Summary
Burada, farelerde retinopatinin tanısını ve kantitatif ölçümünü kolaylaştırmak için optik koherens tomografi kullanan bir in vivo görüntüleme tekniğini tanımladık.
Abstract
Optik koherens tomografi (OKT) retinopati tanısında noninvaziv bir yöntem sunmaktadır. OCT makinesi, retina kalınlığının hesaplanabileceği retinal kesitsel görüntüleri yakalayabilir. OCT klinik pratikte yaygın olarak kullanılmasına rağmen, temel araştırmalardaki uygulaması, özellikle fareler gibi küçük hayvanlarda yaygın değildir. Göz kürelerinin küçük boyutu nedeniyle, farelerde fundus görüntüleme incelemeleri yapmak zordur. Bu nedenle, küçük hayvanlarda OCT görüntülemeyi yerleştirmek için özel bir retinal görüntüleme sistemi gereklidir. Bu makalede, OCT muayene prosedürleri için küçük hayvanlara özgü bir sistem ve görüntü analizi için ayrıntılı bir yöntem gösterilmektedir. Çok düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Vldlr) nakavt fareleri ve C57BL/6J farelerin retinal OCT incelemesinin sonuçları sunulmuştur. C57BL / 6J farelerinin OCT görüntüleri retina tabakalarını gösterirken, Vldlr nakavt farelerininki subretinal neovaskülarizasyon ve retina incelmesi gösterdi. Özetle, OCT muayenesi fare modellerinde retinopatinin noninvaziv tespitini ve ölçümünü kolaylaştırabilir.
Introduction
Optik koherens tomografi (OKT), 1,2,3,4,5,6,7,8 dokusu için, özellikle retinadaki noninvaziv inceleme için in vivo yüksek çözünürlüklü ve kesitsel görüntüleme sağlayabilen bir görüntüleme tekniğidir 9,10,11,12 . Ayrıca retina kalınlığı ve retina sinir lifi tabakası kalınlığı gibi bazı önemli biyobelirteçleri ölçmek için de kullanılabilir. OCT'nin prensibi, bir numuneden yansıyan ışığın tutarlılığından kesitsel doku bilgisini elde eden ve bir bilgisayar sistemi aracılığıyla grafik veya dijital bir forma dönüştüren optik tutarlılık reflektometrisidir7. OKT, retina hastalıkları olan hastaların tanısı, takibi ve yönetimi için gerekli bir araç olarak oftalmoloji kliniklerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca retina hastalıklarının patogenezi hakkında fikir verebilir.
Klinik uygulamalara ek olarak, OCT hayvan çalışmalarında da kullanılmıştır. Patoloji morfolojik karakterizasyonun altın standardı olmasına rağmen, OKT noninvaziv in vivo görüntüleme ve uzunlamasına takip avantajına sahiptir. Ayrıca, OKT'nin retinopati hayvan modellerinde histopatoloji ile iyi ilişkili olduğu gösterilmiştir 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Fare, biyomedikal çalışmalarda en sık kullanılan hayvandır. Bununla birlikte, küçük göz küreleri farelerde OCT görüntüleme yapmak için teknik bir zorluk oluşturmaktadır.
İlk olarak farelerde retinal görüntüleme için kullanılan OCT21,22 ile karşılaştırıldığında, küçük hayvanlarda OCT artık donanım ve yazılım sistemlerine göre optimize edilmiştir. Örneğin, OCT, izleyici ile birlikte, sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde azaltır; OCT yazılım sistemi yükseltmeleri, daha fazla retina katmanının otomatik olarak algılanmasını sağlar; ve entegre DLP beamer, hareket artefaktlarını azaltmaya yardımcı olur.
Çok düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Vldlr), endotel hücrelerinde bulunan bir transmembran proteinidir. Retinal vasküler endotel hücreleri, retinal pigment epitel hücreleri ve dış sınırlayıcı membran23,24 çevresinde eksprese edilir. Subretinal neovaskülarizasyon, Vldlr nakavt fareleri23'ün fenotipidir. Bu nedenle, Vldlr nakavt fareleri, subretinal neovaskülarizasyonun patogenezini ve potansiyel tedavisini araştırmak için kullanılır. Bu makalede, küçük hayvan modellerinde retinopati araştırması için bazı teknik referanslar sağlamayı umarak, Vldlr nakavt farelerinde retinal lezyonları tespit etmek için OCT görüntülemenin uygulanması gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Operasyonlar, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin Oftalmik ve Görme araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildirisi'ni takiben gerçekleştirildi. Deneysel tasarım kurumsal hayvan etik komitesi (JSIEC, EC Tıbbi Etik Komitesi, EC 20171213(4)-P01) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada iki aylık C57BL/6J fareler ve Vldlr nakavt fareleri kullanılmıştır. Her grupta, hepsi dişi olan ve 20 g ila 24 g ağırlığında olan 7 fare vardı.
1. Deneysel koşullar
- Fareleri iki gruba atayın: Vldlr nakavt farelerinden oluşan bir deney grubu ve C57BL / 6J farelerden oluşan bir kontrol grubu.
- Fareleri geleneksel olarak yiyecek ve suyla besleyin.
- Fareleri hayvan laboratuvarında oda sıcaklığı (22 ° C), nem (% 50-60), açık-karanlık döngüsü (12 saat-12 saat) ve oda ışık yoğunluğu (350-400 lüks) gibi sabit koşullar altında yükseltin.
- Deney ekipmanını hazırlayın: küçük hayvanlar için konfokal taramalı lazer oftalmoskop (cSLO) ile optik koherens tomografi (Şekil 1A).
- Deney için gerekli tüm malzemeleri hazırlayın (Şekil 1B) ve fareleri tartın (Şekil 1C).
2. Bilgi kayıtları
- Bilgileri kaydedin: grup, kod, doğum tarihi, yaş, cinsiyet, kilo ve anestezik dozaj.
3. Cihaz başlatma ve test etme
- Bilgisayarı açın ve yazılımı başlatın.
- Test programını tamamlamak için Programı test et düğmesini tıklatın.
- Termostati açın ve 37 ° C sıcaklığa önceden ısıtın.
- Program testinden sonra OCT modülü yordamını başlatın.
- Yeni bir konu oluşturun ve fare bilgilerini doldurun.
- Elektrikli battaniyeyi önceden ısıtın ve cerrahi havlularla örtün.
4. Anestezi
- Anestezik karışımı hazırlamak için Tiletamine ve Zolazepam içeren liyofilize anestezik toz kullanın.
NOT: Anestezi uygulamasının seçimi, dozu ve yolu için yerel hayvan etik komitesinin tavsiyelerine uyun. Hayvanı en az 1 saat boyunca hareketsizlik ve ağrı algısı kaybı sağlayacak bir anestezi ile uyuşturun, ardından hayvan hızla iyileşir. Dozaj, deney süresinin uzunluğuna, hayvan ağırlığına ve diğer faktörlere dayanmalıdır. - Hazırlanan anestezik karışımı kullanarak hayvanı anestezi altına alın. İyileşene kadar tüm prosedür boyunca hayvanı sıcak tuttuğunuzdan emin olun.
5. Mydriatic damlaların uygulanması
- Fareyi tırmıkla manuel olarak sınırlandırın, göz küresinin hafifçe çıkıntı yapmasını sağlayın ve fare kafasını bir göz yukarı bakacak şekilde döndürün.
- Göz bebeklerini genişletmek için midriatik damlaları uygulayın (Şekil 2A).
- 10 dakika sonra öğrenci genişlemesini kontrol edin.
6. Farenin yerleştirilmesi
- Fareyi elektrikli battaniye platformunun üzerine yerleştirin.
- Her iki gözü de tıbbi sodyum hyaluronatis jeli ile kaplayın (Şekil 2B).
- cSLO cihazına 60 D çift küresel lens (önceden ayarlanmış lens) vidalayın (Şekil 1A-5, 6).
- Fare korneasına, içbükey tarafı kornea yüzeyindeki sodyum hyaluronatat jeline dokunacak şekilde 100 D'lik bir kontakt lens yerleştirin (Şekil 2C, D ve Şekil 3A-II).
- Fareyi küçük, sabit sıcaklıktaki hayvan platformuna yerleştirin ve gözü cSLO cihazının merceğinden 1-2 mm uzakta tutun (Şekil 3A).
- Göz bebeğini lensin merkezinde tutmak için forseps ile kontakt lensin açısını ayarlayın.
- Gözün düz bir şekilde öne bakmasını sağlamak için kafadaki ayarlamalara ince ayar yapın.
7. Konfokal Taramalı Lazer Oftalmoskop (cSLO)
- OCT düğmesine tıklayın, fare modülünü seçin ve cSLO programını başlatın (Şekil 4B).
- IR modunu seçin (ışık kaynağı: kırmızı ışık) ve parametreyi ayarlayın (aralık: 2047, Şekil 4D).
- İncelenecek gözü seçin (sağ göz: Şekil 4C-1; sol göz: Şekil 4C-2).
- Kolu kontrol edin ve önceden ayarlanmış lensi yavaşça kontakt lense doğru hareket ettirin.
- Arka kutup görüntüleme netleşene kadar diyoptri değerini ayarlayın (Şekil 4E).
- Retinal arka kutbun görüntüsünü hizalamak için optik sinir kafasına ortalayarak daha fazla ayarlama yapın.
8. Optik koherens tomografi (OKT)
- OCT programını başlatın (Şekil 4G).
- OCT görüntüsü görünene kadar ilerleme çubuğunu yukarı ve aşağı tıklatın (Şekil 4H).
- Parametreleri ayarlayın: Aralık Min (Şekil 4I) = 0-20, Aralık Maksimum (Şekil 4J) = 40-60.
- İdeal bir OCT görüntüsü elde edilene kadar önceden ayarlanmış lens mesafesini ve konum yönünü ayarlayın.
- cSLO'daki standart çizgiyi hareket ettirerek tarama konumunu seçin (Şekil 4M).
- Optik sinir kafasından taramaya başlayın.
- Görüntüleri her göz için aynı sırayla toplayın: yatay çizgi: optik sinir başı → üstün → aşağı; dikey çizgi: optik sinir başı → nazal → zamansal.
- Dört yönden görüntü toplayın.
- cSLO ve OCT görüntü sinyallerini kaplamak için Ortalama'yı tıklatın (Şekil 4F ve Şekil 4O).
- SLO-OCT görüntüsünü elde etmek için çekim düğmesini tıklatın (Şekil 4P).
- Tüm görüntüleri kaydedin ve dışa aktarın (Şekil 4Q, R).
9. Deneyin sonu (OCT muayenesinden sonra)
- Uyanana kadar sıcak tutmak için fareyi elektrikli battaniyenin üzerine yerleştirin.
NOT: Fare, sternal yatışmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar izlenmelidir. Postoperatif parlak ışığa maruz kalma en aza indirilmelidir. - 100 D kontakt lensi çıkarın.
- Korneayı korumak için levofloksasin göz jelini uygulayın.
- Uyandıktan sonra fareyi tekrar kafese yerleştirin.
NOT: İncelenen farenin tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirketine iade edilmediğinden emin olun. - Yazılımı kapatın ve bilgisayarı kapatın.
- 100 D kontakt lensi suyla temizleyin; lensi kurutun.
- Çevreyi temizleyin ve dezenfekte edin.
10. Görüntü analizi
- Vldlr nakavt farelerinin OCT görüntülerini C57BL/6J farelerinkilerle karşılaştırın.
- Birden fazla pozisyonu gözlemleyin: optik papilladan geçen dikey ve yatay taramalar; üstün, inferior, nazal ve temporal taramalar; ve anormal yansıma sitesi taramaları.
- Her görüntüde retinanın kalınlığını, şeklini, katmanlanmasını ve anormal yansıma lezyonlarını, ayrıca retinanın ve vitreus gövdesinin vitreus arayüzünü gözlemleyin.
- Lezyonların yerlerini, özelliklerini ve sayılarını kaydedin.
11. Retinal tabakalaşma düzeltmesi
- OCT arabiriminde Yük Muayenesi'ni tıklatın (Şekil 5A).
- Açılır pencereden farenin OCT görüntülerini çağırın.
- Görüntüleri seçin: Optik papilla boyunca yatay veya dikey olarak OCT görüntü taraması.
- Ekranda görüntülemek için Medya Kapsayıcısı'ndaki görüntüyü çift tıklatın (Şekil 5C).
- Retina üzerinde otomatik katmanlamayı tamamlamak için Katman Algılama'ya tıklayın (Şekil 5D).
- Analiz için hazırlanan katmanın her iki tarafındaki bölme çizgilerini seçin (Şekil 6D-10).
- Ayrı bir bölme çizgisi seçin (Şekil 6B-6) ve kırmızı bir daire göründüğünde çizgiyi etkinleştirmek için Katmanı Düzenle'yi (Şekil 6A-1) tıklatın (Şekil 6B-7).
- Aralığı (Şekil 6A-4, örneğin 50) ve Sınır Aralığını (Şekil 6A-5, örneğin 50) ayarlayın.
- Kırmızı daireyi hareket ettirerek bölme çizgisini değiştirin ( Şekil 6B ve Şekil 6C'deki yeşil bölme çizgisini karşılaştırın; Şekil 6C, değiştirilen sonucu göstermektedir).
12. Retinal laminasyon kalınlığı
- Ölçü İşaretçisi düğmesini tıklatın (Şekil 6D-9).
- OCT görüntüsünde katmanın sınırını görüntülemek için analiz edilecek katmanın bölme çizgisini seçin (örneğin, dış nükleer katmanda, listedeki 4. ve 5. bölme çizgisini seçin) (Şekil 6D-10).
- Katmanla bağlan (Şekil 6D-11) ve Hareket halindeyken bağlı kal (Şekil 6D-12) seçeneğini belirleyin.
- Sonuçların görüntüleneceği alanı seçin (seçilen sütun renklidir, Şekil 6D-13).
- Ölçüm çizgisinin görünmesini sağlamak için OCT görüntüsünde analiz edilecek konuma tıklayın (yatay eksene dik ve ortaya çıkan alanın rengiyle tutarlı) (Şekil 6D-14).
- Bir sonraki ölçüm için bir sonraki sütuna tıklayın ve önceki verileri ortaya çıkarın (Şekil 6E-15).
- μm (doku) cinsinden uzunluk satırındaki Vert değerini (ölçülen konumun kalınlığı) okuyun (Şekil 6E, kırmızı dikdörtgen).
- Sonuçların orijinal verileri kapsayacak şekilde (yeniden ölçüm gerekirse) yeniden test etmek için İşaretçiyi Sil (Şekil 6E-16) ve Yeni İşaretleyici'yi (Şekil 6E-17) tıklatın.
- Ekran görüntülerini kaydetmek için klavyede Print Scr tuşuna basın veya doğrudan kaydetmek için Sınavı Kaydet'i tıklatın (Şekil 5H).
- İstatistiksel analiz için verileri bir elektronik tabloya veya istatistiksel yazılıma girin.
13. Tam retina kalınlığının ölçülmesi
- Satır 1'i (ILM, iç sınırlayıcı membran, Şekil 7B) ve satır 7'yi (OS-RPE, OS: dış fotoreseptör segmentleri; RPE: retinal pigment epitel tabakası, Şekil 7C) sağ üst köşedeki listede.
NOT: Tam retina kalınlığı, OCT'de ILM ve OS-RPE arasındaki retina olan retinal nötrepitelyum tabakasının kalınlığı anlamına gelir). - Optik papillanın her iki tarafındaki retina kalınlığını belirli bir aralıkta ölçün.
- Örneğin: optik papillanın kenarındaki retinal yapının görünümünden, yatay cetvelin 200 μm aralığı ile 4 değer ölçün (Şekil 7G, H).
- Ölçülen tüm değerleri bir e-tabloya kaydedin.
- Her iki gruptaki her bir karşılık gelen pozisyonun ölçülen değerlerini karşılaştırmak için birden fazla t-testi (satır başına bir tane) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OCT'nin yüksek çözünürlüklü taramaları sayesinde, fare retinasının katmanları gözlemlenebilir ve anormal yansımalar ve bunların tam konumları belirlenebilir. Bu çalışmada Vldlr nakavt fareleri ve C57BL/6J farelerin retinal OCT görüntüleri karşılaştırıldı. Tüm C57BL/6J farelerinin OCT görüntüleri, farklı yansıtıcılığa sahip çeşitli retina tabakaları gösterdi ve sınır açıktı (Şekil 8D). Buna karşılık, tüm Vldlr nakavt fareleri, OCT görüntülerinde anormal, hiperreflektif lezyonlar gösterdi (Şekil 8B).
Vldlr nakavt farelerinde eksik vitreus dekolmanı (PVD)
OCT sonuçları, Vldlr nakavt farelerinin retinal yüzeylerinde bazı orta yansıtıcı bantlar göstermiştir (Şekil 8B, kırmızı oklar). Bu orta yansıtıcı bantlar, cSLO görüntüsüne karşılık gelen retinal damara yapışmıştır (Şekil 8B, yeşil ok). Bu özellikler, eksik vitreus dekolmanı OCT özellikleri ile tutarlıdır.
Vldlr nakavt farelerinde subretinal neovaskülarizasyon
Sonuçlar, subretinal neovaskülarizasyonun Vldlr nakavt farelerinde iki gelişim moduna sahip olduğunu gösterdi.
Dış nükleer tabakanın katılımı ile
OCT görüntüsünde aşağıdan aşağıya üçgen şeklinde hiperreflektif bir lezyon, subretinal boşlukta ortaya çıktı ve dış nükleer tabakaya yayıldı. Lezyon dış pleksiform tabakayı kırmadı (Şekil 8B, beyaz ok).
Bu tip subretinal neovaskülarizasyonun OCT görünümü Şekil 9A'da gösterilen patolojik bulgularla tutarlıydı. Patolojik kesitte neovaskülarizasyonun (Şekil 9A, kalın yeşil ok) RPE, fotoreseptör iç/dış segmentleri (IS/OS) ve eksternal sınırlayıcı membranı (ELM) kırdığı görüldü. Dış nükleer tabakayı (ONL) istila etti, ancak dış pleksiform tabakayı (OPL) kırmadı.
Dış nükleer tabakanın katılımı olmadan
OCT görüntüsünde subretinal boşlukta bulunan hiperreflektif lezyon bandı ortaya çıktı (Şekil 8B, sarı ok). cSLO görüntüsü ilgili konumu gösterdi (Şekil 8A, sarı ok). Bu yerin etrafındaki retinanın ek taramaları (Şekil 8A, sarı ok) aynı bulguları göstermiştir.
Patolojik kesitteki lezyonla (Şekil 10A, kalın mavi ok) uyumlu olarak, bu subretinal neovaskülarizasyon ELM'yi kırmadı (Şekil 10A, ince sarı ok) ancak kısmen fotoreseptör IS/OS'yi içeriyordu.
Retina kalınlığı sonuçları
Tüm farelerin sağ gözünün retinal kalınlığı, OCT'nin otomatik tabakalaşma ve kalınlık ölçüm fonksiyonu kullanılarak elde edildi. Vldlr nakavt farelerinin retinal kalınlığı (200.94 ± 14.64 μm), C57BL / 6J farelerinkinden (217.46 ± 10.21 μm, P < 0.001, t-testi, 7 sağ göz / grup) anlamlı derecede düşüktü. Retina kalınlığının iki grup arasında posterior poların dört yönünde (temporal, nazal, superior ve inferior) karşılaştırılması Şekil 11'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Deney materyallerinin ve hayvanların hazırlanması. (A) Ekipman: 1. Küçük hayvan retinal görüntüleme için cSLO/OCT cihazı, 2. bilgisayar ve monitör, 3. Küçük, sabit sıcaklıktaki hayvan platformu, 4. termostat, 5. önceden ayarlanmış lens, 6. önceden ayarlanmış lensin montajı. (B) İlaçlar ve küçük eşyalar: I. povidon-iyot, II. mikroşırınga, III. anestezik karışım çözeltisi, IV. zamanlayıcı, V. midriatik göz damlası, VI. forseps, VII. tıbbi sodyum hyaluronatat jel, VIII. tıbbi pamuklu çubuk, IX. antibiyotik göz merhemi, X. 100 D kontakt lens (iki). (C) Dijital terazide ağırlık ölçümü. Kısaltmalar: cSLO = konfokal taramalı lazer oftalmoskop; OCT = optik koherens tomografi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farelerin OCT muayenesinden önce hazırlık . (A) Mydriasis göz damlası uygulaması, (B) kornea üzerine sodyum hyaluronatis jel kaplama, (C, D) 100 D kontakt lensin yerleştirilmesi, içbükey yüzey korneaya temas edecek şekilde. Kısaltma: OCT = optik koherens tomografi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OCT muayene prosedürleri . (A) Fare pozisyonu yerleştirme, I. ön ayarlı lens, II. kontakt lens, III. Küçük, sabit sıcaklıktaki hayvan platformu. (B) cSLO/OCT makinesinin çalışması, IV. çalışma kolu, V. eğimli kol, VI. cSLO cihazı. Kısaltmalar: cSLO = konfokal taramalı lazer oftalmoskop; OCT = optik koherens tomografi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: OCT görüntüleme işlemi. Bir. Ölçüm modu, B. IR lazerin Laser'sini başlatın, C. göz seçimi (C-1-OD; C-2-OS), D. IR lazerin aralığı, E. diyoptri makinesi, F. cSLO görüntüsünün kaplaması, G. OCT tarama başlat/durdur lazer düğmesi H. OCT görüntüsünün referansı, I. Aralık Min: 0-20, J. Aralık Maksimum: 50-60, K. görüntünün sinyal yoğunluğu, L. tarama yönü (örneğin, dikey tarama), M. yeşil referans çizgisi hareket ettirilerek seçilen tarama konumu (örneğin, optik papilla üzerinden dikey tarama), N. OCT görüntüsünün gerçek zamanlı gösterimi, O. OCT görüntüsünün bindirmesi, P. Shot: görüntü yakalama, elde edilen Q. SLO-OCT görüntüleri, R. Save Exam: muayene sonucunu kaydetme. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: cSLO = konfokal taramalı lazer oftalmoskop; OCT = optik koherens tomografi; IR = kızılötesi; OD = sağ göz; OS = sol göz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: OCT sisteminde otomatik retinal delaminasyon arayüzü. A. Yük Muayenesi düğmesi, B. Tüm OCT görüntülerini gösteren Medya Kabı, analiz için seçilen C. OCT görüntüsü, D. Otomatik retinal tabakalama için Katman Algılama düğmesi, E. bölme çizgisi listesi, F. retinada otomatik delaminasyon, G. Katmanlı düzeltme için Katmanı Düzenle düğmesi, H. Sınavı Kaydet düğmesine basarak sonuçları kaydedin. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltma: OCT = optik koherens tomografi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Katmanlı düzeltme (A-C) ve kalınlık ölçümü (D-E). (A) Katmanlı düzenleme etkinleştirme arayüzü: 1. Katmanı Düzenle düğmesi, 2. satır listesini bölme (ör. tüm satırları seçme), 3. aktif bölme çizgileri, 4. Aralık ayarı, 5. Limit Aralığı ayarı. (B) Bir bölme çizgisinin etkinleştirilmesi (örneğin, A'daki satır 3), 6. satır 3, iç pleksiform tabaka ile iç nükleer tabaka arasındaki çizgi, 7. katmanlama hatasına bir örnek. (C) Katmanlama hatası değişikliği, 8. değişiklik için kırmızı daire. (D) Retinal lamel kalınlık ölçümüne bir örnek, 9. İşaretçi düğmesini ölçün, 10. dış nükleer tabakanın bölünme çizgileri, 11. Katmanla Bağlantı Kurun (ölçüm, bölme çizgilerine göre katmana bağlanacaktır), 12. Hareket Halindeyken Bağlı Kal (ölçüm konumu, manuel tıklamanın kaldığı yerdir), 13. sonuç göstergesinin konumu, 14. ölçüm çizgisi (yatay eksene dikey). (E) Ölçüm sonucu elde edilmesi, 15. ölçüm sonuçları (kırmızı dikdörtgen: Vert değeri kalınlık sonucudur), 16. Ölçüm kaydı silme için İşaretçi Sil düğmesi, 17. Yeniden ölçüm için yeni Marker düğmesi (yeni sonuç orijinal kaydın üzerine yazılır). Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Tam retina kalınlığının ölçümü. A. Tam kalınlıktaki retinanın sınırlarını göstermek için Ölçüm İşaretleyici düğmesi, B. satır 1 (ILM) ve C. satır 7 (OS-RPE) seçimi, D. Katmanla bağlan seçimi, E. Hareket Halinde Bağlı Kal seçimi, F. cetvel çubuğu (dikey ve yatay cetvel çubukları, her ikisi de 200 μm uzunluğunda), G. retina üzerindeki ölçüm çizgileri (her iki tarafında boşluk olarak 200 μm yatay cetvel uzunluğuna sahip 4 satır) optik papilla), H. ölçüm sonuçları (sonuçlar farklı renklerle ayırt edilir ve retinadaki ölçüm çizgilerinin rengine karşılık gelir), I. μm (doku) satırındaki Uzunluktaki Vert değerinden veri çıkarma. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: ILM = iç sınırlayıcı membran; OS-RPE = retinal pigment epitelinin fotoreseptör dış segmenti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Vldlr nakavt ve C57BL/6J farelerinin cSLO ve OCT görüntülerinin karşılaştırılması. Vldlr nakavt farelerinin cSLO (A) ve OCT (B) görüntüleri, C57BL/6J farelerin cSLO (C) ve OCT (D) görüntüleriyle karşılaştırılmıştır. Vldlr nakavt farelerinde OCT'nin özellikleri (B): 1) Retina damarına yapışmasıyla retinanın iç yüzeyinde orta yansıtıcı çizgi (B, kırmızı oklar) (B, yeşil ok). 2) Subretinal boşlukta yerleşimli, (B, beyaz ok) veya (B, sarı ok) dış nükleer tabaka tutulumu olmayan hiperreflektif lezyonlar. cSLO görüntüsündeki (A) oklar, OCT görüntüsündeki (B) karşılık gelen renk oklarının konumlarını temsil eder. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: cSLO = konfokal taramalı lazer oftalmoskop; OCT = optik koherens tomografi; Vldlr = çok düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 9: Mod 1: Vldlr nakavt ve C57BL/6J farede hematoksilin-eozin boyaması olan retinal parafin kesitleri. (A) Bir Vldlr nakavt faresinin retinasının orta kısmında bulunan dış nükleer tabakayı (kalın yeşil ok) istila eden subretinal neovaskülarizasyon örneği. (B) Normal kontrol, C57BL/6J farenin retinasının orta kısmı. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: Vldlr = çok düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü; ILM = iç sınırlayıcı membran; NFL = retinal sinir lifi tabakası; GCL = retinal ganglion hücre tabakası; IPL = iç pleksiform tabaka; INL = iç nükleer tabaka; OPL = dış pleksiform tabaka; ONL = dış nükleer tabaka; ELM = dış sınırlayıcı membran; IS = fotoreseptör iç segmenti; OS = fotoreseptör dış segmenti; RPE = retinal pigment epitel tabakası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Mod 2: Vldlr nakavt ve C57BL/6J farede hematoksilin-eozin boyaması olan retinal parafin kesitleri. (A) Bir Vldlr nakavt faresinde orta çevre retinada bulunan dış nükleer tabaka (kalın mavi ok) ve sağlam ELM (ince sarı ok) tutulumu olmadan subretinal neovaskülarizasyon örneği. (B) Normal kontrol, bir C57BL/6J farenin orta çevre retinası. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: VLDR = çok düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü; ILM = iç sınırlayıcı membran; NFL = retinal sinir lifi tabakası; GCL = retinal ganglion hücre tabakası; IPL = iç pleksiform tabaka; INL = iç nükleer tabaka; OPL = dış pleksiform tabaka; ONL = dış nükleer tabaka; ELM = dış sınırlayıcı membran; IS = fotoreseptör iç segmenti; OS = dış fotoreseptör segmenti; RPE = retinal pigment epitel tabakası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: C57BL/6J fareler ile Vldlr nakavt fareleri arasındaki retina kalınlığının karşılaştırılması (tüm veriler sağ gözden alınmıştır ). (A) OCT yatay taraması ile optik sinir papillasından retina kalınlığı (μm). (B) OCT dikey taraması ile optik sinir papillasından retina kalınlığı (μm). Yatay koordinat, 200 μm aralığındaki ölçüm konumlarını temsil eder.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Kısaltmalar: T = Zamansal; P = Optik papilla; N = Nasal; S = Üstün; I = Aşağı; OCT = optik koherens tomografi; VLDR = çok düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü; OD = sağ göz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, Vldlr nakavt farelerinde eksik posterior vitreus dekolmanı, subretinal neovaskülarizasyon ve retina kalınlığında incelme gösteren retinal değişiklikleri değerlendirmek için küçük hayvan retinal görüntüleme sistemi kullanılarak OCT görüntüleme uygulanmıştır. OKT, retinanın durumunu in vivo olarak incelemek için kullanılan noninvaziv bir görüntüleme yöntemidir. Çoğu OCT cihazı insan gözü muayenesi için tasarlanmıştır. Donanım ekipmanının boyutu, odak uzaklığının ayarı, sistem parametrelerinin ayarlanması ve sınava giren kişinin konumlandırma gereksinimlerinin tümü insan gözüne dayanmaktadır. İnsana özgü OCT ekipmanı olan küçük hayvanları incelemek için lens ve sistem ayarlarının modifikasyonları gereklidir. Bu yazıda küçük hayvan OCT muayene prosedürleri sunulmaktadır.
Odak uzaklığı, farklı boyutlarda göz kürelerine sahip farklı küçük hayvanların görüntü taraması sırasında farklıdır. Odak uzaklığındaki bu fark kritiktir ve net ve doğru fundus görüntüleri elde etmek için çözülmesi gerekir. Etkili bir yöntem, objektif lensi farklı eğriliklere sahip lenslerle değiştirmektir. Küçük göz küresi nedeniyle, farenin OCT ekipmanının çift küresel 60 D ön ayarlı lensine ek olarak korneanın önünde 100 D'lik bir kontakt lense ihtiyacı vardır.
OCT yalnızca retinanın yalnızca sınırlı bir bölgesini kapsayan çizgi taramaları sağlayabilir. Bu nedenle, farklı gruplardaki OCT bulgularının kalitatif ve kantitatif karşılaştırması için OCT taramalarının protokolünün standartlaştırılması esastır. Burada üç yatay tarama ve üç dikey tarama gerçekleştirilmiştir. Bu makine, OCT taramasının konumunu izlemek için gerçek zamanlı bir cSLO görüntüsü sağlar, böylece taramanın konumu doğru ve rahat bir şekilde ayarlanabilir. Anormal bir yansıma bulunduğunda ek taramalar eklenebilir.
Görüntü alma parametrelerinin dikkatli bir şekilde ayarlanması gerekir. Burada, Aralık Min'in 0-20 ve Aralık Maks.'ın 50-60 olması önerilir (Şekil 4I, J). Parametreler aşırı ayarlandığında, görüntünün sinyal kontrastı artar ve retinanın düşük yansımalı yansıyan sinyali daha düşük veya hatta siyah olur ve bazı morfolojik bilgiler kaybolur.
Aşağıdakiler, görüntü kalitesinin bozulmasını önlemek için bazı ipuçlarıdır: 1. Katarakttan kaçınmak için anesteziden hemen sonra gözlerin önüne bir kontakt lens yerleştirin; 2. Önceden ayarlanmış lensin ve kontakt lensin temiz olduğundan emin olun; 3. Kornea ve kontakt lens arasına saç girmesini önleyin; 4. OCT parametrelerindeki doppler, kontrast ve parlaklığın uygun şekilde ayarlandığından emin olun.
OCT görüntüleri, lezyonları kalitatif olarak tespit etmek ve retina kalınlığı gibi metrikleri kantitatif olarak ölçmek için kullanılabilir. Burada, retina kalınlığını çeşitli yerlerde ölçmek için bir yöntem önerilmektedir ve ortalama, ortalama retina kalınlığı olarak hesaplanabilir. Bu, OCT sisteminin otomatik tabakalaşma fonksiyonu ile elde edilir. Bu nedenle, retinal laminasyonların kalınlığı da ölçülebilir. Ölçüm yöntemi basit ve doğrudur (Şekil 6 ve Şekil 7). Sonuçlar, retina kalınlığının Vldlr nakavt farelerinde C57BL / 6J farelerden daha düşük olduğunu ve literatür25 ile tutarlı olduğunu göstermiştir. İki grup arasındaki retina kalınlığı farkı, birden fazla lokasyondaki ölçümlerden elde edilen bir grafikle açıkça görülebilir (Şekil 11). Benzer retinopati analizi ve retina kalınlığı ölçüm yöntemleri Stargardt hastalığı fare model26'da da bildirilmiştir. Bununla birlikte, retinanın vitreus arayüzündeki hiperreflektif bantların retina dokusuna ait olmadığını ve tabakalaşma sırasında çıkarılması gerektiğini belirtmek gerekir. Ayrıca retina altı lezyonlar retinayı invaze ediyorsa kalınlık ölçümü invaze edilen kısmı da içermelidir.
Bu küçük hayvan retinal görüntüleme sisteminin bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, arka kutbun 35 ° 'de net görüntülerini sağlayabilmesine rağmen, periferik retinanın görüntü alımı hala zordur. Ek olarak, cSLO, fundus lezyonlarını (pigmentasyon, kanama, eksüdasyon) tespit etmek için renkli bir fundus görüntüsü kadar iyi olmayan gri tonlamalı bir görüntü oluşturur. Bu nedenle, daha fazla iyileştirmeye ihtiyaç vardır. Özetle, cSLO makinesi tarafından OCT muayenesi, fare modellerinde retinopatinin noninvaziv tespitini ve ölçümünü kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Proje Kaynağı: Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2018A0303130306). Yazarlar, finansman ve materyaller için Oftalmik Araştırma Laboratuvarı, Shantou Üniversitesi Ortak Shantou Uluslararası Göz Merkezi ve Hong Kong Çin Üniversitesi'ne teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
- Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
- Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
- Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
- Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
- Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
- Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
- Huang, D., et al.
- Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
- Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
- Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
- Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
- Podoleanu, A. G.
- Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
- Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
- Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
- Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
- Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
- Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
- Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
- Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
- Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
- Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
- Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
- Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).
