Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تطبيق التصوير المقطعي للتماسك البصري على نموذج فأر لاعتلال الشبكية

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63421
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Joint Shantou International Eye Center, Shantou University and the Chinese University of Hong Kong, 2Shantou University Medical College, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, the Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نصف تقنية التصوير في الجسم الحي باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري لتسهيل التشخيص والقياس الكمي لاعتلال الشبكية في الفئران.

Abstract

يقدم التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) طريقة غير جراحية لتشخيص اعتلال الشبكية. يمكن لجهاز OCT التقاط صور مقطعية للشبكية يمكن من خلالها حساب سمك الشبكية. على الرغم من أن OCT يستخدم على نطاق واسع في الممارسة السريرية ، إلا أن تطبيقه في الأبحاث الأساسية ليس سائدا ، خاصة في الحيوانات الصغيرة مثل الفئران. نظرا لصغر حجم مقل العيون ، من الصعب إجراء فحوصات تصوير قاع العين في الفئران. لذلك ، يلزم وجود نظام متخصص لتصوير الشبكية لاستيعاب التصوير المقطعي المحوسب على الحيوانات الصغيرة. توضح هذه المقالة نظاما خاصا بالحيوانات الصغيرة لإجراءات فحص OCT وطريقة مفصلة لتحليل الصور. تم عرض نتائج فحص OCT في شبكية العين لمستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (Vldlr) والفئران C57BL / 6J. أظهرت صور OCT للفئران C57BL / 6J طبقات شبكية العين ، بينما أظهرت صور الفئران بالضربة القاضية Vldlr الأوعية الدموية الجديدة تحت الشبكية وترقق الشبكية. باختصار ، يمكن أن يسهل فحص OCT الكشف غير الجراحي وقياس اعتلال الشبكية في نماذج الفئران.

Introduction

التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) هو تقنية تصوير يمكن أن توفر في الجسم الحي تصويرا مقطعيا عالي الدقة وتصويرا مقطعيا للأنسجة1،2،3،4،5،6،7،8 ، خاصة للفحص غير الباضع في شبكية العين9،10،11،12 . يمكن استخدامه أيضا لتحديد بعض المؤشرات الحيوية المهمة ، مثل سمك الشبكية وسمك طبقة الألياف العصبية في شبكية العين. مبدأ OCT هو قياس انعكاس التماسك البصري ، والذي يحصل على معلومات الأنسجة المقطعية من تماسك الضوء المنعكس من عينة ويحولها إلى شكل رسومي أو رقمي من خلال نظام كمبيوتر7. يستخدم OCT على نطاق واسع في عيادات طب العيون كأداة أساسية للتشخيص والمتابعة والإدارة للمرضى الذين يعانون من اضطرابات الشبكية. يمكن أن يوفر أيضا نظرة ثاقبة على التسبب في أمراض الشبكية.

بالإضافة إلى التطبيقات السريرية ، تم استخدام OCT أيضا في الدراسات على الحيوانات. على الرغم من أن علم الأمراض هو المعيار الذهبي للتوصيف المورفولوجي ، إلا أن OCT يتمتع بميزة التصوير غير الجراحي في الجسم الحي والمتابعة الطولية. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن OCT يرتبط ارتباطا جيدا بعلم أمراض الأنسجة في النماذج الحيوانية لاعتلال الشبكية11،13،14،15،16،17،18،19،20. الفأر هو الحيوان الأكثر استخداما في الدراسات الطبية الحيوية. ومع ذلك ، فإن مقل العيون الصغيرة تشكل تحديا تقنيا لإجراء تصوير OCT في الفئران.

مقارنة ب OCT المستخدم لأول مرة لتصوير شبكية العين في الفئران21,22 ، تم الآن تحسين OCT في الحيوانات الصغيرة فيما يتعلق بأنظمة الأجهزة والبرامج. على سبيل المثال ، OCT ، بالاقتران مع المتعقب ، يقلل بشكل كبير من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ؛ تسمح ترقيات نظام برنامج OCT باكتشاف المزيد من طبقات الشبكية تلقائيا ؛ ويساعد جهاز عرض DLP المدمج على تقليل عناصر الحركة.

مستقبلات البروتين الدهني منخفضة الكثافة (Vldlr) هي بروتين عبر الغشاء في الخلايا البطانية. يتم التعبير عنه على الخلايا البطانية الوعائية في شبكية العين ، والخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين ، وحول الغشاء الخارجيالمحدد 23,24. الأوعية الدموية تحت الشبكية هي النمط الظاهري لفئران Vldlr بالضربة القاضية23. لذلك ، يتم استخدام فئران Vldlr بالضربة القاضية للتحقيق في التسبب في المرض والعلاج المحتمل للأوعية الدموية تحت الشبكية. توضح هذه المقالة تطبيق التصوير المقطعي المحوسب للكشف عن آفات الشبكية في فئران Vldlr بالضربة القاضية ، على أمل توفير بعض المراجع الفنية لأبحاث اعتلال الشبكية في نماذج الحيوانات الصغيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء العمليات بعد بيان استخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية من جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون. تمت الموافقة على التصميم التجريبي من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية (لجنة الأخلاقيات الطبية في JSIEC ، EC 20171213 (4) -P01). تم استخدام الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر شهرين وفئران Vldlr بالضربة القاضية في هذه الدراسة. كان هناك 7 فئران في كل مجموعة ، وكلها من الإناث ووزنها 20 جم إلى 24 جم.

1. الظروف التجريبية

  1. قم بتعيين الفئران إلى مجموعتين: مجموعة تجريبية تتكون من فئران Vldlr بالضربة القاضية ومجموعة تحكم تتكون من فئران C57BL / 6J.
  2. إطعام الفئران مع الطعام والماء تقليديا.
  3. رفع الفئران في مختبر الحيوانات في ظل ظروف مستقرة من درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) ، والرطوبة (50-60 ٪) ، ودورة الضوء والظلام (12 ساعة - 12 ساعة) ، وشدة ضوء الغرفة (350-400 لوكس).
  4. تحضير المعدات التجريبية: التصوير المقطعي للتماسك البصري مع منظار العين بالليزر المسح البؤري (cSLO) للحيوانات الصغيرة (الشكل 1 أ).
  5. تحضير جميع المواد اللازمة للتجربة (الشكل 1 ب) ووزن الفئران (الشكل 1 ج).

2. سجلات المعلومات

  1. سجل المعلومات: المجموعة ، الرمز ، تاريخ الميلاد ، العمر ، الجنس ، الوزن ، وجرعة التخدير.

3. بدء تشغيل الأداة واختبارها

  1. قم بتشغيل الكمبيوتر وابدأ تشغيل البرنامج.
  2. انقر فوق الزر اختبار البرنامج لإكمال برنامج الاختبار.
  3. قم بتشغيل منظم الحرارة وقم بتسخينه مسبقا إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  4. ابدأ إجراء الوحدة النمطية OCT بعد اختبار البرنامج.
  5. قم بإنشاء موضوع جديد واملأ معلومات الماوس.
  6. سخن البطانية الكهربائية وقم بتغطيتها بمناشف جراحية.

4. التخدير

  1. استخدم مسحوق مخدر مجفف بالتجميد يحتوي على تيلتامين وزولازيبام لتحضير خليط التخدير.
    ملاحظة: اتبع توصيات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية لاختيار وجرعة وطريقة إدارة التخدير. تخدير الحيوان بمخدر يوفر الجمود وفقدان إدراك الألم لمدة 1 ساعة على الأقل ، وبعد ذلك يتعافى الحيوان بسرعة. يجب أن تعتمد الجرعة على طول وقت التجربة ووزن الحيوان وعوامل أخرى.
  2. تخدير الحيوان باستخدام خليط التخدير المحضر. تأكد من إبقاء الحيوان دافئا أثناء الإجراء بأكمله حتى الشفاء.

5. تطبيق قطرات حدقة العين

  1. حقق ضبط النفس اليدوي للماوس بواسطة القفا ، واجعل مقلة العين تبرز قليلا ، وقم بتدوير رأس الماوس مع توجيه عين واحدة لأعلى.
  2. ضع قطرات حدقة العين لتوسيع حدقة العين (الشكل 2 أ).
  3. تحقق من اتساع حدقة العين بعد 10 دقائق.

6. وضع الماوس

  1. ضع الماوس على منصة بطانية كهربائية.
  2. معطف كلتا العينين مع هلام هيالورونات الصوديوم الطبية (الشكل 2B).
  3. قم بربط عدسة كروية مزدوجة 60 D (عدسة محددة مسبقا) على جهاز cSLO (الشكل 1A-5 ، 6).
  4. ضع عدسة لاصقة 100 D على قرنية الفأر بحيث يلامس الجانب المقعر جل هيالورونات الصوديوم على سطح القرنية (الشكل 2C و D والشكل 3A-II).
  5. ضع الماوس على منصة حيوانية صغيرة ذات درجة حرارة ثابتة وأبق العين على بعد 1-2 مم من عدسة جهاز cSLO (الشكل 3 أ).
  6. اضبط زاوية العدسة اللاصقة بالملقط لإبقاء بؤبؤ العين في وسط العدسة.
  7. قم بضبط التعديلات على الرأس لجعل وجه العين مستقيما للأمام.

7. منظار العين بالليزر المسح البؤري (cSLO)

  1. انقر فوق الزر OCT ، واختر وحدة الماوس ، وابدأ برنامج cSLO (الشكل 4 ب).
  2. حدد وضع الأشعة تحت الحمراء (مصدر الضوء: الضوء الأحمر) ، واضبط المعلمة (النطاق: 2047 ، الشكل 4D).
  3. حدد العين المراد فحصها (العين اليمنى: الشكل 4C-1 ؛ العين اليسرى: الشكل 4C-2).
  4. تحكم في الرافعة وحرك العدسة المحددة مسبقا نحو العدسة اللاصقة ببطء.
  5. اضبط قيمة الديوبتر حتى يصبح تصوير القطب الخلفي واضحا (الشكل 4E).
  6. قم بإجراء المزيد من التعديلات لمحاذاة صورة القطب الخلفي للشبكية ، مع توسيطها عند رأس العصب البصري.

8. التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)

  1. ابدأ برنامج OCT (الشكل 4G).
  2. انقر فوق شريط التقدم لأعلى ولأسفل حتى تظهر صورة OCT (الشكل 4H).
  3. ضبط المعلمات: الحد الأدنى للنطاق (الشكل 4I) = 0-20 ، المدى الأقصى (الشكل 4J) = 40-60.
  4. اضبط مسافة العدسة المضبوطة مسبقا واتجاه الموضع حتى يتم الحصول على صورة OCT مثالية.
  5. حدد موضع المسح عن طريق تحريك الخط القياسي في cSLO (الشكل 4M).
  6. ابدأ المسح من رأس العصب البصري.
  7. جمع الصور بنفس الترتيب لكل عين: الخط الأفقي: رأس العصب البصري → أعلى → أدنى. الخط العمودي: رأس العصب البصري → الأنف → الصدغي.
  8. اجمع الصور من أربعة اتجاهات.
  9. انقر فوق المتوسط لتراكب إشارات صورة cSLO و OCT (الشكل 4F والشكل 4O).
  10. انقر فوق زر اللقطة للحصول على صورة SLO-OCT (الشكل 4P).
  11. حفظ وتصدير جميع الصور (الشكل 4Q ، R).

9. نهاية التجربة (بعد فحص OCT)

  1. ضع الماوس على البطانية الكهربائية لإبقائها دافئة حتى تستيقظ.
    ملاحظة: يجب مراقبة الماوس حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على استلقاء القص. يجب تقليل التعرض بعد العملية الجراحية للضوء الساطع.
  2. قم بإزالة العدسات اللاصقة 100 D.
  3. ضع جل العين ليفوفلوكساسين لحماية القرنية.
  4. ضع الماوس مرة أخرى في القفص بعد استيقاظه.
    ملاحظة: تأكد من عدم إرجاع الفأر الذي تم فحصه إلى صحبة الفئران الأخرى حتى يتم استرداده بالكامل.
  5. قم بإيقاف تشغيل البرنامج وإيقاف تشغيل الكمبيوتر.
  6. تنظيف العدسات اللاصقة 100 D بالماء. جفف العدسة.
  7. تنظيف وتطهير البيئة.

10. تحليل الصور

  1. قارن صور OCT لفئران Vldlr بالضربة القاضية مع صور الفئران C57BL / 6J.
  2. مراقبة مواقف متعددة: المسح الرأسي والأفقي الذي يمر عبر الحليمة البصرية. المسح العلوي ، السفلي ، الأنفي ، والزمني ؛ ومسح موقع الانعكاس غير الطبيعي.
  3. راقب سمك وشكل وطبقات وآفات الانعكاس غير الطبيعية لشبكية العين في كل صورة ، وكذلك الواجهة الزجاجية للشبكية والجسم الزجاجي.
  4. سجل مواقع وخصائص وأعداد الآفات.

11. تصحيح التقسيم الطبقي للشبكية

  1. انقر فوق تحميل الفحص على واجهة OCT (الشكل 5 أ).
  2. قم باستدعاء صور OCT للماوس من نافذة منبثقة.
  3. تحديد الصور: مسح صور OCT من خلال الحليمة البصرية ، أفقيا أو رأسيا.
  4. انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة في حاوية الوسائط لعرضها على الشاشة (الشكل 5C).
  5. انقر فوق اكتشاف الطبقة لإكمال الطبقات التلقائية على شبكية العين (الشكل 5D).
  6. حدد الخطوط الفاصلة على جانبي الطبقة المعدة للتحليل (الشكل 6D-10).
  7. حدد خطا فاصلا منفصلا (الشكل 6B-6) وانقر فوق تحرير الطبقة (الشكل 6A-1) لتنشيط الخط عند ظهور دائرة حمراء (الشكل 6B-7).
  8. اضبط التباعد (الشكل 6A-4 ، على سبيل المثال ، 50) ونطاق الحد (الشكل 6A-5 ، على سبيل المثال ، 50).
  9. قم بتعديل الخط الفاصل عن طريق تحريك الدائرة الحمراء (قارن الخط الفاصل الأخضر في الشكل 6B والشكل 6C ؛ يوضح الشكل 6C النتيجة المعدلة).

12. سمك تصفيح الشبكية

  1. انقر فوق زر علامة القياس (الشكل 6D-9).
  2. حدد الخط الفاصل للطبقة المراد تحليلها (على سبيل المثال ، في الطبقة النووية الخارجية ، حدد الخط الفاصل4 و 5 في القائمة) لعرض حدود الطبقة على صورة OCT (الشكل 6D-10).
  3. حدد الاتصال بالطبقة (الشكل 6D-11) والبقاء على اتصال أثناء التنقل (الشكل 6D-12).
  4. حدد المنطقة لعرض النتائج (العمود المحدد ملون ، الشكل 6D-13).
  5. انقر فوق الموضع المراد تحليله على صورة OCT لإظهار خط القياس (عموديا على المحور الأفقي ومتسقا مع لون المنطقة الناتجة) (الشكل 6D-14).
  6. انقر فوق العمود التالي للقياس التالي واكشف عن البيانات السابقة (الشكل 6E-15).
  7. اقرأ قيمة Vert (سمك الموضع المقاس) في صف الطول في ميكرومتر (الأنسجة) (الشكل 6E ، المستطيل الأحمر).
  8. انقر فوق حذف العلامة (الشكل 6E-16) والعلامة الجديدة (الشكل 6E-17) لإعادة الاختبار بحيث تغطي النتائج البيانات الأصلية (إذا كانت إعادة القياس ضرورية).
  9. صحافة طباعة Scr على لوحة المفاتيح لحفظ لقطات الشاشة ، أو انقر فوق حفظ الفحص للحفظ مباشرة (الشكل 5H).
  10. أدخل البيانات في جدول بيانات أو برنامج إحصائي للتحليل الإحصائي.

13. قياس سمك الشبكية الكامل

  1. حدد السطر 1 (ILM ، غشاء الحد الداخلي ، الشكل 7B) والسطر 7 (OS-RPE ، OS: قطاعات مستقبلات الضوء الخارجية ؛ RPE: الطبقة الظهارية الصبغية الشبكية ، الشكل 7C) في القائمة في الزاوية اليمنى العليا.
    ملاحظة: سمك الشبكية الكامل يعني سمك طبقة الظهارة العصبية في الشبكية ، وهي شبكية العين بين ILM و OS-RPE على OCT).
  2. قياس سمك الشبكية على جانبي الحليمة البصرية في فترة محددة.
    1. على سبيل المثال: من ظهور بنية الشبكية على حافة الحليمة البصرية ، قم بقياس 4 قيم مع تباعد 200 ميكرومتر للمسطرة الأفقية (الشكل 7G ، H).
  3. سجل جميع القيم المقاسة في جدول بيانات.
  4. استخدم اختبارات t متعددة (واحد لكل صف) لمقارنة القيم المقاسة لكل موضع مقابل في كلتا المجموعتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بفضل عمليات المسح عالية الدقة ل OCT ، يمكن ملاحظة طبقات شبكية العين ، ويمكن تحديد الانعكاسات غير الطبيعية ومواقعها الدقيقة. تمت مقارنة صور OCT الشبكية لفئران Vldlr بالضربة القاضية والفئران C57BL / 6J في هذه الدراسة. أظهرت صور OCT لجميع الفئران C57BL / 6J طبقات شبكية مختلفة ذات انعكاسية مختلفة ، وكان الترسيم واضحا (الشكل 8D). في المقابل ، أظهرت جميع فئران Vldlr بالضربة القاضية آفات غير طبيعية ومفرطة الانعكاس على صور OCT (الشكل 8B).

انفصال زجاجي غير مكتمل (PVD) في فئران Vldlr بالضربة القاضية

أظهرت نتائج OCT بعض العصابات العاكسة الوسطى على أسطح شبكية العين لفئران Vldlr بالضربة القاضية (الشكل 8B ، الأسهم الحمراء). تلتصق هذه الأشرطة العاكسة الوسطى بوعاء الشبكية (الشكل 8B ، السهم الأخضر) ، المقابلة لصورة cSLO (الشكل 8A ، السهم الأخضر). تتوافق هذه الميزات مع خصائص OCT للانفصال الزجاجي غير الكامل.

الأوعية الدموية تحت الشبكية في فئران Vldlr بالضربة القاضية

أظهرت النتائج أن الأوعية الدموية تحت الشبكية لها وضعان للتطور في فئران Vldlr بالضربة القاضية.

بمشاركة الطبقة النووية الخارجية

ظهرت آفة مفرطة الانعكاس ، ذات شكل مثلث من أسفل إلى أسفل على صورة OCT ، على الفضاء تحت الشبكية وانتشرت إلى الطبقة النووية الخارجية. لم تخترق الآفة الطبقة الضفيرية الخارجية (الشكل 8 ب ، السهم الأبيض).

كان مظهر OCT لهذا النوع من الأوعية الدموية تحت الشبكية متسقا مع النتائج المرضية الموضحة في الشكل 9 أ. أظهر القسم المرضي أن الأوعية الدموية الجديدة (الشكل 9 أ ، السهم الأخضر السميك) اخترقت RPE ، والأجزاء الداخلية / الخارجية للمستقبلات الضوئية (IS / OS) ، والغشاء الخارجي المحدد (ELM). غزت الطبقة النووية الخارجية (ONL) لكنها لم تخترق الطبقة الضفيرية الخارجية (OPL).

دون تدخل الطبقة النووية الخارجية

ظهرت مجموعة من الآفة شديدة الانعكاس على صورة OCT ، والتي كانت موجودة في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 8B ، السهم الأصفر). أظهرت صورة cSLO الموقع المقابل (الشكل 8 أ ، السهم الأصفر). أظهرت عمليات المسح الإضافية لشبكية العين حول هذا الموقع (الشكل 8 أ ، السهم الأصفر) نفس النتائج.

تماشيا مع الآفة (الشكل 10 أ ، السهم الأزرق السميك) في القسم المرضي ، لم تخترق الأوعية الدموية الجديدة تحت الشبكية الدردار (الشكل 10 أ ، السهم الأصفر الرفيع) ولكنها تضمنت جزئيا المستقبل الضوئي IS / OS.

نتائج سمك الشبكية

تم الحصول على سمك الشبكية للعين اليمنى لجميع الفئران باستخدام وظيفة التقسيم الطبقي التلقائي وقياس سمك OCT. كان سمك الشبكية لفئران Vldlr بالضربة القاضية (200.94 ± 14.64 ميكرومتر) أقل بكثير من سمك الفئران C57BL / 6J (217.46 ± 10.21 ميكرومتر ، P < 0.001 ، اختبار t ، 7 عيون / مجموعة أيمن). يوضح الشكل 11 مقارنة سمك الشبكية في الاتجاهات الأربعة (الصدغي والأنف والعلوي والسفلي) للقطبية الخلفية بين المجموعتين.

Figure 1
الشكل 1: تحضير المواد التجريبية والحيوانات. (أ) المعدات: 1. جهاز cSLO / OCT لتصوير شبكية العين للحيوانات الصغيرة ، 2. الكمبيوتر والشاشة ، 3. منصة حيوانية صغيرة ذات درجة حرارة ثابتة ، 4. ترموستات ، 5. عدسة محددة مسبقا ، 6. تركيب العدسة المحددة مسبقا. (ب) الأدوية والأشياء الصغيرة: I. بوفيدون - اليود، II. ميكروسيرينج ، الثالث. محلول خليط مخدر ، IV. الموقت ، V. قطرات العين mydriatic ، السادس. ملقط ، السابع. هلام هيالورونات الصوديوم الطبي ، الثامن. مسحة القطن الطبية ، التاسع. مرهم مضاد حيوي للعين ، X. 100 D العدسات اللاصقة (اثنان). (ج) قياس الوزن على ميزان رقمي. الاختصارات: cSLO = منظار العين بالليزر المسح البؤري ؛ OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التحضير قبل فحص OCT للفئران . (أ) تطبيق قطرة العين Mydriasis ، (ب) طلاء هلام هيالورونات الصوديوم على القرنية ، (C ، D) وضع عدسة لاصقة 100 D ، مع سطح مقعر ملامس للقرنية. اختصار: OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: إجراءات فحص OCT . (A) موضع الماوس ، I. عدسة مضبوطة مسبقا ، II. العدسات اللاصقة ، III. منصة حيوانية صغيرة ذات درجة حرارة ثابتة. (ب) تشغيل آلة cSLO / OCT ، IV. ذراع التشغيل ، V. ذراع الإمالة ، VI. جهاز cSLO. الاختصارات: cSLO = منظار العين بالليزر المسح البؤري ؛ OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: عملية التصوير OCT. أ. وضع القياس ، B. بدء تشغيل الليزرr من ليزر الأشعة تحت الحمراء ، C. اختيار العين (C-1-OD ؛ C-2-OS) ، D. نطاق ليزر الأشعة تحت الحمراء ، E. الديوبتر ، F. تراكب صورة cSLO ، G. OCT زر بدء / إيقاف الليزر H. مرجع صورة OCT ، I. المدى الأدنى: 0-20 ، J. المدى الأقصى: 50-60 ، K. شدة إشارة الصورة ، L. اتجاه المسح (على سبيل المثال ، المسح الرأسي) ، M. موضع المسح المحدد عن طريق تحريك الخط المرجعي الأخضر (على سبيل المثال ، المسح العمودي من خلال الحليمة البصرية) ، N. عرض في الوقت الحقيقي لصورة OCT ، O. تراكب صورة OCT ، P. Shot: الحصول على الصور ، Q. SLO-OCT الصور التي تم الحصول عليها ، R. حفظ الفحص: حفظ نتيجة الفحص. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: cSLO = منظار العين بالليزر المسح البؤري ؛ OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري ؛ الأشعة تحت الحمراء = الأشعة تحت الحمراء ؛ OD = العين اليمنى ؛ نظام التشغيل = العين اليسرى. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: واجهة تفريغ الشبكية التلقائية على نظام OCT. أ. زر فحص التحميل ، ب. حاوية الوسائط ، تظهر جميع صور OCT ، C. صورة OCT التي يتم تحديدها للتحليل ، D. زر الكشف عن الطبقة لطبقات الشبكية التلقائية ، E. قائمة خط التقسيم ، F. التفريغ التلقائي على شبكية العين ، G. زر تحرير الطبقة لتصحيح الطبقات ، H. حفظ الفحص زر لحفظ النتائج. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. اختصار: OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: تصحيح الطبقات (A-C) وقياس السمك (D-E). (أ) واجهة تنشيط تحرير الطبقات: 1. زر تحرير الطبقة ، 2. تقسيم قائمة الأسطر (على سبيل المثال ، تحديد جميع الخطوط) ، 3. خطوط تقسيم مفعلة ، 4. تعديل التباعد ، 5. تعديل نطاق الحد. (ب) تفعيل خط فاصل (على سبيل المثال ، الخط 3 في A) ، 6. الخط 3 ، الخط الفاصل بين طبقة الضفيرة الداخلية والطبقة النووية الداخلية ، 7. مثال على خطأ الطبقات. (ج) تعديل خطأ الطبقات ، 8. الدائرة الحمراء للتعديل. (د) مثال على قياس سمك رقائقي الشبكية ، 9. زر قياس العلامة ، 10. الخطوط الفاصلة للطبقة النووية الخارجية ، 11. تواصل مع الطبقة (سيتصل القياس بالطبقة وفقا لخطوط التقسيم) ، 12. ابق على اتصال أثناء التنقل (موضع القياس هو المكان الذي تبقى فيه النقرة اليدوية) ، 13. موقع عرض النتيجة ، 14. خط القياس (عمودي على المحور الأفقي). (ه) الحصول على نتيجة القياس ، 15. نتائج القياس (المستطيل الأحمر: قيمة Vert هي نتيجة السماكة) ، 16. زر حذف العلامة لحذف سجل القياس ، 17. زر Marke r جديدلإعادة القياس (ستحل النتيجة الجديدة محل السجل الأصلي). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: قياس سمك الشبكية الكامل. أ. قياس زر العلامة ، B. الخط 1 (ILM) و C. اختيار الخط 7 (OS-RPE) لإظهار حدود شبكية العين كاملة السماكة ، D. تواصل مع اختيار الطبقة ، E. ابق على اتصال عند اختيار الحركة ، F. شريط المسطرة (قضبان المسطرة الرأسية والأفقية ، كلاهما 200 ميكرومتر في الطول) ، G. خطوط القياس على شبكية العين (4 خطوط مع 200 ميكرومتر من طول المسطرة الأفقية كتباعد على كل جانب من جوانب الحليمة البصرية) ، H. نتائج القياس (يتم تمييز النتائج بألوان مختلفة وتتوافق مع لون خطوط القياس على شبكية العين) ، I. استخراج البيانات من قيمة Vert في صف الطول في ميكرومتر (الأنسجة). قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: ILM = غشاء الحد الداخلي ؛ OS-RPE = الجزء الخارجي المستقبلات الضوئية من ظهارة صبغة الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: مقارنة بين صور cSLO و OCT لفئران Vldlr بالضربة القاضية والفئران C57BL / 6J. صور cSLO (A) و OCT (B) لفئران Vldlr بالضربة القاضية مقارنة بصور cSLO (C) و OCT (D) لفئران C57BL / 6J. خصائص OCT في فئران Vldlr بالضربة القاضية (B): 1) خط عاكس متوسط (B ، أسهم حمراء) على السطح الداخلي للشبكية مع التصاق بوعاء الشبكية (B ، سهم أخضر). 2) آفات مفرطة الانعكاس ، تقع في الفضاء تحت الشبكية ، مع (B ، سهم أبيض) أو بدون (B ، سهم أصفر) تورط الطبقة النووية الخارجية. تمثل الأسهم الموجودة على صورة cSLO (A) مواقع أسهم الألوان المقابلة على صورة OCT (B). قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: cSLO = منظار العين بالليزر المسح البؤري ؛ OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري ؛ Vldlr = مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة للغاية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9: الوضع 1: أقسام البارافين في شبكية العين مع تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين بالضربة القاضية Vldlr وماوس C57BL / 6J. (أ) مثال على الأوعية الدموية تحت الشبكية التي تغزو الطبقة النووية الخارجية (السهم الأخضر السميك) ، الموجود في الجزء الأوسط من شبكية العين لفأر Vldlr بالضربة القاضية. (ب) التحكم الطبيعي ، الجزء الأوسط من شبكية العين للماوس C57BL / 6J. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: Vldlr = مستقبلات البروتين الدهني منخفضة الكثافة ؛ ILM = غشاء الحد الداخلي ؛ NFL = طبقة الألياف العصبية الشبكية ؛ GCL = طبقة خلية العقدة الشبكية ؛ IPL = طبقة الضفيرة الداخلية ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ OPL = طبقة الضفيرة الخارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ ELM = غشاء الحد الخارجي ؛ IS = الجزء الداخلي للمستقبلات الضوئية ؛ OS = الجزء الخارجي لمستقبلات الضوء ؛ RPE = طبقة ظهارة الصباغ الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 10
الشكل 10: الوضع 2: أقسام البارافين الشبكية مع تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين في Vldlr بالضربة القاضية والماوس C57BL / 6J. (أ) مثال على الأوعية الدموية الجديدة تحت الشبكية دون تدخل الطبقة النووية الخارجية (السهم الأزرق السميك) ومع الدردار السليم (السهم الأصفر الرفيع) ، الموجود في شبكية العين المحيطية الوسطى في فأر خروج المغلوب Vldlr. (ب) التحكم الطبيعي ، شبكية العين المحيطية الوسطى للماوس C57BL / 6J. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: VLDR = مستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة ؛ ILM = غشاء الحد الداخلي ؛ NFL = طبقة الألياف العصبية الشبكية ؛ GCL = طبقة خلية العقدة الشبكية ؛ IPL = طبقة الضفيرة الداخلية ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ OPL = طبقة الضفيرة الخارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ ELM = غشاء الحد الخارجي ؛ IS = الجزء الداخلي للمستقبلات الضوئية ؛ OS = جزء مستقبلات الضوء الخارجي ؛ RPE = طبقة ظهارة الصباغ الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 11
الشكل 11: مقارنة سمك الشبكية بين الفئران C57BL / 6J والفئران بالضربة القاضية Vldlr (جميع البيانات من العين اليمنى). (أ) سمك الشبكية (ميكرومتر) من خلال حليمة العصب البصري عن طريق المسح الأفقي OCT. (ب) سمك الشبكية (ميكرومتر) من خلال حليمة العصب البصري عن طريق المسح الرأسي OCT. يمثل الإحداثي الأفقي مواضع القياس بمسافة 200 ميكرومتر.*: P < 0.05 ، **: P < 0.01 ، ***: P < 0.001. الاختصارات: T = مؤقت ؛ P = الحليمة البصرية. N = أنف ؛ S = متفوق ؛ أنا = أدنى. OCT = التصوير المقطعي للتماسك البصري ؛ VLDR = مستقبلات البروتين الدهني منخفضة الكثافة ؛ OD = العين اليمنى. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم تطبيق التصوير المقطعي المحوسب باستخدام نظام تصوير شبكية العين للحيوانات الصغيرة لتقييم تغيرات الشبكية في فئران Vldlr بالضربة القاضية ، والتي تظهر انفصالا زجاجيا خلفيا غير مكتمل ، والأوعية الدموية تحت الشبكية ، وترقق سمك الشبكية. OCT هي طريقة تصوير غير جراحية لفحص حالة شبكية العين في الجسم الحي. تم تصميم معظم أجهزة OCT لفحص العين البشرية. يعتمد حجم الأجهزة ، وتحديد البعد البؤري ، وإعداد معلمات النظام ، ومتطلبات تحديد المواقع للممتحن على العين البشرية. يلزم إجراء تعديلات على العدسة وإعدادات النظام لفحص الحيوانات الصغيرة باستخدام معدات OCT الخاصة بالإنسان. تقدم هذه الورقة إجراءات فحص OCT للحيوانات الصغيرة.

يختلف البعد البؤري أثناء مسح الصور لحيوانات صغيرة مختلفة بأحجام مختلفة من مقل العيون. هذا الاختلاف في البعد البؤري أمر بالغ الأهمية ويجب حله للحصول على صور قاع العين واضحة ودقيقة. إحدى الطرق الفعالة هي استبدال العدسة الشيئية بعدسات ذات انحناءات مختلفة. نظرا لصغر حجم مقلة العين ، يحتاج الماوس إلى عدسة لاصقة 100 D أمام القرنية بالإضافة إلى عدسة 60 D مزدوجة كروية محددة مسبقا لجهاز OCT.

يمكن ل OCT فقط توفير فحوصات خطية تغطي فقط منطقة محدودة من شبكية العين. لذلك ، من الضروري توحيد بروتوكول فحوصات OCT للمقارنة النوعية والكمية لنتائج OCT في مجموعات مختلفة. تم إجراء ثلاث عمليات مسح أفقية وثلاث عمليات مسح عمودية هنا. يوفر هذا الجهاز صورة cSLO في الوقت الفعلي لمراقبة موقع مسح OCT بحيث يمكن ضبط موضع الفحص بدقة وسهولة. يمكن إضافة فحوصات إضافية عند العثور على انعكاس غير طبيعي.

يجب تعديل معلمات الحصول على الصور بعناية. هنا ، يوصى بأن يكون الحد الأدنى للنطاق 0-20 وأن يكون النطاق الأقصى 50-60 (الشكل 4I ، J). عندما يتم ضبط المعلمات بشكل مفرط ، سيتم تحسين تباين إشارة الصورة ، وتصبح الإشارة المنعكسة لشبكية العين ذات الانعكاس المنخفض أقل أو حتى سوداء ، وستفقد بعض المعلومات المورفولوجية.

فيما يلي بعض النصائح لتجنب تدهور جودة الصورة: 1. ضع العدسات اللاصقة أمام العينين مباشرة بعد التخدير لتجنب إعتام عدسة العين. 2. تأكد من نظافة العدسة والعدسات اللاصقة المحددة مسبقا ؛ 3. تجنب دخول الشعر بين القرنية والعدسات اللاصقة. 4. تأكد من ضبط الدوبلر والتباين والسطوع في معلمات OCT بشكل مناسب.

يمكن استخدام صور OCT للكشف النوعي عن الآفات وقياس المقاييس كميا مثل سمك الشبكية. هنا ، يتم اقتراح طريقة لقياس سمك الشبكية في عدة مواقع ، ويمكن حساب المتوسط على أنه متوسط سمك الشبكية. يتم تحقيق ذلك من خلال وظيفة التقسيم الطبقي التلقائي لنظام OCT. لذلك ، يمكن أيضا قياس سمك تصفيح الشبكية. طريقة القياس بسيطة ودقيقة (الشكل 6 والشكل 7). أظهرت النتائج أن سمك الشبكية كان أقل في فئران Vldlr بالضربة القاضية من الفئران C57BL / 6J ، بما يتفق مع الأدبيات25. يمكن إظهار الفرق في سمك الشبكية بين المجموعتين بوضوح من خلال رسم بياني تم إنشاؤه من القياسات في مواقع متعددة (الشكل 11). كما تم الإبلاغ عن تحليل اعتلال الشبكية وطرق قياس سمك الشبكية في نموذج فأر مرض ستارغاردت26. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن العصابات العاكسة في الواجهة الزجاجية للشبكية لا تنتمي إلى أنسجة الشبكية ويجب إزالتها أثناء التقسيم الطبقي. بالإضافة إلى ذلك ، إذا غزت الآفات تحت الشبكية شبكية العين ، فيجب أن يشمل قياس السمك الجزء الغازي.

نظام تصوير شبكية العين للحيوانات الصغيرة هذا له بعض القيود. على سبيل المثال ، على الرغم من أنه يمكن أن يوفر صورا واضحة للقطب الخلفي في حدود 35 درجة ، إلا أن الحصول على صورة للشبكية المحيطية لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل cSLO صورة ذات مقياس رمادي ، وهي ليست جيدة مثل صورة قاع العين الملونة للكشف عن آفات قاع العين (التصبغ ، النزيف ، النضح). ومن ثم، هناك حاجة إلى مزيد من التحسينات. باختصار ، يمكن أن يسهل فحص OCT بواسطة جهاز cSLO الكشف غير الجراحي وقياس اعتلال الشبكية في نماذج الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

مصدر المشروع: مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2018A0303130306). يود المؤلفون أن يشكروا مختبر أبحاث العيون ومركز شانتو الدولي المشترك للعيون بجامعة شانتو والجامعة الصينية في هونغ كونغ على التمويل والمواد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-Dpt contact lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket POPOCOLA CW-DRT-01 50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL) Kaile 0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD 5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel Alcon 16H01E
Microliter syringes Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD Q31/0113000236C001-2017 50 µL
Povidone iodine solution Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD 100 mL
RETImap ROLAND CONSULT 19-99_50-2.1_1.2E cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs OSMO POCKET OT110 INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops Santen Pharmaceutical Co.,LTD 5 mg/mL
Xylazin Sigma X1251-5G 5 g
Zoletil 50 Virbac.S.A 7FRPA Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
  2. Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
  3. Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
  4. Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
  5. Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
  6. Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
  7. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  8. Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
  9. Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
  10. Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
  11. Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
  12. Podoleanu, A. G. Optical coherence tomography. Journal of Microscopy. 247 (3), 209-219 (2012).
  13. Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
  14. Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
  15. Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
  16. Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
  17. Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
  18. Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
  19. Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
  20. Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
  21. Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
  22. Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
  23. Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
  24. Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
  25. Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
  26. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).

Tags

الطب ، العدد 179 ،
تطبيق التصوير المقطعي للتماسك البصري على نموذج فأر لاعتلال الشبكية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. … More

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J. Vis. Exp. (179), e63421, doi:10.3791/63421 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter