Summary
Oksijen tüketim hızı (OCR), mitokondriyal fonksiyon için yaygın bir vekildir ve farklı hastalık modellerini incelemek için kullanılabilir. Yetişkin farelerden akut striatal dilimlerdeki OCR'yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdik ve bu da fizyolojik olarak diğer yöntemlerden daha alakalı.
Abstract
Mitokondri, hücresel ATP üretiminde, reaktif oksijen türlerinin düzenlenmesinde ve Ca2 + konsantrasyon kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır. Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalığın patogenezinde rol oynamıştır. Mitokondrinin bu hastalıkların modellerindeki rolünü incelemek için, mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak oksijen tüketim oranı (OCR) yoluyla mitokondriyal solunumu ölçebiliriz. OCR, hücre kültürlerinde ve izole mitokondrilerde zaten başarıyla ölçülmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler akut beyin dilimlerinde OCR'yi ölçmekten daha az fizyolojik olarak ilgilidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yazarlar yetişkin farelerden akut striatal dilimlerde OCR'yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdiler. Teknik, PD ve Huntington hastalığında yer alan bir beyin bölgesi olan striatuma odaklanarak optimize edilmiştir. Analizör, 24 numunenin eşzamanlı kinetik ölçümüne izin veren 24 delikli bir plaka kullanarak canlı bir hücre testi gerçekleştirir. Yöntem, örnek olarak dairesel delikli striatal beyin dilimleri parçalarını kullanır. Bu tekniğin etkinliğini, PD'nin bir fare modelinin striatal dilimlerinde daha düşük bir bazal OCR tanımlayarak gösteriyoruz. Bu yöntem, PD ve Huntington hastalığı alanında çalışan araştırmacılar için geniş ilgi çekici olacaktır.
Introduction
Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıklarda rol oynamıştır. PINK1 nakavt (KO) fareleri ve sıçanlar gibi PD modelleri, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon 4,5,6,7,8,9,10,11 gösterir. Yaşlı PINK1 KO farenin striatumundan (STR) veya tüm beyninden izole edilen mitokondri, kompleks I 7,10,12,13'te kusurlar sergiler. Oksijen tüketim oranının (OCR) doğrudan ölçülmesi, mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için en yaygın yöntemlerden biridir, çünkü OCR, mitokondri14'ün temel işlevi olan ATP üretimi ile birleştirilir. Bu nedenle, OCR'nin hastalık modellerinde veya hasta kaynaklı örneklerde / dokularda ölçülmesi, mitokondriyal disfonksiyonun hastalığa nasıl yol açtığını araştırmaya yardımcı olabilir.
Şu anda, Clark elektrodu ve diğer O2 elektrotları,O2 floresan boya ve hücre dışı akı analizörü15,16,17,18,19 dahil olmak üzere mitokondriyal OCR'yi ölçmenin birkaç yolu vardır. Bir avantaj olarak,O2 elektrot bazlı yöntemler çeşitli substratların kolayca eklenmesini sağlar. Bununla birlikte, birkaç numuneyi aynı anda ölçmek için yetersizdirler. GelenekselO2 elektrot bazlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, hücre kültürlerinde OCR veya saflaştırılmış mitokondri için yaygın olarak kullanılan bir araç olan hücre dışı akı analizörü,gelişmiş verim 15,18,20 sunar. Bununla birlikte, tüm bu yöntemler genellikle izole mitokondri veya hücre kültürlerinde OCR'yi ölçmek için uygulanır 6,16,17,19,20,21. Mitokondrinin izolasyonu yanlışlıkla hasara neden olur ve ekstrakte edilen mitokondri veya hücre kültürleri, fizyolojik olarak sağlam beyin dilimlerinden daha az ilgilidir22. Mikroelektrotlar dilimlerde kullanıldığında bile, kültürlenmiş hücrelere göre daha az hassastır ve çalıştırılması daha zordur23.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, farelerin akut striatal beyin dilimlerinden çoklu metabolik parametrelerin analizine izin veren XF24 hücre dışı akı analizörünü kullanarak bir yöntem geliştirdik24. Bu teknik, OCR aracılığıyla mitokondriyal solunumun sürekli doğrudan nicelleştirilmesini sağlar. Kısacası, striatal beyin dilimlerinin küçük bölümleri adacık plakasının kuyucuklarına yerleştirilir ve analizör, OCR ve hücre dışı asitleşme oranını ölçmek için sırasıyla17,21,25 olan oksijen ve proton floresan bazlı biyosensörleri kullanır.
Analizörün benzersiz özelliklerinden biri, dört adede kadar bileşiği veya reaktifi sırayla enjekte ederken OCR'nin sürekli ölçümüne izin veren dört enjeksiyon kuyusudur; bu, bazal mitokondriyal OCR, ATP'ye bağlı OCR ve maksimum mitokondriyal OCR gibi çeşitli hücresel solunum parametrelerinin ölçülmesini sağlar. Burada gösterilen protokol ölçümleri sırasında enjekte edilen bileşikler, birinci çözelti kuyusunda (port A) 10 mM piruvat, ikinci çözelti kuyusunda (port B) 20 μM oligomisin, üçüncü kuyuda (port C) 10 μM karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) ve dördüncü kuyuda (port D) 20 μM antimisin A çalışma konsantrasyonlarıydı. Fried ve ark.25'e dayanmaktadır. Bu konsantrasyonların çalışma konsantrasyonları olduğu ve sırasıyla A'dan D'ye kadar olan çözelti portlarına 10x, 11x, 12x ve 13x'lik stok çözeltilerinin enjekte edildiği belirtilmelidir. Her bir çözeltinin kullanılmasının amacı aşağıdaki gibiydi: 1) Piruvat gerekliydi, çünkü onsuz, FCCP ilavesi, mevcut substratların sınırlandırılmasından kaynaklanan azalmış bir OCR tepkisine sahip olacaktı; 2) Oligomisin, ATP sentazı inhibe eder ve ATP'ye bağlı solunumun ölçülmesine izin verir; 3) FCCP, oksidasyonu fosforilasyondan ayırır ve maksimum mitokondriyal kapasitenin ölçülmesine izin verir; 4) Antimisin A, elektron taşıma zincirindeki kompleks III'ü inhibe eder ve bu nedenle mitokondriye bağlı olmayan OCR'nin ölçülmesine izin verir.
Kullanılan oligomisin konsantrasyonu aşağıdaki nedenlere dayanarak belirlenmiştir: 1) Çoğu hücre tipi (izole mitokondri veya hücre kültürleri) için önerilen oligomisin dozu 1.5 μM'dir. Deneyimlere göre, genellikle ayrışmış hücre dozunun 3x-10x'i dilim deneyleri için kullanılır, çünkü bir gradyan olabilir ve çözeltinin dilimlere nüfuz etmesi zaman alır. Bu nedenle, konsantrasyon 5 μM ila 25 μM aralığında olmalıdır. 2) Fried ve ark.25'e dayanarak 20 μM konsantrasyon seçildi. Oligomisinin spesifik olmayan toksisitesi nedeniyle daha yüksek konsantrasyonlar denenmemiştir. 3) Underwood ve ark.26 tarafından hazırlanan raporda, yazarlar oligomisin için bir titrasyon deneyi yaptılar ve 6.25, 12.5, 25 ve 50 μg / mL'deki dozların benzer inhibisyonla sonuçlandığını buldular. Daha yüksek oligomisin konsantrasyonu (50 μg / mL) daha fazla inhibe etmedi, ancak daha büyük bir varyansa sahipti. 4) Gözlemimizde, belirleyici faktör oligomisinin nüfuz etme kabiliyeti gibi görünmektedir. Oligomisinin dokuya nüfuz etmesi zordur ve bu nedenle maksimum yanıt olan platoya ulaşmak için en az 7 ila 8 döngü gerekir. Platoya ulaştığı sürece, inhibisyonun maksimum olduğu varsayılır.
Striatal dilimlerde OCR'yi ölçmek için hücre dışı akı analizörünü uyarlamanın önemli bir teknik zorluğu, doku hipoksisini önlemektir. Tampon, ölçümlerin tüm süresi boyunca (yaklaşık 4 saat) oksijenlenmediğinden, hipoksi merkezi bir konuydu. Bu, özellikle oksijenin numuneler boyunca yayılamadığı daha kalın doku örnekleri için geçerlidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, dilimler 150 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı, böylece ortam oksijeni beyin dilimlerinin ortasına nüfuz edebildi. Ek olarak, önceden oksijenlenmiş yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) tamponuna 4 mg / mL sığır serum albümini (BSA) eklenmiştir, bu da daha önce önerildiği gibi maksimum OCR'nin belirlenmesini kolaylaştırmıştır23. Hücrelerin canlı olup olmadığını inceledik. İlk olarak, hücrelerin bu koşullar altında sağlıklı olup olmadığını incelemek için Hoechst 33258 (10 μM) ve propidium iyodür (10 μM) kullanılmıştır. Daha sonra orta dikenli nöronların yama-kelepçe kaydı kullanarak işlevsel olarak sağlıklı olup olmadığını inceledik. Ayrıca, striatal dilimlerdeki dopamin (DA) terminallerinin, hızlı tarama voltametrisi kullanarak DA salınımını ölçerek fonksiyonel olarak sağlıklı olup olmadığını değerlendirdik. Sonuçlar, oksijenlenmemiş striatal dilimlerin (ACSF / BSA grubu) oksijenli kontrol grubu24 kadar sağlıklı olduğunu göstermiştir.
Daha sonra, akı solunum testi için en uygun striatal dilim koşullarını belirlemek için farklı dilim kalınlığı ve zımba boyutu kombinasyonlarını test ettik. Analizör kullanılarak OCR analizi için farklı kalınlıklarda (150 μm ve 200 μm) ve punch boyutlarında (1,0 mm, 1,5 mm ve 2,0 mm çapında) dorsal striatal dilimler kullanılmıştır. 1,5 mm çapında zımba boyutuna sahip 150 μm kalınlığındaki Striatal dilimler, analizör24 için en yüksek bağlantı verimliliğine ve OCR'lere sahipti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan çalışmaları da dahil olmak üzere tüm prosedürler ulusal ve uluslararası kılavuzlara göre yürütülmüş ve Thomas Jefferson Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. 3-14 aylıkken erkek FVB/NTac fareleri kullanıldı. Aşağıdaki adımlar steril olmayan bir ortamda gerçekleştirilmiştir, ancak her şeyi mümkün olduğunca temiz tutmak için dikkatli olunmalıdır.
NOT: Burada sunulan yöntem, Zhi ve ark.24 tarafından bildirilen araştırmada kurulmuş ve kullanılmıştır. Burada açıklanan deneylerde bir Denizatı XF24 hücre dışı akı analizörü kullanılmıştır (bkz. Bu yöntemler XFe24 analizörü için uyarlanabilir ve bazı sonuçlar bu analizör kullanılarak doğrulanmıştır.
1. Kartuş sensörlerini nemlendirin (tahlilden 1 gün önce)
- Hücre dışı akı testi kitini açın (bkz . Malzeme Tablosu) ve hem sensör kartuşunu (yeşil) hem de yardımcı plakayı (net; Şekil 1A). Sensör kartuşunu bir kenara koyun (sensörler yukarı) ve sensörlere dokunmayın.
- Yardımcı plakanın her bir kuyucuğuna 600 μL kalibrent çözeltisi (pH 7.4) ekleyin. Sensör kartuşunu yardımcı plakanın üzerine yerleştirin ve sensörleri kalibrant çözeltisine batırın. Yardımcı programın ve sensör kartuşu plakasının üçgen çentiğinin doğru hizalandığından emin olun (Şekil 1B).
- Kalibrant çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için hücre dışı akı testi kitini sızdırmazlık filmi ile kapatın ve ardından gece boyunca CO2 veya oksijen ile desteklenmemiş 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
2. Doku plakasını hazırlayın (tahlil gününde)
- Adacık yakalama mikro plakasını açın ve doku oturması için adacık plakasını çıkarın.
- Önceden oksijenlenmiş modifiye edilmiş yapay beyin omurilik sıvısının (ACSF, bileşim 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl 2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mM KH 2 PO4,25mM glikoz, 10 mM HEPES, pH7.2) uygun bir hacmini (kuyu başına 625 μL) 50 mL'lik bir tüpte 37 °C'ye kadar ısıtın. Daha sonra solunum tamponunu hazırlamak için BSA'yı 4 mg / mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Genel olarak, bir plaka için 50 mL yeterlidir.
- Adacık plakasının her bir kuyucuğuna 625 μL solunum tamponu (25 mM glikoz ve 4 mg / mL BSA ile önceden oksijenlenmiş ACSF tamponu) dikkatlice ekleyin ve plakayı sallamaktan kaçının. Sensör kartuşunun üstünde artık damla olmadığından ve her bir kuyucuğun tamponunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.
3. Akut striatal dilim hazırlama ve eksize edilmiş dilim yerleştirme
- Servikal çıkıktan sonra farenin kafasını kesin ve beyni hemen 10 mL buz gibi soğuk ön oksijenli kesme çözeltisinde (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 3.7 mM MgSO 4,0.3 mM KH2PO 4, 10 mM glikoz, pH 7.4) diseke edin.
- Bölüm koronal striatal dilimler, buz gibi soğuk, önceden oksijenlenmiş kesme çözeltisinde 150 μm kalınlığında üreticinin talimatını takiben bir vibratom ile dilimler ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Dilimleri 50 mL oksijenli ACSF'de (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO 4,0,3 mM KH 2 PO 4, 10 mM glikoz,2mM HEPES, pH7,4) geri kazanın ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakikaya kadar çözelti içinde tutun.
- İyileştikten sonra, dilimleri 5 mL solunum tamponu ile 35 mm x 10 mm Petri kabına aktarın.
- Dilimlenmiş beynin istenen bölgesinde dairesel bir doku parçası oluşturmak için paslanmaz çelik bir biyopsi punch (örneğin, 1,5 mm çapında) kullanın. Zımba ile hafifçe bastırırken dilimi tamponda tutun. Zımbanın dokuyu kesecek kadar sert bir şekilde aşağı itildiğinden emin olun. Dokunun geri kalanını çıkarın, zımbayı kaldırın ve dairesel doku parçasını tampona çıkarın.
- 1,5-2,0 mm çapında bir delik açmak için 1 mL'lik pipet ucunun en ucunu kesin ve delinmiş dilimi tutup yakalama ekranının üstüne aktarmak için kullanın. Bir parça delinmiş beyin dokusunu emin ve dokuyu dikkatlice yakalama ekranının ağ tarafına yerleştirin (Şekil 2A). Yakalama ekranı, ağ bir tarafa tutturulmuş dairesel bir plastik parçası olacaktır.
NOT: Yakalama ekranları mikroplaka paketine dahil edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu) ve Schuh et al.23'te kullanılana benzer. - Yakalama ekranını kısa bir süre kurutmak için bir kağıt mendil kullanın. Nem alındığında, doku yapışkan hale gelir ve bu da dilimin ağın merkezine yapışmasını sağlar. Dilimi çok fazla kurutmayın, aksi takdirde zarar görür.
- Yakalama ekranı dilimini cımbızla yan yana doğru tutun ve inkübasyon adacık plakasının kuyucuklarından birine yerleştirin (Şekil 2B). Dilimi düşürmemeye dikkat edin; öyleyse, ekranı çıkarın ve üzerine yeni bir dilim yerleştirin.
NOT: Beyin dilimlerini adacık plakasındaki iki arka plan düzeltme kuyusuna (A1 ve D6) yerleştirmeyin. - Testi çalıştırmadan önce sıcaklık ve pH dengesine izin vermek için adacık plakasını bir inkübatörde 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca inkübe edin.
4. İstenilen bileşiklerle kartuşların yüklenmesi
- İstenilen bileşikleri modifiye ACSF'de (37 °C) sırasıyla A'dan D'ye portlar için çalışma konsantrasyonunun 10x, 11x, 12x ve 13x'lik nihai stok konsantrasyonuna kadar seyreltin ve pH 7.4'e ayarlayın. Test, bileşikleri A'dan D'ye kadar sırayla uygulayacaktır. Bu deney için, daha önce belirtilen çalışma konsantrasyonlarıyla birlikte aşağıdaki çözeltiler kullanılmıştır: 10 mM piruvat (port A), 20 μM oligomisin (port B), 10 μM veya diğer FCCP konsantrasyonları (port C) ve 20 μM antimisin A (port D).
- Seyreltilmiş bileşiklerin 75 μL'sini sensör kartuşunun uygun enjeksiyon portlarına nazikçe önceden yükleyin. Uçları, ucu enjeksiyon portunun duvarına dayamış olacak şekilde 45° açıyla enjeksiyon portlarının yarısına yerleştirin. Uçlar, enjeksiyon portlarının altına tamamen yerleştirilmemelidir, çünkü bu, porttan bileşik sızıntısına neden olabilir.
- Hava kabarcıkları oluşturmamak için uçları bağlantı noktalarından dikkatlice çekin. Hava kabarcıklarının hafiflemesini önlemek için kartuşun herhangi bir kısmına dokunmayın.
- Enjeksiyon portlarını eşit yükleme için görsel olarak inceleyin. Tüm sıvının bağlantı noktasında olduğundan ve kartuşun üstünde artık damla bulunmadığından emin olun.
- Sensör kartuşunu yardımcı plakaya yerleştirin ve tekrar 37 ° C'ye kadar ısınmasını sağlamak için 30 dakika boyunca bir inkübatöre (CO2 olmayan) yerleştirin. Sadece yardımcı plakayı tutarak dikkatlice kullanın. Mümkün olduğunca az hareket edin.
5. Kalibrasyon ve tahlilin yapılması
- Tahlil şablonunu yazılıma yükleyin. Yeşil renkli START düğmesine basın.
- Doğru protokolü yüklediğinizden emin olun. Protokol, 3 dakikalık karışım, 3 dakikalık bekleme ve 2 dakikalık ölçüm dizilerinin bir kombinasyonunu içerir (bu üç adım bir ölçüm oluşturur). Enstrüman ayarları25 altındaki donanım ayarlarında prob kafasının mesafesini 26.600'den 27.800'e değiştirin. XFe24 analizörü için prob kafasını değiştirmeye gerek yoktur. BAŞLAT tuşuna basın.
- Yardımcı program plakasındaki sensör kartuşunu cihaz tepsisine takın. Çentik öne, sol köşeye gider. Plakanın doğru oturduğundan ve düz olduğundan emin olun. Kalibrasyon için ilaç dolu sensör kartuşunu analizöre yükleyin.
- Sensörleri kalibre etmek ve dengelemek için ekrandaki talimatları izleyin. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürer.
- Kalibrasyon adımı tamamlandıktan sonra, kalibrasyon plakasını çıkarın ve adacık plakasıyla değiştirin (ağ ve doku dilimlerini içeren).
- Tahlil protokollerini kullanarak plakanın her bir kuyucuğundaki oksijen tüketimini ölçün. Protokol, OCR'nin hesaplandığı 3 dakikalık karışım, 3 dakikalık bekleme ve 2 dakikalık ölçüm dizilerinin (bu üç adım bir ölçüm oluşturur) bir kombinasyonunu içerir.
- Tüm deney için, bir taban çizgisi oluşturmak için 4x OCR ölçümlerini, ardından 4x ölçümlerle A portunun (piruvat) enjeksiyonunu, daha sonra 8x ölçümlerle B portunun (oligomisin) enjeksiyonunu, daha sonra 5x ölçümlerle C portunun (FCCP) enjeksiyonunu ve son olarak, 6x ölçümlerle port D'nin (antimisin A) enjeksiyonunu içerir.
NOT: Her bileşik enjeksiyondan sonra bu ölçüm sayısı, ölçümün platoya ne zaman ulaştığına bağlı olarak belirlenir. - OCR ölçüm verilerini ve bağlantı verimliliği verilerini analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın ilk adımı, striatumun bir bölümünü dilimden çıkarmak için kullanılan dilim kalınlığını ve zımba boyutunu optimize etmekti (Şekil 3A). 150 μm kalınlığındaki bir dilim ve 1,5 mm'lik bir zımba boyutu, kavrama verimliliği tarafından belirlenen en iyi sonuçları vermiştir (Şekil 3B-C). Şekil 3B'de gösterildiği gibi, OCR% 10'dan az tükenme ile 5 saat boyunca nispeten kararlıdır. Ek olarak, fonksiyonel ölçümlerin yanı sıra, striatumdaki kortikal nöronların ve orta dikenli nöronların yama-kelepçe kaydı ve DA salınımının hızlı tarama siklik voltammetri (FSCV) ölçümü, nöronların ve terminallerin Zhi ve ark.24'te gösterildiği gibi bu preparatta tamamen işlevsel olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, hangisinin en iyi cevabı vereceğini keşfetmek için farklı FCCP konsantrasyonlarını test ettik; 10 μM FCCP, yedek solunum kapasitesi tarafından belirlenen en iyi okumayı (Şekil 3D1, D2) verdi:
Yedek solunum kapasitesi = maksimum solunum - bazal solunum
Bu dilim koşulları, PINK1 KO farelerden ve vahşi tip (WT) çöp arkadaşlarından striatal dilimlerin OCR'sindeki farklılıkları ölçmek için kullanıldı. PINK1 KO ve WT farelerinin sonuçları için 3-4 fare kullanıldı ve fare başına 4-6 replika kullanıldı ve bir veri noktası elde etmek için ortalaması alındı. PINK1, mitokondriyal fonksiyonun önemli bir düzenleyicisi olduğundan, mitokondriyal OCR'nin azalmasıyla ölçülen KO farelerde mitokondriyal disfonksiyonun bulunması bekleniyordu. Gerçekten de, OCR'de yaşa bağlı bir azalma, WT kontrollerine kıyasla KO farelerinde belirgindi (Şekil 4A, D). Bazal OCR, genç fareler için hem KO hem de WT gruplarında benzerdi (3-4 ay); Bununla birlikte, eski gruptaki KO fareleri için bazal OCR azaldı (10-14 ay; Şekil 4B,E). Aşağıdaki gibi belirlenen kaplin verimliliği,
Kaplin verimliliği = [ATP üretim hızı] / [bazal solunum hızı] × 100
Bununla birlikte, hem genç hem de yaşlı gruplar için KO farelerinde azalma olmuştur (Şekil 4C, F). Bu veriler, PINK1 KO farelerinden striatal doku kesitlerinin mitokondriyal disfonksiyona sahip olduğunu göstermektedir. KO farelerinde bu işlev bozukluğu da genç yaştan itibaren başladı, bazal OCR sadece eski grupta azalmış olmasına rağmen, azalan bağlantı verimliliği ile belirtildi. Bu yaşa bağlı azalma muhtemelen PINK1'in nakavtının neden olduğu mitokondriyal defektlerin birikmesinin bir sonucuydu.
Resim 1: Hücre dışı akı analizörü hidrat kartuşu sensörlerini ve plakasını gösteren görüntüler. (A) Bir kalibrasyon plakasının (yardımcı plaka) üstünde oturan sensör kartuşu. (B) Yardımcı plakanın ve sensör kartuşu plakasının yandan görünümü. Yardımcı programın ve sensör kartuş plakasının üçgen çentiği doğru şekilde hizalanmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Delinmiş dilim bağlantısı ve yerleşimi. (A) Delinmiş dilim, yakalama ekranının ağ ucuna tutturulur ve daha sonra (B) ölçüm sırasında dilimin ayrılmamasını veya hareket etmemesini sağlamak için inkübasyon adacık plakasının kuyucuklarından birine dikkatlice yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akı solunum testi için optimal striatal dilim durumu . (A) Analiz için elde edilen alanları temsil eden kırmızı dairelerle triatum (STR) için doku delme boyutlarının (1.0 mm, 1.5 mm ve 2.0 mm çapında) diyagramı. (B1) Kontrol grubundaki dilimlerin farklı kalınlıkları ve zımba boyutları için O2 tüketim oranları (OCR'ler), tüm ölçüm boyunca (4 saat) stabil bazal solunum gösterdi ve OCR, dilimin hacmi ile orantılıydı. OCR'ler, 1,0 mm, 1,5 mm ve 2,0 mm zımba ile delinmiş 150 μm ve 200 μm kalınlığındaki dilimlerde ölçülmüştür. Kullanılan kombinasyonlar göstergelerde kalınlık * zımba boyutu (örneğin, 150 μm * 1 mm) olarak belirtilmiştir. (B2) 1,5 mm zımba ile delinmiş 150 μm kalınlığındaki dilimlerde ölçülen ortalama OCR'ler; n = 7. (C1) Sırayla enjekte edilen 10 mM piruvat (P), 20 μM oligomisin (O), 10 μM FCCP (F) ve 20 μM antimisin A (A) ile farklı kalınlık ve çaplardaki dilimlerin temsili OCR yanıtları. Oklar, bu bileşiklerin enjeksiyon zaman noktasını gösterir. (C2) Mitokondriyal kuplajın etkinliği farklı gruplar arasında karşılaştırıldı. 150 μm * 1,5 mm'lik dilimler yüksek bağlantı verimliliğine ancak en küçük varyansa sahipti; n = 4. (D1) FCCP için titrasyon deneyi yapıldı ve 10 μM FCCP en büyük yedek kapasiteyi verdi; n = her grup için 4. (D2) FCCP için titrasyon deneyleri bir analizör ile gerçekleştirildi ve 10 μM FCCP en büyük yedek kapasiteyi verdi; n = her grup için 4. Şekillerde verilen değerler ortalamanın standart hatası (SEM) ±. Bu rakam Zhi ve ark.24'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Eski gruptan PINK1 KO dilimleri önemli ölçüde daha düşük OCR gösteriyor. Akut STR dilimlerinin OCR'leri (150 μm * 1.5 mm) gençlerdeki farelerden (A, B ve C) ve yaşlı gruplardan (D, E ve F), solunum modülatörlerinin ardışık ilavelerine maruz kalır (oklar kullanılarak gösterilmiştir). Genç grubun OCR'si farklı genotipler (B) arasında anlamlı farklılık göstermezken, PINK1 KO dilimlerinde (C) bağlanma verimliliği (yukarıda belirtilen formül kullanılarak yüzde değeri olarak belirlenen) azalmıştır. Eski grupta, PINK1 KOslices bazal solunum seviyesinde (E) ve kaplin verimliliğinde (F) önemli ölçüde azalma gösterdi. Aşağıdaki çözelti, 10 mM piruvat (P), 20 μM oligomisin (O), 10 μM FCCP (F) ve 20 μM antimisin A (A), sırayla enjekte edildi. n = 4 her genotip ve yaş için. Şekillerde verilen değerler SEM ± ortalamadır. P 0.05 (*) < fark anlamlı kabul edildi. Bu rakam Zhi ve ark.24'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geliştirdiğimiz yöntem, yetişkin farelerden striatal dilimlerde OCR'yi 4 saatlik bir süre boyunca ölçmek için bir XF analizörünün kullanılmasına izin verdi. Bu yöntem, anatomik olarak tanımlanmış beyin yapılarından eksize edilen yumruklardaki hücresel biyoenerjetik ölçümleri ölçmek için yeni bir yol sağlar. Analiz edilen doku örnekleri oldukça küçük olduğundan, bir hastalıkta yer alan belirli beyin bölgelerinin metabolik parametreleri araştırılabilir. Ek olarak, akut dilimlerin kullanılması, izole mitokondri veya kültürlenmiş hücreler ve organotipik dilimlerle elde edilemeyen fizyolojik hücresel ortamı daha yakından taklit eder. Ayrıca, OCR'yi tek bir hayvandan birden fazla beyin bölgesinde veya birden fazla hayvanda 24 kuyucuklu bir plakada ölçmek, bu yeni tekniği uygulayan çalışmaların istatistiksel gücünü büyük ölçüde artırmaktadır.
Bu, yetişkin farelerden akut striatal dilimlerde OCR ölçümünün ilk protokolüdür. Odak noktası, esas olarak PD ve Huntington hastalığında yer alan beyin bölgelerinden biri olduğu için STR üzerindeydi. Çalışmamızdaki bazal OCR ve kuplaj verimliliği, XF analizörü25,26,27 kullanılarak akut beyin dilimlerinde OCR'yi ölçen diğer çalışmalarla karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, çalışmamızdaki striatal dilimlerin yedek solunum kapasitesi, diğer beyin bölgelerini ölçen diğer raporlara kıyasla daha küçük görünmektedir. Bu farkın beyin bölgeleri arasındaki yedek solunum kapasitesindeki gerçek farklılıkları mı yoksa dilim hazırlama, eksize edilmiş dilim yerleşimi veya fare suşundaki küçük farklılıkları mı yansıttığı hala bilinmemektedir. Bu farklılıklar daha fazla araştırmayı gerektirir.
Bu protokolde, akut beyin dilimleri hazırlamak, delikli dilimi yakalama ekranının üstüne aktarmak ve dilimi kuyuya yerleştirmek de dahil olmak üzere birkaç kritik adım vardır. Dilimler, ölçüm sırasında yakalama ekranına bağlı tutulmalıdır. Aksi takdirde, dilim ekrandan ayrılırsa ve plakanın kuyusuna oturursa, oksijen sensöründen çok uzakta olacak ve OCR'nin çok daha düşük okunmasına ve ilaçlara verilen tepkilere neden olacaktır. Her koşul için en az dört replika (aynı bölgede eksize edilmiş dört beyin dilimi) ve ayrılmış dilimlerin sonuçlarını hariç tutmanızı öneririz. OCR doku içeriği ile orantılı olmalıdır. Bu çalışma, beyin aynı kalınlıkta dilimlendiği ve dilim aynı zımba kullanılarak delindiği için doku miktarını ölçmedi. Böylece doku miktarı sabitti ve doku içeriğinin belirlenmesine gerek yoktu. Netliği ve dolayısıyla aynı miktarda dokuyu sağlamak için her plaka (24 dilim) için yeni bir zımba kullanmak çok önemlidir. Ek olarak, bölümleme, doku punchları hazırlama ve fare başına dilimleri takmak yaklaşık 30 dakika sürer ve iki çift fare için toplamda yaklaşık 2 saat sürer. Akut beyin dilimlerinin stabilitesi, optimal koşullarda bile (nöronların sağlıklı durumunu değerlendirmek için hassas fonksiyonel tahliller-yama-kelepçe kaydı kullanılarak değerlendirilir) kesitlemeden sonra sadece 7-8 saat boyunca iyidir ve bu nedenle, 96 iyi kurulum kullanmak pratik olmayabilir.
Tekniğin faydasını göstermek için, OCR'yi PINK1 KO farelerinden ve WT çöp arkadaşlarından striatal dilimlerden ölçtük. Yaşlı PINK1 KO farelerinin bazal solunumunda, yaşa bağlı DA salınım açıkları24 ile tutarlı, yaşa uygun WT kontrollerine kıyasla anlamlı bir azalma bulunmuştur. Bu gözlem aynı zamanda daha önce yayınlanmış çalışmalarla da uyumludur ve bu protokolün geçerliliğini doğrulamaktadır. Yöntemlerin sınırlamaları da vardır. Örneğin, OCR, muhtemelen beyin aktivitesinden bağımsız olan ve çoğunlukla inaktif orta dikenli nöronlar ve dopaminerjik terminallerin yanı sıra astrositler sunan akut striatal beyin diliminden ölçülmüştür. Ayrıca, yöntemin hücre türüne özgü bir çözünürlüğü yoktur.
Özetle, bu yeni yöntem, yetişkin farelerden akut beyin dilimlerinde OCR'yi ölçer ve PD ile ilişkili bir gen olan PINK1'in farelerde mitokondriyal fonksiyonu nasıl etkilediğini gösterir. Bu yöntemin uygulanması kolaydır ve PD ve Huntington hastalığı alanında çalışan araştırmacılar için yaygın olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Wangchen Tsering ve Pamela Walter'a bu makaleyi eleştirel okumaları ve düzenledikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) (NS054773'ten C.J. L.'ye ve NS098393'ten H.Z.Z.'ye) ve Thomas Jefferson Üniversitesi Sinirbilim Bölümü (H.Z.'ye Başlangıç Fonları) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
