA-gruppen) var lika friska som den syresatta kontrollgruppen24.
Vi testade sedan olika kombinationer av skivtjocklek och stansstorlek för att bestämma optimala striatala skivförhållanden för flödesandningsanalysen. Dorsala striatala skivor med olika tjocklekar (150 μm och 200 μm) och stansstorlekar (1,0 mm, 1,5 mm och 2,0 mm i diameter) användes för OCR-analys med hjälp av analysatorn. Striatala skivor som var 150 μm tjocka med en stansstorlek på 1,5 mm i diameter hade den högsta kopplingseffektiviteten och OCR inom ett optimalt intervall för analysatorn24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer inklusive djurarbete utfördes enligt nationella och internationella riktlinjer och godkändes av Animal Care and Use Committee vid Thomas Jefferson University. Manliga FVB/ NTac-möss i åldern 3 till 14 månader användes. Följande steg utfördes i en icke-steril inställning, men försiktighet bör vidtas för att hålla allt så rent som möjligt.
OBS: Metoden som presenteras här fastställdes och användes i den forskning som rapporterades av Zhi et al.24. Experimenten som beskrivs här använde en Seahorse XF24 extracellulär flödesanalysator (se materialtabell). Dessa metoder kan anpassas för XFe24-analysatorn, och vissa resultat bekräftades med hjälp av denna analysator.
1. Hydratpatronsensorer (1 dag före analysen)
- Öppna den extracellulära flödesanalyssatsen (se materialtabell) och ta bort både sensorpatronen (grön) och verktygsplattan (klar; Figur 1A). Placera sensorpatronen åt sidan (sensorerna uppåt) och rör inte sensorerna.
- Tillsätt 600 μL kalibrantlösning (pH 7,4) till varje brunn på verktygsplattan. Placera sensorpatronen ovanpå verktygsplattan och sänk ner sensorerna i kalibrantlösningen. Se till att det triangulära hacket på verktygs- och sensorpatronplattan är korrekt inrett (figur 1B).
- Försegla den extracellulära flödesanalyssatsen med tätningsfilm för att förhindra avdunstning av kalibreringslösningen och placera den sedan i en 37 °C inkubator som inte kompletteras medCO2 eller syre över natten.
2. Förbered vävnadsplattan (på analysdagen)
- Öppna öfångsmikroplattan och ta ut öplattan för vävnadssittning.
- Värm en lämplig volym (625 μl per brunn) av försyreerad modifierad konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF, sammansättning 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM glukos, 10 mM HEPES, pH 7,2) buffert till 37 °C i ett 50 ml rör. Tillsätt sedan BSA till en slutlig koncentration på 4 mg/ml för att bereda andningsbufferten. I allmänhet räcker 50 ml för en platta.
- Tillsätt 625 μl andningsbuffert (försyreerad ACSF-buffert med 25 mM glukos och 4 mg/ml BSA) till varje brunn på öplattan försiktigt och undvik att skaka plattan. Se till att inga kvarvarande droppar finns ovanpå sensorpatronen och att inga luftbubblor finns i bufferten i varje brunn.
3. Akut striatal skivberedning och utskuren skivplacering
- Halshugga musen efter cervikal dislokation och dissekera omedelbart hjärnan i 10 ml iskall försyresatt skärlösning (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glukos, pH 7,4).
- Sektionera koronastritala skivor med ett vibratom enligt tillverkarens anvisningar (se materialtabell) med en tjocklek av 150 μm i iskall, försyregjord skärlösning.
- Återvinn skivorna i 50 ml syresatt ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glukos, 2 mM HEPES, pH 7,4) och förvara i lösning i upp till 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Efter återvinning överför skivorna till en 35 mm x 10 mm petriskål med 5 ml andningsbuffert.
- Använd en biopsistans i rostfritt stål (t.ex. 1,5 mm diameter) för att skapa en cirkulär bit vävnad i önskat område av den skivade hjärnan. Håll skivan i bufferten medan du försiktigt trycker ner med stansen. Se till att stansen trycks ner tillräckligt hårt för att skära vävnaden. Ta bort resten av vävnaden, lyft bort stansen och ta bort den cirkulära vävnadsbiten i bufferten.
- Skär själva änden av en 1 ml pipettspets för att göra ett hål med en diameter på 1,5-2,0 mm och använd den för att hålla och överföra den stansade skivan till toppen av inspelningsskärmen. Sug en bit stansad hjärnvävnad och placera försiktigt vävnaden på nätsidan av inspelningsskärmen (figur 2A). Fångstskärmen kommer att vara en cirkulär plastbit med nätet fäst på ena sidan.
OBS: Fångstskärmarna ingår i mikroplattpaketet (se materialtabell) och liknar den som används i Schuh et al.23. - Använd försiktigt en pappersnäsduk för att torka inspelningsskärmen en kort stund. Med fukten borttagen blir vävnaden klibbig, vilket gör att skivan kan fästa i mitten av nätet. Torka inte skivan för mycket eftersom den annars kommer att skadas.
- Håll ned inspelningsskärmens skiva med pincett och placera den i en av brunnarna på den ruvande öplattan (figur 2B). Var försiktig så att du inte tappar skivan; Om så är fallet, ta ut skärmen och placera en ny skiva på den.
OBS: Placera inte hjärnskivor i de två bakgrundskorrigeringsbrunnarna (A1 och D6) i öplattan. - Inkubera öplattan vid 37 °C i en kuvös i minst 30 minuter för att möjliggöra temperatur och pH-jämvikt innan testet körs.
4. Laddning av patroner med önskade föreningar
- Späd de önskade föreningarna i modifierad ACSF (37 °C) till den slutliga stamkoncentrationen på 10x, 11x, 12x och 13x av arbetskoncentrationen för portarna A till D och justera till pH 7,4. Testet kommer att administrera föreningarna i ordning från port A till D. För detta experiment användes följande lösningar, med deras respektive arbetskoncentration som nämns före dem: 10 mM pyruvat (port A), 20 μM oligomycin (port B), 10 μM eller andra koncentrationer av FCCP (port C) och 20 μM antimycin A (port D).
- Förinstallera försiktigt 75 μL av de utspädda föreningarna i lämpliga injektionsportar på sensorpatronen. Placera spetsarna halvvägs in i injektionsportarna i 45° vinkel med spetsen mot injektionsportens vägg. Spetsar ska inte sättas in helt i botten av injektionsportarna eftersom detta kan orsaka sammansatt läckage genom porten.
- Dra försiktigt ut spetsarna från portarna för att undvika att skapa luftbubblor. Knacka inte på någon del av patronen för att undvika att lindra luftbubblor.
- Inspektera injektionsportarna visuellt för jämn lastning. Se till att all vätska finns i porten och att inga kvarvarande droppar finns ovanpå patronen.
- Placera sensorpatronen på verktygsplattan och lägg den i en inkubator (icke-CO2) i 30 minuter så att den kan värmas upp till 37 °C igen. Hantera försiktigt genom att bara hålla i verktygsplattan. Rör dig så lite som möjligt.
5. Kalibrering och utförande av analysen
- Ladda analysmallen i programvaran. Tryck på den gröna START-knappen .
- Se till att ladda rätt protokoll. Protokollet innehåller en kombination av 3 min mix, 3 min wait och 2 min mätsekvenser (dessa tre steg bildar en mätning). Ändra sondhuvudets avstånd från 26 600 till 27 800 i maskinvaruinställningarna under instrumentinställningar25. Det finns inget behov av att byta sondhuvud för XFe24-analysatorn. Tryck på START.
- Ladda sensorkassetten på verktygsplattan i instrumentfacket. Skåran går i det främre, vänstra hörnet. Se till att plattan sitter korrekt och är platt. Ladda den läkemedelsfyllda sensorpatronen i analysatorn för kalibrering.
- Följ instruktionerna på skärmen för att kalibrera och balansera sensorerna. Detta tar cirka 30 min.
- När kalibreringssteget är klart tar du bort kalibreringsplattan och ersätter den med öplattan (som innehåller nät- och vävnadsskivorna).
- Mät syreförbrukningen i varje brunn på plattan med hjälp av analysprotokollen. Protokollet innehåller en kombination av 3 min mix, 3 min wait och 2 min mätsekvenser (dessa tre steg bildar en mätning), vid vilken tidpunkt OCR beräknas.
- För hela experimentet, inkludera 4x OCR-mätningar för att skapa en baslinje, följt av injektion av port A (pyruvat) med 4x mätningar, sedan injektion av port B (oligomycin) med 8x mätningar, sedan injektion av port C (FCCP) med 5x mätningar och slutligen injektion av port D (antimycin A) med 6x mätningar.
OBS: Detta antal mätningar efter varje sammansatt injektion bestäms beroende på när mätningen når platån. - Analysera OCR-mätdata och kopplingseffektivitetsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det första steget i denna studie var att optimera skivtjockleken och stansstorleken som används för att skära ut en del av striatum från skivan (figur 3A). En skiva med en tjocklek på 150 μm och en stansstorlek på 1,5 mm gav de bästa resultaten som bestämdes av kopplingseffektiviteten (figur 3B-C). Som visas i figur 3B är OCR relativt stabil i 5 timmar med mindre än 10% nedgång. Dessutom användes funktionella mätningar, liksom patch-clamp-inspelning av kortikala neuroner och medium spiny neuroner i striatum, och snabb-scan cyklisk voltametri (FSCV) mätning av DA-frisättning, för att visa att neuronerna och terminalerna var fullt funktionella i denna beredning, som visas i Zhi et al.24. Inkluderat med detta testade vi sedan olika koncentrationer av FCCP för att upptäcka vilka som skulle ge det bästa svaret; 10 μM FCCP gav den bästa avläsningen (figur 3D1,D2) bestämd av den extra andningskapaciteten:
Extra andningskapacitet = maximal andning - basal andning
Dessa skivförhållanden användes för att mäta skillnaderna i OCR för striatala skivor från PINK1 KO-möss och vildtyps (WT) kullkamrater. För resultaten av PINK1 KO- och WT-möss användes 3-4 möss och 4-6 replikat per mus användes och medelvärdet för att erhålla en datapunkt. Eftersom PINK1 är en viktig regulator för mitokondriell funktion förväntades mitokondriell dysfunktion hittas hos KO-mössen, mätt med minskad mitokondriell OCR. Faktum är att en åldersberoende minskning av OCR var tydlig hos KO-mössen jämfört med deras WT-kontroller (figur 4A,D). Basal OCR var liknande i både KO- och WT-grupperna för unga möss (3-4 månader); basal OCR minskade dock för KO-mössen i den gamla gruppen (10-14 månader; Figur 4B,E). Kopplingseffektivitet, bestämd enligt nedan.
Kopplingseffektivitet = [ATP-produktionshastighet] / [basal andningshastighet] × 100
minskade dock hos KO-mössen för både unga och gamla grupper (figur 4C,F). Dessa data visar att sektionerna av striatal vävnad från PINK1 KO-möss hade mitokondriell dysfunktion. Denna dysfunktion hos KO-mössen började också från en ung ålder, vilket indikeras av den minskade kopplingseffektiviteten, även om den basala OCR endast minskade i den gamla gruppen. Denna åldersberoende minskning var sannolikt ett resultat av ackumulerande mitokondriella defekter orsakade av knockout av PINK1.
Figur 1: Bilder som visar de extracellulära flödesanalysatorns hydratpatronsensorer och platta. (A) Sensorkassetten som sitter ovanpå en kalibreringsplatta (verktygsplatta). (B) Sidovy av verktygsplattan och sensorpatronplattan. Det triangulära hacket på verktygs- och sensorpatronplattan ska vara korrekt inriktat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Stansad skivas fastsättning och placering. (A) Stansad skiva fästs på nätinsatsen på inspelningsskärmen och placeras sedan (B) försiktigt i en av brunnarna på den ruvande öplattan för att säkerställa att skivan inte lossnar eller rör sig under mätningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Optimalt striatalt skivtillstånd för flödesandningsanalys (A) Diagram över vävnadsstansstorlekar (1,0 mm, 1,5 mm och 2,0 mm i diameter) för striatum (STR) med röda cirklar som representerar de områden som erhölls för analysen. (B1) O2-förbrukningshastigheter (OCR) för olika tjocklekar och stansstorlekar av skivor i kontrollgruppen visade stabil basal andning över hela mätningen (4 h), och OCR var proportionell mot skivans volym. OCR mättes i skivor med en tjocklek på 150 μm och 200 μm stansade med 1,0 mm, 1,5 mm och 2,0 mm stans. Kombinationerna som används nämns i legenderna som tjocklek * stansstorlek (t.ex. 150 μm * 1 mm). (B2) Genomsnittlig OCR mätt i skivor med en tjocklek på 150 μm stansade med 1,5 mm stans; n = 7. (C1) Representativa OCR-svar av skivor med olika tjocklekar och diametrar med 10 mM pyruvat (P), 20 μM oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) och 20 μM antimycin A (A) injicerat sekventiellt. Pilarna indikerar tidpunkten för injektion av dessa föreningar. (C2) Mitokondriell kopplingseffektivitet jämfördes mellan olika grupper. Skivor på 150 μm * 1,5 mm hade den höga kopplingseffektiviteten men den minsta variansen; n = 4. (D1) Titreringsexperiment för FCCP utfördes och 10 μM FCCP gav den största reservkapaciteten; n = 4 för varje grupp. (D2) Titreringsexperiment för FCCP utfördes med en analysator och 10 μM FCCP gav den största reservkapaciteten; n = 4 för varje grupp. De värden som anges i figurerna är medelvärdet ± medelvärdet av medelvärdet (SEM). Denna siffra har modifierats från Zhi et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: PINK1 KO-skivor från den gamla gruppen som visar signifikant lägre OCR. OCR av akuta STR-skivor (150 μm * 1,5 mm) från möss hos unga (A, B och C) och de gamla grupperna (D, E och F), utsatta för successiva tillägg av andningsmodulatorer (visas med pilar). OCR för den unga gruppen skilde sig inte signifikant mellan olika genotyper (B), medan kopplingseffektiviteten (bestämd som ett procentvärde med hjälp av formeln som nämns ovan %) minskade i PINK1 KO-skivor (C). I den gamla gruppen visade PINK1 KOslices signifikant minskad basal andningsnivå (E) och kopplingseffektivitet (F). Följande lösning, 10 mM pyruvat (P), 20 μM oligomycin (O), 10 μM FCCP (F) och 20 μM antimycin A (A), injicerades sekventiellt. n = 4 för varje genotyp och ålder. De värden som anges i figurerna är medelvärde ± SEM. Skillnaden ansågs signifikant när p < 0,05 (*). Denna siffra har modifierats från Zhi et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden vi utvecklade gjorde det möjligt att använda en XF-analysator för att mäta OCR i striatala skivor från vuxna möss under en tidsperiod på 4 timmar. Denna metod ger ett nytt sätt att mäta cellulär bioenergetik i slag som skärs ut från anatomiskt definierade hjärnstrukturer. Eftersom vävnadsproverna som analyseras är ganska små kan de metaboliska parametrarna för specifika hjärnområden som är involverade i en sjukdom undersökas. Dessutom efterliknar användningen av akuta skivor närmare den fysiologiska cellulära miljön, vilket inte kan uppnås med isolerade mitokondrier eller odlade celler och organotypiska skivor. Vidare ökar mätningen av OCR i flera hjärnregioner från ett enda djur eller över flera djur i en 24-brunnsplatta kraftigt den statistiska kraften i studier som implementerar denna nya teknik.
Detta är det första protokollet för OCR-mätning i akuta striatala skivor från vuxna möss. Fokus låg på STR eftersom det är ett av de hjärnområden som främst är involverade i PD och Huntingtons sjukdom. Den basala OCR- och kopplingseffektiviteten i vår studie är jämförbar med de andra studierna som mäter OCR i akuta hjärnskivor med hjälp av XF-analysatorn 25,26,27. Den extra andningskapaciteten hos striatala skivor i vår studie verkar dock mindre jämfört med de andra rapporterna som mätte andra hjärnområden. Fortfarande okänt är om denna skillnad återspeglar verkliga skillnader i extra andningskapacitet mellan hjärnområden eller små skillnader i skivberedning, utskuren skivplacering eller musbelastning. Dessa skillnader motiverar ytterligare undersökning.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll, inklusive att förbereda akuta hjärnskivor, överföra den stansade skivan till toppen av inspelningsskärmen och placera skivan i brunnen. Segmenten ska hållas fästa på inspelningsskärmen under mätningen. Annars, om skivan lossnar från skärmen och sitter i plattans brunn, kommer den att vara långt borta från syresensorn, vilket resulterar i en mycket lägre avläsning av OCR och svar på drogerna. Vi rekommenderar minst fyra replikat (fyra utskurna hjärnskivor i samma område) för varje tillstånd och exklusive resultaten av de fristående segmenten. OCR bör vara proportionellt mot vävnadsinnehållet. Denna studie mätte inte vävnadsmängden eftersom hjärnan skivades i samma tjocklek och skivan stansades med samma puncher. Således var vävnadsmängden konstant, och det var inte nödvändigt att bestämma vävnadsinnehållet. Det är viktigt att använda en ny puncher för varje tallrik (24 skivor) för att säkerställa skärpan och därmed samma mängd vävnad. Dessutom tar sektionering, beredning av vävnadsstansar och fästning av skivorna per mus cirka 30 minuter och tar cirka 2 timmar totalt för två par möss. Stabiliteten hos akuta hjärnskivor är bara bra i 7-8 timmar efter sektionering även vid optimala förhållanden (bedömd med hjälp av känsliga funktionella analyser-patch-clamp-inspelning för att utvärdera neurons hälsosamma tillstånd) och därmed kanske det inte är praktiskt att använda en 96-brunnsinställning.
För att illustrera nyttan av tekniken mätte vi OCR från striatala skivor från PINK1 KO-möss och deras WT-kullkamrater. En signifikant minskning hittades i den basala andningen hos åldrade PINK1 KO-möss jämfört med åldersmatchade WT-kontroller, i överensstämmelse med åldersberoende DA-frisättningsunderskott24. Denna observation överensstämmer också med tidigare publicerade studier, vilket bekräftar giltigheten av detta protokoll. Det finns också begränsningar för metoderna. Till exempel mättes OCR från den akuta striatala hjärnskivan, som sannolikt är hjärnaktivitetsoberoende och mestadels erbjuder inaktiva medium spiny neuroner och dopaminerga terminaler, liksom astrocyter. Dessutom har metoden ingen celltypspecifik upplösning.
Sammanfattningsvis mäter denna nya metod OCR i akuta hjärnskivor från vuxna möss och visar hur PINK1, en PD-relaterad gen, påverkar mitokondriell funktion hos möss. Denna metod är lätt att implementera och allmänt tillämplig på forskare som arbetar inom PD och Huntingtons sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Wangchen Tsering och Pamela Walter för deras kritiska läsning och redigering av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 till CJ L. och NS098393 till H.Z.) och Institutionen för neurovetenskap vid Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
