Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Mesure du taux de consommation d’oxygène dans les tranches striatales aiguës de souris adultes

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63379
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 3, 4, 1
1Department of Neuroscience, Thomas Jefferson University, 2School of Biomedical Engineering, Drexel University, 3Department of Pathology, MitoCare Center, Thomas Jefferson University, 4School of Life Sciences, Peking University

Summary

Le taux de consommation d’oxygène (OCR) est un indicateur commun de la fonction mitochondriale et peut être utilisé pour étudier différents modèles de maladie. Nous avons développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes qui est plus pertinente physiologiquement que d’autres méthodes.

Abstract

Les mitochondries jouent un rôle important dans la production cellulaire d’ATP, la régulation des espèces réactives de l’oxygène etle contrôle de la concentration de Ca 2 +. Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans la pathogenèse de multiples maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer. Pour étudier le rôle des mitochondries dans les modèles de ces maladies, nous pouvons mesurer la respiration mitochondriale via le taux de consommation d’oxygène (OCR) comme proxy de la fonction mitochondriale. L’OCR a déjà été mesurée avec succès dans des cultures cellulaires, ainsi que dans des mitochondries isolées. Cependant, ces techniques sont moins pertinentes physiologiquement que la mesure de l’OCR dans les tranches de cerveau aiguës. Pour surmonter cette limitation, les auteurs ont développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes. La technique est optimisée en mettant l’accent sur le striatum, une zone du cerveau impliquée dans la MP et la maladie de Huntington. L’analyseur effectue un test de cellules vivantes à l’aide d’une plaque de 24 puits, ce qui permet la mesure cinétique simultanée de 24 échantillons. La méthode utilise des morceaux perforés circulairement de tranches cérébrales striatales comme échantillons. Nous démontrons l’efficacité de cette technique en identifiant une OCR basale inférieure dans des tranches striatales d’un modèle murin de MP. Cette méthode intéressera grandement les chercheurs travaillant dans le domaine de la MP et de la maladie de Huntington.

Introduction

Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer 1,2,3. Les modèles tels que les souris et les rats PINK1 knockout (KO) présentent une altération de la fonction mitochondriale 4,5,6,7,8,9,10,11. Les mitochondries isolées du striatum (STR) ou du cerveau entier d’une souris ROSE1 KO âgée présentent des défauts dans le complexe I 7,10,12,13. La mesure directe du taux de consommation d’oxygène (OCR) est l’une des méthodes les plus courantes pour évaluer la fonction mitochondriale puisque l’OCR est couplée à la production d’ATP, la fonction principale des mitochondries14. Par conséquent, la mesure de l’OCR dans des modèles de maladie ou des échantillons / tissus dérivés du patient peut aider à étudier comment le dysfonctionnement mitochondrial conduit à la maladie.

Actuellement, il existe plusieurs façons de mesurer l’OCR mitochondriale, y compris l’électrode Clark et d’autresélectrodes O2, le colorant fluorescent O 2 et l’analyseur de flux extracellulaire 15,16,17,18,19. En avantage, les méthodes à base d’électrodes O2 permettent d’ajouter facilement divers substrats. Cependant, ils sont insuffisants pour mesurer simultanément plusieurs échantillons. Par rapport aux méthodestraditionnelles à base d’électrodes O 2, l’analyseur de flux extracellulaire, un outil couramment utilisé pour l’OCR dans les cultures cellulaires ou les mitochondries purifiées, offre un débit amélioré de 15,18,20. Néanmoins, toutes ces méthodes sont généralement appliquées pour mesurer l’OCR dans des mitochondries isolées ou des cultures cellulaires 6,16,17,19,20,21. L’isolement des mitochondries cause des dommages par inadvertance, et les mitochondries extraites ou les cultures cellulaires sont moins pertinentes physiologiquement que les tranches de cerveau intactes22. Même lorsque les microélectrodes sont utilisées en tranches, elles sont moins sensibles et plus difficiles à utiliser que dans les cellules cultivées23.

Pour relever ces défis, nous avons développé une méthode utilisant l’analyseur de flux extracellulaire XF24, qui permet d’analyser plusieurs paramètres métaboliques à partir de tranches cérébrales striatales aiguës de souris24. Cette technique fournit une quantification directe continue de la respiration mitochondriale via l’OCR. En bref, de petites sections de tranches cérébrales striatales sont placées dans des puits de la plaque d’îlot, et l’analyseur utilise des biocapteurs fluorescents à base d’oxygène et de protons pour mesurer l’OCR et le taux d’acidification extracellulaire, respectivement 17,21,25.

L’une des caractéristiques uniques de l’analyseur est les quatre puits d’injection, qui permettent la mesure continue de l’OCR tout en injectant séquentiellement jusqu’à quatre composés ou réactifs; cela permet de mesurer plusieurs paramètres de respiration cellulaire, tels que l’OCR mitochondriale basale, l’OCR liée à l’ATP et l’OCR mitochondriale maximale. Les composés injectés lors des mesures pour le protocole montrés ici étaient des concentrations de travail de 10 mM de pyruvate dans le puits de la première solution (port A), de 20 μM d’oligomycine dans le puits de la deuxième solution (port B), de 10 μM de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) dans le troisième puits (port C) et de 20 μM d’antimycine A dans le quatrième puits (port D), d’après Fried et al.25. Il convient de noter que ces concentrations étaient des concentrations de travail et que des solutions mères de 10x, 11x, 12x et 13x ont été injectées dans les ports de solution A à D, respectivement. Le but de l’utilisation de chaque solution était le suivant: 1) Le pyruvate était nécessaire car, sans lui, l’ajout de FCCP aurait une réponse OCR diminuée causée par une limitation des substrats disponibles; 2) L’oligomycine inhibe l’ATP synthase et permet de mesurer la respiration liée à l’ATP; 3) FCCP découple l’oxydation de la phosphorylation et permet la mesure de la capacité mitochondriale maximale; 4) L’antimycine A inhibe le complexe III dans la chaîne de transport d’électrons et, par conséquent, permet la mesure de l’OCR non liée aux mitochondries.

La concentration d’oligomycine utilisée a été déterminée pour les raisons suivantes : 1) La dose recommandée d’oligomycine pour la plupart des types de cellules (mitochondries isolées ou cultures cellulaires) est de 1,5 μM. D’après l’expérience, généralement 3x-10x de la dose de cellules dissociées est utilisée pour les expériences de tranches, car il peut y avoir un gradient et la pénétration de la solution dans les tranches prend du temps. Par conséquent, la concentration doit être comprise entre 5 μM et 25 μM. 2) Une concentration de 20 μM a été choisie sur la base de Fried et al.25. Des concentrations plus élevées n’ont pas été essayées en raison de la toxicité non spécifique de l’olélicine. 3) Dans le rapport d’Underwood et al.26, les auteurs ont fait une expérience de titrage pour l’oligomycine et ont constaté que des doses de 6,25, 12,5, 25 et 50 μg / mL entraînaient une inhibition similaire. La concentration plus élevée d’oligomycine (50 μg/mL) n’a pas inhibé davantage, mais a eu une plus grande variance. 4) Dans notre observation, le facteur déterminant semble être la capacité de pénétration de l’olligomycine. Il est difficile pour l’oligomycine de pénétrer dans le tissu, et c’est pourquoi il faut au moins 7 à 8 cycles pour atteindre le plateau, la réponse maximale. Tant qu’il atteint le plateau, l’inhibition est supposée être maximale.

L’un des principaux défis techniques de l’adaptation de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer l’OCR dans les tranches striatales est de prévenir l’hypoxie tissulaire. Comme le tampon n’a pas été oxygéné pendant toute la durée des mesures (environ 4 h), l’hypoxie était un problème central. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de tissus plus épais, où l’oxygène ne peut pas diffuser dans les échantillons. Pour surmonter ce problème, des tranches ont été sectionnées à 150 μm d’épaisseur, de sorte que l’oxygène ambiant puisse pénétrer au milieu des tranches de cerveau. De plus, 4 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) ont été ajoutés au tampon du liquide céphalo-rachidien artificiel préoxygéné (ACSF), ce qui a facilité la détermination de l’OCR maximale, comme suggéré précédemment23. Nous avons examiné si les cellules étaient vivantes. Tout d’abord, Hoechst 33258 (10 μM) et l’iodure de propidium (10 μM) ont été utilisés pour examiner si les cellules étaient saines dans ces conditions. Nous avons ensuite examiné si les neurones épineux moyens étaient fonctionnellement sains à l’aide de l’enregistrement patch-clamp. Nous avons ensuite évalué si les terminaux dopaminergiques (DA) dans les tranches striatales étaient fonctionnellement sains en mesurant la libération de DA à l’aide de la voltampérométrie à balayage rapide. Les résultats ont montré que les tranches striatales qui n’étaient pas oxygénées (groupe ACSF/BSA) étaient aussi saines que le groupe témoinoxygéné 24.

Nous avons ensuite testé différentes combinaisons d’épaisseur de tranche et de taille de poinçon pour déterminer les conditions optimales de la tranche striatale pour le test de respiration de flux. Des tranches striatales dorsales de différentes épaisseurs (150 μm et 200 μm) et de différentes tailles de poinçonnage (1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm de diamètre) ont été utilisées pour l’analyse OCR à l’aide de l’analyseur. Les tranches striatales de 150 μm d’épaisseur avec une taille de poinçon de 1,5 mm de diamètre avaient l’efficacité de couplage la plus élevée et des OCR dans une plage optimale pour l’analyseur24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures, y compris le travail sur les animaux, ont été menées conformément aux directives nationales et internationales et ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Thomas Jefferson. Des souris mâles FVB/NTac âgées de 3 à 14 mois ont été utilisées. Les étapes suivantes ont été effectuées dans un environnement non stérile, mais il faut faire preuve de prudence pour que tout reste aussi propre que possible.

REMARQUE: La méthode présentée ici a été établie et utilisée dans la recherche rapportée par Zhi et al.24. Les expériences décrites ici utilisaient un analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF24 (voir tableau des matériaux). Ces méthodes peuvent être adaptées à l’analyseur XFe24, et certains résultats ont été confirmés à l’aide de cet analyseur.

1. Capteurs à cartouche hydratée (1 jour avant le test)

  1. Ouvrez le kit de dosage du flux extracellulaire (voir tableau des matériaux) et retirez à la fois la cartouche du capteur (verte) et la plaque d’utilité (claire; Figure 1A). Placez la cartouche du capteur de côté (capteurs vers le haut) et ne touchez pas les capteurs.
  2. Ajouter 600 μL de solution d’étriquant (pH 7,4) à chaque puits de la plaque utilitaire. Placez la cartouche de capteur sur le dessus de la plaque utilitaire et immergez les capteurs dans la solution d’étalonnage. Assurez-vous que l’encoche triangulaire de l’utilitaire et la plaque de la cartouche du capteur sont correctement alignées (Figure 1B).
  3. Scellez le kit de dosage de flux extracellulaire avec un film d’étanchéité pour éviter l’évaporation de la solution d’étriquant, puis placez-le dans un incubateur à 37 °C non complété par du CO2 ou de l’oxygène pendant la nuit.

2. Préparer la plaque de tissu (le jour de l’essai)

  1. Ouvrez la microplaque de capture des îlots et retirez la plaque des îlots pour la présence de tissus.
  2. Réchauffer un volume approprié (625 μL par puits) de liquide céphalo-rachidien artificiel modifié préoxygéné (ACSF, composition 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM de glucose, 10 mM HEPES, pH 7,2) tampon à 37 °C dans un tube de 50 mL. Ajouter ensuite le BSA à une concentration finale de 4 mg/mL pour préparer le tampon respiratoire. En général, 50 mL suffisent pour une plaque.
  3. Ajouter 625 μL de tampon respiratoire (tampon ACSF pré-oxygéné avec 25 mM de glucose et 4 mg/mL de BSA) à chaque puits de la plaque istolaire soigneusement et éviter de secouer la plaque. Assurez-vous qu’aucune goutte résiduelle n’est sur le dessus de la cartouche du capteur et qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le tampon de chaque puits.

3. Préparation aiguë de tranches striatales et placement de tranches excisées

  1. Décapiter la souris après luxation cervicale et disséquer immédiatement le cerveau dans 10 mL de solution de coupe pré-oxygénée glacée (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glucose, pH 7,4).
  2. Section tranches striatales coronales avec un vibratome suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux) à une épaisseur de 150 μm dans une solution de coupe pré-oxygénée glacée.
  3. Récupérer les tranches dans 50 mL d’ACSF oxygéné (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glucose, 2 mM HEPES, pH 7,4) et conserver en solution jusqu’à 30 min à température ambiante (RT).
  4. Après récupération, transférer les tranches dans une boîte de Petri de 35 mm x 10 mm avec 5 mL de tampon respiratoire.
  5. Utilisez un poinçon de biopsie en acier inoxydable (p. ex., 1,5 mm de diamètre) pour créer un morceau de tissu circulaire dans la zone souhaitée du cerveau tranché. Gardez la tranche dans le tampon tout en appuyant doucement avec le poinçon. Assurez-vous que le poinçon est poussé assez fort pour couper le tissu. Retirez le reste du tissu, soulevez le poinçon et retirez le morceau de tissu circulaire dans le tampon.
  6. Coupez l’extrémité même d’une pointe de pipette de 1 mL pour faire un trou d’un diamètre de 1,5 à 2,0 mm et utilisez-la pour maintenir et transférer la tranche perforée vers le haut de l’écran de capture. Aspirez un morceau de tissu cérébral perforé et placez-le soigneusement sur le côté maillé de l’écran de capture (Figure 2A). L’écran de capture sera un morceau de plastique circulaire avec le maillage attaché d’un côté.
    REMARQUE: Les écrans de capture sont inclus dans l’emballage de microplaques (voir tableau des matériaux) et sont similaires à celui utilisé dans Schuh et al.23.
  7. Utilisez doucement un mouchoir en papier pour sécher brièvement l’écran de capture. Une fois l’humidité éliminée, le tissu devient collant, ce qui permet à la tranche de s’attacher au centre de la maille. Ne séchez pas trop la tranche car, sinon, elle sera endommagée.
  8. Maintenez la tranche d’écran de capture vers le bas avec une pince à épiler et placez-la dans l’un des puits de la plaque d’îlot en incubation (Figure 2B). Veillez à ne pas laisser tomber la tranche; si c’est le cas, retirez l’écran et placez-y une nouvelle tranche.
    REMARQUE: Ne placez pas de tranches de cerveau dans les deux puits de correction de fond (A1 et D6) dans la plaque des îlots.
  9. Incuber la plaque d’îlots à 37 °C dans un incubateur pendant au moins 30 min pour permettre l’équilibrage de la température et du pH avant d’effectuer le test.

4. Chargement des cartouches avec les composés souhaités

  1. Diluer les composés souhaités dans de l’ACSF modifié (37 °C) jusqu’à la concentration finale sur le stock de 10x, 11x, 12x et 13x de la concentration de travail pour les ports A à D, respectivement, et ajuster à pH 7,4. Le test administrera les composés dans l’ordre du port A au port D. Pour cette expérience, les solutions suivantes ont été utilisées, avec leur concentration de travail respective mentionnée avant elles: 10 mM de pyruvate (port A), 20 μM d’oligomycine (port B), 10 μM ou d’autres concentrations de FCCP (port C) et 20 μM d’antimycine A (port D).
  2. Préchargez délicatement 75 μL des composés dilués dans les orifices d’injection appropriés de la cartouche du capteur. Placez les pointes à mi-chemin dans les orifices d’injection à un angle de 45° avec la pointe contre la paroi de l’orifice d’injection. Les embouts ne doivent pas être insérés complètement au bas des orifices d’injection, car cela pourrait provoquer une fuite de composé à travers le port.
  3. Retirez soigneusement les embouts des orifices pour éviter de créer des bulles d’air. Ne touchez aucune partie de la cartouche pour éviter d’atténuer les bulles d’air.
  4. Inspectez visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme. Assurez-vous que tout le liquide est dans le port et qu’aucune goutte résiduelle n’est présente sur le dessus de la cartouche.
  5. Placez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire et mettez-la dans un incubateur (sans CO2) pendant 30 min pour lui permettre de chauffer à nouveau jusqu’à 37 °C. Manipulez soigneusement en ne tenant que la plaque utilitaire. Déplacez-vous le moins possible.

5. Étalonnage et exécution du test

  1. Chargez le modèle de test dans le logiciel. Appuyez sur le bouton vert START .
  2. Assurez-vous de charger le bon protocole. Le protocole contient une combinaison de séquences de mesure de 3 min, 3 min d’attente et 2 min (ces trois étapes forment une seule mesure). Modifiez la distance de la tête de sonde de 26 600 à 27 800 dans les paramètres matériels sous paramètres de l’instrument25. Il n’est pas nécessaire de changer la tête de sonde pour l’analyseur XFe24. Appuyez sur DÉMARRER.
  3. Chargez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire dans le plateau de l’instrument. L’encoche va à l’avant, dans le coin gauche. Assurez-vous que la plaque est bien assise et plate. Chargez la cartouche de capteur remplie de médicament dans l’analyseur pour l’étalonnage.
  4. Suivez les instructions à l’écran afin d’étalonner et d’équilibrer les capteurs. Cela prend environ 30 min.
  5. Une fois l’étape d’étalonnage terminée, retirez la plaque d’étalonnage et remplacez-la par la plaque d’îlots (contenant les tranches de maille et de tissu).
  6. Mesurez la consommation d’oxygène dans chaque puits de la plaque à l’aide des protocoles d’essai. Le protocole contient une combinaison de séquences de mélange de 3 minutes, d’attente de 3 minutes et de séquences de mesure de 2 minutes (ces trois étapes forment une mesure), moment auquel l’OCR est calculé.
  7. Pour l’ensemble de l’expérience, inclure des mesures OCR 4x pour créer une ligne de base, suivies de l’injection du port A (pyruvate) avec des mesures 4x, puis de l’injection du port B (oligomycine) avec des mesures 8x, puis de l’injection du port C (FCCP) avec des mesures 5x, et, enfin, de l’injection du port D (antimycine A) avec des mesures 6x.
    REMARQUE: Ce nombre de mesures après chaque injection de composé est déterminé en fonction du moment où la mesure atteint le plateau.
  8. Analysez les données de mesure OCR et les données d’efficacité de couplage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La première étape de cette étude consistait à optimiser l’épaisseur de la tranche et la taille du poinçon utilisée pour exciser une section du striatum de la tranche (figure 3A). Une tranche de 150 μm d’épaisseur et une taille de poinçon de 1,5 mm ont donné les meilleurs résultats déterminés par l’efficacité du couplage (Figure 3B-C). Comme le montre la figure 3B, l’OCR est relativement stable pendant 5 h avec moins de 10 % de réduction. En outre, des mesures fonctionnelles ont été utilisées, ainsi que l’enregistrement par patch-clamp des neurones corticaux et des neurones épineux moyens dans le striatum, et la mesure par voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV) de la libération de DA, pour démontrer que les neurones et les terminaux étaient pleinement fonctionnels dans cette préparation, comme le montrent Zhi et al.24. Inclus avec cela, nous avons ensuite testé différentes concentrations de FCCP pour découvrir laquelle donnerait la meilleure réponse; 10 μM FCCP a donné la meilleure lecture (Figure 3D1,D2) déterminée par la capacité respiratoire de réserve:

Capacité respiratoire de rechange = respiration maximale - respiration basale

Ces conditions de tranches ont été utilisées pour mesurer les différences dans l’OCR des tranches striatales de souris PINK1 KO et de compagnons de litière de type sauvage (WT). Pour les résultats des souris PINK1 KO et WT, 3-4 souris ont été utilisées et 4-6 répliques par souris ont été utilisées et moyennées pour obtenir un point de données. Étant donné que PINK1 est un régulateur clé de la fonction mitochondriale, on s’attendait à ce que le dysfonctionnement mitochondrial soit trouvé chez les souris KO, mesuré par une diminution de l’OCR mitochondriale. En effet, une diminution de l’OCR en fonction de l’âge était évidente chez les souris KO par rapport à leurs témoins WT (Figure 4A,D). L’OCR basale était similaire dans les groupes KO et WT pour les jeunes souris (3-4 mois); cependant, l’OCR basale a diminué pour les souris KO dans le groupe ancien (10-14 mois; Figure 4B,E). Efficacité de couplage, déterminée comme suit,

Efficacité de couplage = [taux de production d’ATP] / [taux de respiration basale] × 100

cependant, a diminué chez les souris KO pour les groupes jeunes et âgés (Figure 4C, F). Ces données démontrent que les sections de tissu striatal de souris PINK1 KO présentaient un dysfonctionnement mitochondrial. Ce dysfonctionnement chez les souris KO a également commencé dès le plus jeune âge, indiqué par la diminution de l’efficacité du couplage, bien que l’OCR basale n’ait diminué que dans le groupe ancien. Cette diminution dépendante de l’âge était probablement le résultat de l’accumulation de défauts mitochondriaux causés par l’élimination de PINK1.

Figure 1
Figure 1 : Images montrant les capteurs et la plaque de la cartouche d’hydrate de l’analyseur de flux extracellulaire. (A) La cartouche du capteur située sur une plaque d’étalonnage (plaque utilitaire). (B) Vue latérale de la plaque d’utilité et de la plaque de cartouche du capteur. L’encoche triangulaire de la plaque de l’utilitaire et de la cartouche du capteur doit être correctement alignée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fixation et placement de la tranche perforée. (A) La tranche perforée est fixée à l’insert de maille de l’écran de capture, puis (B) placée dans l’un des puits de la plaque d’îlots en incubation avec soin pour s’assurer que la tranche ne se détache pas ou ne bouge pas pendant la mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : État optimal des tranches striatales pour le dosage de la respiration par flux. (A) Diagramme des tailles de poinçon tissulaire (1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm de diamètre) pour le striatum (STR) avec des cercles rouges représentant les zones obtenues pour l’analyse. (B1) Les taux de consommation d’O2 (OCR) pour différentes épaisseurs et tailles de poinçonnage des tranches du groupe témoin ont montré une respiration basale stable sur l’ensemble de la mesure (4 h), et l’OCR était proportionnelle au volume de la tranche. Les OCR ont été mesurés en tranches de 150 μm et 200 μm d’épaisseur perforées par un poinçon de 1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm. Les combinaisons utilisées sont mentionnées dans les légendes comme épaisseur * taille de poinçon (par exemple, 150 μm * 1 mm). (B2) OCR moyens mesurés en tranches de 150 μm d’épaisseur poinçonnées par poinçon de 1,5 mm; n = 7. (C1) Réponses OCR représentatives de tranches de différentes épaisseurs et diamètres avec 10 mM de pyruvate (P), 20 μM d’oligomycine (O), 10 μM de FCCP (F) et 20 μM d’antimycine A (A) injectés séquentiellement. Les flèches indiquent le moment de l’injection de ces composés. (C2) L’efficacité du couplage mitochondrial a été comparée entre différents groupes. Les tranches de 150 μm * 1,5 mm avaient l’efficacité de couplage élevée mais la plus petite variance; n = 4. (D1) L’expérience de titrage pour FCCP a été réalisée, et 10 μM FCCP a donné la plus grande capacité de réserve; n = 4 pour chaque groupe. (D2) Les expériences de titrage pour fccP ont été réalisées avec un analyseur, et 10 μM FCCP ont donné la plus grande capacité de réserve; n = 4 pour chaque groupe. Les valeurs indiquées dans les figures sont la moyenne ±'erreur-type de la moyenne (SEM). Ce chiffre a été modifié à partir de Zhi et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Tranches PINK1 KO de l’ancien groupe présentant une OCR significativement plus faible. OCR de tranches STR aiguës (150 μm * 1,5 mm) de souris des groupes jeunes (A, B et C) et âgés (D, E et F), exposées à des ajouts successifs de modulateurs respiratoires (montrés à l’aide de flèches). L’OCR du groupe jeune n’était pas significativement différente entre les différents génotypes (B), tandis que l’efficacité du couplage (déterminée en pourcentage à l’aide de la formule mentionnée ci-dessus%) était diminuée dans les tranches PINK1 KO (C). Dans l’ancien groupe, les KOslices PINK1 ont montré une diminution significative du niveau de respiration basale (E) et de l’efficacité du couplage (F). La solution suivante, 10 mM de pyruvate (P), 20 μM d’oligomycine (O), 10 μM de FCCP (F) et 20 μM d’antimycine A (A), a été injectée séquentiellement. n = 4 pour chaque génotype et âge. Les valeurs données dans les chiffres sont moyennes ± SEM. La différence a été considérée comme significative lorsque p < 0,05 (*). Ce chiffre a été modifié à partir de Zhi et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode que nous avons développée a permis d’utiliser un analyseur XF pour mesurer l’OCR dans des tranches striatales de souris adultes sur une période de 4 h. Cette méthode offre une nouvelle façon de mesurer la bioénergétique cellulaire dans les poinçons excisés à partir de structures cérébrales anatomiquement définies. Étant donné que les échantillons de tissus analysés sont plutôt petits, les paramètres métaboliques de zones cérébrales spécifiques impliquées dans une maladie peuvent être étudiés. En outre, l’utilisation de tranches aiguës imite plus étroitement l’environnement cellulaire physiologique, ce qui ne peut pas être réalisé avec des mitochondries isolées ou des cellules cultivées et des tranches organotypiques. De plus, la mesure de l’OCR dans plusieurs régions du cerveau à partir d’un seul animal ou de plusieurs animaux dans une plaque de 24 puits augmente considérablement la puissance statistique des études qui mettent en œuvre cette nouvelle technique.

Il s’agit du premier protocole de mesure de l’OCR dans des tranches striatales aiguës de souris adultes. L’accent a été mis sur le STR car c’est l’une des zones du cerveau principalement impliquées dans la MP et la maladie de Huntington. L’OCR basale et l’efficacité de couplage dans notre étude sont comparables aux autres études mesurant l’OCR dans les tranches cérébrales aiguës à l’aide de l’analyseur XF 25,26,27. Cependant, la capacité respiratoire inutilisée des tranches striatales dans notre étude semble plus petite par rapport aux autres rapports qui ont mesuré d’autres zones du cerveau. On ne sait toujours pas si cette différence reflète de réelles différences dans la capacité respiratoire inutilisée entre les zones du cerveau ou de légères différences dans la préparation des tranches, le placement des tranches excisées ou la souche de souris. Ces différences justifient une enquête plus approfondie.

Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, y compris la préparation de tranches cérébrales aiguës, le transfert de la tranche poinçonnée en haut de l’écran de capture et le placement de la tranche dans le puits. Les tranches doivent être maintenues attachées à l’écran de capture pendant la mesure. Sinon, si la tranche se détache de l’écran et se trouve dans le puits de la plaque, elle sera loin du capteur d’oxygène, ce qui entraînera une lecture beaucoup plus faible de l’OCR et des réponses aux médicaments. Nous recommandons au moins quatre répliques (quatre tranches de cerveau excisées dans la même zone) pour chaque condition et en excluant les résultats des tranches détachées. L’OCR doit être proportionnelle à la teneur en tissus. Cette étude n’a pas mesuré la quantité de tissu puisque le cerveau a été tranché à la même épaisseur et que la tranche a été poinçonnée à l’aide du même poinçonneur. Ainsi, la quantité de tissu était constante et il n’était pas nécessaire de déterminer le contenu en tissu. Il est essentiel d’utiliser un nouveau poinçonneur pour chaque plaque (24 tranches) pour assurer la netteté et, par conséquent, la même quantité de tissu. De plus, la section, la préparation des poinçons tissulaires et la fixation des tranches par souris prennent environ 30 minutes et environ 2 heures au total pour deux paires de souris. La stabilité des tranches cérébrales aiguës n’est bonne que pendant 7 à 8 heures après la section, même dans des conditions optimales (évaluée à l’aide de tests fonctionnels sensibles, d’un enregistrement patch-clamp pour évaluer l’état sain des neurones) et, par conséquent, l’utilisation d’une configuration de 96 puits pourrait ne pas être pratique.

Pour illustrer l’utilité de la technique, nous avons mesuré l’OCR à partir de tranches striatales de souris PINK1 KO et de leurs compagnons de litière WT. Une diminution significative a été observée dans la respiration basale des souris PINK1 KO âgées par rapport aux témoins WT appariés selon l’âge, ce qui correspond aux déficits de libération de DA dépendant de l’âge24. Cette observation s’aligne également sur des études publiées précédemment, confirmant la validité de ce protocole. Il y a aussi des limites aux méthodes. Par exemple, l’OCR a été mesurée à partir de la tranche cérébrale striatale aiguë, qui est probablement indépendante de l’activité cérébrale et offre principalement des neurones épineux moyens inactifs et des terminaux dopaminergiques, ainsi que des astrocytes. En outre, la méthode n’a pas de résolution spécifique au type de cellule.

En résumé, cette nouvelle méthode mesure l’OCR dans les tranches cérébrales aiguës de souris adultes et démontre comment PINK1, un gène lié à la MP, affecte la fonction mitochondriale chez la souris. Cette méthode est facile à mettre en œuvre et largement applicable aux chercheurs travaillant dans le domaine de la MP et de la maladie de Huntington.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Wangchen Tsering et Pamela Walter pour leur lecture critique et leur édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 à C.J. L. et NS098393 à H.Z.) et le Département de neurosciences de l’Université Thomas Jefferson (Startup Funds à H.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter Thermo Fisher Scientific 13-636-AB150 To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp. SIGMA A8674 To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA A6003 To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) SIGMA C2920 To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose SIGMA G8270 To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO SIGMA D8418 To dissovle compounds
HEPES SIGMA H3375 To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator Fisher Scientific 11-683-230D To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes SIGMA O4876 To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm SIGMA-ALDRICH sealing film
Rotenone Tocris 3616 To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL Seahorse Bioscience 103681-100 Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer Seahorse Bioscience Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer Seahorse Bioscience Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks Seahorse Bioscience 101174-100 Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate SIGMA P2256 To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches Miltex Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm Eppendrof 0030700102 Used for slice punch
Vibratome Leica VT1200 To slice brain tissue
Water bath Thermo Scientific Precision 282-115 To heat buffer and solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
  2. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  3. Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
  4. Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
  5. Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
  7. Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
  8. Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
  9. Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
  10. Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
  11. Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
  12. Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
  13. Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
  14. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  15. Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
  16. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
  17. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  18. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  19. Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
  20. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
  21. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  22. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
  23. Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
  24. Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
  25. Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
  26. Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
  27. Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).

Tags

Neurosciences Numéro 184 Taux de consommation d’oxygène OCR respiration mitochondriale souris tranche cérébrale aiguë analyseur XF24 striatum maladie de Parkinson
Mesure du taux de consommation d’oxygène dans les tranches striatales aiguës de souris adultes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhi, L., Zhao, J., Jaffe, D., Chen,… More

Zhi, L., Zhao, J., Jaffe, D., Chen, Y., Wang, N., Qin, Q., Seifert, E. L., Li, C., Zhang, H. Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice. J. Vis. Exp. (184), e63379, doi:10.3791/63379 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter