Summary
ここでは、マウス網膜症の診断と定量的測定を容易にするために、光干渉断層撮影法を用いた in vivo イメージング技術について述べる。
Abstract
光干渉断層撮影(OCT)は、網膜症の診断のための非侵襲的な方法を提供します。OCTマシンは、網膜の厚さを計算できる網膜断面画像をキャプチャできます。OCTは臨床現場で広く使用されていますが、基礎研究への応用は、特にマウスなどの小動物ではそれほど普及していません。眼球のサイズが小さいため、マウスで眼底画像検査を行うことは困難です。そのため、小動物のOCTイメージングに対応するために、特殊な網膜イメージングシステムが必要です。本稿では、OCT検査手順のための小動物固有のシステムと画像解析のための詳細な方法を紹介します。超低比重リポタンパク質受容体(Vldlr)ノックアウトマウスおよびC57BL/6Jマウスの網膜OCT検査の結果を提示する。C57BL/6JマウスのOCT画像は網膜層を示し、 Vldlr ノックアウトマウスのOCT画像は網膜下血管新生と網膜菲薄化を示した。要約すると、OCT検査は、マウスモデルにおける網膜症の非侵襲的検出および測定を容易にすることができる。
Introduction
光干渉断層撮影(OCT)は、組織1,2,3,4,5,6,7,8、特に網膜9,10,11,12の非侵襲的検査のために、in vivo高解像度および断面イメージングを提供できるイメージング技術です。.また、網膜の厚さや網膜神経線維層の厚さなど、いくつかの重要なバイオマーカーを定量するためにも使用できます。OCTの原理は光コヒーレンス反射率法であり、これは、試料から反射された光のコヒーレンスから断面組織情報を取得し、それをコンピュータシステム7を介してグラフィックまたはデジタル形式に変換する。OCTは、網膜疾患患者の診断、フォローアップ、および管理に不可欠なツールとして、眼科クリニックで広く使用されています。また、網膜疾患の病因についての洞察を提供することもできます。
OCTは、臨床応用に加えて、動物実験でも使用されています。病理学は形態学的特性評価のゴールドスタンダードですが、OCTには非侵襲的なin vivoイメージングと縦断的フォローアップという利点があります。さらに、OCTは網膜症動物モデル11、13、14、15、16、17、18、19、20において組織病理学とよく相関することが示された。マウスは生物医学研究で最も一般的に使用される動物です。しかし、その小さな眼球は、マウスでOCTイメージングを行う上で技術的な課題をもたらします。
マウス21、22における網膜イメージングに最初に使用されたOCTと比較して、小動物におけるOCTは、ハードウェアおよびソフトウェアシステムに関して最適化されている。たとえば、OCTをトラッカーと組み合わせると、信号対雑音比が大幅に低下します。OCTソフトウェアシステムのアップグレードにより、より多くの網膜層を自動的に検出できます。統合されたDLPビーマーは、モーションアーチファクトを減らすのに役立ちます。
超低密度リポタンパク質受容体(Vldlr)は、内皮細胞の膜貫通タンパク質です。網膜血管内皮細胞、網膜色素上皮細胞、および外限膜23、24の周囲に発現する。網膜下新生血管は、 Vldlr ノックアウトマウス23の表現型である。したがって、 Vldlr ノックアウトマウスは、網膜下血管の病因および潜在的な治療法を調査するために使用される。この記事では、小動物モデルでの網膜症研究に技術的な参考資料を提供し、 Vldlr ノックアウトマウスの網膜病変を検出するためのOCTイメージングのアプリケーションを示します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
手術は、視覚眼科学研究協会の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に従って実施されました。実験デザインは、施設動物倫理委員会(日本医療倫理委員会、EC 20171213(4)-P01)によって承認されました。この研究では、生後2か月のC57BL / 6Jマウスと Vldlr ノックアウトマウスを使用しました。各群に7匹のマウスがいて、全員が雌で、体重は20gから24gでした。
1. 実験条件
- マウスを2つのグループに割り当てます: Vldlr ノックアウトマウスからなる実験グループとC57BL / 6Jマウスからなる対照グループ。
- 従来、マウスに餌と水を与えます。
- 室温(22°C)、湿度(50〜60%)、明暗サイクル(12時間〜12時間)、および室内光強度(350〜400ルクス)の安定した条件下で動物実験室でマウスを飼育します。
- 実験装置を準備します:小動物用の共焦点走査レーザー検眼鏡(cSLO)による光干渉断層撮影(図1A)。
- 実験に必要なすべての材料を準備し(図1B)、マウスの体重を測定します(図1C)。
2. 情報記録
- グループ、コード、生年月日、年齢、性別、体重、麻酔薬の投与量などの情報を記録します。
3. 機器の起動とテスト
- コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。
- [テスト プログラム] ボタンをクリックして、 テスト プログラム を完了します。
- サーモスタットの電源を入れ、37°Cの温度に予熱します。
- プログラムのテスト後に OCT モジュール 手順を開始します。
- 新しい件名を作成し、マウス情報を入力します。
- 電気毛布を予熱し、外科用タオルで覆います。
4.麻酔
- チレタミンとゾラゼパムを含む凍結乾燥麻酔薬粉末を使用して、麻酔薬混合物を調製します。.
注:麻酔投与の選択、投与量、および経路については、地域の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。少なくとも1時間、不動および疼痛知覚の喪失をもたらす麻酔薬で動物を麻酔し、その後動物は急速に回復する。投与量は、実験時間の長さ、動物の体重、およびその他の要因に基づく必要があります。. - 調製した麻酔薬混合物を使用して動物を麻酔する。回復するまで、手順全体を通して動物を暖かく保つようにしてください。
5.散瞳液滴の適用
- 首筋でマウスを手動で拘束し、眼球をわずかに突き出し、片方の目を上に向けてマウスの頭を回転させます。
- 散瞳液滴を適用して瞳孔を拡張します(図2A)。
- 10分後に瞳孔の拡張を確認します。
6.マウスの配置
- 電気毛布のプラットフォームにマウスを置きます。
- 医療用ヒアルロン酸ナトリウムゲルで両目をコーティングします(図2B)。
- 60 D二重球面レンズ(プリセットレンズ)をcSLOデバイスにねじ込みます(図1A-5、6)。
- マウスの角膜に100Dコンタクトレンズを置き、凹面側が角膜表面のヒアルロン酸ナトリウムゲルに触れます(図2C、Dおよび図3A-II)。
- マウスを小型の恒温動物プラットフォームに置き、cSLOデバイスのレンズから目を1〜2 mm離します(図3A)。
- 瞳孔をレンズの中央に保つために、鉗子でコンタクトレンズの角度を調整します。
- 頭の調整を微調整して、目の向きをまっすぐにします。
7.共焦点走査レーザー検眼鏡(cSLO)
- OCTボタンをクリックし、マウスモジュールを選択して、cSLOプログラムを起動します(図4B)。
- IRモード(光源:赤色光)を選択し、パラメータを調整します(範囲:2047、図4D)。
- 検査する目を選択します(右目:図4C-1、左目:図4C-2)。
- レバーを制御し、プリセットレンズをコンタクトレンズに向かってゆっくりと動かします。
- 後極の画像が明確になるまで視度値を調整します(図4E)。
- 網膜後極の画像を視神経乳頭の中央に揃えるようにさらに調整します。
8.光干渉断層撮影(OCT)
- OCT プログラムを起動します (図 4G)。
- OCT画像が表示されるまで進行状況バーを上下にクリックします(図4H)。
- パラメータを調整します:範囲最小(図4I)= 0-20、範囲最大(図4J)= 40-60。
- 理想的なOCT画像が得られるまで、プリセットレンズの距離と位置方向を調整します。
- cSLOの標準ラインを移動してスキャン位置を選択します(図4M)。
- 視神経乳頭からスキャンを開始します。
- 各目について同じ順序で画像を収集します:水平線:視神経乳頭→上→劣。垂直線:視神経頭→鼻→側頭。
- 4方向から画像を収集します。
- [平均]をクリックして、cSLOおよびOCTイメージ信号をオーバーレイします(図4Fおよび図4O)。
- 撮影ボタンをクリックして、SLO-OCT画像を取得します(図4P)。
- すべての画像を保存してエクスポートします(図4Q、R)。
9. 実験終了(OCT試験後)
- マウスを電気毛布の上に置いて、目覚めるまで暖かく保ちます。
注意: マウスは、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで監視する必要があります。術後の明るい光への曝露は最小限に抑える必要があります。 - 100Dコンタクトレンズを取り外します。
- 角膜を保護するためにレボフロキサシンアイジェルを適用します。
- ウェイクアップ後、マウスをケージに戻します。
注意: 検査したマウスが完全に回復するまで、他のマウスの会社に戻されていないことを確認してください。 - ソフトウェアの電源を切り、コンピュータの電源を切ります。
- 100 Dコンタクトレンズを水で洗浄します。レンズを乾かします。
- 環境をきれいにして消毒します。
10. 画像解析
- VldlrノックアウトマウスのOCT画像をC57BL/6JマウスのOCT画像と比較します。
- 複数の位置を観察する:視神経乳頭を通過する垂直および水平スキャン。上、下、鼻、および側頭スキャン。異常な反射サイトスキャン。
- 各画像の網膜の厚さ、形状、層状、異常な反射率病変、および網膜と硝子体の硝子体界面を観察します。
- 病変の位置、特徴、および数を記録します。
11.網膜層別化補正
- OCT インターフェイスの [負荷検査 ] をクリックします (図 5A)。
- ポップアップ ウィンドウからマウスの OCT イメージを呼び出します。
- 画像の選択:OCT画像は、視神経乳頭を水平または垂直にスキャンします。
- メディアコンテナ内の画像をダブルクリックして、画面に表示します(図5C)。
- [レイヤー 検出 ]をクリックして、網膜の自動レイヤー化を完了します(図5D)。
- 解析用に準備したレイヤーの両側の分割線を選択します(図6D-10)。
- 別の分割線を選択し(図6B-6)、レイヤーの編集(図6A-1)をクリックして、赤い円が表示されたら線をアクティブにします(図6B-7)。
- 間隔(図6A-4、例:50)と制限範囲(図6A-5、例:50)を調整します。
- 赤い円を移動して分割線を変更します(図6Bと図6Cの緑の分割線を比較してください。図6Cは修正結果を示す)。
12.網膜ラミネーションの厚さ
- マーカーの測定ボタンをクリックします(図6D-9)。
- 解析する層の分割線を選択し(例えば、外顆粒層で、リストの4番目と5番目の分割線を選択)、OCT画像上に層の境界を表示します(図6D-10)。
- [レイヤーと接続](図6D-11)を選択し、移動中に接続を維持します(図6D-12)。
- 結果を表示する領域を選択します(選択した列は色付きです、図6D-13)。
- OCT画像上で解析する位置をクリックして、測定線を表示します(水平軸に垂直で、結果の領域の色と一致します)(図6D-14)。
- 次の測定の次の列をクリックして、前のデータを表示します(図6E-15)。
- μm単位の長さ(組織)行のVert値(測定位置の厚さ)を読み取ります(図6E、赤い長方形)。
- マーカーの削除(図6E-16)と新しいマーカー(図6E-17)をクリックして再テストし、結果が元のデータをカバーするようにします(再測定が必要な場合)。
- キーボードの Print Scr を押してスクリーンショットを保存するか、[ 検査の保存 ]をクリックして直接保存します(図5H)。
- 統計分析のためにスプレッドシートまたは統計ソフトウェアにデータを入力します。
13.網膜全体の厚さの測定
- ライン 1 (ILM、内限界膜、 図7B)と ライン7 (OS-RPE、OS:外側感光体セグメント;RPE:網膜色素上皮層、 図7C)の右上隅のリストにある。
注:網膜の全厚さとは、OCT上のILMとOS-RPEの間の網膜である網膜神経上皮層の厚さを意味します。 - 視神経乳頭の両側の網膜の厚さを特定間隔で測定します。
- 例:視乳頭の端にある網膜構造の外観から、水平定規の200μm間隔で4つの値を測定します(図7G、H)。
- すべての測定値をスプレッドシートに記録します。
- 複数の t検定(行ごとに1つ)を使用して、両方のグループの対応する各位置の測定値を比較します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OCTの高解像度スキャンのおかげで、マウスの網膜の層を観察することができ、異常な反射とその正確な位置を特定することができます。この研究では、 Vldlr ノックアウトマウスとC57BL / 6Jマウスの網膜OCT画像を比較しました。すべてのC57BL/6JマウスのOCT画像は、反射率の異なるさまざまな網膜層を示し、境界は明確でした(図8D)。対照的に、すべての Vldlr ノックアウトマウスは、OCT画像上に異常な過反射病変を示した(図8B)。
Vldlrノックアウトマウスにおける不完全硝子体剥離(PVD)
OCTの結果は、 Vldlr ノックアウトマウスの網膜表面にいくつかの中央反射バンドを示した(図8B、赤い矢印)。これらの中央反射バンドは、網膜血管に付着し(図8B、緑色の矢印)、cSLO画像(図8A、緑色の矢印)に対応する。これらの特徴は、不完全な硝子体剥離のOCT特性と一致しています。
Vldlrノックアウトマウスにおける網膜下血管新生
結果は、網膜下血管が Vldlr ノックアウトマウスにおいて2つの発達様式を有することを示した。
外顆粒層の関与
OCT画像上のボトムダウン三角形の形状を有する過反射病変が網膜下腔に出現し、外顆粒層に拡がった。病変は外側の網状層を突き破らなかった(図8B、白い矢印)。
このタイプの網膜下血管のOCT外観は、図9Aに示す病理学的所見と一致した。病理部では,新生血管(図9A,太い緑色の矢印)がRPE,視細胞内外セグメント(IS/OS),外限界膜(ELM)を突破した。それは外顆粒層(ONL)に侵入したが、外叢状層(OPL)を突破しなかった。
外顆粒層の関与なし
網膜下腔に位置するOCT画像に過反射病変のバンドが現れた(図8B、黄色矢印)。cSLO画像は、対応する位置を示した(図8A、黄色矢印)。この場所の周りの網膜の追加スキャン(図8A、黄色の矢印)は同じ所見を示しました。
病理部の病変(図10A、太い青矢印)と一致して、この網膜下血管新生はELM(図10A、細い黄色矢印)を突破せず、部分的に視細胞IS/OSに関与していました。
網膜の厚さの結果
全てのマウスの右眼の網膜の厚さは、OCTの自動層別化および厚さ測定機能を用いて得られた。 Vldlr ノックアウトマウス(200.94 ± 14.64 μm)の網膜厚は、C57BL/6Jマウス(217.46 ± 10.21 μm、P < 0.001、 t検定、7右眼/群)よりも有意に低かった。後極の4方向(側頭、鼻、上、下)の網膜厚を2群間で比較した例を 図11に示す。
図1:実験材料と動物の準備 。 (A)機器:1.小動物網膜イメージング用のcSLO / OCTデバイス、2.コンピューターとモニター、3.小型の恒温動物プラットフォーム、4.サーモスタット、5.プリセットレンズ、6.プリセットレンズの取り付け。(B)医薬品および小物:I.ポビドンヨード、II.マイクロシリンジ、III。麻酔薬混合液、IV。タイマー、V.散瞳点眼薬、VI。鉗子、VII。医療用ヒアルロン酸ナトリウムゲル、VIII。医療用綿棒、IX。抗生物質眼軟膏、X.100 Dコンタクトレンズ(2つ)。(C)デジタル天秤での重量測定。略語:cSLO =共焦点走査レーザー検眼鏡;OCT = 光コヒーレンストモグラフィー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスのOCT検査前の準備 。 (A)散瞳点眼剤塗布、(B)角膜上のヒアルロン酸ナトリウムゲルコーティング、(C、D)100Dコンタクトレンズの配置、凹面を角膜に接触させる。略称:OCT =光干渉断層撮影。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:OCT検査手順。 (A)マウス位置の配置、I.プリセットレンズ、II.コンタクトレンズ、III.小型で恒温の動物用プラットフォーム。(B) cSLO/OCT マシンの操作、IV.操作レバー、V.チルトレバー、VI。cSLO デバイス。略語:cSLO =共焦点走査レーザー検眼鏡;OCT = 光コヒーレンストモグラフィー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:OCTイメージングプロセス。 A.いいえ。測定 モードは、B.IRレーザーの開始 レーザーr、C.眼球選択(C-1-OD;C−2−OS)、D.IRレーザーの範囲、E.視度、F.cSLO画像のオーバーレイ、G.OCTスキャン開始/停止レーザーボタンH.OCT画像の基準、I.範囲 最小:0〜20、J .範囲最大:50〜60、K.画像の信号強度、L.スキャン方向(例えば、垂直スキャン)、M.緑色の基準線を移動して選択されたスキャン位置(例えば、 視神経乳頭を通る垂直スキャン)、N.OCT画像のリアルタイム表示、O.OCT画像のオーバーレイ、P. ショット:画像取得、Q.取得されたSLO-OCT画像、R.検査の保存:検査結果 の保存。スケールバー= 200μm。略語:cSLO =共焦点走査レーザー検眼鏡;OCT = 光コヒーレンストモグラフィー;IR =赤外線;OD =右目;OS = 左目。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:OCTシステムの自動網膜層間剥離インターフェース。 A.検査の読み込みボタン、B.すべてのOCT画像を表示するメディアコンテナ、C.分析用に選択されているOCT画像、D.網膜層自動レイヤー化のための層検出ボタン、E.分割線リスト、F.網膜上の自動層間剥離、G.層状補正のためのレイヤー編集ボタン、H.検査の保存 結果を保存するためのボタン。スケールバー= 200μm。略称:OCT =光干渉断層撮影。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:層状補正(A-C)と厚さ測定(D-E)。 (A)階層化された編集アクティベーションインターフェイス:1. レイヤーの編集 ボタン、2。分割行リスト(例:すべての行を選択)、3。分割線をアクティブにし、4。 間隔 調整、5。 制限範囲 の調整。(B)分割線(例えば、 Aの3行目)の活性化、6。線3は、内叢状層と内顆粒層との間の線、7。レイヤーエラーの例。(C) 階層化誤差の修正、8.変更用の赤い円。(d)網膜層厚測定の一例、9. マーカーの測定 ボタン、10。外顆粒層の分割線、11。レイヤー と接続 します(測定値は分割線に従ってレイヤーに接続します)、12。 移動中に接続を維持 (測定位置は手動クリックがとどまる場所です)、13。結果表示の位置、14。測定線(水平軸に垂直)。(e)測定結果取得、15.測定結果(赤四角形: Vert 値は厚さの結果)、16.測定記録削除のための マーカー削除 ボタン、17.再測定用の 新しいMarkerボタン(新しい結果は元のレコードを上書きします)。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:網膜全体の厚さの測定。 A.マーカー測定ボタン、B.全層網膜の境界を示すための1行目(ILM)およびC.ライン7(OS-RPE)の選択、D.レイヤー選択で接続、E.移動時に接続したままの選択、F.定規バー(垂直および水平定規バー、両方とも長さ200 μm)、G.網膜上の測定線(両側の間隔として200 μmの水平定規の長さを持つ4本の線 視乳頭)、H.測定結果(結果は異なる色で区別され、網膜上の測定線の色に対応します)、I.μm(組織)行の長さのVert値からのデータ抽出。スケールバー= 200μm。略語: ILM = 内限界膜;OS-RPE =網膜色素上皮の光受容体外側セグメント。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:VldlrノックアウトマウスとC57BL/6JマウスのcSLO画像とOCT画像の比較。 VldlrノックアウトマウスのcSLO(A)およびOCT(B)画像と、C57BL/6JマウスのcSLO(C)およびOCT(D)画像を比較した。VldlrノックアウトマウスにおけるOCTの特徴(B):1)網膜血管に接着した網膜内面の中央反射線(B、赤矢印)。2)網膜下腔に位置する過反射病変, (B, 白い矢印) またはなし (B, 黄色の矢印) 外顆粒層の関与.cSLO イメージ(A)の矢印は、OCT イメージ(B)上の対応するカラー矢印の位置を表します。スケールバー= 200μm。略語:cSLO =共焦点走査レーザー検眼鏡;OCT = 光コヒーレンストモグラフィー;Vldlr =超低密度リポタンパク質受容体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:モード1:VldlrノックアウトおよびC57BL / 6Jマウスにおけるヘマトキシリン-エオジン染色による網膜パラフィン切片。 (a)Vldlrノックアウトマウスの網膜中央部に位置する網膜下顆粒層(太い緑色の矢印)に侵入する網膜下血管形成の例。(B)正常コントロール、C57BL / 6Jマウスの網膜の中央部。スケールバー= 50μm。 略語:Vldlr =超低密度リポタンパク質受容体;ILM = 内限界膜;NFL =網膜神経線維層;GCL =網膜神経節細胞層;IPL =内側の網状層;INL =内顆粒層;OPL =外側の網状層;ONL =外顆粒層;ELM =外部制限膜;IS =感光体内部セグメント;OS =感光体外部セグメント;RPE =網膜色素上皮層。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:モード2:VldlrノックアウトおよびC57BL / 6Jマウスにおけるヘマトキシリン-エオジン染色による網膜パラフィン切片。 (A)Vldlrノックアウトマウスの中周網膜に位置する、外顆粒層の関与なし(太い青い矢印)および無傷のELM(細い黄色の矢印)を使用した網膜下新生血管の例。(B)正常対照、C57BL / 6Jマウスの中周網膜。スケールバー= 50μm。略語:VLDR =超低密度リポタンパク質受容体;ILM = 内限界膜;NFL =網膜神経線維層;GCL =網膜神経節細胞層;IPL =内側の網状層;INL =内顆粒層;OPL =外側の網状層;ONL =外顆粒層;ELM =外部制限膜;IS =感光体内部セグメント;OS =外側の感光体セグメント;RPE =網膜色素上皮層。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:C57BL/6Jマウスと Vldlr ノックアウトマウスの網膜厚さの比較(すべてのデータは右眼から )。 (A)OCT水平スキャンによる視神経乳頭を通る網膜の厚さ(μm)。(B)OCT垂直スキャンによる視神経乳頭を通る網膜の厚さ(μm)。水平座標は、200μm*:P < 0.05、**:P < 0.01、***:P < 0.001の間隔で測定位置を表します。略語:T =時間的。P =視神経乳頭;N =鼻;S =スーペリア。I =劣っている。OCT = 光コヒーレンストモグラフィー;VLDR =超低密度リポタンパク質受容体;OD =右目。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究では、小動物網膜イメージングシステムを用いたOCTイメージングを適用して、不完全な後硝子体剥離、網膜下新生血管形成、および網膜厚さの菲薄化を示す Vldlr ノックアウトマウスの網膜変化を評価しました。OCTは、 生体内の網膜の状態を調べるための非侵襲的なイメージング方法です。ほとんどのOCTデバイスは、人間の目の検査用に設計されています。ハードウェア機器のサイズ、焦点距離の設定、システムパラメータの設定、および受験者の位置決め要件はすべて人間の目に基づいています。人間専用のOCT機器で小動物を検査するには、レンズとシステム設定の変更が必要です。本稿では,小動物OCT検査手順について述べる.
焦点距離は、眼球のサイズが異なるさまざまな小動物の画像スキャン中に異なります。この焦点距離の違いは非常に重要であり、鮮明で正確な眼底画像を取得するには解決する必要があります。効果的な方法の1つは、対物レンズを異なる曲率のレンズに置き換えることです。眼球が小さいため、マウスはOCT機器の二重球面60Dプリセットレンズに加えて、角膜の前に100Dのコンタクトレンズを必要とします。
OCTは、網膜の限られた領域のみをカバーするラインスキャンのみを提供できます。したがって、異なるグループにおけるOCT所見の定性的および定量的比較のために、OCTスキャンのプロトコルを標準化することが不可欠です。ここでは、3つの水平スキャンと3つの垂直スキャンが実行されました。このマシンは、OCTスキャンの位置を監視するためのリアルタイムのcSLO画像を提供し、スキャンの位置を正確かつ便利に調整できるようにします。異常な反射が見つかった場合は、追加のスキャンを追加できます。
画像取得のパラメータは慎重に調整する必要があります。ここでは、範囲の最小値を0〜20、範囲の最大を50〜60にすることをお勧めします(図4I、J)。パラメータを過剰に調整すると、画像の信号コントラストが高まり、反射率の低い網膜の反射信号が低くなるか、さらには黒くなり、一部の形態学的情報が失われます。
以下は、画質の低下を回避するためのヒントです。 1.白内障を避けるために、麻酔直後にコンタクトレンズを目の前に置きます。2.プリセットレンズとコンタクトレンズが汚れていないことを確認します。3.角膜とコンタクトレンズの間に入る髪を避けます。4. OCTパラメータのドップラー、コントラスト、および明るさが適切に設定されていることを確認します。
OCT画像は、病変を定性的に検出し、網膜の厚さなどの指標を定量的に測定するために使用できます。ここでは、数箇所の網膜厚を測定する方法を提案し、その平均を平均網膜厚さとして算出することができる。これは、OCTシステムの自動層別化機能によって実現されます。したがって、網膜積層の厚さも測定することができる。測定方法は簡単で正確です(図6および図7)。結果は、文献25と一致して、VldlrノックアウトマウスでC57BL / 6Jマウスよりも網膜の厚さが低いことを示しました。2つのグループ間の網膜の厚さの違いは、複数の場所での測定から生成されたグラフによって明確に示すことができます(図11)。同様の網膜症解析および網膜厚さ測定法も、スターガルト病モデルマウス26において報告されている。しかしながら、網膜の硝子体界面における過反射バンドは網膜組織に属しておらず、層別化中に除去されるべきであることは注目に値する。さらに、網膜下病変が網膜に浸潤する場合、厚さ測定には浸潤部分を含める必要があります。
この小動物網膜イメージングシステムにはいくつかの制限があります。例えば、35°以内の後極の鮮明な画像を提供することはできますが、末梢網膜の画像取得は依然として困難です。さらに、cSLOはグレースケール画像を形成しますが、これは眼底病変(色素沈着、出血、滲出)を検出するためのカラー眼底画像ほど良くありません。したがって、さらなる改善が必要です。要約すると、cSLOマシンによるOCT検査は、マウスモデルにおける網膜症の非侵襲的検出と測定を容易にする可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、潜在的な利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
プロジェクトソース:広東省自然科学財団(2018A0303130306)。著者らは、眼科研究所、汕頭大学合同汕頭国際眼科センター、香港中文大学に資金と資料を提供してくれたことに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
- Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
- Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
- Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
- Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
- Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
- Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
- Huang, D., et al.
- Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
- Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
- Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
- Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
- Podoleanu, A. G.
- Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
- Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
- Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
- Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
- Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
- Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
- Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
- Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
- Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
- Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
- Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
- Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).
