Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

המחקר מפרט את המתודולוגיה של מיפוי FRET כולל בחירת אתרי תיוג, בחירת צבעים, רכישה וניתוח נתונים. מתודולוגיה זו יעילה בקביעת אתרי קשירה, שינויים קונפורמיים ותנועות דינמיות במערכות חלבונים, והיא שימושית ביותר אם היא מבוצעת בשילוב עם מידע מבני תלת-ממדי קיים.

Abstract

העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא שיטה מבוססת פלואורסצנטיות מבוססת המשמשת למדידה מוצלחת של מרחקים בתוך ובין ביו-מולקולות במבחנה , כמו גם בתוך תאים. ב-FRET, היעילות של העברת אנרגיה, הנמדדת על ידי שינויים בעוצמת הפלואורסצנציה או באורך החיים, מתייחסת למרחק בין שתי מולקולות או תוויות פלואורסצנטיות. קביעת דינמיקה ושינויים קונפורמיים מהמרחקים הם רק כמה דוגמאות ליישומים של שיטה זו למערכות ביולוגיות. בתנאים מסוימים, מתודולוגיה זו יכולה להוסיף ולשפר מבנים גבישיים קיימים של קרני רנטגן על ידי מתן מידע לגבי דינמיקה, גמישות והתאמה למשטחי קישור. אנו מתארים את השימוש ב-FRET ובקביעות מרחק נלוות כדי להבהיר תכונות מבניות, באמצעות זיהוי אתר איגוד או אוריינטציות של תת-יחידות דימר. באמצעות בחירה מושכלת של אתרי תיוג, ולעתים קרובות שימוש באסטרטגיות תיוג מרובות, יישמנו בהצלחה שיטות מיפוי אלה כדי לקבוע תכונות מבניות גלובליות בקומפלקס חלבון-DNA ובמערכת טרנסלוקציה של חלבונים SecA-SecYEG. במערכת SecA-SecYEG, השתמשנו בשיטות מיפוי FRET כדי לזהות את אתר קישור הפרה-פרוטאין ולקבוע את ההתאמה המקומית של אזור רצף האותות המאוגדים. מחקר זה מתאר את השלבים לביצוע מחקרי מיפוי FRET, כולל זיהוי אתרי תיוג מתאימים, דיון בתוויות אפשריות, כולל שאריות של חומצות אמינו שאינן מקומיות, הליכי תיוג, כיצד לבצע מדידות ופירוש הנתונים.

Introduction

עבור חלבונים, הבהרת הדינמיקה יחד עם ידע מבני תלת-ממדי (תלת-ממדי) מובילה להבנה משופרת של יחסי מבנה-תפקוד של מערכות ביו-מולקולריות. שיטות מבניות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית, לוכדות מבנה סטטי ולעתים קרובות דורשות קביעת מבנים מרובים כדי להבהיר היבטים של קשירת ביו-מולקולציה ודינמיקה1. מאמר זה דן בשיטה מבוססת פתרון למיפוי אלמנטים מבניים גלובליים, כגון אתרי קשירה או אינטראקציות איגוד, שעשויים להיות ארעיים יותר ופחות קלים ללכידה בשיטות סטטיות. מערכות מועמדות חזקות למתודולוגיה זו הן כאלה שבהן מבנה תלת-ממדי נקבע בעבר על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה של NMR או שיטות מבניות אחרות. במקרה זה, אנו מנצלים את המבנה הגבישי של קרני הרנטגן של קומפלקס SecA-SecYEG, שחקן מרכזי במסלול ההפרשה הכללי של חלבונים, כדי למפות את מיקומו של אתר קשירת פפטידי אותות באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) לפני הובלת הפרפרוטאין על פני הממברנה2. מניפולציה של המערכת הביולוגית באמצעות שינויים גנטיים יחד עם הידע שלנו על המבנה התלת-ממדי אפשרו את קביעת הקונפורמציה של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם מיד לפני ההחדרה לערוץ 3.

FRET כולל העברה נטולת קרינה של אנרגיה ממולקולה אחת (תורם) לאחרת (מקבל) באופן תלוי מרחק שנמצא דרך חלל 4,5. היעילות של העברה זו מנוטרת באמצעות ירידה בתורם או עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של המקבלים. ניתן לתאר את היעילות של העברת אנרגיה כ

E = R06/(R06 + R6)

שבו ערך R0 הוא המרחק שבו ההעברה יעילה ב-50%6. הטכניקה תוארה בעבר כשליט מולקולרי והיא יעילה בקביעת מרחקים בטווח של 2.5-12 ננומטר, בהתאם לזהותם של צבעי התורם-מקבל 4,7,8,9. עוצמות הפלואורסצנציה של התורם ואורך החיים עם או בלי מקבל מאפשרים קביעת יעילות ההעברה וכתוצאה מכך, מרחקים 5,8. בשל זמינות הטכנולוגיה, רגישות השיטה וקלות השימוש, FRET מצאה יישום רחב גם בתחומים כגון ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת ומיקרוסקופיה קונפוקלית6. הופעתם של חלבונים פלואורסצנטיים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק הפכה את התצפית על דינמיקה תוך-תאית והדמיה של תאים חיים לקלה יחסיתל-10,11. יישומי FRET רבים כגון אלה נדונים בפירוט בנושא וירטואלי זה.

במחקר זה, אנו מתמקדים במיוחד בשימוש במדידות FRET כדי להניב ערכי מרחק כדי לקבוע פרטים מבניים. בעבר, נעשה שימוש יעיל במדידות FRET כדי לקבוע את הקונפורמציה של מולקולות דנ"א כאשר הן קשורות לחלבון 12,13,14, לדינמיקה הפנימית של חלבונים ולאינטראקציות קושרות חלבונים 15,16,17. היתרונות של שיטה זו טמונים ביכולת לקבוע אלמנטים מבניים גמישים ודינמיים בתמיסה עם כמויות נמוכות יחסית של חומר. באופן משמעותי, שיטה זו יעילה במיוחד כאשר משתמשים בה בשילוב עם מידע מבני קיים ואינה יכולה לשמש כאמצעי לקביעת מבנה תלת-ממדי. השיטה מספקת את התובנה הטובה ביותר ואת העידון של המבנה אם העבודה מתבססת על מידע מבני קיים שלעתים קרובות בשילוב עם סימולציה חישובית18,19. כאן מתואר השימוש במרחקים המתקבלים ממדידות FRET במצב יציב ובזמן לפתרון זמן כדי למפות אתר מחייב, שמיקומו לא היה ידוע, על מבנה קריסטלוגרפי קיים של קומפלקס SecA-SecYEG, חלבונים עיקריים במסלול ההפרשה הכללי3.

מסלול ההפרשה הכללי, מערכת שמורה מאוד, מפרוקריוטים דרך אאוקריוטים ועד ארכיאה, מתווך את העברת החלבונים לרוחב או לתוך הממברנה למיקומה התפקודי של התא. עבור חיידקים גראם-שליליים, כגון E. coli, האורגניזם ששימש במחקר שלנו, חלבונים מוחדרים לתוך הממברנה הפנימית או עוברים טרנסלוקציה על פני הממברנה הפנימית לפריפלסמה. קומפלקס תעלות ה-SecY החיידקי (המכונה טרנסלוקון) מתאם עם חלבונים אחרים כדי לבצע טרנסלוקציה של החלבון המסונתז החדש, המופנה למיקומו הנכון בתא באמצעות רצף אותות הממוקם בדרך כלל ב-N-terminus20,21. עבור חלבונים הקשורים לפריפלזמה, החלבון ATPase SecA מתחבר למנהרת היציאה של הריבוזום, ועם הפריפרוטאין לאחר שכ-100 שאריות תורגמו22. יחד עם חלבון המלווה של SecB, הוא שומר על הפרפרוטאין במצב של התגלגלות. SecA נקשר לטרנסלוקון SecYEG, ובאמצעות מחזורים רבים של הידרוליזה של ATP, מאפשר הובלת חלבונים על פני הממברנה23,24.

SecA הוא חלבון רב-תחומי שקיים בצורות ציטוזוליות וממברנה הקשורות לממברנה. החלבון ההומודימרי בציטוזול, SecA מורכב מתחום קשירת פרפרוטאין או קישור צולב25, שני תחומים קושרי נוקלאוטידים, תחום כנף סלילית, תחום פיגומים סליליים ושתי אצבעות סליל (THF)26,27,28,29 (איור 1). במחקרים קריסטלוגרפיים קודמים של קומפלקס SecA-SecYEG, מיקומו של ה-THF הציע כי הוא היה מעורב באופן פעיל בטרנסלוקציה של חלבונים וניסויים צולבים שלאחר מכן עם פפטיד האותות ביססו עוד יותר את המשמעות של אזור זה בטרנסלוקציה של חלבונים30,31. מחקרים קודמים, שהשתמשו במתודולוגיית המיפוי FRET, הראו כי פפטידי אותות אקסוגניים נקשרים לאזור זה של SecA 2,32. כדי להבין באופן מלא את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרה-פרוטאין לפני ההחדרה לתעלת SecYEG, נוצרה כימרה חלבונית שבה רצף האותות והשאריות של האזור הבוגר המוקדם חוברו ל-SecA באמצעות מקשר Ser-Gly (איור 1). באמצעות מבנה בר-קיימא ביולוגית זה, הוכח עוד יותר כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין נקשרים ל-THF באופן מקביל2. לאחר מכן, מתודולוגיית מיפוי FRET שימשה כדי להבהיר את הקונפורמציה והמיקום של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם בנוכחות SecYEG כמתואר להלן3.

הידע על המבנה התלת-ממדי של מתחם SecA-SecYEG 33,34,35 והמיקום האפשרי של אתר הכריכה אפשרו לנו למקם באופן שיפוטי תוויות תורמים-מקבלים במיקומים שבהם ההצטלבות של מרחקי FRET בודדים מזהה את מיקום אתר הכריכה. מדידות מיפוי FRET אלה גילו כי רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין יוצרים סיכת שיער עם הקצה הממוקם בפתחו של ערוץ SecYEG, מה שמדגים כי מבנה סיכות השיער מעוצב לפני החדרת התעלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בחירת אתרי תיוג

  1. זהה לפחות שלושה אתרי תיוג פוטנציאליים כדי לשלש את אתר הקשירה הפוטטיבי על מבני החלבונים הקיימים. במקרה זה, SecA, SecYEG ופרפרוטאין המחוברים ל- SecA באמצעות איחוי גנטי זוהו2.
    1. בחר אתרי תיוג בטווח של 25-75 Å מאתר הקשירה הפוטטיבי ובאזורים סטטיים יחסית של החלבון, המרחק יקבע את זוג צבעי ה- FRET הספציפי שישמש36. אתרו את אתרי הסימון באזורי חלבונים הנבדלים יחסית זה מזה, כך שהאתרים יתארו את הקודקודים של משולש כאשר אתר הקשירה הפוטטיבי ממוקם במרכזו (איור 1A-D).
    2. להציג או לזהות שאריות ציסטאין (Cys) באתרי תיוג בעלי עניין בחלבון שאין לו שאריות Cys אחרות, כדי לשפר את יעילות הסימון של האתר הספציפי37,38.
    3. הציגו חומצות אמינו לא טבעיות, למשל p-azidophenylalanine לתיוג באמצעות כימיה של קליקים, על מנת לתייג ביעילות חלבון אחד בשתי עמדות נפרדות עם צבעים שונים39,40.
    4. בדוק את המוטנטים של Cys לאובדן תפקוד. אמתו את הפעילות של המוטציה חסרת ה-Cys ואת המוטציה הלא טבעית של חומצות האמינו באמצעות בדיקת פעילות מתאימה. במקרה זה, הפעילות אומתה עם בדיקת צמיחה ואחריה בדיקת ATPase ירוקה במבחנה 32,41,42

2. תיוג החלבון

  1. טהרו את החלבון או החלבונים המעניינים לפחות 95% לצורך תיוג מדויק. לטהר חלבוני SecA ו- SecYEG בהתאם לפרוטוקולים המפורטים בהפניה3. ודא שיש לך לפחות 5 מיקרוגרם של חלבון מטוהר לשלב זה, מכיוון שחלק מהחלבון יאבד במהלך תהליך הסימון.
  2. בחר שני צבעים למדידות FRET בהתאם לערך R0 שלהם ולמרחקים החזויים בין אתרים מסומנים. הערך ערכי R0 וציין את פליטת התורמים ואת חפיפת ספיגת המקבלים באמצעות המידע ממסד הנתונים של חלבונים פלואורסצנטיים, אשר נותן גם ספקטרה עבור צבעים נפוצים (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    הערה: R0 מוגדר כמרחק שבו יעילות ההעברה היא 50% עבור זוג צבעים נתון. עבור ניסויי מיפוי, המרחקים החזויים צריכים להיות קרובים לערך R0 של זוג הצבעים כדי להבטיח שניתן יהיה למדוד מרחקים במדויק.
  3. סמן את המיקומים שזוהו בשלב 1.1.1. עם צמד הצבעים התורם-מקבל.
    1. סמן את החלבון על פי הוראות היצרן תוך מתן תשומת לב מיוחדת לפרמטרים כגון ריכוז חלבון אופטימלי, טמפרטורה, pH, משך זמן ומאגר עבור הצבעים הספציפיים שבהם נעשה שימוש 43,44.
    2. הכינו את החלבון בריכוז של 1-2 מ"ג/מ"ל או כ-10 מיקרומטר ב-25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffer. ממיסים צבע בדימתילפורמיד (DMF) או דימתילסולפוקסיד (DMSO) לריכוז סופי של 1 mM. מוסיפים את הצבע בצורה טיפתית לתמיסה תוך כדי ערבוב כדי להגיע לצבע: יחס חלבון טוחן של 5:1 (50 μM צבע: 10 μM חלבון).
    3. אפשרו לתגובה להמשיך במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT) בבקבוקון זכוכית עם נדנדה עדינה או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. עצור את התגובה על ידי הוספת β-mercaptoethanol.
      הערה: אם החלבון אינו תואם למאגר Tris, ניתן להשתמש במאגרי פוספט או HEPES. שמור על pH בטווח של 7.0-7.5. אם לחלבון יש קשרים דיסולפידיים, הוסיפו חומר מחזר כגון DTT או TCEP לפני התוויה. הסר DTT על ידי דיאליזה או סינון ג'ל לפני הוספת צבע.
  4. למדידות FRET מדויקות, הסר את הצבע החופשי באמצעות רכז צנטריפוגלי עם חתך משקל מולקולרי מתאים (MWCO) כדי לאפשר לצבע החופשי לזרום דרכו תוך שמירה על החלבון המסומן.
    1. הכן את קרום הריכוז על ידי הצבת ~ 1 מ"ל של מים בחלק העליון של רכז 3 מ"ל ולאחר מכן צנטריפוגה של המים דרך הממברנה (לפחות 10 דקות ב 4,300 x גרם).
    2. הסר צבע חופשי על ידי צנטריפוגה מדגם מסומן ברכז (20 דקות ב 4,300 x g). חזרו על הפעולה 3-4 פעמים והשליכו את הזרימה.
    3. בדוק את יעילות הסימון של החלבון המסומן באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגת UV-Vis.
      הערה: מדידות FRET דורשות יעילות תיוג של 50% או יותר. יעילות תיוג נמוכה יותר מפחיתה את אות ה- FRET ועלולה להוביל לאי דיוקים במדידה.
    4. קבל ספקטרום UV-Vis של החלבון המסומן עם טווח של 250-700 ננומטר כדי לצפות הן ברצועת ספיגת החלבון והן ברצועת הספיגה המרבית של הצבע. מדוד את הספיגה בשיא הספיגה של הצבע וב-280 ננומטר עבור חלבון.
    5. קבע את ריכוז החלבון ותקן עבור כל תרומה מהצבע באמצעות מקדם התיקון, CF, והמשוואות הבאות45,46:
      Equation 1
      כאשר C הוא ריכוז החלבון (M), A280 הוא ספיגת הדגימה ב-280 ננומטר, Aמקסימום הוא הספיגה בספיגת הצבע המקסימלית, ε החלבון הוא מקדם ההכחדה של החלבון ב-280 ננומטר ו-CF הוא גורם התיקון, A'280/A'max, כאשר A'280 הוא הספיגה ב-280 ננומטר ו-A'max הוא הספיגה בשיא המקסימלי עבור הצבע בלבד.
    6. קביעת יעילות התוויות באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 2
      כאשר צבע ε הוא מקדם ההכחדה הטוחנת של הצבע, C הוא ריכוז החלבון כפי שנקבע בשלב 2.4.5, ו-E הוא יעילות הסימון. חזור על שלב 2.4.2 עד שערך יעילות הסימון הוגדל והוא פחות מ- 100%.

3. קבע את ערכי R 0

  1. מדוד את ערכי R0 באתרו. הכינו שתי דגימות חלבון באותו ריכוז של סך החלבון, 4 μM, אחת עם החלבון המסומן בצבע התורם בלבד ואחת עם החלבון המסומן בצבע המקבל בלבד. עבור SecA, ריכוז חלבון של מונומר 4 μM SecA עובד היטב עבור מדידות אלה.
    1. הכינו נפחי דגימה של 2.5 מ"ל עבור קובט בגודל 1 ס"מ x 1 ס"מ, 600 μL עבור קובט 5 מ"מ x 5 מ"מ או 200 μL עבור קובט 3 מ"מ x 3 מ"מ.
  2. הפעל את הפלואורומטר ופתח את תוכנית הרכישה והניתוח הספקטרלית בתוכנת הפלואורסצנציה אם אתה משתמש בספקטרופלואורומטר. לחץ על M האדום כדי לחבר את המחשב למכשיר (איור 2A) ובחר ספקטרום פליטה.
    1. הזן פרמטרים של סריקה כגון אורך גל של עירור, הטווח של סריקת פליטה, טמפרטורה ומיקום מחליף דגימה באמצעות פריט התפריט Collect Experiment (איור 2B).
    2. לחץ על RTC ובצע אופטימיזציה של הגדרות המכשיר (למשל, חריצים ספקטרליים) על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה בשיא באמצעות אורך גל של עירור שנקבע במקסימום הקליטה של הצבע. עבור SecA, הגדר את ההגדרות הבאות: פס פס כ- 1 ננומטר; עירור וחריצי פליטה כ-1 ו-1.5 מ"מ בהתאמה, כאשר הטמפרטורה היא 25 מעלות צלזיוס ומהירות הערבוב ב-250 סל"ד.
      הערה: אין לחרוג מקיבולת הספירות לשנייה (cps) של המכשיר (בדרך כלל 2 x 106 cps).
  3. מקם את דגימת החלבון המסומנת על ידי התורם במחזיק הדגימה ולחץ על הפעל כדי ליצור סריקת פליטה של החלבון המסומן בצבע התורם בלבד (חלבון התורם בלבד) על ידי העברת הדגימה בספיגת הצבע המרבית (למשל, 488 ננומטר עבור AF488) וסריקה מעל שיא הפליטה (505-750 ננומטר עבור חלבון SecA תורם בלבד המסומן ב- AF488).
  4. קבעו קו בסיס לסריקה על ידי הארכת הסריקה ב-25-50 ננומטר מעבר לסוף השיא. מדדו את התפוקה הקוונטית של החלבון התורם בלבד, על ידי ביצוע מדידות ספיגה ופלואורסצנציה על דגימות בריכוזים שונים כמתואר47. שמור על אותן הגדרות חריץ עבור מדידות אלה.
    1. השתמש בצבע התורם החופשי כהפניה לתפוקה הקוונטית. קבל לפחות ארבע מדידות של החלבון התורם בלבד והצבע החופשי בריכוזים שונים לצורך קביעה מדויקת.
    2. התאם את עוצמת הפלואורסצנציה או האזור המשולב לעומת הספיגה של החלבון התורם בלבד והצבע החופשי או הייחוס. קבע את המדרונות עבור החלבון התורם בלבד (שיפועD) ואת הייחוס (SlopeR).
    3. התשואה הקוונטית (Φ) מחושבת באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 3
      כאן ΦD הוא התשואה הקוונטית של החלבון התורם בלבד, ΦR הוא התשואה הקוונטית של הצבע החופשי (בדרך כלל ניתן להשיג זאת מהיצרן), שיפועD ומדרוןR הם המדרונות שנקבעו בשלב 3.4.2 עבור החלבון והייחוס היחידים של התורם, בהתאמה ηD ו- ηR מייצגים את מדד השבירה של החלבון התורם בלבד ואת תמיסות הצבע ללא ייחוס, בהתאמה 47.
  5. השג ספקטרום ספיגה של החלבון שלך למקבל בלבד באמצעות תא באורך 1 ס"מ. צרו ספקטרום מקדם הכחדה של החלבון שלכם שמקבלים בלבד על ידי חלוקת ספקטרום הספיגה בריכוז הצבע.
  6. צור את אינטגרל החפיפה הספקטרלי, J (λ) באמצעות תוכנית אנליזה גרפית. ניתן להשתמש גם בתוכנית גליון עבודה סטנדרטית (לדוגמה, גיליון אלקטרוני) עבור תהליך זה.
    1. הכפל את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של החלבון התורם בלבד (שלב 3.4) בספקטרום מקדם ההכחדה של החלבון המקבל בלבד כדי ליצור את ספקטרום החפיפה.
    2. הכפל את ספקטרום החפיפה המתקבל ב- λ4.
    3. קבע את השטח שמתחת לעקומה על ידי שילוב של אזור החפיפה. אזור החפיפה מוגדר כאזור שבו ספקטרום פליטת התורמים המוכפל בספקטרום מקדם ההכחדה של המקבל מניב ערכים חיוביים. אינטגרל החפיפה הספקטרלי מוגדר כ:
      Equation 4
      כאשר FD (λ) הוא ספקטרום הפליטה של החלבון התורם בלבד (המתקבל בשלב 3.4) ו-εA(λ) הוא ספקטרום מקדם ההכחדה של החלבון המקבל בלבד ויש לו יחידות של M-1 cm-1 (המתקבל בשלב 3.5). אינטגרל החפיפה הספקטרלי המתקבל צריך לכלול יחידות של M-1 cm-1 nm4.
    4. נרמל את אינטגרל החפיפה הספקטרלית. חלקו את אינטגרל החפיפה בשטח המשולב של ספקטרום החלבון היחיד של התורם על פני אותו טווח ספקטרלי:
      Equation 5
    5. חישוב הערך R0 ב- Å באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 6
      כאשר κ2 הוא גורם הכיוון, הנלקח בדרך כלל כ- 2/3 עבור צבעים המסתובבים בחופשיות, η הוא מדד השבירה וניתן לקירוב כ- 1.33 עבור תמיסות מימיות מדוללות, QD הוא התשואה הקוונטית של התורם (שלב 3.4) ו- J(λ) הוא אינטגרל החפיפה הספקטרלי כפי שנקבע בשלב 3.6.35. הערה: אם הצבעים אינם מסתובבים באופן חופשי, ניתן להציג תיקונים כמתואר על ידי Ivanov 48 וליישם על ידי Auclair49 ו- Zhang 2,3.

4. בצע מדידות ספקטרליות של FRET

  1. הכינו דגימות חלבון של תורמים בלבד, חלבון מקבל בלבד ודגימות חלבון של תורמים-מקבלים בריכוז זהה; מומלץ ריכוז של 4 μM. השתמש בפתרון של 200 μL, אם אתה משתמש ב- cuvette של 3 מ"מ x 3 מ"מ, 600 μL אם אתה משתמש ב- cuvette של 5 מ"מ x 5 מ"מ, או 2.5 מ"ל אם אתה משתמש ב- cuvette בגודל 1 ס"מ x 1 ס"מ.
    1. הכינו את דגימת החלבון התורם-מקבל על ידי שימוש בכמויות טוחנות שוות של החלבון התורם בלבד והמקבל בלבד.
    2. שמרו על אותה כמות של דגימה מסומנת בתורם בקרה בלבד וקבלו רק דגימות חלבון באמצעות הכנסת חלבון ללא תווית בכמות טוחנת שווה לתורם בלבד או לדגימות המקבלות בלבד. לדוגמה, עבור תמיסות באותו ריכוז, כל דגימת FRET של תורם בלבד תכיל 100 μL של חלבון לתורם בלבד ו-100 μL של חלבון ללא תווית עבור נפח של 200 μL.
  2. צור ספקטרום פליטה פלואורסצנטי של התורם בלבד, המקבל בלבד, ודגימות מקבל התורם בלבד. מטב את האות כמתואר בשלב 3.2. לאחר האופטימיזציה שמור על אותן הגדרות עבור כל הדוגמאות.
    1. השג את הסריקה לתורם בלבד כמתואר בשלב 3.3. לעורר את התמיסה בספיגת הצבעים המקסימלית של התורם ולסרוק את שיאי הפליטה של התורם והמקבל (הצפוי).
    2. החלף את הדגימה בחלבון המקבל בלבד או שנה את מיקום מחליף הדגימה לקובטה המכילה את החלבון המקבל בלבד.
    3. קבל בדיקת פליטה של החלבון המסומן בצבע מקבל בלבד (חלבון מקבל בלבד) באמצעות אותן הגדרות כמו בשלב 4.2.1. לעורר את הדגימה באורך הגל של עירור התורם.
      הערה: ספקטרום זה מספק תיקון לכמות המקבל המתרגש באורך הגל של התורם (FA בשלב 5.1.2)
    4. החלף את הדגימה לדגימת החלבון המקבלת-תורם או שנה את מיקום מחליף הדגימה ל-cuvette המכיל את החלבון המסומן על-ידי התורם-מקבל.
    5. קבל סריקת פליטה של דגימת החלבון המקבלת-התורם באמצעות אותן הגדרות כמו בשלבים 4.2.1 ו- 4.2.3.
    6. עבור כל הספקטרום, מתאים לפלואורסצנציה ברקע על ידי הפחתת ספירות הרקע שנמדדו בסוף הסריקה.
  3. מדוד את אורך חיי התורם של התורם בלבד ואת דגימות התורם-מקבל שהוכנו כמתואר בשלב 4.1.2. השתמש במכשיר פלואורסצנטי לספירת פוטון יחיד בקורלציה בזמן המסוגל למדוד ולפתור דעיכות פלואורסצנטיות בטווח הזמן של ננו-שניות (10-9 שניות).
    הערה: עבור זוגות צבעי FRET, התאם את מקור אור העירור למקסימום הספיגה של צבע התורם.
    1. הפעל את המכשיר. פתח את תוכנת הרכישה, השתמש בתוכנת בקרת המכשירים לרכישת נתונים עם ספקטרומטר הפלואורסצנציה.
    2. לרכישה, בחר TCSPC Decay, עם טווח זמן של 55 ns, רווח של 1 ו 4096 ערוצים.
    3. קבל פונקציית תגובה למכשיר (IRF) באמצעות תמיסה של מלבין שאינו חלבי או תמיסת פיזור מסחרית ופקח על הפיזור במהירות של 490 ננומטר. התאם את הגדרת החריץ והשתמש במסנני צפיפות ניטרליים לפי הצורך כדי לשמור על קצב ספירה נמוך מספיק כדי למנוע ערימת דופק5. לחץ על קבל ולאחר מכן התחל. זה יתחיל את הרכישה.
      הערה: קצב ספירה מרבי של 4000 cps משמש לקצב חזרה של 180 קילוהרץ.
    4. אסוף את ה-IRF ב-490 ננומטר עד שלערוץ השיא יהיה מקסימום של 20,000 ספירות. אסוף IRF לפני ואחרי מדידת כל דעיכה פלואורסצנטית.
    5. קבל את הדעיכות הפלואורסצנטיות של התורם בלבד ואת דגימות מקבלי התורם בלבד על ידי ניטור פליטת הפלואורסצנציה באורך הגל של פליטת התורם, 520 ננומטר.
    6. התאם את הגדרות החריץ לקצב ספירה מרבי של 4000 cps או פחות. הגדרות חריץ הן בדרך כלל פס פס של 15-20 ננומטר עבור דגימות חלבון. אסוף את הדעיכה עד שיתקבלו 20,000 ספירות בערוץ השיא.
  4. נתח את הדעיכה או את עוצמת הפלואורסצנציה (I) כפונקציה של זמן (t) עבור אורך החיים הפלואורסצנטי (τ). התאמת הדעיכה לסכום מעריכים עם המשוואה הבאה:
    Equation 7
    כאשר αI הוא הגורם הקדם-אקספוננציאלי של הרכיב ith ו- τI הוא אורך החיים. ההתאמה סובבת מחדש עם ה-IRF כדי להתאים לריקבון הפלואורסצנטי. לשפוט את איכות ההתאמה מהפרמטרים המופחתים של Χ2 .

5. ניתוח נתוני FRET

  1. חשב את יעילות FRET מהירידה בעוצמת התורם של מדגם התורם-מקבל ביחס לתורם רק עם המשוואה הבאה.
    Equation 8
    כאשר FDA היא עוצמת הפלואורסצנציה של דגימת התורם-מקבל ו-FD היא עוצמת הפלואורסצנציה של המדגם היחיד של התורם בשיא הפלואורסצנציה של התורם. השתמש באזורים המשולבים של הפסגות אם הנתונים רועשים.
    1. נכון לגבי כל ההבדלים בסימון בין המדגם התורם בלבד לבין דגימות התורם-מקבל. חשב תיקונים המבוססים על מידת התוויה של התורם באופן הבא.
      Equation 9
      כאשר fDA היא יעילות הסימון של התורם במדגם התורם-מקבל ו- fD היא יעילות הסימון במדגם התורם בלבד.
    2. נכון לכל תרומה של הפלואורסצנציה המקבלת לספקטרום הנרגש-תורם באמצעות חיסור ספקטרום החלבון המקבל בלבד (שלב 4.2) מספקטרום החלבון התורם-מקבל.
      Equation 14
    3. נכון להבדלים ביעילות הסימון של החלבון המקבל בלבד ביחס לדגימת החלבון התורם-מקבל, מה שמניב את המשוואה הבאה לחישוב היעילות:
      Equation 10
      כאשר fA מציין את הכמות החלקית של תיוג המקבל. משוואה זו כוללת את כל התיקונים עקב תיוג צבע ופלואורסצנציה של מקבלים.
    4. חישוב מרחקי FRET מהיעילות באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 11
      באמצעות הערך R0 המתקבל בשלב 3.6.5.
    5. חשב את יעילות ה-FRET באמצעות אורך חיים פלואורסצנטי של התורם בלבד ודגימות מקבלי התורם בלבד שנמדדו בשלב 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. השתמש באורך החיים המשוקלל משרעת כדי לחשב את יעילות ה- FRET ולהשוות לתוצאות במצב יציב5.
      Equation 13
    7. חשב את המרחק כשלב 5.1.4 מהיעילות שנקבעה על-ידי אורך החיים הפלואורסצנטי. השווה ערכים במצב יציב ובזמן שנפתרו עבור יעילות ומרחקים של FRET וודא שהם נמצאים בשגיאה זה מזה.

6. מיפוי המרחקים

  1. השתמש במרחקים המחושבים כדי למפות את אתר האיגוד במבנה התלת-ממדי. חשב את המרחקים והשגיאות עבור כל זוגות הצבעים והמיקומים שנבדקו באמצעות המשוואה הנתונה בערכי שלב 5.1.4 ו-R0 שהתקבלו בשלב 3.6.5 עבור כל זוג FRET.
    1. השתמש בתוכנית צפייה גרפית תלת-ממדית כגון PyMOL50 כדי למפות את המרחקים על המבנה (סקריפט המופיע בקובץ משלים). ניתן להזין פקודות מהסקריפט ישירות לחלון הפקודה עם מידע המרחק המתאים.
    2. צור מעטפת עבור כל מרחק שנמדד והשגיאה הקשורה אליו (איור 3, איור 4, איורים משלימים 1-3).
    3. מפה את המיקום דרך ההצטלבות של הקונכיות השונות (איורים משלימים 1-3). אתר קשירת פפטיד האותות מופה דרך שלושת המיקומים השונים ב-SecA וב-SecYEG ובארבעה מיקומים שונים על פפטיד האות (איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה התמקד בקביעת המיקום של אתר קשירת הפרהפרוטאין ב- SecA לפני הכנסת הפרפרוטאין לערוץ SecYEG. כדי למפות את אתר הקשירה, ניסויי FRET בוצעו בין אזורים שונים של הפרפרוטאין ושלושה מיקומים נפרדים בחלבוני SecA ו-SecYEG (איור 1A-D). מהמרחקים שהתקבלו והמבנים התלת-ממדיים של SecA, SecYEG והפרפרוטאין, נחזה המיקום של אתר הקישור של פרפרוטאין. במקום להשתמש בשלוש ישויות נפרדות (SecA, SecYEG ופרפרוטאין) כדי לבצע מדידות אלה, רצף האותות של PhoA חובר ל-SecA באמצעות שינוי גנטי לאחר שילוב של מקשר Gly-Ser 2,3. עבור תיוג facile עם צבעים, שאריות Cys או מוטציות ענבר הוכנסו בשאריות 2, 22, 35 ו-45 בפרפרוטאין PhoA (איור 1E).

זיהוי אתרים ותיוג
אתר קשירה פוטטיבי לרצף האותות זוהה בעבר באמצעות שיטות מיפוי FRET דומות 2,32. מחקרים אלה ואחרים זיהו את האצבע הדו-סלילית (THF) ואת תחום הקישור ההצלבה של פרפרוטאין כאתרי קישור אפשריים של פפטיד האות עם כיוון מוצע במיקום מקביל ל-THF 33,51,52,53,54 (איור 1F). לפיכך, זיהוי אתרי תיוג פוטנציאליים בחלבוני SecA ו-SecYEG נעשה על סמך מיקומו של אתר הקשירה הפוטטיבי במבנה הגבישי SecA ו-SecYEG (המוצג בירוק באיור 1A-D). שלושה אתרים נבחרו כדי לשלש את מיקומו של אתר הכריכה הפוטטיבי, כאשר למעשה שלושת האתרים יוצרים משולש סביב אתר הכריכה הפוטטיבי. כפי שניתן לראות באיור 1, שלושת האתרים היו בטווח ה-FRET של אתר הקישור (50-70 Å). זוג הצבעים של אלקסה פלואור 488 (AF488) ואלכסה פלואור 647 (AF647) נבחר, שכן ערך R0 של 55.7 Å36 תואם היטב את המרחקים הצפויים בין האתרים המסומנים לבין אתר הקשירה הפוטטיבי המבטיח את דיוק המדידה.

שלושת האתרים שנבחרו לסימון, SecA37, SecA321 ו-SecY292 (המוצגים ככדורי מג'נטה, סגול וציאן באיור 1A-D) ממוקמים לאורך כל קומפלקס החלבון ויוצרים משולש סביב אתר הקשירה הפוטטיבי. שלושת האתרים עברו מוטציה נפרדת לשאריות Cys במוטציה ללא Cys כדי להבטיח שרק המיקום הנכון יסומןכ-2,37. עבור הניסויים של SecY292, אתרי הפרפרוטאין של PhoA סומנו ב-AF647 ושאריות SecY 292 סומנו ב-AF488 באמצעות כימיה של מאלימיד. בחלבון הכימרי, האתרים SecA37 ו-SecA321 סומנו ב-AF647 והפרפרוטאין סומן ב-AF488. בחלבון הכימרי SecA-PhoA, שאריות 2, 22, 37 ו-45 של מקטע הקדם-פרוטאין PhoA עברו כל אחת מוטציה לקודון ענבר בחלבונים בודדים. המוטציות בקודון הענבר אפשרו את כניסתה של חומצת אמינו לא טבעית, p-azidophenylalanine, באותן עמדות, אשר סומנו לאחר מכן עם AF488 באמצעות כימיה קליק39,40. כל מוטציה נוצרה ותויגה באופן עצמאי כדי להבטיח תיוג נכון ודיפרנציאלי של רכיבי החלבון. מידת הסימון נקבעה עבור כל החלבונים ובדרך כלל היה צריך להיות 50% או יותר כדי להמשיך עם הדגימה.

קביעת יעילות העברה ומרחקים
לפני ביצוע מדידות העברת האנרגיה נקבעו ערכי התשואה הקוונטית של התורם, אינטגרל החפיפה וערכי R0 (שלבים 3.4-3.6). התשואה הקוונטית של התורם נמדדה ביחס לצבע, פלואורסצין, בעל תפוקה קוונטית של 0.79 ב-0.1 M NaOH47. ספקטרום ספיגה ופליטת פלואורסצנציה התקבלו בסדרה של ריכוזים כדי ליצור תרשים ליניארי של ספיגה ביחס לעוצמת הפליטה הפלואורסצנטית כדי לקבוע את התפוקה הקוונטית. במדידות אלה, חיוני למדוד את הקליטה בטווח הליניארי (0.1-1.0) וכל מדידות הפליטה צריכות להיווצר עם אותן הגדרות חריץ. מכיוון שערכים אלה משמשים לקביעת אינטגרלים חופפים וערכי R0 , יש למדוד אותם בתנאי FRET. הסביבה המקומית של חלבונים משפיעה באופן עמוק על פליטת הצבעים וכתוצאה מכך, יש למדוד את התשואות הקוונטיות של התורמים עבור כל אחד מהאתרים שנחקרו. נציין כי אתרים ב- SecA וב- SecYEG משפיעים על ערכי R0 בצורה חזקה יותר מאלו שבחלק ה- PhoA של הכימרה. עבור זוגות צבעים עם אותו אתר SecA או SecYEG, ערכי R0 הם בדרך כלל בטווח של 5 Å זה מזה; בעוד שערכי R0 יכולים להיות שונים עד 20 Å עבור שני מיקומי SecA השונים (שאריות 37 לעומת 321), מה שמדגיש את החשיבות של קביעת ערכי R0 עבור כל זוג צבעים (טבלה 1).

החישוב של R0 מניח שצבעי התורם והמקבל מסתובבים בחופשיות והמידה שבה הצבעים אינם מסתובבים תורמת לאי הוודאות הכוללת במדידה. כדי לקחת בחשבון כראוי את התנועה היחסית של הצבעים ואת האוריינטציות שלהם, מדידות אניזוטרופיה פלואורסצנטיות במצב יציב בוצעו על כל צבעי התורם והמקבל בתנוחות הסימון השונות. ערכים אלה, שהיו בטווח 0.10-0.21, שימשו לחישוב השגיאה הקשורה למדידות המרחק 2,3,48. ערכי האניזוטרופיה הגבוהים יחסית שנצפו הן עבור הצבע התורם והן עבור הצבעים המקבלים תואמים לירידה בסיבוב הצבע, שאינה עולה בקנה אחד עם ההנחה של סיבוב חופשי. היעדר סיבוב חופשי יוצר שגיאה של 19%-25% בחישובי המרחק. כפי שמוצג בטבלה 1, הדבר הוביל לאי-ודאות ממוצעת במרחקים הנמדדים של לכל היותר ± 15 Å. בעת מיפוי מרחקי ה-FRET, אי-ודאות זו במדידות המרחקים היא שיקול חשוב, כפי שיפורט להלן.

המרחק המחושב בין זוגות תורמים-מקבלים מבוסס על הקשר בין יעילות למרחק, שבו יעילות גבוהה יותר מעידה על זוגות תורמים-מקבלים המופרדים במרחק קצר יותר. כדי לקבוע את יעילות ה-FRET, ספקטרום פליטה פלואורסצנטית הנרגש באורך הגל של עירור התורם (488 ננומטר) מתקבל על דגימות של תורמים בלבד ומקבלי תורמים בלבד. בדרך כלל, הפחתה בעוצמת הפליטה של התורמים מסמלת נוכחות של העברת אנרגיה (שלב 5.1). איור 1G מתאר את הספקטרום המקבל-תורם עבור שאריות SecA 37 עם שאריות 2 או 22 של הכימרה PhoA. שאריות SecA37 מסומנות ב-AF647 או בצבע המקבל, ושאריות ה-PhoA מסומנות ב-AF488 או בצבע התורם. בכל אחת מהתנוחות, הפלואורסצנציה של התורם מצטמצמת וניתן לראות עלייה קטנה בעוצמת הפלואורסצנציה של המקבלים את הקבלה בדגימות התורם-מקבל. מכיוון שהעירור נעשה באורך הגל של עירור התורם של 488 ננומטר, שאינו מעורר ישירות את המקבל, כל פלואורסצנציה מקבלת שנצפתה נובעת מהעברת אנרגיה. לפיכך, הירידה בעוצמת התורם והעלייה המקבילה בעוצמת המקבל נובעת מהעברת אנרגיה בין שני הצבעים. באופן משמעותי, עוצמת הפלואורסצנציה של התורם גבוהה יותר עבור מיקום PhoA2 (כחול) ביחס למיקום PhoA22 (צהוב) בנוכחות המקבל. הבדל יחסי זה בירידה בעוצמת התורם מצביע על כך שהעברת האנרגיה בין שאריות PhoA2 לשאריות SecA37 חלשה יותר מההעברה בין שאריות PhoA22 ו- SecA37, מה שמרמז על כך שאריות PhoA2 ממוקמות רחוק יותר מ- SecA37 מאשר PhoA22. המרחקים נקבעים מהקשר בין ערכי יעילות לערכי R0 (שלב 5.1.4).

מאחר שמדידות הפלואורסצנציה במצב יציב יכולות לייצג ממוצע של שני מרחקים או יותר, ביצענו גם מדידות פלואורסצנטיות שנפתרו בזמן. עבור ניסויים אלה, אורך החיים של צבע התורם נמדד בנוכחותו ובהיעדרו של המקבל (איור 1G). אם היו שני תהליכי העברת אנרגיה נפרדים שתרמו ליעילות הפלואורסצנטית הנמדדת במצב יציב, הם היו נצפים כחירי חיים דיסקרטיים, בתנאי שהם היו ניתנים לפתרון בתוך רזולוציית הזמן של המכשיר. כדי לשפר את היכולת לפתור את אורך החיים, יש לאסוף 10,000 ספירות או יותר בשיא; עם זאת, יש לאזן את גובה השיא או את ספירת ערוצי השיא עם זמן הרכישה והנזק הפוטנציאלי למדגם. מדידות שנפתרו בזמן הניבו אורך חיים יחיד עבור כל זוג תורם-מקבל, התואמים רק כיוון אחד או מרחק אחד בין הצבעים. נציין כי הבדלים קטנים במרחק כפי שנצפו באזורים שנחשפו על ידי טכניקת מיפוי ה-FRET שלנו לא יובילו למשך חיים פתיר במערכת שלנו. יתר על כן, היעילות כפי שנקבעה על ידי מדידות הפלואורסצנציה שנפתרו בזמן הסכימו היטב עם אלה שנקבעו ממדידות המצב היציב, וסיפקו תמיכה נוספת לכך שהיעילות הנמדדת נובעת ממרחק אחד בלבד בין זוגות הצבעים3.

מיפוי מרחקי ה-FRET למבנה התלת-ממדי
מדידות העברת אנרגיית התהודה מפיקות מידע מספיק על מרחק כדי לזהות את אתר הקישור ואת הכיוון של רצף האותות ב- SecA. שלושת המיקומים ב- SecA וב- SecYEG יחד עם ארבעת המיקומים באזור PhoA של כימרה SecA-PhoA מספקים את 12 המרחקים השונים המשמשים למיפוי אתר הכריכה (טבלה 1). שנים עשר המרחקים מופו על המבנה הקו-קריסטלי התלת-ממדי של קרני הרנטגן של קומפלקס Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) כדי לזהות את אתר הקישור של רצף האותות33. המבנה של קומפלקס SecA-SecYEG דומה לזה שנצפה ב- E. coli כפי שמעיד מחקר פוטו-קרוסלינקינג in vivo 55.

אנו משתמשים בשאריות ההתחלה (PhoA2) והסוף (PhoA22) של רצף האותות PhoA בכימרה SecA-PhoA כדי להמחיש כיצד זוהו מיקומי שאריות במתחם SecA-SecYEG. מכיוון שהעברת אנרגיה יכולה להתרחש לכל הכיוונים, מרחקי ה-FRET והשגיאות הנלוות מתארים קליפה כדורית, כאשר אחד ממיקומי הצבע מזוג התורם-מקבל מוגדר כמרכז. במחקר זה, השאריות SecA37, SecA321 ו- SecY292 מהוות את המרכזים של שלוש קליפות כדוריות המתארות את מיקומן של שאריות PhoA2 של רצף האותות. הדמיה של האזורים החופפים הנובעים משלושת המיקומים הנפרדים, SecA37 (magenta), SecA321 (סגול) ו- SecY292 (ציאן) מוצגים באיור 3. רק חלק מכל מעטפת FRET מצטלב עם מבנה החלבון, והשאריות ועמוד השדרה שנמצאים בתוך אותה קליפה מודגשים. לפיכך, אזורי החלבון בתוך הקליפה המוגדרים על ידי מרחק SecA37-PhoA2 מוצגים במג'נטה (איור 3A,E), בעוד שהאזורים המוגדרים על ידי הקליפות SecA321-PhoA2 ו-SecY292-PhoA2 מוצגים בסגול (איור 3B,F) ובציאן (איור 3C,G), בהתאמה. אתר הכריכה הפוטטיבי, המורכב בעיקר מאצבע שני הסלילים, מוצג בירוק.

כפי שמוצג באיור 3, כל אחת מקליפות ה-FRET האלה מגדירה חלק גדול יחסית של קומפלקס החלבון. עבור כל שלושת המקומות, מעטפת ה-FRET אכן מצטלבת עם אתר הכריכה הפוטטיבי; עם זאת, עבור שאריות SecA321, לדוגמה, השטח המצטלב קטן יותר ונמצא לכיוון קצות האצבעות עם חפיפה משמעותית עם תחום הפיגומים הסליליים. ההצטלבות או האזור המשותף של כל שלוש קונכיות ה-FRET (איור 3D,H), מגדירים את המיקום של שאריות PhoA2. שטח זה קטן משמעותית מכל מעטפת FRET וכולל רק חלק קטן מה-THF עם תרומה גדולה מהפיגום הסלילי. הסקריפטים המשמשים ליצירת פגזי FRET והאזורים המצטלבים עבור תוכנית ההדמיה המולקולרית, PyMOL, ניתנים במידע המשלים. חלקים מהקליפות מוצגים כנקודות ורודות במתחם SecA-SecYEG באיורים משלימים 1-3.

אסטרטגיה דומה שימשה לזיהוי המיקום של שאריות PhoA22. קונכיות ה-FRET שהוגדרו על-ידי מרחקי ה-FRET של PhoA22 (איור 4A-C,E-G) מתארות שטח קטן יותר ביחס לשאריות PhoA2 (איור 4D,H לעומת איור 3D,H). אנו מפרשים את ההבדל הזה כדי להציע כי שאריות PhoA2 והאזור הקשור אליהם גמישים יותר מאשר PhoA22. באופן משמעותי, השטח המיוחס לשאריות PhoA22 ממוקם קרוב יותר לקצה ה-THF ולפה של ערוץ ה-SecYEG, כאשר אזורים של SecY מזוהים באזור המשותף (איור 3D,H). כל שלושת זיווגי הצבעים מזהים אזורים יחד עם אתר הקשירה הפוטטיבי; עם זאת, האזורים המשותפים המצטלבים מרכזים את מיקום PhoA22 (איור 4D,H) בקצה הנגדי של ה-THF ביחס למיקום PhoA2 (איור 3D,H). ממצאים אלה מצביעים על כך שרצף האותות של הפרפרוטאין המשתרע משאריות 2-22, נמצא לאורך ה-THF במצב לא מובנה יחסית. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהציעו כי רצף האותות נקשר לחלבון לאורך ה-THF במצב מורחב, וכי הקצה הטרמינלי C של SecA במבנה הגבישי B. subtilis למעשה מדגים את מבנה פפטיד האות ותופס את אותו מיקום (מוצג באיור אדום 1F)2,26 . השתמשנו בגישה דומה כדי לזהות שני מיקומים באזור הבשלה המוקדמת (שאריות 37 ו-45) של כימרה פרפרוטאין SecA-PhoA כדי להגדיר עוד יותר את הקשירה והכיוון של רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם כפי שיפורט להלן. במחקרים אחרים נעשה שימוש יעיל במרחקי FRET כדי לחדד מבנה קיים או מודל שמקורו בדינמיקה מולקולרית 18,19,56; לא הצלחנו לעשות זאת, מכיוון שלא קיים מבנה לרצף האותות הקשור ל- SecA.  

Figure 1
איור 1: תיוג אתרים במתחם SecA-SecYEG עם ספקטרום FRET מייצג(A-D) ארבע תצוגות שונות של המבנה הקו-גבישי של SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33 שבהן אתרי הסימון של SecA37, SecA321 ו-SecY292 מוצגים ככדורי מג'נטה, סגול וציאן, בהתאמה. A-C הם תצוגות צדדיות של המתחם ו- D הוא תצוגה עליונה. SecA מוצג באפור בהיר, SecYEG מוצג באפור כהה ואתר הכריכה הפוטטיבי, ה- THF, מוצג בירוק. (E) סכמטית של מבנה הכימרה SecA-PhoA, המחברת את חלבון ה-SecA לפרפרוטאין PhoA באמצעות מקשר Ser-Gly (לא נמשך לקנה מידה). אתרי הסימון בחלק PhoA של הכימרה ניתנים בכחול, ירוק, צהוב ואדום, המתאימים לשאריות 2, 22, 37 ו-45. (F) דיאגרמת סרט של המבנה הגבישי של החלבון B. subtilis SecA (PDBID: 1M6N) הצבועה לפי תחום שבו תחומים קושרי נוקלאוטידים 1 ו-2 מוצגים בכחול וכחול בהיר, בהתאמה, תחום הקישור ההצלבה של פרפרוטאין מוצג בזהב, הסליל המרכזי בירוק, האצבע בעלת שני הסלילים בציאן, תחום הכנף הסלילית בירוק כהה ומקשר ה-C-terminal באדום26 . ה-C-terminus הלא מובנה משמש כמודל של פפטיד האותות PhoA הקשור המבוסס על מחקר מיפוי FRET קודם2. (G) ספקטרום פלואורסצנטי במצב יציב של התורם בלבד ודגימות מקבל התורם בלבד של זוג ה-SECA37-AF647 וה-PhoA2-AF488 FRET והזוג SecA37-AF647 ו-PhoA22-AF488 FRET. הירידה בעוצמת התורם עבור מדגם התורם-מקבל מעידה על העברת אנרגיה. העברת אנרגיה גדולה יותר מתרחשת מ- PhoA22 ביחס לאתר PhoA2 בהתבסס על הירידה בעוצמת התורם. (H) תורם פלואורסצנטי שנפתר בזמן בלבד (magenta) וספקטרום דעיכה של תורם-מקבל (מגנטה קלה) של זוג ה-FRET SecA37-AF647 וה-PhoA22-AF488. פונקציית התגובה של המכשיר מוצגת באפור. קומפלקס התורם-מקבל נותן ריקבון קצר יותר וכתוצאה מכך אורך חיים מהיר יותר התואם את העברת האנרגיה. כל המבנים המולקולריים נוצרו עם קובץ PDB המצוין ו- PyMOL50. איור 1E-H שונה מ-Zhang et al.3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ממשק המשתמש של תוכנית FluorEssence. (A) חלון הפתיחה מוצג עם עיגול סביב M האדום. יש ללחוץ על כך כדי לחבר את התוכנית עם הפלואורומטר. (B) חלון ההתקנה של הניסוי ממחיש את האזורים השונים (מונו, גלאים, אביזרים) שבהם מוזנים פרמטרים רלוונטיים לסריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פגזי מרחק FRET נקבעו עבור מיקום SecA-PhoA2. פגזי מרחק FRET הבנויים ממרחקי FRET ואי הוודאות המשויכת (טבלה 1) מתוארים במתחם SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (א-ג) פגזי מרחק FRET עבור מיקום PhoA2 שנבנו עם SecA37 (מגנטה), SecA321 (סגול) ו- SecY292 (ציאן), בהתאמה במיקום המרכז. הקונכיות צבועות על פי שאריות המרכז. (D) ההצטלבות של שלושת פגזי ה-FRET מגדירה את המיקום של PhoA2, המוצג בכחול. (ה-ה) התצוגות מסובבות בערך 180° מ-A-D. כל המבנים המולקולריים נוצרו עם קובץ PDB המצוין ו- PyMOL50. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: פגזי מרחק FRET שנקבעו עבור מיקום SecA-PhoA22. פגזי מרחק FRET הבנויים ממרחקי FRET ואי-ודאות משויכים (טבלה 1) מתוארים במתחם SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (א-ג) פגזי מרחק FRET עבור מיקום PhoA22 שנבנו עם SecA37 (magenta), SecA321 (סגול) ו- SecY292 (ציאן), בהתאמה במיקום המרכז. הקונכיות צבועות על פי שאריות המרכז. (D) ההצטלבות של שלוש קונכיות ה-FRET מגדירה את המיקום של PhoA22, המוצג בצהוב. (ה-ה) התצוגות מסובבות בערך 180° מ-A-D. כל המבנים המולקולריים נוצרו עם קובץ PDB המצוין ו- PyMOL50. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: מיקומים ממופים על-ידי FRET של PhoA2, PhoA22, PhoA37 ו-PhoA45 הוקרנו על המבנה הקוקריסטלי של B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE (PDBID: 5EUL). (A) צביעה של SecA-SecYE כמו באיור 1. המצע הפפטידי OmpA המוחדר בסוף ה-THF מוצג בוורוד. אזורים ממופים על-ידי FRET נוצרו בנוכחות ATP-γS, כאשר PhoA2 מוצג בכחול, PhoA22 בירוק, PhoA37 בצהוב ו-PhoA45 באדום. אזורי החפיפה מוצגים בזית (PhoA22 ו-PhoA37) ובתפוז (PhoA37 ו-PhoA45). המצע הפפטידי (שאריות 749-791, ציאן) נכרת מהמבנה המקורי והוכנס לאזור הקשירה הפוטטיבי ללא כל שינויים במבנה (בעיגול באדום). (B) תצוגה מוגדלת של המצע הפפטידי הממודל. שאריות 2 (ליס), 22 (צור) ו-37 (גלי) של מצע הפפטיד OmpA מתוארות בצורת מקל בכחול, ירוק וצהוב, בהתאמה. שאריות אלה בפפטידים הממודלים מפגינות הסכמה מצוינת עם המיקומים הממופים של FRET החזויים. לשם הבהירות, הננו-גוף במבנה המקורי הושמט. נתון זה שונה מ-Zhang et al.3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

אתר מסומן במתחם SecA-PhoA-SecYEG האתר מסומן בחלק הפפטידי PhoA של כימרה SecA-PhoA
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
יעילות FRET 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
מרחק 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
יעילות FRET 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
מרחק 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
יעילות FRET 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
מרחק 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
מותאם מתוך הפניה 3.
ערכי R0 שניתנו באנגסטרומים חושבו כמתואר בטקסט
יעילות ה-FRET חושבה מתוך הירידה בעוצמת הפלואורסצנציה של התורם בנוכחות המקבל כמתואר. השגיאה מדווחת כ-SD משלוש מדידות בלתי תלויות.
מרחקי תורם-מקבל (R) ניתנים באנגסטרומים ומחושבים כמתואר בטקסט. השגיאה שדווחה נובעת משיקול של הטעות הניסיונית וזו הנובעת מהתמצאות הצבעים.  אוריינטציית הצבע מוערכת מהאניזוטרופיה הפלואורסצנטית במצב יציב

טבלה 1: יעילות העברה ומרחקים שנקבעו עבור קומפלקס SecA-PhoA-SecYEG. נצילויות FRET, מרחקים וערכי R0 ניתנים עבור 12 המרחקים המשמשים למיפוי אתר איגוד הפרה-פרוטאין.

איור משלים 1: מעטפת מרחק FRET, המוצגת בנקודות ורודות, נקבעה עבור שאריות SecA37 ושאריות PhoA 37 בקומפלקס SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A מוצג באפור בהיר, SecYEG מוצג באפור כהה ושאריות SecA37 מוצגות במג'נטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: מעטפת מרחק FRET, המוצגת בנקודות ורודות, נקבעה עבור שאריות SecA321 ושאריות PhoA 37 בקומפלקס SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A מוצג באפור בהיר, SecYEG מוצג באפור כהה ושאריות SecA321 מוצגות בסגול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: מעטפת מרחק FRET, המוצגת בנקודות ורודות, נקבעה עבור שאריות SecY292 ושאריות PhoA 37 על קומפלקס SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A מוצג באפור בהיר, SecYEG מוצג באפור כהה ושאריות SecY292 מוצגות בציאן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באמצעות שימוש במתודולוגיית המיפוי של FRET, זיהינו את אתר קשירת רצף האותות בחלבון SecA. חשוב לציין שנוכחותו של מבנה גבישי תלת-ממדי של המתחם הקלה מאוד על המחקר שלנו. כוחה של מתודולוגיית מיפוי זו טמון ביכולת להשתמש במבנה קיים כדי לזהות מיקומים לתיוג. לא ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לקבוע מבנה תלת-ממדי; עם זאת, קביעת אלמנטים מבניים56, חידוד מבנה קיים49, קביעת מיקום אתר מחייב 2,32, או הבהרת תנועה דינמית57, כולם יישומים אפשריים של שיטה זו.

במתחם SecYEG-SecA-PhoA, שלושת אתרי הסימון יוצרים משולש סביב אתר הקשירה הפוטטיבי (איור 1). ההעסקה של מדידות מרחק מרובות מהקודקודים של משולש זה לאותם שאריות מחדדת את נתוני המיקום בדומה לשיטות ניווט GPS. שלושה אתרים, SecA37, SecA341 ו-SecY292, זוהו ב-SecA וב-SecY יחד עם ארבעה אתרים, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 ברצף האותות ובאזור הבשלה המוקדמת של הפרפרוטאין כדי לתת בסך הכל 12 מרחקים למיפוי מיקום פפטיד האות (טבלה 1). חשוב לציין, כדי לשפר את הדיוק של מדידות המרחק, אתרי תיוג צריכים להיות ממוקמים באזורים סטטיים יחסית של החלבון, כגון באלמנטים של מבנה משני ולא בלולאות. יתר על כן, אתרים צריכים להיות גם במיקומים שהם נגישים יחסית לממסים כדי להקל ויעילות מוגברת של תיוג. בתוך קומפלקס SecA-PhoA-SecYEG, הביצועים של מדידות מרחק מאתרי המשולש או הקודקודים לשאריות במצע הקישור הספיקו לאיתור השאריות במצע הקישור לשטח קטן יחסית (איור 3D,H ואיור 4D,H). זיהוי האזור המצטלב ממדידות המרחק המרובות משכלל באופן משמעותי את המיקום מזה של מדידת מרחק יחיד, כפי שמוצג באיור 3 ובאיור 4. לכן, בעת שימוש בשיטה זו, מומלץ מאוד למדוד מרחקים מרובים. למרות ששיטה זו יכולה לזהות אזורים של מולקולות המעורבות בקשירת קשר, למשל, היא אינה מספקת מידע מבני מדויק; מידע כזה מתקבל בצורה הטובה ביותר משיטות מבניות אחרות כגון רנטגן, NMR ו- cryo-EM. ניתן להשתמש במרחקי FRET כדי לחדד ביעילות מבנה קיים18,19 או מודל, במקרה זה, שלא היה אפשרי מכיוון שלא קיים מודל של רצף האותות הקשור ל- SecA.

כדי להבטיח שתיוג צבע יתרחש רק במקומות הרצויים ומדידות מרחק FRET מדויקות, עדיף להשתמש במוטגנזה לסימון. יצירת מוטציה נטולת Cys דורשת מוטציה שמרנית יחסית של שאריות Cys ל-Ser או לשאריות דומות בחלבון מסוג פראי, תוך שימוש בשיטות מוטגנזה מכוונות אתר. במחקר הנוכחי, מוטציות Cys הוכנסו לגרסאות ללא Cys של SecA ו- SecYEG לתיוג37. פעילותו של החלבון המוטנטי אומתה באמצעות בדיקת גדילה ואחריה בדיקת ATPase ירוקה של מלכיט במבחנה 41,42. מבחני פעילות רלוונטיים תלויים בתפקוד החלבון, למשל עבור חלבונים קושרי DNA, בדיקת קשירת DNA תהיהמתאימה 58. אי הקפדה על תיוג במיקום אחד בלבד עלולה להוביל לסימון של יותר מאתר אחד עם אותו צבע, מה שמסבך משמעותית את קביעות המרחק. לפיכך, הכנסת תווית שנייה על אותו חלבון יכולה להיעשות באמצעות שילוב של חומצת אמינו לא טבעית על ידי מוטגנזה מכוונת אתר. השתמשנו במתודולוגיה זו כדי לתייג את הכימרה SecA-PhoA במיקומים שונים משאריות Cys על ידי החדרת חומצת האמינו הלא טבעית, p-azidophenylalanine ותיוג עם כימיה של קליק39,40.

שיקול חשוב נוסף של שיטה זו הוא בחירת הצבעים המשמשים ואת הערך R0 הקשורים. לאחר זיהוי אתרי הסימון הפוטנציאליים, ניתן להעריך את המרחקים שיש למדוד מהמבנה התלת-ממדי. בעזרת מידע זה, חוקרים יכולים לבחור זוגות צבעים עם ערכי R0 המשתרעים על פני הטווח הרצוי של המרחקים הצפויים. לדוגמה, לזוג הצבעים AF488-AF647 יש R0 מחושב של 55.7 Å המספק טווח טוב לאתרי תיוג הממוקמים במרחק מוערך של 40-75 Å מאתר הכריכה הפוטטיבי. למרות שערכי R0 המחושבים בשלב 2.2 שימושיים לבחירת זוג הצבעים להשתמש עבור המערכת שלך, חיבור הצבעים לחלבון יכול לשנות את תכונותיהם באופן משמעותי. לקבלת דיוק רב יותר, יש לחשב ערכי R0 מניסויים באתרם שבוצעו עם חלבון מסומן (שלבים 3.1 - 3.6.5).

מדידת יעילות ההעברה יכולה להיעשות על ידי ניטור פליטת פלואורסצנציה במצב יציב והתבוננות בירידה בפליטת התורמים או בעלייה בפליטת המקבלים. למרות שתצפית על שתי ההשפעות רצויה, ניתן לחשב את היעילות מאחת מהן כמתואר 5,8. ניתן לחשב את היעילות גם מירידה בחיי התורם במדגם התורם-מקבל ביחס למדגם התורם בלבד. מומלץ לקבוע את היעילות על ידי יותר משיטה אחת, במיוחד השימוש בשיטות שנפתרו בזמן כדי לבסס את ההומוגניות היחסית של היעילות הנמדדת.

שיטת המיפוי גם אפשרה לנו לקבוע את הכיוון היחסי של רצף האותות ואת האזורים הבוגרים המוקדמים של פרפרוטאין PhoA ביחס ל- SecA ולאתר הקשירה הפוטטיבי. מבנה גבישי קרני רנטגן SecA-SecYEG ומחקר cryo-EM שנערך לאחר מכן סיפקו בהירות לגבי מבנה רצף האותות והאזור הבוגר המוקדם של הפרפרוטאין ביחס לתעלה ול- SecA34,35. במבנה קרני הרנטגן, שאריות 1-41 של פרפרוטאין OmpA היו מחוברות לקצה האצבע בעלת שני הסלילים והודמיינו במבנה סיכת שיער בתעלה (מוצג בוורוד, איור 5). מיקומם של ארבעת שאריות ה-PhoA בצ'ימרה SecA-PhoA מופו למבנה זה באמצעות אותו פרוטוקול שתואר לעיל. כפי שניתן לראות באיור 5, המיקום של שאריות PhoA37 ו-PhoA45 (צהוב, כתום, אדום) נמצא בין PhoA2 ל-PhoA22, כאשר PhoA45 קרוב יותר ל-PhoA2. ממצאים אלה, במיוחד המיקום של PhoA45, הציעו כי פרפרוטאין PhoA יצר מבנה סיכת שיער.

כדי לאמת עוד יותר את אתר האיגוד שלנו המזוהה עם FRET, ביצענו השוואה של המיקומים הממופים שלנו עם זה של הקדם-פרוטאין של OmpA, על-ידי כריתת מבנה פרפרוטאין של 41 שאריות מהערוץ ומידולו לאזורים המוגדרים על-ידי מיפוי FRET (איור 5, ציאן). ללא כל שינוי במבנה קרני הרנטגן של פרפרוטאין, אנו מוצאים שהמיקומים של שאריות 2, 22 ו-37 (המוצגים בכחול, ירוק וצהוב) במבנה הכריתה של שבר פרפרוטאין OmpA תואמים להפליא את המיקומים הממופים של FRET (איור 5B) ומציעים שסיכת השיער נוצרת לפני הכניסה לערוץ. פרפרוטאין OmpA מסתיים בשאריות 41 במבנה גבישי קרני הרנטגן; עם זאת, מסוף C של SecY, שאינו מובנה, מספק אינדיקציה למיקום האפשרי של PhoA45. במבנה המדגם שלנו, לולאת סיכת השיער יושבת בפתח התעלה, כדי להקל על טרנסלוקציה של הפרפרוטאין על פני הממברנה. לפיכך, בדוגמה זו, מתודולוגיית המיפוי של FRET משפרת את המידע הקיים על מבנה SecA-SecYEG הסטטי, על ידי מתן רמז לתנועה הדינמית הדרושה לטרנסלוקציה של חלבונים על פני הממברנה. למרות שאינו מתאים לקביעת מבנה דה נובו , אם מידע מבני תלת-ממדי זמין, מתודולוגיית המיפוי של FRET יכולה לקדם את ההבנה הנוכחית של יחסי מבנה-פונקציה, באמצעות הבהרה של אתרי קישור ותנועות דינמיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R15GM135904 של המכונים הלאומיים לבריאות (הוענק ל- IM) ומענק המכונים הלאומיים לבריאות GM110552 (הוענק ל- DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

ביוכימיה גיליון 181 פלואורסצנציה העברת אנרגיה SecA טרנסלוקציה של חלבונים מיפוי FRET
מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter