Summary
Qui, descriviamo una tecnica di imaging in vivo che utilizza la tomografia a coerenza ottica per facilitare la diagnosi e la misurazione quantitativa della retinopatia nei topi.
Abstract
La tomografia a coerenza ottica (OCT) offre un metodo non invasivo per la diagnosi di retinopatia. La macchina OCT può acquisire immagini della sezione trasversale retinica da cui è possibile calcolare lo spessore della retina. Sebbene l'OCT sia ampiamente utilizzato nella pratica clinica, la sua applicazione nella ricerca di base non è così prevalente, specialmente nei piccoli animali come i topi. A causa delle piccole dimensioni dei loro bulbi oculari, è difficile condurre esami di imaging del fondo nei topi. Pertanto, è necessario un sistema di imaging retinico specializzato per ospitare l'imaging OCT su piccoli animali. Questo articolo illustra un sistema specifico per i piccoli animali per le procedure di esame dello PTOM e un metodo dettagliato per l'analisi delle immagini. Vengono presentati i risultati dell'esame OCT retinico di topi knockout a bassissima densità del recettore delle lipoproteine (Vldlr) e topi C57BL/6J. Le immagini OCT dei topi C57BL / 6J hanno mostrato strati retinici, mentre quelle di topi knockout Vldlr hanno mostrato neovascolarizzazione sottoretinica e assottigliamento della retina. In sintesi, l'esame OCT potrebbe facilitare il rilevamento non invasivo e la misurazione della retinopatia nei modelli murini.
Introduction
La tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica di imaging in grado di fornire in vivo l'alta risoluzione e l'imaging trasversale per il tessuto 1,2,3,4,5,6,7,8, in particolare per l'esame non invasivo nella retina 9,10,11,12 . Può anche essere utilizzato per quantificare alcuni importanti biomarcatori, come lo spessore della retina e lo spessore dello strato di fibre nervose retiniche. Il principio dell'OCT è la riflettometria a coerenza ottica, che ottiene informazioni trasversali sui tessuti dalla coerenza della luce riflessa da un campione e la converte in forma grafica o digitale attraverso un sistema informatico7. L'OCT è ampiamente utilizzato nelle cliniche oftalmologiche come strumento essenziale per la diagnosi, il follow-up e la gestione per i pazienti con disturbi della retina. Può anche fornire informazioni sulla patogenesi delle malattie della retina.
Oltre alle applicazioni cliniche, l'OCT è stato utilizzato anche negli studi sugli animali. Sebbene la patologia sia il gold standard della caratterizzazione morfologica, l'OCT ha il vantaggio dell'imaging non invasivo in vivo e del follow-up longitudinale. Inoltre, è stato dimostrato che l'OCT è ben correlato con l'istopatologia nei modelli animali di retinopatia 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Il topo è l'animale più comunemente usato negli studi biomedici. Tuttavia, i suoi piccoli bulbi oculari rappresentano una sfida tecnica per condurre l'imaging OCT nei topi.
Rispetto all'OCT utilizzato per la prima volta per l'imaging retinico nei topi21,22, l'OCT nei piccoli animali è stato ora ottimizzato rispetto ai sistemi hardware e software. Ad esempio, OCT, in combinazione con il tracker, riduce significativamente il rapporto segnale-rumore; Gli aggiornamenti del sistema software OCT consentono di rilevare automaticamente più strati retinici; e il proiettore DLP integrato aiuta a ridurre gli artefatti di movimento.
Il recettore della lipoproteina a bassissima densità (Vldlr) è una proteina transmembrana nelle cellule endoteliali. È espresso sulle cellule endoteliali vascolari retiniche, sulle cellule epiteliali pigmentate retiniche e intorno alla membrana limitante esterna23,24. La neovascolarizzazione sottoretinica è il fenotipo dei topi knockout Vldlr 23. Pertanto, i topi knockout Vldlr vengono utilizzati per studiare la patogenesi e la potenziale terapia della neovascolarizzazione sottoretinica. Questo articolo dimostra l'applicazione dell'imaging OCT per rilevare lesioni retiniche nei topi knockout Vldlr, sperando di fornire qualche riferimento tecnico per la ricerca sulla retinopatia in piccoli modelli animali.
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Protocol
Le operazioni sono state eseguite a seguito della Dichiarazione sull'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia. Il progetto sperimentale è stato approvato dal Comitato etico istituzionale per gli animali (Medical Ethics Committee of JSIEC, EC 20171213(4)-P01). In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL / 6J di due mesi e topi knockout Vldlr . C'erano 7 topi in ogni gruppo, tutti femmine e pesavano da 20 g a 24 g.
1. Condizioni sperimentali
- Assegnare i topi a due gruppi: un gruppo sperimentale composto da topi knockout Vldlr e un gruppo di controllo composto da topi C57BL / 6J.
- Dai da mangiare ai topi con cibo e acqua in modo convenzionale.
- Allevare i topi nel laboratorio animale in condizioni stabili di temperatura ambiente (22 ° C), umidità (50-60%), ciclo luce-buio (12 h-12 h) e intensità luminosa ambiente (350-400 lux).
- Preparare l'attrezzatura sperimentale: tomografia a coerenza ottica con oftalmoscopio laser a scansione confocale (cSLO) per piccoli animali (Figura 1A).
- Preparare tutti i materiali necessari per l'esperimento (Figura 1B) e pesare i topi (Figura 1C).
2. Registrazioni informative
- Registra le informazioni: gruppo, codice, data di nascita, età, sesso, peso e dosaggio anestetico.
3. Avviamento e collaudo dello strumento
- Accendere il computer e avviare il software.
- Fare clic sul pulsante Programma di test per completare il programma di test.
- Accendere il termostato e preriscaldarlo alla temperatura di 37 °C.
- Avviare la procedura del modulo dello Strumento di personalizzazione di Office dopo il test del programma.
- Crea un nuovo soggetto e inserisci le informazioni del mouse.
- Preriscaldare la coperta elettrica e coprirla con asciugamani chirurgici.
4. Anestesia
- Utilizzare polvere anestetica liofilizzata contenente Tiletamina e Zolazepam per preparare la miscela anestetica.
NOTA: Seguire le raccomandazioni del comitato etico animale locale per la scelta, il dosaggio e la via di somministrazione dell'anestesia. Anestetizzare l'animale con un anestetico che fornirà immobilità e perdita di percezione del dolore per almeno 1 ora, dopo di che l'animale si riprende rapidamente. Il dosaggio deve essere basato sulla durata del tempo di esperimento, sul peso dell'animale e su altri fattori. - Anestetizzare l'animale usando la miscela anestetica preparata. Assicurarsi di mantenere l'animale caldo durante l'intera procedura fino al recupero.
5. Applicazione di gocce midriatiche
- Ottenere il contenimento manuale del mouse per la collottola, far sporgere leggermente il bulbo oculare e ruotare la testa del mouse con un occhio rivolto verso l'alto.
- Applicare le gocce midriatiche per dilatare le pupille (Figura 2A).
- Controllare la dilatazione della pupilla dopo 10 minuti.
6. Posizionamento del mouse
- Posiziona un mouse su una piattaforma elettrica.
- Rivestire entrambi gli occhi con gel ialuronato di sodio medicale (Figura 2B).
- Avvitare una doppia lente sferica 60 D (lente preimpostata) sul dispositivo cSLO (Figura 1A-5, 6).
- Posizionare una lente a contatto 100 D sulla cornea del topo con il lato concavo che tocca il gel ialuronato di sodio sulla superficie corneale (Figura 2C, D e Figura 3A-II).
- Posizionare il mouse sulla piccola piattaforma animale a temperatura costante e tenere l'occhio a 1-2 mm di distanza dall'obiettivo del dispositivo cSLO (Figura 3A).
- Regolare l'angolo della lente a contatto con una pinza per mantenere la pupilla al centro della lente.
- Perfeziona le regolazioni della testa per rendere l'occhio rivolto dritto in avanti.
7. Oftalmoscopio laser a scansione confocale (cSLO)
- Fare clic sul pulsante dello Strumento di personalizzazione di Office , scegliere il modulo mouse e avviare il programma cSLO (Figura 4B).
- Selezionare la modalità IR (sorgente luminosa: luce rossa) e regolare il parametro (intervallo: 2047, Figura 4D).
- Selezionare l'occhio da esaminare (occhio destro: figura 4C-1; occhio sinistro: figura 4C-2).
- Controllare la leva e spostare lentamente la lente preimpostata verso la lente a contatto.
- Regolare il valore diottrico fino a quando l'imaging del polo posteriore è chiaro (Figura 4E).
- Effettuare ulteriori regolazioni per allineare l'immagine del polo posteriore retinico, centrandola sulla testa del nervo ottico.
8. Tomografia a coerenza ottica (OCT)
- Avviare il programma dello Strumento di personalizzazione di Office (Figura 4G).
- Fare clic sull'indicatore di stato verso l'alto e verso il basso finché non viene visualizzata l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office (Figura 4H).
- Regolare i parametri: Range Min (Figura 4I) = 0-20, Range Max (Figura 4J) = 40-60.
- Regolare la distanza dell'obiettivo preimpostata e la direzione della posizione fino a ottenere un'immagine OCT ideale.
- Selezionare la posizione di scansione spostando la linea standard nel cSLO (Figura 4M).
- Avviare la scansione dalla testa del nervo ottico.
- Raccogli le immagini nello stesso ordine per ciascun occhio: linea orizzontale: testa del nervo ottico → superiore → inferiore; Linea verticale: testa del nervo ottico → nasale → temporale.
- Raccogli immagini da quattro direzioni.
- Fare clic su Media per sovrapporre i segnali immagine cSLO e OCT (Figura 4F e Figura 4O).
- Fare clic sul pulsante di ripresa per acquisire l'immagine SLO-OCT (Figura 4P).
- Salvare ed esportare tutte le immagini (Figura 4Q, R).
9. La fine dell'esperimento (dopo l'esame OCT)
- Posizionare il mouse sulla coperta elettrica per tenerlo caldo fino al risveglio.
NOTA: Il topo deve essere monitorato fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale. L'esposizione postoperatoria alla luce intensa deve essere ridotta al minimo. - Rimuovere la lente a contatto 100 D.
- Applicare il gel per gli occhi levofloxacina per proteggere la cornea.
- Rimetti il mouse nella gabbia dopo che si è svegliato.
NOTA: Assicurarsi che il topo esaminato non venga restituito alla compagnia di altri topi fino a quando non si è completamente ristabilito. - Spegnere il software e spegnere il computer.
- Pulire la lente a contatto 100 D con acqua; Asciugare la lente.
- Pulire e disinfettare l'ambiente.
10. Analisi delle immagini
- Confronta le immagini OCT dei topi knockout Vldlr con quelle dei topi C57BL / 6J.
- Osservare più posizioni: scansioni verticali e orizzontali che passano attraverso la papilla ottica; scansioni superiori, inferiori, nasali e temporali; e scansioni anomale del sito di riflessione.
- Osservare lo spessore, la forma, la stratificazione e le lesioni anomale della riflettanza della retina in ogni immagine, nonché l'interfaccia vitreale della retina e del corpo vitreo.
- Registrare le posizioni, le caratteristiche e il numero di lesioni.
11. Correzione della stratificazione retinica
- Fare clic su Esame carico (Load Examination ) nell'interfaccia dello Strumento di personalizzazione di Office (Figura 5A).
- Richiamare le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office di un mouse da una finestra popup.
- Seleziona immagini: scansione delle immagini OCT attraverso la papilla ottica, orizzontalmente o verticalmente.
- Fare doppio clic sull'immagine nel contenitore multimediale per visualizzarla sullo schermo (Figura 5C).
- Fare clic su Layer Detection (Rilevamento strati ) per completare la stratificazione automatica sulla retina (Figura 5D).
- Selezionate le linee divisorie su entrambi i lati del livello preparato per l'analisi (Figura 6D-10).
- Selezionate una linea divisoria separata (Figura 6B-6) e fate clic su Modifica livello (Figura 6A-1) per attivare la linea quando viene visualizzato un cerchio rosso (Figura 6B-7).
- Regolare la spaziatura (Figura 6A-4, ad esempio, 50) e l'intervallo limite (Figura 6A-5, ad esempio, 50).
- Modificare la linea di demarcazione spostando il cerchio rosso (confrontare la linea di demarcazione verde nella Figura 6B e nella Figura 6C; La Figura 6C mostra il risultato modificato).
12. Spessore della laminazione retinica
- Fare clic sul pulsante Marcatore misura (Figura 6D-9).
- Selezionare la linea di demarcazione dello strato da analizzare (ad esempio, nello strato nucleare esterno, selezionare la 4° e la 5° linea di divisione nell'elenco) per visualizzare il limite dello strato sull'immagine OCT (Figura 6D-10).
- Selezionare Connetti con layer (Figura 6D-11) e Rimani connesso in movimento (Figura 6D-12).
- Selezionare l'area in cui visualizzare i risultati (la colonna selezionata è colorata, Figura 6D-13).
- Fare clic sulla posizione da analizzare sull'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office per visualizzare la linea di misurazione (perpendicolare all'asse orizzontale e coerente con il colore dell'area risultante) (Figura 6D-14).
- Fare clic sulla colonna successiva per la misurazione successiva e visualizzare i dati precedenti (Figura 6E-15).
- Leggere il valore Vert (spessore della posizione misurata) nella riga Lunghezza in μm (tessuto) (Figura 6E, rettangolo rosso).
- Fare clic su Elimina marcatore (Figura 6E-16) e Nuovo marcatore (Figura 6E-17) per ripetere il test in modo che i risultati coprano i dati originali (se è necessaria una nuova misurazione).
- Premere Stampa Scr sulla tastiera per salvare le schermate oppure fare clic su Salva esame per salvare direttamente (Figura 5H).
- Inserisci i dati in un foglio di calcolo o in un software statistico per l'analisi statistica.
13. Misurazione dello spessore retinico completo
- Selezionare la linea 1 (ILM, membrana limitante interna, Figura 7B) e la linea 7 (OS-RPE, OS: segmenti fotorecettori esterni; RPE: strato epiteliale pigmentato retinico, Figura 7C) nell'elenco nell'angolo in alto a destra.
NOTA: Lo spessore completo della retina indica lo spessore dello strato di neurepitelio retinico, che è la retina tra ILM e OS-RPE su OCT). - Misurare lo spessore retinico su entrambi i lati della papilla ottica ad un intervallo specifico.
- Ad esempio: dall'aspetto della struttura retinica sul bordo della papilla ottica, misurare 4 valori con spaziatura di 200 μm del righello orizzontale (Figura 7G, H).
- Registrare tutti i valori misurati in un foglio di calcolo.
- Utilizzare più test t (uno per riga) per confrontare i valori misurati di ciascuna posizione corrispondente in entrambi i gruppi.
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Representative Results
Grazie alle scansioni ad alta risoluzione dell'OCT, è possibile osservare gli strati della retina del topo e identificare riflessi anomali e le loro posizioni esatte. Le immagini OCT retiniche di topi knockout Vldlr e topi C57BL / 6J sono state confrontate in questo studio. Le immagini OCT di tutti i topi C57BL / 6J hanno mostrato vari strati retinici con riflettività diversa e la demarcazione era chiara (Figura 8D). Al contrario, tutti i topi knockout di Vldlr hanno mostrato lesioni anormali e iperriflettenti sulle immagini OCT (Figura 8B).
Distacco vitreo incompleto (PVD) in topi knockout Vldlr
I risultati dell'OCT hanno mostrato alcune bande riflettenti centrali sulle superfici retiniche dei topi knockout Vldlr (Figura 8B, frecce rosse). Queste bande riflettenti centrali aderivano al vaso retinico (Figura 8B, freccia verde), corrispondente all'immagine cSLO (Figura 8A, freccia verde). Queste caratteristiche sono coerenti con le caratteristiche OCT del distacco incompleto del vitreo.
Neovascolarizzazione sottoretinica in topi knockout Vldlr
I risultati hanno mostrato che la neovascolarizzazione sottoretinica aveva due modalità di sviluppo nei topi knockout Vldlr .
Con coinvolgimento dello strato nucleare esterno
Una lesione iperriflettente, con una forma triangolare dal basso verso il basso sull'immagine OCT, è apparsa sullo spazio sottoretinico e si è diffusa allo strato nucleare esterno. La lesione non ha sfondato lo strato plessiforme esterno (Figura 8B, freccia bianca).
L'aspetto OCT di questo tipo di neovascolarizzazione sottoretinica era coerente con i risultati patologici mostrati nella Figura 9A. La sezione patologica ha mostrato che la neovascolarizzazione (Figura 9A, freccia verde spessa) ha sfondato l'RPE, i segmenti interni / esterni dei fotorecettori (IS / OS) e la membrana limitante esterna (ELM). Ha invaso lo strato nucleare esterno (ONL) ma non ha sfondato lo strato plessiforme esterno (OPL).
Senza coinvolgimento dello strato nucleare esterno
Una banda di lesione iperriflettente è apparsa sull'immagine OCT, che si trovava nello spazio sottoretinico (Figura 8B, freccia gialla). L'immagine cSLO mostrava la posizione corrispondente (Figura 8A, freccia gialla). Le scansioni aggiuntive della retina intorno a questa posizione (Figura 8A, freccia gialla) hanno mostrato gli stessi risultati.
Coerentemente con la lesione (Figura 10A, spessa freccia blu) nella sezione patologica, questa neovascolarizzazione sottoretinica non ha sfondato l'ELM (Figura 10A, sottile freccia gialla) ma ha coinvolto parzialmente il fotorecettore IS/OS.
Risultati dello spessore retinico
Lo spessore retinico dell'occhio destro di tutti i topi è stato ottenuto utilizzando la funzione di stratificazione automatica e misurazione dello spessore di OCT. Lo spessore retinico dei topi knockout Vldlr (200,94 ± 14,64 μm) era significativamente inferiore a quello dei topi C57BL / 6J (217,46 ± 10,21 μm, P < 0,001, t-test, 7 occhi destri / gruppo). Il confronto dello spessore retinico nelle quattro direzioni (temporale, nasale, superiore e inferiore) del polare posteriore tra i due gruppi è mostrato nella Figura 11.
Figura 1: Preparazione di materiali sperimentali e animali. (A) Attrezzatura: 1. dispositivo cSLO/OCT per l'imaging della retina di piccoli animali, 2. computer e monitor, 3. Piccola piattaforma animale a temperatura costante, 4. termostato, 5. lente preimpostata, 6. installazione della lente preimpostata. (B) Medicinali e piccoli oggetti: I. povidone-iodio, II. microsiringa, III. soluzione di miscela anestetica, IV. timer, V. collirio mydriatic, VI. forcipe, VII. gel ialuronato di sodio medico, VIII. cotton fioc medico, IX. unguento antibiotico per gli occhi, X. 100 D lenti a contatto (due). (C) Misurazione del peso su una bilancia digitale. Abbreviazioni: cSLO = oftalmoscopio laser a scansione confocale; OCT = tomografia a coerenza ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Preparazione dei topi prima dell'esame OCT . (A) applicazione di colliri di midriasi, (B) rivestimento in gel ialuronato di sodio sulla cornea, (C, D) posizionamento di una lente a contatto 100 D, con superficie concava a contatto con la cornea. Abbreviazione: OCT = tomografia a coerenza ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Procedure d'esame PTOM . (A) Posizione del mouse, I. obiettivo preimpostato, II. lenti a contatto, III. Piccola piattaforma animale a temperatura costante. (B) Funzionamento della macchina cSLO/OCT, IV. leva di comando, V. leva di inclinazione, VI. Dispositivo cSLO. Abbreviazioni: cSLO = oftalmoscopio laser a scansione confocale; OCT = tomografia a coerenza ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Processo di imaging dello Strumento di personalizzazione (OCT). A. Modalità di misurazione , B. Start Laser del laser IR, C. selezione degli occhi (C-1-OD; C-2-OS), D. gamma del laser IR, E. la diottria, F. sovrapposizione dell'immagine cSLO, G. pulsante di avvio/arresto della scansione OCT H. riferimento dell'immagine OCT, I. Intervallo minimo: 0-20, J. Intervallo massimo: 50-60, K. intensità del segnale dell'immagine, L. direzione di scansione (ad esempio, scansione verticale), M. posizione di scansione selezionata spostando la linea di riferimento verde (ad esempio, scansione verticale attraverso la papilla ottica), N. visualizzazione in tempo reale dell'immagine OCT, O. sovrapposizione dell'immagine OCT, P. Scatto: acquisizione dell'immagine, Q. Immagini SLO-OCT acquisite, R. Salva esame: salvataggio del risultato dell'esame. Barre della scala = 200 μm. Abbreviazioni: cSLO = oftalmoscopio laser a scansione confocale; OCT = tomografia a coerenza ottica; IR = infrarosso; OD = occhio destro; OS = occhio sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Interfaccia automatica di delaminazione retinica sul sistema OCT. A. Pulsante Esame carico , B. Contenitore multimediale, che mostra tutte le immagini OCT, C. Immagine OCT selezionata per l'analisi, D. Pulsante di rilevamento dello strato per la stratificazione automatica della retina, E. elenco delle linee divisorie, F. delaminazione automatica sulla retina, G. Pulsante Modifica livello per la correzione dei livelli, H. Salva esame per salvare i risultati. Barre della scala = 200 μm. Abbreviazione: OCT = tomografia a coerenza ottica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Correzione stratificata (A-C) e misurazione dello spessore (D-E). (A) Interfaccia di attivazione della modifica a più livelli: 1. Pulsante Modifica livello, 2. elenco delle linee divisorie (ad esempio, selezione di tutte le linee), 3. linee divisorie attivate, 4. Regolazione della spaziatura, 5. Regolazione dell'intervallo limite. (B) Attivazione di una linea divisoria (ad esempio, linea 3 in A), 6. linea 3, la linea tra lo strato plessiforme interno e lo strato nucleare interno, 7. Un esempio di errore di stratificazione. (C) Modifica dell'errore di stratificazione, 8. Il cerchio rosso per la modifica. (D) Un esempio di misurazione dello spessore lamellare retinico, 9. Pulsante Misura marcatore, 10. linee divisorie dello strato nucleare esterno, 11. Connetti con Layer (la misurazione si collegherà con il layer in base alle linee divisorie), 12. Rimani connesso in movimento (la posizione di misurazione è dove rimane il clic manuale), 13. la posizione della visualizzazione dei risultati, 14. la linea di misura (perpendicolare all'asse orizzontale). (E) Acquisizione dei risultati delle misurazioni, 15. i risultati della misurazione (rettangolo rosso: il valore Vert è il risultato dello spessore), 16. Pulsante Elimina marcatore per l'eliminazione del record di misurazione, 17. Nuovo pulsante Marker per la rimisurazione (il nuovo risultato sovrascriverà il record originale). Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Misurazione dello spessore retinico completo. A. Pulsante marcatore di misura, B. selezione della linea 1 (ILM) e C. linea 7 (OS-RPE) per mostrare i confini della retina a tutto spessore, D. Connetti con selezione del livello, E. Rimani connesso alla selezione Sposta, F. barra righello (barre righello verticali e orizzontali, entrambe lunghe 200 μm), G. linee di misurazione sulla retina (4 linee con 200 μm di lunghezza del righello orizzontale come spaziatura su ciascun lato di la papilla ottica), H. i risultati della misurazione (i risultati sono differenziati da diversi colori e corrispondono al colore delle linee di misurazione sulla retina), I. Estrazione dei dati dal valore Vert nella riga Lunghezza in μm (tessuto). Barre della scala = 200 μm. Abbreviazioni: ILM = membrana limitante interna; OS-RPE = segmento esterno del fotorecettore dell'epitelio pigmentato retinico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Confronto tra immagini cSLO e OCT di topi Vldlr knockout e C57BL/6J. Immagini cSLO (A) e OCT (B) di topi knockout Vldlr confrontate con le immagini cSLO (C) e OCT (D) di topi C57BL/6J. Caratteristiche dell'OCT nei topi knockout Vldlr (B): 1) Linea riflettente centrale (B, frecce rosse) sulla superficie interna della retina con adesione al vaso retinico (B, freccia verde). 2) Lesioni iperriflettenti, localizzate nello spazio sottoretinico, con (B, freccia bianca) o senza (B, freccia gialla) coinvolgimento dello strato nucleare esterno. Le frecce sull'immagine cSLO (A) rappresentano le posizioni delle frecce colorate corrispondenti sull'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office (B). Barre della scala = 200 μm. Abbreviazioni: cSLO = oftalmoscopio laser a scansione confocale; OCT = tomografia a coerenza ottica; Vldlr = recettore delle lipoproteine a bassissima densità. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Modalità 1: sezioni di paraffina retinica con colorazione ematossilina-eosina nel knockout Vldlr e nel topo C57BL/6J. (A) Un esempio di neovascolarizzazione sottoretinica che invade lo strato nucleare esterno (spessa freccia verde), situato nella parte centrale della retina di un topo knockout Vldlr. (B) Controllo normale, la parte centrale della retina di un topo C57BL/6J. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: Vldlr = recettore delle lipoproteine a bassissima densità; ILM = membrana limitante interna; NFL = strato di fibre nervose retiniche; GCL = strato di cellule gangliari retiniche; IPL = strato plessiforme interno; INL = strato nucleare interno; OPL = strato plessiforme esterno; ONL = strato nucleare esterno; ELM = membrana limitante esterna; IS = segmento interno del fotorecettore; OS = segmento esterno del fotorecettore; RPE = strato di epitelio pigmentato retinico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Modalità 2: sezioni di paraffina retinica con colorazione dell'ematossilina-eosina nel knockout Vldlr e nel topo C57BL/6J. (A) Un esempio di neovascolarizzazione sottoretinica senza il coinvolgimento dello strato nucleare esterno (freccia blu spessa) e con ELM intatto (sottile freccia gialla), situato nella retina della periferia media in un topo knockout Vldlr. (B) Controllo normale, la retina della periferia media di un topo C57BL/6J. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: VLDR = recettore delle lipoproteine a bassissima densità; ILM = membrana limitante interna; NFL = strato di fibre nervose retiniche; GCL = strato di cellule gangliari retiniche; IPL = strato plessiforme interno; INL = strato nucleare interno; OPL = strato plessiforme esterno; ONL = strato nucleare esterno; ELM = membrana limitante esterna; IS = segmento interno del fotorecettore; OS = segmento esterno del fotorecettore; RPE = strato di epitelio pigmentato retinico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Confronto dello spessore retinico tra topi C57BL/6J e topi knockout Vldlr (tutti i dati dall'occhio destro). (A) Spessore retinico (μm) attraverso la papilla del nervo ottico mediante scansione orizzontale OCT. (B) Spessore retinico (μm) attraverso la papilla del nervo ottico mediante scansione verticale OCT. La coordinata orizzontale rappresenta le posizioni di misura con spaziatura di 200 μm.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Abbreviazioni: T = Temporale; P = Papilla ottica; N = nasale; S = Superiore; I = Inferiore; OCT = tomografia a coerenza ottica; VLDR = recettore della lipoproteina a bassissima densità; OD = occhio destro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
In questo studio, l'imaging OCT utilizzando un sistema di imaging retinico di piccoli animali è stato applicato per valutare i cambiamenti retinici nei topi knockout Vldlr , che dimostrano distacco posteriore del vitreo incompleto, neovascolarizzazione sottoretinica e assottigliamento dello spessore retinico. OCT è un metodo di imaging non invasivo per esaminare la condizione della retina in vivo. La maggior parte dei dispositivi OCT sono progettati per l'esame oculistico umano. Le dimensioni dell'apparecchiatura hardware, l'impostazione della lunghezza focale, l'impostazione dei parametri di sistema e i requisiti di posizionamento del candidato sono tutti basati sull'occhio umano. Sono necessarie modifiche dell'obiettivo e delle impostazioni di sistema per esaminare piccoli animali con apparecchiature OCT specifiche per l'uomo. Questo documento presenta le procedure di esame dei PTOM per i piccoli animali.
La lunghezza focale è diversa durante la scansione delle immagini di diversi piccoli animali con diverse dimensioni di bulbi oculari. Questa differenza di lunghezza focale è fondamentale e deve essere risolta per ottenere immagini chiare e accurate del fondo oculare. Un metodo efficace è la sostituzione dell'obiettivo con lenti di diversa curvatura. A causa del suo piccolo bulbo oculare, il topo ha bisogno di una lente a contatto di 100 D davanti alla cornea oltre alla lente preimpostata a doppia sferica 60 D dell'apparecchiatura OCT.
Lo Strumento di personalizzazione di Office può fornire solo scansioni di linea che coprono solo una regione limitata della retina. Pertanto, è essenziale standardizzare il protocollo delle scansioni OCT per il confronto qualitativo e quantitativo dei risultati OCT in diversi gruppi. Qui sono state eseguite tre scansioni orizzontali e tre scansioni verticali. Questa macchina fornisce un'immagine cSLO in tempo reale per monitorare la posizione della scansione OCT in modo che la posizione della scansione possa essere regolata in modo accurato e conveniente. Ulteriori scansioni possono essere aggiunte quando viene rilevato un riflesso anomalo.
I parametri di acquisizione delle immagini devono essere regolati con attenzione. Qui, si consiglia che l'intervallo Min sia 0-20 e l'intervallo Max sia 50-60 (Figura 4I, J). Quando i parametri sono sovraregolati, il contrasto del segnale dell'immagine sarebbe migliorato e il segnale riflesso della retina con bassa riflessione diventa più basso o addirittura nero, e alcune informazioni morfologiche andranno perse.
Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti per evitare il deterioramento della qualità dell'immagine: 1. Posizionare una lente a contatto davanti agli occhi immediatamente dopo l'anestesia per evitare la cataratta; 2. Assicurarsi che la lente preimpostata e la lente a contatto siano pulite; 3. Evitare che i capelli entrino tra la cornea e la lente a contatto; 4. Assicurarsi che il doppler, il contrasto e la luminosità nei parametri dello Strumento di personalizzazione di Office siano impostati correttamente.
Le immagini OCT possono essere utilizzate per rilevare qualitativamente le lesioni e misurare quantitativamente metriche come lo spessore della retina. Qui, viene proposto un metodo per misurare lo spessore retinico in diverse posizioni e la media può essere calcolata come spessore medio della retina. Ciò è ottenuto attraverso la funzione di stratificazione automatica del sistema OCT. Pertanto, è possibile misurare anche lo spessore delle lamierinazioni retiniche. Il metodo di misurazione è semplice e preciso (Figura 6 e Figura 7). I risultati hanno mostrato che lo spessore della retina era inferiore nei topi knockout Vldlr rispetto ai topi C57BL / 6J, in linea con la letteratura25. La differenza nello spessore retinico tra i due gruppi può essere chiaramente mostrata da un grafico generato dalle misurazioni in più posizioni (Figura 11). Analisi della retinopatia e metodi di misurazione dello spessore retinico simili sono stati riportati anche nel modello murino26 della malattia di Stargardt. Tuttavia, vale la pena notare che le bande iperriflettenti all'interfaccia vitreale della retina non appartengono al tessuto retinico e devono essere rimosse durante la stratificazione. Inoltre, se le lesioni sottoretiniche invadono la retina, la misurazione dello spessore dovrebbe includere la porzione invasa.
Questo sistema di imaging retinico per piccoli animali ha alcune limitazioni. Ad esempio, sebbene possa fornire immagini chiare del polo posteriore entro 35°, l'acquisizione di immagini della retina periferica è ancora impegnativa. Inoltre, cSLO forma un'immagine in scala di grigi, che non è buona come un'immagine del fondo oculare a colori per rilevare lesioni del fondo oculare (pigmentazione, sanguinamento, essudazione). Pertanto, sono necessari ulteriori miglioramenti. In sintesi, l'esame OCT da parte della macchina cSLO potrebbe facilitare il rilevamento non invasivo e la misurazione della retinopatia nei modelli murini.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Fonte del progetto: Fondazione di scienze naturali della provincia del Guangdong (2018A0303130306). Gli autori desiderano ringraziare l'Ophthalmic Research Laboratory, il Joint Shantou International Eye Center della Shantou University e la Chinese University di Hong Kong per i finanziamenti e i materiali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
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