Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Anvendelse av optisk koherenstomografi til en musemodell av retinopati

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63421
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Joint Shantou International Eye Center, Shantou University and the Chinese University of Hong Kong, 2Shantou University Medical College, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, the Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en in vivo avbildningsteknikk ved hjelp av optisk koherenstomografi for å lette diagnosen og kvantitativ måling av retinopati hos mus.

Abstract

Optisk koherenstomografi (OCT) tilbyr en ikke-invasiv metode for diagnostisering av retinopati. OCT-maskinen kan fange retinale tverrsnittsbilder som retinaltykkelsen kan beregnes fra. Selv om OCT er mye brukt i klinisk praksis, er anvendelsen i grunnforskning ikke så utbredt, spesielt hos små dyr som mus. På grunn av den lille størrelsen på øyeeplene deres, er det utfordrende å gjennomføre fundus-bildeundersøkelser hos mus. Derfor er det nødvendig med et spesialisert retinalbildesystem for å imøtekomme OCT-avbildning på små dyr. Denne artikkelen demonstrerer et smådyrspesifikt system for OCT-undersøkelsesprosedyrer og en detaljert metode for bildeanalyse. Resultatene av retinal OCT-undersøkelse av svært lav tetthet lipoproteinreseptor (Vldlr) knockoutmus og C57BL / 6J-mus presenteres. OCT-bildene av C57BL / 6J-mus viste retinale lag, mens de av Vldlr knockoutmus viste subretinal neovaskularisering og retinal tynning. Oppsummert kan OCT-undersøkelse lette ikke-invasiv deteksjon og måling av retinopati i musemodeller.

Introduction

Optisk koherenstomografi (OCT) er en avbildningsteknikk som in vivo kan gi in vivo høyoppløselig og tverrsnittsavbildning for vev 1,2,3,4,5,6,7,8, spesielt for ikke-invasiv undersøkelse i netthinnen 9,10,11,12 . Det kan også brukes til å kvantifisere noen viktige biomarkører, for eksempel retinal tykkelse og retinal nerve fiber lag tykkelse. Prinsippet for OCT er optisk koherensreflektometri, som oppnår tverrsnittsvevsinformasjon fra sammenhengen mellom lys reflektert fra en prøve og konverterer den til en grafisk eller digital form gjennom et datasystem7. OCT er mye brukt i oftalmologiklinikker som et viktig verktøy for diagnose, oppfølging og behandling for pasienter med retinale lidelser. Det kan også gi innsikt i patogenesen av retinale sykdommer.

I tillegg til kliniske anvendelser har OCT også blitt brukt i dyreforsøk. Selv om patologi er gullstandarden for morfologisk karakterisering, har OCT fordelen av ikke-invasiv in vivo avbildning og langsgående oppfølging. Videre har det vist seg at OCT er godt korrelert med histopatologi i retinopati dyremodeller 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Musen er det mest brukte dyret i biomedisinske studier. Imidlertid utgjør de små øyebollene en teknisk utfordring for å utføre OCT-avbildning hos mus.

Sammenlignet med OCT som først ble brukt til retinal avbildning hos mus21,22, har OCT hos små dyr nå blitt optimalisert med hensyn til maskinvare- og programvaresystemer. For eksempel reduserer OCT, i kombinasjon med trackeren, signal-til-støy-forholdet betydelig; OCT-programvaresystemoppgraderinger gjør at flere retinale lag kan oppdages automatisk; og den integrerte DLP-beameren bidrar til å redusere bevegelsesartefaktene.

Lipoproteinreseptor med svært lav tetthet (Vldlr) er et transmembranprotein i endotelceller. Det uttrykkes på retinale vaskulære endotelceller, retinale pigmentepitelceller og rundt den ytre begrensende membranen23,24. Subretinal neovaskularisering er fenotypen til Vldlr knockoutmus23. Derfor brukes Vldlr knockoutmus til å undersøke patogenesen og potensiell terapi av subretinal neovaskularisering. Denne artikkelen demonstrerer anvendelsen av OCT-avbildning for å oppdage retinale lesjoner i Vldlr knockoutmus, i håp om å gi noen teknisk referanse for retinopatiforskning i smådyrmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Operasjonene ble utført etter erklæringen om bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning fra Association for Research in Vision and Ophthalmology. Det eksperimentelle designet ble godkjent av institutional animal Ethics Committee (Medical Ethics Committee of JSIEC, EC 20171213(4)-P01). To måneder gamle C57BL/6J-mus og Vldlr knockoutmus ble brukt i denne studien. Det var 7 mus i hver gruppe, som alle var kvinner og veide 20 g til 24 g.

1. Eksperimentelle forhold

  1. Tilordne musene til to grupper: en eksperimentell gruppe bestående av Vldlr knockoutmus og en kontrollgruppe bestående av C57BL/6J-mus.
  2. Fôr musene med mat og vann konvensjonelt.
  3. Løft musene i dyrelaboratoriet under stabile forhold med romtemperatur (22 °C), fuktighet (50-60%), lys-mørk syklus (12 t-12 timer) og romlysintensitet (350-400 lux).
  4. Klargjør forsøksutstyret: optisk koherenstomografi med konfokal skanning laser oftalmoskop (cSLO) for små dyr (figur 1A).
  5. Forbered alle materialer som kreves for eksperimentet (figur 1B) og vei musene (figur 1C).

2. Opplysninger

  1. Registrer informasjonen: gruppe, kode, fødselsdato, alder, kjønn, vekt og bedøvelsesdosering.

3. Oppstart og testing av instrumenter

  1. Slå på datamaskinen og start opp programvaren.
  2. Klikk på Test program-knappen for å fullføre testprogrammet.
  3. Slå på termostaten og forvarm den til temperaturen på 37 °C.
  4. Start OCT-modulprosedyren etter programtestingen.
  5. Opprett et nytt emne og fyll ut museinformasjonen.
  6. Forvarm det elektriske teppet og dekk det med kirurgiske håndklær.

4. Anestesi

  1. Bruk lyofilisert bedøvelsespulver som inneholder tiletamin og zolazepam for å fremstille bedøvelsesblandingen.
    MERK: Følg lokale anbefalinger fra dyreetiske komiteer for valg, dosering og administrasjonsvei for anestesi. Anestesere dyret med en bedøvelse som vil gi immobilitet og tap av smerteoppfattelse i minst 1 time, hvoretter dyret gjenoppretter raskt. Dosering bør baseres på lengden på forsøkstiden, dyrevekt og andre faktorer.
  2. Bedøv dyret ved hjelp av den tilberedte bedøvelsesblandingen. Sørg for å holde dyret varmt under hele prosedyren til utvinning.

5. Påføring av mydriatiske dråper

  1. Oppnå manuell tilbakeholdenhet av musen ved scruff, få øyebollet til å stikke litt ut, og roter musehodet med ett øye vendt oppover.
  2. Påfør de mydriatiske dråpene for å utvide pupillene (figur 2A).
  3. Se etter elevutvidelse etter 10 min.

6. Plassering av musen

  1. Plasser en mus på en elektrisk teppeplattform.
  2. Belegg begge øynene med medisinsk natriumhyaluronatgel (figur 2B).
  3. Skru en 60 D dobbel sfærisk linse (forhåndsinnstilt linse) på cSLO-enheten (Figur 1A-5, 6).
  4. Plasser en 100 D kontaktlinse på musens hornhinne med den konkave siden som berører natriumhyaluronatgelen på hornhinnens overflate (figur 2C, D og figur 3A-II).
  5. Plasser musen på den lille dyreplattformen med konstant temperatur og hold øyet 1–2 mm unna objektivet på cSLO-enheten (figur 3A).
  6. Juster vinkelen på kontaktlinsen med tang for å holde eleven i midten av linsen.
  7. Finjuster justeringene på hodet for å få øyet til å vende rett frem.

7. Konfokal skanning laser oftalmoskop (cSLO)

  1. Klikk på OCT-knappen , velg musemodulen og start cSLO-programmet (figur 4B).
  2. Velg IR-modus (lyskilde: rødt lys), og juster parameteren (område: 2047, figur 4D).
  3. Velg øyet som skal undersøkes (høyre øye: Figur 4C-1; venstre øye: Figur 4C-2).
  4. Kontroller spaken og beveg den forhåndsinnstilte linsen sakte mot kontaktlinsen.
  5. Juster diopterverdien til den bakre polavbildningen er klar (figur 4E).
  6. Gjør ytterligere justeringer for å justere bildet av retinal bakre pol, sentrere den ved optisk nervehode.

8. Optisk koherenstomografi (OCT)

  1. Start OCT-programmet (figur 4G).
  2. Klikk på fremdriftslinjen opp og ned til OCT-bildet vises (figur 4H).
  3. Juster parametere: Rekkevidde min (Figur 4I) = 0-20, Maks rekkevidde (Figur 4J) = 40-60.
  4. Juster den forhåndsinnstilte objektivavstanden og posisjonsretningen til et ideelt OCT-bilde er oppnådd.
  5. Velg skanneposisjon ved å flytte standardlinjen i cSLO (figur 4M).
  6. Begynn å skanne fra optisk nervehodet.
  7. Samle bilder i samme rekkefølge for hvert øye: horisontal linje: optisk nervehode → overlegen → dårligere; vertikal linje: optisk nervehode → nasal → temporal.
  8. Samle bilder fra fire retninger.
  9. Klikk på Gjennomsnitt for å overlappe cSLO- og OCT-bildesignalene (figur 4F og figur 4O).
  10. Klikk på bildeknappen for å ta bildet SLO-OCT (figur 4P).
  11. Lagre og eksporter alle bildene (figur 4Q, R).

9. Slutten av eksperimentet (etter OCT-undersøkelsen)

  1. Plasser musen på det elektriske teppet for å holde det varmt til det våkner.
    MERK: Musen bør overvåkes til den gjenvinner tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Postoperativ eksponering for sterkt lys bør minimeres.
  2. Fjern 100 D kontaktlinsen.
  3. Påfør levofloxacin øyegel for å beskytte hornhinnen.
  4. Plasser musen tilbake i buret etter at den våkner.
    MERK: Forsikre deg om at den undersøkte musen ikke returneres til selskap med andre mus før den er fullstendig gjenopprettet.
  5. Slå av programvaren og slå av datamaskinen.
  6. Rengjør 100 D kontaktlinsen med vann; tørk linsen.
  7. Rengjør og desinfiser miljøet.

10. Bildeanalyse

  1. Sammenlign OCT-bildene av Vldlr knockoutmus med bildene til C57BL/6J-mus.
  2. Vær oppmerksom på flere posisjoner: vertikale og horisontale skanninger som passerer gjennom optisk papilla; overlegne, dårligere, nasal og tidsmessige skanninger; og unormale skanninger av refleksjonsstedet.
  3. Vær oppmerksom på tykkelsen, formen, lagdelingen og unormale refleksjonslesjonene i netthinnen i hvert bilde, samt glasslegemet til netthinnen og glasslegemet.
  4. Registrer stedene, egenskapene og antall lesjoner.

11. Retinal stratifisering korreksjon

  1. Klikk på Last inn undersøkelse i OCT-grensesnittet (figur 5A).
  2. Fremhev OCT-bildene av en mus fra et popup-vindu.
  3. Velg bilder: OCT-bildeskanning gjennom optisk papilla, horisontalt eller vertikalt.
  4. Dobbeltklikk på bildet i mediebeholderen for å vise det på skjermen (figur 5C).
  5. Klikk på Layer Detection for å fullføre automatisk lagdeling på netthinnen (figur 5D).
  6. Velg skillelinjene på begge sider av laget som er klargjort for analyse (Figur 6D-10).
  7. Velg en egen skillelinje (figur 6B-6) og klikk på Rediger lag (figur 6A-1) for å aktivere linjen når en rød sirkel vises (figur 6B-7).
  8. Juster avstanden (figur 6A-4, f.eks. 50) og grenseområdet (figur 6A-5, f.eks. 50).
  9. Endre skillelinjen ved å flytte den røde sirkelen (sammenlign den grønne skillelinjen i figur 6B og figur 6C; Figur 6C viser det modifiserte resultatet).

12. Retinal laminering tykkelse

  1. Klikk på Målmarkør-knappen (figur 6D-9).
  2. Velg delelinjen til laget som skal analyseres (f.eks. i det ytre kjernefysiske laget,velg 4. og 5. skillelinje i listen) for å vise grensen til laget på OCT-bildet (figur 6D-10).
  3. Velg Koble til lag (figur 6D-11) og forbli tilkoblet når du er på farten (figur 6D-12).
  4. Velg området for å vise resultatene (den valgte kolonnen er farget, figur 6D-13).
  5. Klikk på posisjonen som skal analyseres på OCT-bildet for å få målelinjen til å vises (vinkelrett på den horisontale aksen og i samsvar med fargen på det resulterende området) (figur 6D-14).
  6. Klikk på neste kolonne for neste måling og avslør tidligere data (figur 6E-15).
  7. Les av Vert-verdien (tykkelsen på den målte posisjonen) i raden Lengde i μm (vev) (figur 6E, rødt rektangel).
  8. Klikk på Slett markør (figur 6E-16) og Ny markør (figur 6E-17) for å teste på nytt slik at resultatene dekker de opprinnelige dataene (hvis ny måling er nødvendig).
  9. Trykk på Print Scr på tastaturet for å lagre skjermbilder, eller klikk på Lagre undersøkelse for å lagre direkte (figur 5H).
  10. Skriv inn dataene i et regneark eller statistisk programvare for statistisk analyse.

13. Måling av full retinal tykkelse

  1. Velg linje 1 (ILM, indre begrensende membran, figur 7B) og linje 7 (OS-RPE, OS: ytre fotoreseptorsegmenter; RPE: retinal pigmentepitellag, figur 7C) i listen øverst til høyre.
    MERK: Den fulle retinale tykkelsen betyr tykkelsen på retinal neurepitellaget, som er netthinnen mellom ILM og OS-RPE på OCT).
  2. Mål retinaltykkelsen på begge sider av optisk papilla med et bestemt intervall.
    1. For eksempel: Fra utseendet på retinalstrukturen ved kanten av optisk papilla, måler du 4 verdier med 200 μm avstand mellom den horisontale linjalen (figur 7G, H).
  3. Registrer alle målte verdier i et regneark.
  4. Bruk flere t-tester (én per rad) til å sammenligne de målte verdiene for hver tilsvarende plassering i begge gruppene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Takket være de høyoppløselige skanningene av OCT, kan lagene i musens netthinne observeres, og unormale refleksjoner og deres nøyaktige plasseringer kan identifiseres. Retinal OCT-bildene av Vldlr knockoutmus og C57BL / 6J-mus ble sammenlignet i denne studien. OCT-bildene av alle C57BL/6J-mus viste ulike netthinnelag med ulik reflektivitet, og avgrensningen var tydelig (figur 8D). Derimot viste alle Vldlr knockoutmus unormale, hyperreflekterende lesjoner på OCT-bildene (figur 8B).

Ufullstendig glasslegeme (PVD) i Vldlr knockoutmus

OCT-resultatene viste noen midtre reflekterende bånd på retinaloverflatene til Vldlr knockoutmus (figur 8B, røde piler). Disse midtre reflekterende båndene festet seg til retinalbeholderen (figur 8B, grønn pil), tilsvarende cSLO-bildet (figur 8A, grønn pil). Disse funksjonene er i samsvar med OCT-egenskapene til ufullstendig glasslegemeløsning.

Subretinal neovaskularisering hos Vldlr knockoutmus

Resultatene viste at subretinal neovaskularisering hadde to utviklingsmoduser i Vldlr knockoutmusene.

Med involvering av det ytre atomlaget

En hyperreflekterende lesjon, med en nedenfra og ned trekantet form på OCT-bildet, dukket opp på subretinalrommet og spredte seg til det ytre atomlaget. Lesjonen brøt ikke gjennom det ytre pleksiforme laget (figur 8B, hvit pil).

OCT-forekomsten av denne typen subretinal neovaskularisering var i samsvar med de patologiske funnene vist i figur 9A. Den patologiske delen viste at neovaskularisering (figur 9A, tykk grønn pil) brøt gjennom RPE, fotoreseptor indre/ytre segmenter (IS/OS) og ytre begrensende membran (ELM). Det invaderte det ytre kjernefysiske laget (ONL), men brøt ikke gjennom det ytre pleksiforme laget (OPL).

Uten involvering av det ytre atomlaget

Et bånd av hyperreflekterende lesjon dukket opp på OCT-bildet, som var lokalisert i subretinalrommet (figur 8B, gul pil). CSLO-bildet viste tilsvarende plassering (figur 8A, gul pil). De ekstra skanningene av netthinnen rundt dette stedet (figur 8A, gul pil) viste de samme funnene.

I samsvar med lesjonen (figur 10A, tykk blå pil) i den patologiske delen, brøt ikke denne subretinale neovaskulariseringen gjennom ELM (figur 10A, tynn gul pil), men involverte delvis fotoreseptoren IS / OS.

Retinal tykkelse resultater

Retinaltykkelsen på høyre øye av alle mus ble oppnådd ved å bruke den automatiske stratifiserings- og tykkelsesmålingsfunksjonen til OCT. Retinaltykkelsen til Vldlr knockoutmus (200,94 ± 14,64 μm) var signifikant lavere enn for C57BL/6J-mus (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, t-test, 7 høyre øyne / gruppe). Sammenligningen av retinal tykkelse i de fire retningene (temporal, nasal, superior og inferior) av den bakre polaren mellom de to gruppene er vist i figur 11.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av eksperimentelle materialer og dyr. (A) Utstyr: 1. cSLO / OCT-enhet for netthinneavbildning av små dyr, 2. datamaskin og skjerm, 3. Liten dyreplattform med konstant temperatur, 4. termostat, 5. forhåndsinnstilt linse, 6. installasjon av det forhåndsinnstilte objektivet. (B) Legemidler og småting: I. povidon-jod, II. mikrosprøyte, III. bedøvelsesblandingsløsning, IV. timer, V. mydriatiske øyedråper, VI. tang, VII. medisinsk natriumhyaluronat gel, VIII. medisinsk bomullspinne, IX. antibiotisk øyesalve, X. 100 D kontaktlinse (to). (C) Vektmåling på en digital balanse. Forkortelser: cSLO = konfokal skanning laser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse før OCT-undersøkelse av mus . (A) Påføring av Mydriasis øyedråpe, (B) natriumhyaluronatgelbelegg på hornhinnen, (C, D) plassering av en 100 D kontaktlinse, med konkav overflate i kontakt med hornhinnen. Forkortelse: OCT = optisk koherenstomografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: OCT undersøkelsesprosedyrer . (A) Plassering av museposisjon, I. forhåndsinnstilt linse, II. kontaktlinse, III. Liten dyreplattform med konstant temperatur. (B) Betjening av cSLO/OCT-maskinen, IV. betjeningsspak, V. vippespak, VI. cSLO-enhet. Forkortelser: cSLO = konfokal skanning laser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: OCT-bildebehandlingsprosess. A. Målemodus , B. Start Laser av IR-laseren, C. øyevalg (C-1-OD; C-2-OS), D. utvalg av IR-laser, E. diopteren, F. overlegg av cSLO-bildet, G. OCT-skanning start/stopp laserknapp H. referanse til OCT-bilde, I. Område Min: 0-20, J. Område Maks: 50-60, K. signalintensitet på bildet, L. skanneretning (f.eks. vertikal skanning), M. skanneposisjon valgt ved å flytte den grønne referanselinjen (f.eks. vertikal skanning gjennom optisk papilla), N. sanntidsvisning av OCT-bildet, O. overlegg av OCT-bildet, P. Shot: bildeoppkjøp, Q. SLO-OCT-bilder som er anskaffet, R. Lagre Eksamen: lagring av eksamensresultatet. Skala barer = 200 μm. Forkortelser: cSLO = konfokal skanning laser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi; IR = infrarød; OD = høyre øye; OS = venstre øye. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Automatisk netthinnedelamineringsgrensesnitt på OCT-systemet. A. Load Examination-knappen , B. Media Container, som viser alle OCT-bildene, C. OCT-bildet som velges for analyse, D. Layer Detection-knappen for automatisk retinal layering, E. delelinjeliste, F. automatisk delaminering på netthinnen, G. Rediger lag-knappen for lagdelt korreksjon, H. Lagre eksamen -knappen for å lagre resultatene. Skala barer = 200 μm. Forkortelse: OCT = optisk koherenstomografi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Lagvis korreksjon (A-C) og tykkelsesmåling (D-E). (A) Lagdelt redigeringsaktiveringsgrensesnitt: 1. Rediger lag-knappen, 2. delelinjeliste (f.eks. velge alle linjer), 3. aktiverte skillelinjer, 4. Justering av avstand, 5. Justering av begrens rekkevidde. (B) Aktivering av en skillelinje (f.eks. linje 3 i A), 6. linje 3, linjen mellom det indre pleksiforme laget og det indre kjernelaget, 7. et eksempel på lagdelingsfeil. (C) Endring av lagdelingsfeil, 8. den røde sirkelen for endring. (D) Et eksempel på måling av retinal lamellær tykkelse, 9. Målemarkør-knappen, 10. skillelinjer i det ytre atomlaget, 11. Koble til lag (målingen vil koble til laget i henhold til skillelinjene), 12. Hold kontakten på Move (måleposisjonen er der det manuelle klikket forblir), 13. plasseringen av resultatvisningen, 14. målelinjen (vinkelrett på den horisontale aksen). (E) Oppkjøp av måleresultat, 15. måleresultatene (rødt rektangel: Vert-verdi er tykkelsesresultatet), 16. Slett markørknapp for sletting av målejournal, 17. Ny Marker-knapp for remeasurement (det nye resultatet vil overskrive den opprinnelige posten). Skala barer = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Måling av full retinal tykkelse. A. Målemarkørknapp, B. linje 1 (ILM) og C. linje 7 (OS-RPE) for å vise grensene for netthinnen i full tykkelse, D. Koble til lagvalg, E. Hold kontakten ved flytting, F. linjalstang (vertikale og horisontale linjalstenger, begge 200 μm lange), G. målelinjer på netthinnen (4 linjer med 200 μm horisontal linjallengde som avstand på hver side av den optiske papillen), H. måleresultatene (resultatene er differensiert av forskjellige farger og tilsvarer fargen på målelinjene på netthinnen), I. Datautvinning fra Vert-verdien i raden Lengde i μm (vev). Skala barer = 200 μm. Forkortelser: ILM = indre begrensende membran; OS-RPE = fotoreseptor ytre segment av retinal pigmentepitel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Sammenligning av cSLO- og OCT-bilder av Vldlr knockout og C57BL/6J mus. cSLO (A) og OCT (B) bilder av Vldlr knockout mus sammenlignet med cSLO (C) og OCT (D) bilder av C57BL/6J mus. Kjennetegn ved OCT i Vldlr knockoutmus (B): 1) Midtre reflekterende linje (B, røde piler) på den indre overflaten av netthinnen med vedheft til retinalbeholderen (B, grønn pil). 2) Hyperreflekterende lesjoner, plassert i subretinalrommet, med (B, hvit pil) eller uten (B, gul pil) involvering av ytre atomlag. Pilene på cSLO-bildet (A) representerer plasseringen av de tilsvarende fargepilene på OCT-bilde (B). Skala barer = 200 μm. Forkortelser: cSLO = konfokal skanning laser oftalmoskop; OCT = optisk koherenstomografi; Vldlr = lipoproteinreseptor med svært lav tetthet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Modus 1: retinale parafinseksjoner med hematoksylin-eosinfarging i Vldlr knockout og C57BL / 6J mus. (A) Et eksempel på subretinal neovaskularisering som invaderer det ytre atomlaget (tykk grønn pil), som ligger i den midtre delen av netthinnen til en Vldlr knockout-mus. (B) Normal kontroll, den midterste delen av netthinnen til en C57BL/6J-mus. Skalastenger = 50 μm. Forkortelser: Vldlr = lipoproteinreseptor med svært lav tetthet; ILM = indre begrensende membran; NFL = retinal nervefiber lag; GCL = retinal ganglioncellelag; IPL = indre plexiform lag; INL = indre kjernelag; OPL = ytre plexiform lag; ONL = ytre atomlag; ELM = ekstern begrensende membran; IS = fotoreseptor indre segment; OS = fotoreseptor ytre segment; RPE = retinalt pigmentepitellag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Modus 2: retinale parafinseksjoner med hematoksylin-eosinfarging i Vldlr knockout og C57BL / 6J mus. (A) Et eksempel på subretinal neovaskularisering uten involvering av ytre atomlag (tykk blå pil) og med intakt ELM (tynn gul pil), plassert i den midtre periferien netthinnen i en Vldlr knockout-mus. (B) Normal kontroll, den midtre periferien netthinnen til en C57BL/6J-mus. Skala barer = 50 μm. Forkortelser: VLDR = lipoproteinreseptor med svært lav tetthet; ILM = indre begrensende membran; NFL = retinal nerve fiber lag; GCL = retinal ganglioncellelag; IPL = indre plexiform lag; INL = indre kjernelag; OPL = ytre plexiform lag; ONL = ytre atomlag; ELM = ekstern begrensende membran; IS = fotoreseptor indre segment; OS = ytre fotoreseptorsegment; RPE = retinalt pigmentepitellag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Sammenligning av retinal tykkelse mellom C57BL / 6J mus og Vldlr knockout mus (alle data fra høyre øye). (A) Retinal tykkelse (μm) gjennom optisk nerve papilla ved OCT horisontal skanning. (B) Retinal tykkelse (μm) gjennom optisk nerve papilla ved OCT vertikal skanning. Den horisontale koordinaten representerer måleposisjonene med en avstand på 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Forkortelser: T = Temporal; P = Optisk papilla; N = Nasal; S = Overlegen; I = Dårligere; OCT = optisk koherenstomografi; VLDR = lipoproteinreseptor med svært lav tetthet; OD = høyre øye. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien ble OCT-avbildning ved hjelp av et smådyr retinal imaging system brukt for å evaluere retinale endringer i Vldlr knockout mus, som viser ufullstendig bakre glasslegeme detachment, subretinal neovaskularisering og retinal tykkelse tynning. OCT er en ikke-invasiv avbildningsmetode for å undersøke tilstanden til netthinnen in vivo. De fleste OCT-enheter er designet for menneskelig øyeundersøkelse. Størrelsen på maskinvareutstyret, innstillingen av brennvidden, innstillingen av systemparametrene og posisjoneringskravene til kandidaten er alle basert på det menneskelige øye. Modifikasjoner av linsen og systeminnstillingene er nødvendige for å undersøke små dyr med menneskespesifikt OCT-utstyr. Denne artikkelen presenterer OCT-undersøkelsesprosedyrer for små dyr.

Brennvidden er forskjellig under bildeskanning av forskjellige små dyr med forskjellige størrelser på øyebollene. Denne forskjellen i brennvidde er kritisk og må løses for å oppnå klare og nøyaktige fundusbilder. En effektiv metode er å erstatte objektivlinsen med linser med forskjellige krumninger. På grunn av det lille øyebollet trenger musen en kontaktlinse på 100 D foran hornhinnen i tillegg til den dobbeltsfæriske 60 D forhåndsinnstilte linsen til OCT-utstyret.

OCT kan bare gi linjeskanninger som bare dekker et begrenset område av netthinnen. Derfor er det viktig å standardisere protokollen for OCT-skanninger for kvalitativ og kvantitativ sammenligning av OCT-funn i forskjellige grupper. Tre horisontale skanninger og tre vertikale skanninger ble utført her. Denne maskinen gir et sanntids cSLO-bilde for å overvåke plasseringen av OCT-skanningen, slik at skanningens posisjon kan justeres nøyaktig og praktisk. Ytterligere skanninger kan legges til når en unormal refleksjon er funnet.

Parametrene for bildeoppkjøp må justeres nøye. Her anbefales det at Range Min være 0-20 og Range Max være 50-60 (Figur 4I, J). Når parametrene er overjustert, vil signalkontrasten til bildet bli forbedret, og det reflekterte signalet fra netthinnen med lav refleksjon blir lavere eller til og med svart, og noe morfologisk informasjon vil gå tapt.

Følgende er noen tips for å unngå forringelse av bildekvaliteten: 1. Plasser en kontaktlinse foran øynene umiddelbart etter anestesi for å unngå grå stær; 2. Forsikre deg om at den forhåndsinnstilte linsen og kontaktlinsen er rene; 3. Unngå at hår kommer inn mellom hornhinnen og kontaktlinsen; 4. Forsikre deg om at doppleren, kontrasten og lysstyrken i OCT-parametrene er riktig innstilt.

OCT-bildene kan brukes til å kvalitativt oppdage lesjoner og kvantitativt måle beregninger som retinal tykkelse. Her foreslås en metode for å måle retinaltykkelsen flere steder, og gjennomsnittet kan beregnes som gjennomsnittlig retinal tykkelse. Dette oppnås gjennom den automatiske stratifiseringsfunksjonen til OCT-systemet. Derfor kan tykkelsen på retinallamineringene også måles. Målemetoden er enkel og nøyaktig (figur 6 og figur 7). Resultatene viste at retinaltykkelsen var lavere hos Vldlr knockoutmus enn C57BL/6J-mus, i samsvar med litteraturen25. Forskjellen i retinal tykkelse mellom de to gruppene kan tydelig vises ved en graf generert fra målingene på flere steder (figur 11). Lignende retinopatianalyse og målemetoder for retinaltykkelse er også rapportert i Stargardt-sykdomsmusemodellen26. Det er imidlertid verdt å merke seg at de hyperreflekterende båndene ved retinaens glasslegeme ikke tilhører retinalvevet og bør fjernes under stratifisering. I tillegg, hvis subretinale lesjoner invaderer netthinnen, bør tykkelsesmålingen inkludere den invaderte delen.

Dette smådyr retinale bildebehandlingssystemet har noen begrensninger. For eksempel, selv om det kan gi klare bilder av den bakre polen innen 35 °, er bildeopptak av den perifere netthinnen fortsatt utfordrende. I tillegg danner cSLO et gråtonebilde, som ikke er like bra som et fargefundusbilde for å oppdage funduslesjoner (pigmentering, blødning, ekssudasjon). Derfor er det behov for ytterligere forbedringer. Oppsummert kan OCT-undersøkelse av cSLO-maskinen lette ikke-invasiv deteksjon og måling av retinopati i musemodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Prosjektkilde: Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (2018A0303130306). Forfatterne vil takke Ophthalmic Research Laboratory, Joint Shantou International Eye Center of Shantou University og Chinese University of Hong Kong for finansiering og materialer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-Dpt contact lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket POPOCOLA CW-DRT-01 50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL) Kaile 0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD 5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel Alcon 16H01E
Microliter syringes Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD Q31/0113000236C001-2017 50 µL
Povidone iodine solution Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD 100 mL
RETImap ROLAND CONSULT 19-99_50-2.1_1.2E cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs OSMO POCKET OT110 INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops Santen Pharmaceutical Co.,LTD 5 mg/mL
Xylazin Sigma X1251-5G 5 g
Zoletil 50 Virbac.S.A 7FRPA Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
  2. Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
  3. Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
  4. Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
  5. Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
  6. Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
  7. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  8. Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
  9. Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
  10. Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
  11. Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
  12. Podoleanu, A. G. Optical coherence tomography. Journal of Microscopy. 247 (3), 209-219 (2012).
  13. Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
  14. Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
  15. Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
  16. Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
  17. Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
  18. Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
  19. Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
  20. Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
  21. Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
  22. Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
  23. Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
  24. Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
  25. Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
  26. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).

Tags

Medisin utgave 179
Anvendelse av optisk koherenstomografi til en musemodell av retinopati
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. … More

Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J. Vis. Exp. (179), e63421, doi:10.3791/63421 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter