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Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63421
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1
1Joint Shantou International Eye Center, Shantou University and the Chinese University of Hong Kong, 2Shantou University Medical College, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, the Chinese University of Hong Kong
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Abstract

La tomografía de coherencia óptica (OCT) ofrece un método no invasivo para el diagnóstico de la retinopatía. La máquina OCT puede capturar imágenes transversales de la retina a partir de las cuales se puede calcular el grosor de la retina. Aunque la OCT es ampliamente utilizada en la práctica clínica, su aplicación en la investigación básica no es tan frecuente, especialmente en animales pequeños como los ratones. Debido al pequeño tamaño de sus globos oculares, es difícil realizar exámenes de imágenes de fondo de ojo en ratones. Por lo tanto, se requiere un sistema especializado de imágenes de retina para acomodar las imágenes de OCT en animales pequeños. Este artículo demuestra un sistema específico de animales pequeños para los procedimientos de examen de la OCT y un método detallado para el análisis de imágenes. Se presentan los resultados del examen de OCT retiniana de ratones knockout con receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (Vldlr) y ratones C57BL / 6J. Las imágenes OCT de ratones C57BL / 6J mostraron capas retinianas, mientras que las de ratones knockout Vldlr mostraron neovascularización subretiniana y adelgazamiento de la retina. En resumen, el examen de OCT podría facilitar la detección y medición no invasiva de la retinopatía en modelos de ratón.

Introduction

La tomografía de coherencia óptica (OCT) es una técnica de imagen que puede proporcionar imágenes in vivo de alta resolución y transversales para el tejido 1,2,3,4,5,6,7,8, especialmente para el examen no invasivo en la retina 9,10,11,12 . También se puede utilizar para cuantificar algunos biomarcadores importantes, como el grosor de la retina y el grosor de la capa de fibras nerviosas de la retina. El principio de la OCT es la reflectometría de coherencia óptica, que obtiene información tisular transversal a partir de la coherencia de la luz reflejada de una muestra y la convierte en una forma gráfica o digital a través de un sistema informático7. La OCT es ampliamente utilizada en las clínicas de oftalmología como una herramienta esencial para el diagnóstico, seguimiento y manejo de pacientes con trastornos de la retina. También puede proporcionar información sobre la patogénesis de las enfermedades de la retina.

Además de las aplicaciones clínicas, la OCT también se ha utilizado en estudios con animales. Aunque la patología es el estándar de oro de la caracterización morfológica, la OCT tiene la ventaja de las imágenes in vivo no invasivas y el seguimiento longitudinal. Además, se ha demostrado que la OCT está bien correlacionada con la histopatología en modelos animales de retinopatía 11,13,14,15,16,17,18,19,20. El ratón es el animal más utilizado en estudios biomédicos. Sin embargo, sus pequeños globos oculares plantean un desafío técnico para la realización de imágenes de OCT en ratones.

En comparación con la OCT utilizada por primera vez para imágenes de la retina en ratones21,22, la OCT en animales pequeños ahora se ha optimizado con respecto a los sistemas de hardware y software. Por ejemplo, la OCT, en combinación con el seguidor, reduce significativamente la relación señal-ruido; Las actualizaciones del sistema de software OCT permiten detectar automáticamente más capas de retina; y el proyector DLP integrado ayuda a reducir los artefactos de movimiento.

El receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (Vldlr) es una proteína transmembrana en las células endoteliales. Se expresa en las células endoteliales vasculares de la retina, en las células epiteliales pigmentarias de la retina y alrededor de la membrana limitante externa23,24. La neovascularización subretiniana es el fenotipo de los ratones knockout Vldlr 23. Por lo tanto, los ratones knockout Vldlr se utilizan para investigar la patogénesis y la terapia potencial de la neovascularización subretiniana. Este artículo demuestra la aplicación de imágenes OCT para detectar lesiones retinianas en ratones knockout Vldlr, con la esperanza de proporcionar alguna referencia técnica para la investigación de la retinopatía en modelos de animales pequeños.

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Protocol

Las operaciones se realizaron siguiendo la Declaración sobre el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología. El diseño experimental fue aprobado por el Comité de Ética Animal institucional (Comité de Ética Médica de JSIEC, EC 20171213(4)-P01). En este estudio se utilizaron ratones C57BL / 6J de dos meses de edad y ratones knockout Vldlr . Había 7 ratones en cada grupo, todos los cuales eran hembras y pesaban de 20 g a 24 g.

1. Condiciones experimentales

  1. Asigne los ratones a dos grupos: un grupo experimental formado por ratones knockout Vldlr y un grupo de control formado por ratones C57BL/6J.
  2. Alimente a los ratones con comida y agua convencionalmente.
  3. Criar a los ratones en el laboratorio animal en condiciones estables de temperatura ambiente (22 °C), humedad (50-60%), ciclo luz-oscuridad (12 h-12 h) e intensidad de luz ambiente (350-400 lux).
  4. Preparar el equipo experimental: tomografía de coherencia óptica con oftalmoscopio láser de barrido confocal (cSLO) para animales pequeños (Figura 1A).
  5. Preparar todos los materiales necesarios para el experimento (Figura 1B) y pesar los ratones (Figura 1C).

2. Registros de información

  1. Registre la información: grupo, código, fecha de nacimiento, edad, sexo, peso y dosis de anestesia.

3. Inicio y prueba del instrumento

  1. Encienda la computadora e inicie el software.
  2. Haga clic en el botón Programa de prueba para completar el programa de prueba.
  3. Encienda el termostato y precaliéntelo a la temperatura de 37 °C.
  4. Inicie el procedimiento del módulo OCT después de la prueba del programa.
  5. Cree un nuevo asunto y rellene la información del ratón.
  6. Precalienta la manta eléctrica y cúbrela con toallas quirúrgicas.

4. Anestesia

  1. Use polvo anestésico liofilizado que contenga Tiletamine y Zolazepam para preparar la mezcla anestésica.
    NOTA: Siga las recomendaciones del comité local de ética animal para la elección, dosis y vía de administración de anestesia. Anestesiar al animal con un anestésico que proporcionará inmovilidad y pérdida de percepción del dolor durante al menos 1 hora, después de lo cual el animal se recupera rápidamente. La dosificación debe basarse en la duración del tiempo de experimento, el peso del animal y otros factores.
  2. Anestesiar al animal usando la mezcla anestésica preparada. Asegúrese de mantener al animal caliente durante todo el procedimiento hasta la recuperación.

5. Aplicación de gotas midriáticas

  1. Logre la sujeción manual del mouse por el desaliño, haga que el globo ocular sobresalga ligeramente y gire la cabeza del mouse con un ojo hacia arriba.
  2. Aplicar las gotas midriáticas para dilatar las pupilas (Figura 2A).
  3. Compruebe si hay dilatación de la pupila después de 10 min.

6. Colocación del ratón

  1. Coloque un mouse en una plataforma de manta eléctrica.
  2. Cubra ambos ojos con gel médico de hialuronato de sodio (Figura 2B).
  3. Atornille una lente esférica doble 60 D (lente preestablecida) en el dispositivo cSLO (Figura 1A-5, 6).
  4. Coloque una lente de contacto 100 D en la córnea del ratón con el lado cóncavo tocando el gel de hialuronato de sodio en la superficie corneal (Figura 2C, D y Figura 3A-II).
  5. Coloque el ratón en la pequeña plataforma animal de temperatura constante y mantenga el ojo a 1-2 mm de distancia de la lente del dispositivo cSLO (Figura 3A).
  6. Ajuste el ángulo de la lente de contacto con fórceps para mantener la pupila en el centro de la lente.
  7. Ajuste los ajustes de la cabeza para que el ojo mire hacia adelante.

7. Oftalmoscopio láser de barrido confocal (cSLO)

  1. Haga clic en el botón OCT , elija el módulo del mouse e inicie el programa cSLO (Figura 4B).
  2. Seleccione el modo IR (fuente de luz: luz roja) y ajuste el parámetro (rango: 2047, Figura 4D).
  3. Seleccione el ojo a examinar (ojo derecho: figura 4C-1; ojo izquierdo: figura 4C-2).
  4. Controle la palanca y mueva la lente predefinida hacia la lente de contacto lentamente.
  5. Ajuste el valor de las dioptrías hasta que la imagen del polo posterior sea clara (Figura 4E).
  6. Haga más ajustes para alinear la imagen del polo posterior de la retina, centrándola en la cabeza del nervio óptico.

8. Tomografía de coherencia óptica (OCT)

  1. Inicie el programa OCT (Figura 4G).
  2. Haga clic en la barra de progreso hacia arriba y hacia abajo hasta que aparezca la imagen de OCT (Figura 4H).
  3. Ajuste los parámetros: Rango mínimo (Figura 4I) = 0-20, Rango máximo (Figura 4J) = 40-60.
  4. Ajuste la distancia preestablecida de la lente y la dirección de la posición hasta obtener una imagen OCT ideal.
  5. Seleccione la posición de escaneo moviendo la línea estándar en el cSLO (Figura 4M).
  6. Comience a escanear desde la cabeza del nervio óptico.
  7. Recopilar imágenes en el mismo orden para cada ojo: línea horizontal: cabeza del nervio óptico → superior → inferior; Línea vertical: Cabeza del nervio óptico → nasal → temporal.
  8. Recopila imágenes desde cuatro direcciones.
  9. Haga clic en Promedio para superponer las señales de imagen cSLO y OCT (Figura 4F y Figura 4O).
  10. Haga clic en el botón de disparo para adquirir la imagen SLO-OCT (Figura 4P).
  11. Guarde y exporte todas las imágenes (Figura 4Q, R).

9. El final del experimento (después del examen PTU)

  1. Coloque el mouse sobre la manta eléctrica para mantenerlo caliente hasta que se despierte.
    NOTA: El ratón debe ser monitoreado hasta que recupere suficiente conciencia para mantener la decúbito esternal. La exposición postoperatoria a la luz brillante debe minimizarse.
  2. Retire la lente de contacto 100 D.
  3. Aplique el gel ocular de levofloxacina para proteger la córnea.
  4. Vuelva a colocar el ratón en la jaula después de que se despierte.
    NOTA: Asegúrese de que el ratón examinado no se devuelva a la compañía de otros ratones hasta que se recupere por completo.
  5. Apague el software y apague el equipo.
  6. Limpie la lente de contacto 100 D con agua; Seque la lente.
  7. Limpiar y desinfectar el ambiente.

10. Análisis de imágenes

  1. Compare las imágenes OCT de ratones knockout Vldlr con las de ratones C57BL / 6J.
  2. Observe múltiples posiciones: escaneos verticales y horizontales que pasan a través de la papila óptica; exploraciones superiores, inferiores, nasales y temporales; y exploraciones anormales en el sitio de reflexión.
  3. Observe el grosor, la forma, las capas y las lesiones de reflectancia anormal de la retina en cada imagen, así como la interfaz vítrea de la retina y el cuerpo vítreo.
  4. Registre las ubicaciones, características y números de lesiones.

11. Corrección de la estratificación retiniana

  1. Haga clic en Examen de carga en la interfaz de OCT (Figura 5A).
  2. Llame a las imágenes OCT de un mouse desde una ventana emergente.
  3. Seleccionar imágenes: escaneo de imágenes OCT a través de la papila óptica, horizontal o verticalmente.
  4. Haga doble clic en la imagen en el contenedor de medios para mostrarla en la pantalla (Figura 5C).
  5. Haga clic en Detección de capas para completar la estratificación automática en la retina (Figura 5D).
  6. Seleccione las líneas divisorias a ambos lados de la capa preparada para el análisis (Figura 6D-10).
  7. Seleccione una línea divisoria separada (Figura 6B-6) y haga clic en Editar capa (Figura 6A-1) para activar la línea cuando aparezca un círculo rojo (Figura 6B-7).
  8. Ajuste el espaciado (Figura 6A-4, por ejemplo, 50) y el rango límite (Figura 6A-5, por ejemplo, 50).
  9. Modifique la línea divisoria moviendo el círculo rojo (compare la línea divisoria verde en la Figura 6B y la Figura 6C; La figura 6C muestra el resultado modificado).

12. Espesor de laminación retiniana

  1. Haga clic en el botón Marcador de medida (Figura 6D-9).
  2. Seleccione la línea divisoria de la capa a analizar (por ejemplo, en la capa nuclear externa, seleccione la 4ª y5ª línea divisoria de la lista) para mostrar el límite de la capa en la imagen OCT (Figura 6D-10).
  3. Seleccione Conectar con capa (Figura 6D-11) y Permanezca conectado en movimiento (Figura 6D-12).
  4. Seleccione el área para mostrar los resultados (la columna seleccionada está coloreada, Figura 6D-13).
  5. Haga clic en la posición a analizar en la imagen de OCT para que aparezca la línea de medición (perpendicular al eje horizontal y consistente con el color del área resultante) (Figura 6D-14).
  6. Haga clic en la siguiente columna para la siguiente medición y revele los datos anteriores (Figura 6E-15).
  7. Lea el valor de Vert (grosor de la posición medida) en la fila Longitud en μm (tejido) (Figura 6E, rectángulo rojo).
  8. Haga clic en Eliminar marcador (Figura 6E-16) y Nuevo marcador (Figura 6E-17) para volver a realizar la prueba de modo que los resultados cubran los datos originales (si es necesario volver a medirlos).
  9. Presione Imprimir Scr en el teclado para guardar capturas de pantalla, o haga clic en Guardar examen para guardar directamente (Figura 5H).
  10. Ingrese los datos en una hoja de cálculo o software estadístico para el análisis estadístico.

13. Medición del espesor total de la retina

  1. Seleccione la línea 1 (ILM, membrana limitante interna, figura 7B) y la línea 7 (OS-RPE, SG: segmentos fotorreceptores externos; EPR: capa epitelial pigmentaria retiniana, figura 7C) en la lista de la esquina superior derecha.
    NOTA: El grosor retiniano completo significa el grosor de la capa del neurepitelio retiniano, que es la retina entre ILM y OS-RPE en OCT).
  2. Mida el grosor de la retina en ambos lados de la papila óptica en un intervalo específico.
    1. Por ejemplo: a partir de la apariencia de la estructura retiniana en el borde de la papila óptica, medir 4 valores con un espaciado de 200 μm de la regla horizontal (Figura 7G, H).
  3. Registra todos los valores medidos en una hoja de cálculo.
  4. Utilice múltiples pruebas t (una por fila) para comparar los valores medidos de cada posición correspondiente en ambos grupos.

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Representative Results

Gracias a los escaneos de alta resolución de OCT, se pueden observar las capas de la retina del ratón y se pueden identificar reflejos anormales y sus ubicaciones exactas. Las imágenes de OCT retiniana de ratones knockout Vldlr y ratones C57BL / 6J se compararon en este estudio. Las imágenes OCT de todos los ratones C57BL / 6J mostraron varias capas retinianas con diferente reflectividad, y la demarcación fue clara (Figura 8D). En contraste, todos los ratones knockout Vldlr mostraron lesiones anormales e hiperreflectantes en las imágenes de OCT (Figura 8B).

Desprendimiento vítreo incompleto (PVD) en ratones knockout Vldlr

Los resultados de la OCT mostraron algunas bandas reflectantes medias en las superficies retinianas de ratones knockout Vldlr (Figura 8B, flechas rojas). Estas bandas reflectantes medias se adhirieron al vaso retiniano (Figura 8B, flecha verde), correspondiente a la imagen cSLO (Figura 8A, flecha verde). Estas características son consistentes con las características de OCT de desprendimiento vítreo incompleto.

Neovascularización subretiniana en ratones knockout Vldlr

Los resultados mostraron que la neovascularización subretiniana tenía dos modos de desarrollo en los ratones knockout Vldlr .

Con la participación de la capa nuclear externa

Una lesión hiperreflectante, con una forma triangular de abajo hacia abajo en la imagen de OCT, apareció en el espacio subretiniano y se extendió a la capa nuclear externa. La lesión no atravesó la capa plexiforme externa (Figura 8B, flecha blanca).

La aparición de OCT de este tipo de neovascularización subretiniana fue consistente con los hallazgos patológicos mostrados en la Figura 9A. La sección patológica mostró que la neovascularización (Figura 9A, flecha verde gruesa) rompió el EPR, los segmentos internos / externos de los fotorreceptores (SI / OS) y la membrana limitante externa (ELM). Invadió la capa nuclear externa (ONL) pero no atravesó la capa plexiforme externa (OPL).

Sin la participación de la capa nuclear externa

Una banda de lesión hiperreflectante apareció en la imagen de OCT, que se localizó en el espacio subretiniano (Figura 8B, flecha amarilla). La imagen de cSLO mostraba la ubicación correspondiente (Figura 8A, flecha amarilla). Las exploraciones adicionales de la retina alrededor de esta ubicación (Figura 8A, flecha amarilla) mostraron los mismos hallazgos.

De acuerdo con la lesión (Figura 10A, flecha azul gruesa) en la sección patológica, esta neovascularización subretiniana no rompió el ELM (Figura 10A, flecha amarilla delgada) sino que involucró parcialmente al fotorreceptor IS/OS.

Resultados del grosor de la retina

El grosor retiniano del ojo derecho de todos los ratones se obtuvo utilizando la estratificación automática y la función de medición del grosor de la OCT. El grosor retiniano de los ratones knockout Vldlr (200,94 ± 14,64 μm) fue significativamente menor que el de los ratones C57BL/6J (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, prueba t, 7 ojos derechos/grupo). La comparación del grosor de la retina en las cuatro direcciones (temporal, nasal, superior e inferior) del polo posterior entre los dos grupos se muestra en la Figura 11.

Figure 1
Figura 1: Preparación de materiales experimentales y animales. (A) Equipo: 1. dispositivo cSLO/OCT para imágenes de retina de animales pequeños, 2. computadora y monitor, 3. Plataforma animal pequeña y de temperatura constante, 4. termostato, 5. lente preestablecida, 6. instalación de la lente preestablecida. (B) Medicamentos y artículos pequeños: I. povidona yodada, II. microjeringa, III. solución de mezcla anestésica, IV. temporizador, V. gotas oftálmicas midriáticas, VI. fórceps, VII. gel médico de hialuronato de sodio, VIII. hisopo de algodón medicinal, IX. pomada ocular antibiótica, X. 100 D lente de contacto (dos). (C) Medición del peso en una balanza digital. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscopio láser de barrido confocal; OCT = tomografía de coherencia óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación antes del examen de OCT en ratones . (A) Aplicación de gotas oftálmicas de midriasis, (B) recubrimiento de gel de hialuronato de sodio en la córnea, (C, D) colocación de una lente de contacto 100 D, con superficie cóncava en contacto con la córnea. Abreviatura: OCT = tomografía de coherencia óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Procedimientos de examen de la PTU . (A) Colocación de la posición del ratón, I. lente predefinida, II. lentes de contacto, III. Plataforma animal pequeña y de temperatura constante. B) Funcionamiento de la máquina cSLO/PTU, IV. palanca de accionamiento, V. palanca basculante, VI. Dispositivo cSLO. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscopio láser de barrido confocal; OCT = tomografía de coherencia óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Proceso de obtención de imágenes de OCT. R. Modo de medición , B. Iniciar Laser del láser IR, C. selección ocular (C-1-OD; C-2-OS), D. rango del láser IR, E. la dioptría, F. superposición de la imagen cSLO, G. Botón láser de inicio/parada del escaneo OCT H. referencia de la imagen OCT, I. Rango Min: 0-20, J. Rango Max: 50-60, K. intensidad de la señal de la imagen, L. dirección de escaneo (por ejemplo, escaneo vertical), M. posición de escaneo seleccionada moviendo la línea de referencia verde (por ejemplo, escaneo vertical a través de la papila óptica), N. visualización en tiempo real de la imagen OCT, O. superposición de la imagen OCT, P. Shot: adquisición de imagen, Q. SLO-OCT imágenes que se han adquirido, R. Save Examination: guardar el resultado del examen. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscopio láser de barrido confocal; OCT = tomografía de coherencia óptica; IR = infrarrojo; OD = ojo derecho; OS = ojo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Interfaz de delaminación retiniana automática en el sistema OCT. A. Botón Load Examination, B. Contenedor de medios, que muestra todas las imágenes de OCT, C. Imagen OCT seleccionada para el análisis, D. Botón de detección de capas para capas retinianas automáticas, E. lista de líneas divisorias, F. delaminación automática en la retina, G. Botón Editar capa para corrección en capas, H. Guardar examen para guardar los resultados. Barras de escala = 200 μm. Abreviatura: OCT = tomografía de coherencia óptica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Corrección en capas (A-C) y medición de espesor (D-E). (A) Interfaz de activación de edición en capas: 1. Botón Editar capa, 2. dividir la lista de líneas (por ejemplo, seleccionar todas las líneas), 3. líneas divisorias activadas, 4. Ajuste de espaciado, 5. Ajuste de rango límite. (B) Activación de una línea divisoria (por ejemplo, la línea 3 en A), 6. línea 3, la línea entre la capa plexiforme interna y la capa nuclear interna, 7. Un ejemplo de error de capas. (C) Modificación de errores de capas, 8. El círculo rojo para la modificación. (D) Un ejemplo de medición del grosor lamelar de la retina, 9. Botón Marcador de medida, 10. líneas divisorias de la capa nuclear externa, 11. Conectar con Capa (la medición se conectará con la capa según las líneas divisorias), 12. Manténgase conectado en movimiento (la posición de medición es donde permanece el clic manual), 13. La ubicación de la visualización de resultados, 14. la línea de medición (perpendicular al eje horizontal). (E) Adquisición de resultados de medición, 15. los resultados de la medición (rectángulo rojo: el valor Vert es el resultado del espesor), 16. Botón Eliminar marcador para la eliminación del registro de medición, 17. Nuevo botón Marker para remedición (el nuevo resultado sobrescribirá el registro original). Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Medición del espesor total de la retina. A. Botón Medir marcador, B. línea 1 (ILM) y C. línea 7 (OS-RPE) selección para mostrar los límites de la retina de espesor total, D. Conectar con la selección de capa, E. Permanecer conectado al moverse, F. barra de regla (barras de regla verticales y horizontales, ambas de 200 μm de longitud), G. líneas de medición en la retina (4 líneas con 200 μm de longitud de regla horizontal como espaciado a cada lado de la papila óptica), H. los resultados de medición (los resultados se diferencian por diferentes colores y corresponden al color de las líneas de medición en la retina), I. Extracción de datos del valor Vert en la fila Longitud en μm (tejido). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: ILM = membrana limitante interna; OS-RPE = segmento externo fotorreceptor del epitelio pigmentario de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Comparación de imágenes cSLO y OCT de ratones Vldlr knockout y C57BL/6J. Imágenes cSLO (A) y OCT (B) de ratones knockout Vldlr comparadas con las imágenes cSLO (C) y OCT (D) de ratones C57BL/6J. Características de la OCT en ratones knockout Vldlr (B): 1) Línea reflectante media (B, flechas rojas) en la superficie interna de la retina con adhesión al vaso retiniano (B, flecha verde). 2) Lesiones hiperreflectantes, localizadas en el espacio subretiniano, con (B, flecha blanca) o sin afectación (B, flecha amarilla) de la capa nuclear externa. Las flechas de la imagen cSLO (A) representan las ubicaciones de las flechas de color correspondientes en la imagen OCT (B). Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: cSLO = oftalmoscopio láser de barrido confocal; OCT = tomografía de coherencia óptica; Vldlr = receptor de lipoproteínas de muy baja densidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Modo 1: secciones de parafina retiniana con tinción de hematoxilina-eosina en Vldlr knockout y ratón C57BL/6J. (A) Un ejemplo de neovascularización subretiniana que invade la capa nuclear externa (flecha verde gruesa), ubicada en la parte media de la retina de un ratón knockout Vldlr. (B) Control normal, la parte media de la retina de un ratón C57BL/6J. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: Vldlr = receptor de lipoproteínas de muy baja densidad; ILM = membrana limitante interna; NFL = capa de fibras nerviosas de la retina; GCL = capa de células ganglionares de la retina; IPL = capa plexiforme interna; INL = capa nuclear interna; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; ELM = membrana limitante externa; IS = segmento interno fotorreceptor; SG = segmento externo fotorreceptor; EPR = capa de epitelio pigmentario retiniano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Modo 2: secciones de parafina retiniana con tinción de hematoxilina-eosina en Vldlr knockout y ratón C57BL/6J. (A) Un ejemplo de neovascularización subretiniana sin la afectación de la capa nuclear externa (flecha azul gruesa) y con ELM intacto (flecha amarilla delgada), situado en la retina de la periferia media en un ratón knockout Vldlr. (B) Control normal, la retina de la periferia media de un ratón C57BL/6J. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: VLDR = receptor de lipoproteínas de muy baja densidad; ILM = membrana limitante interna; NFL = capa de fibra nerviosa retiniana; GCL = capa de células ganglionares de la retina; IPL = capa plexiforme interna; INL = capa nuclear interna; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; ELM = membrana limitante externa; IS = segmento interno fotorreceptor; SG = segmento fotorreceptor externo; EPR = capa de epitelio pigmentario retiniano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Comparación del grosor retiniano entre ratones C57BL/6J y ratones knockout Vldlr (todos los datos del ojo derecho). (A) Grosor retiniano (μm) a través de la papila del nervio óptico mediante exploración horizontal OCT. (B) Grosor de la retina (μm) a través de la papila del nervio óptico mediante exploración vertical de OCT. La coordenada horizontal representa las posiciones de medición con un espaciado de 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Abreviaturas: T = Temporal; P = Papila óptica; N = Nasal; S = Superior; I = Inferior; OCT = tomografía de coherencia óptica; VLDR = receptor de lipoproteínas de muy baja densidad; OD = ojo derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, se aplicaron imágenes de OCT utilizando un sistema de imágenes de retina de animales pequeños para evaluar los cambios retinianos en ratones knockout Vldlr , que demuestran desprendimiento vítreo posterior incompleto, neovascularización subretiniana y adelgazamiento del grosor de la retina. La OCT es un método de imagen no invasivo para examinar la condición de la retina in vivo. La mayoría de los dispositivos OCT están diseñados para el examen ocular humano. El tamaño del equipo de hardware, el ajuste de la distancia focal, el ajuste de los parámetros del sistema y los requisitos de posicionamiento del examinado se basan en el ojo humano. Se requieren modificaciones de la lente y la configuración del sistema para examinar animales pequeños con equipos OCT específicos para humanos. Este documento presenta los procedimientos de examen de OCT de animales pequeños.

La distancia focal es diferente durante el escaneo de imágenes de diferentes animales pequeños con diferentes tamaños de globos oculares. Esta diferencia en la distancia focal es crítica y debe resolverse para obtener imágenes claras y precisas del fondo de ojo. Un método efectivo es reemplazar la lente del objetivo con lentes de diferentes curvaturas. Debido a su pequeño globo ocular, el ratón necesita una lente de contacto de 100 D delante de la córnea además de la lente preestablecida 60 D de doble esférica del equipo OCT.

La OCT solo puede proporcionar exploraciones de línea que solo cubren una región limitada de la retina. Por lo tanto, es esencial estandarizar el protocolo de exploraciones OCT para la comparación cualitativa y cuantitativa de los hallazgos de OCT en diferentes grupos. Aquí se realizaron tres escaneos horizontales y tres escaneos verticales. Esta máquina proporciona una imagen cSLO en tiempo real para monitorear la ubicación del escaneo OCT para que la posición del escaneo se pueda ajustar de manera precisa y conveniente. Se pueden agregar escaneos adicionales cuando se encuentra un reflejo anormal.

Los parámetros de adquisición de imágenes deben ajustarse cuidadosamente. Aquí, se recomienda que el rango mínimo sea 0-20 y el rango máximo sea 50-60 (Figura 4I, J). Cuando los parámetros están sobreajustados, el contraste de la señal de la imagen se mejoraría, y la señal reflejada de la retina con baja reflexión se vuelve más baja o incluso negra, y se perderá parte de la información morfológica.

Los siguientes son algunos consejos para evitar el deterioro de la calidad de la imagen: 1. Coloque una lente de contacto frente a los ojos inmediatamente después de la anestesia para evitar cataratas; 2. Asegúrese de que la lente preestablecida y la lente de contacto estén limpias; 3. Evite que el pelo entre entre la córnea y la lente de contacto; 4. Asegúrese de que el doppler, el contraste y el brillo en los parámetros OCT estén configurados correctamente.

Las imágenes de OCT se pueden utilizar para detectar cualitativamente lesiones y medir cuantitativamente métricas como el grosor de la retina. Aquí, se propone un método para medir el grosor de la retina en varios lugares, y el promedio se puede calcular como el grosor medio de la retina. Esto se logra a través de la función de estratificación automática del sistema OCT. Por lo tanto, también se puede medir el grosor de las laminaciones retinianas. El método de medición es simple y preciso (Figura 6 y Figura 7). Los resultados mostraron que el grosor de la retina fue menor en ratones knockout Vldlr que en ratones C57BL/6J, consistente con la literatura25. La diferencia en el grosor de la retina entre los dos grupos se puede mostrar claramente mediante un gráfico generado a partir de las mediciones en múltiples ubicaciones (Figura 11). También se han reportado análisis de retinopatía y métodos similares de medición del grosor de la retina en el modelo de ratón con enfermedad de Stargardt26. Sin embargo, vale la pena señalar que las bandas hiperreflectantes en la interfaz vítrea de la retina no pertenecen al tejido retiniano y deben eliminarse durante la estratificación. Además, si las lesiones subretinianas invaden la retina, la medición del grosor debe incluir la porción invadida.

Este sistema de imágenes de retina de animales pequeños tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, aunque puede proporcionar imágenes claras del polo posterior dentro de 35 °, la adquisición de imágenes de la retina periférica sigue siendo un desafío. Además, cSLO forma una imagen en escala de grises, que no es tan buena como una imagen de fondo de ojo en color para detectar lesiones de fondo de ojo (pigmentación, sangrado, exudación). Por lo tanto, se necesitan más mejoras. En resumen, el examen de OCT por la máquina cSLO podría facilitar la detección no invasiva y la medición de la retinopatía en modelos de ratón.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún posible conflicto de intereses.

Acknowledgments

Fuente del proyecto: Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2018A0303130306). Los autores desean agradecer al Laboratorio de Investigación Oftalmológica, al Centro Oftalmológico Internacional Shantou Conjunto de la Universidad de Shantou y a la Universidad China de Hong Kong por la financiación y los materiales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100-Dpt contact lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Double aspheric 60-Dpt glass lens Volk Optical,Inc, Mentor, OH Accessory belonging to the RETImap
Electric heating blanket POPOCOLA CW-DRT-01 50 x 35 cm
Injection syringe (1 mL) Kaile 0.45 x 16RWLB
Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD 5 g: 0.015 g
Medical sodium hyaluronate gel Alcon 16H01E
Microliter syringes Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD Q31/0113000236C001-2017 50 µL
Povidone iodine solution Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD 100 mL
RETImap ROLAND CONSULT 19-99_50-2.1_1.2E cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP
Small animal ear studs OSMO POCKET OT110 INS1005-1S
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops Santen Pharmaceutical Co.,LTD 5 mg/mL
Xylazin Sigma X1251-5G 5 g
Zoletil 50 Virbac.S.A 7FRPA Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg

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References

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Medicina Número 179
Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones
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Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J. Vis. Exp. (179), e63421, doi:10.3791/63421 (2022).

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