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Biochemistry

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

Abstract

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un método establecido basado en la fluorescencia utilizado para medir con éxito las distancias en y entre las biomoléculas in vitro, así como dentro de las células. En FRET, la eficiencia de la transferencia de energía, medida por los cambios en la intensidad de la fluorescencia o la vida útil, se relaciona con la distancia entre dos moléculas fluorescentes o etiquetas. La determinación de la dinámica y los cambios conformacionales a partir de las distancias son solo algunos ejemplos de las aplicaciones de este método a los sistemas biológicos. Bajo ciertas condiciones, esta metodología puede agregar y mejorar las estructuras cristalinas de rayos X existentes al proporcionar información sobre la dinámica, la flexibilidad y la adaptación a las superficies de unión. Describimos el uso de FRET y las determinaciones de distancia asociadas para dilucidar las propiedades estructurales, a través de la identificación de un sitio de unión o las orientaciones de las subunidades de dímeros. A través de la elección juiciosa de los sitios de etiquetado y, a menudo, el empleo de múltiples estrategias de etiquetado, hemos aplicado con éxito estos métodos de mapeo para determinar las propiedades estructurales globales en un complejo proteína-ADN y el sistema de translocación de proteínas SecA-SecYEG. En el sistema SecA-SecYEG, hemos utilizado métodos de mapeo FRET para identificar el sitio de unión a preproteínas y determinar la conformación local de la región de secuencia de señales unidas. Este estudio describe los pasos para realizar estudios de mapeo FRET, incluida la identificación de sitios de etiquetado apropiados, la discusión de posibles etiquetas, incluidos los residuos de aminoácidos no nativos, los procedimientos de etiquetado, cómo realizar mediciones e interpretar los datos.

Introduction

Para las proteínas, la elucidación de la dinámica junto con el conocimiento estructural tridimensional (3-D) conduce a una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los sistemas biomoleculares. Los métodos estructurales, como la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica, capturan una estructura estática y, a menudo, requieren la determinación de múltiples estructuras para dilucidar aspectos de la unión y dinámica de biomoléculas1. En este artículo se describe un método basado en soluciones para mapear elementos estructurales globales, como sitios de enlace o interacciones de enlace, que son potencialmente más transitorios y menos fáciles de capturar mediante métodos estáticos. Los sistemas candidatos fuertes para esta metodología son aquellos en los que una estructura 3-D ha sido previamente determinada por cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN u otros métodos estructurales. En este caso, aprovechamos la estructura cristalina de rayos X del complejo SecA-SecYEG, un actor central en la vía secretora general de la proteína, para mapear la ubicación de un sitio de unión al péptido señal utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) antes del transporte de la preproteína a través de la membrana2. La manipulación del sistema biológico a través de modificaciones genéticas junto con nuestro conocimiento de la estructura 3-D permitió la determinación de la conformación de la secuencia de señal y la región madura temprana inmediatamente antes de la inserción en el canal 3.

FRET implica la transferencia de energía sin radiación de una molécula (donante) a otra (aceptor) de una manera dependiente de la distancia que es a través del espacio 4,5. La eficiencia de esta transferencia se controla a través de una disminución en el donante o un aumento en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. La eficiencia de la transferencia de energía se puede describir como

E = R06/(R06 + R6)

en el que el valor R0 es la distancia a la que la transferencia es 50% eficiente6. La técnica ha sido descrita previamente como una regla molecular y es efectiva para determinar distancias en el rango de 2.5-12 nm, dependiendo de la identidad de los colorantes donante-aceptor 4,7,8,9. Las intensidades de fluorescencia del donante y las vidas útiles con o sin aceptor permiten determinar las eficiencias de transferencia y, en consecuencia, las distancias 5,8. Debido a la disponibilidad de la tecnología, la sensibilidad del método y la facilidad de uso, FRET también ha encontrado una amplia aplicación en áreas como la espectroscopia de fluorescencia de molécula única y la microscopía confocal6. El advenimiento de proteínas fluorescentes como la proteína fluorescente verde ha hecho que la observación de la dinámica intracelular y las imágenes de células vivas sean relativamentefáciles 10,11. Muchas aplicaciones FRET como estas se discuten en detalle en este número virtual.

En este estudio, nos centramos particularmente en el uso de mediciones FRET para obtener valores de distancia para determinar detalles estructurales. Anteriormente, las mediciones de FRET se han utilizado eficazmente para determinar la conformación de las moléculas de ADN cuando se unen a la proteína 12,13,14, la dinámica interna de las proteínas y las interacciones de unión a proteínas 15,16,17. Las ventajas de este método radican en la capacidad de determinar elementos estructurales flexibles y dinámicos en una solución con cantidades relativamente bajas de material. Significativamente, este método es particularmente efectivo cuando se usa junto con la información estructural existente y no se puede usar como un medio de determinación de la estructura 3D. El método proporciona la mejor visión y refinamiento de la estructura si el trabajo se basa en la información estructural existente a menudo junto con la simulación computacional18,19. Aquí, se describe el uso de distancias obtenidas de mediciones FRET en estado estacionario y resueltas en el tiempo para mapear un sitio de unión, cuya ubicación no se conocía, en una estructura cristalográfica existente del complejo SecA-SecYEG, proteínas principales en la vía secretora general3.

La vía secretora general, un sistema altamente conservado desde procariotas hasta eucariotas y arqueas, media el transporte de proteínas a través o dentro de la membrana a su ubicación funcional en la célula. Para las bacterias Gram-negativas, como E. coli, el organismo utilizado en nuestro estudio, las proteínas se insertan o translocan a través de la membrana interna hasta el periplasma. El complejo del canal SecY bacteriano (denominado translocon) se coordina con otras proteínas para translocar la proteína recién sintetizada, que se dirige a su ubicación correcta en la célula a través de una secuencia de señal típicamente ubicada en el extremo N20,21. Para las proteínas unidas al periplasma, la proteína ATPasa SecA se asocia con el túnel de salida del ribosoma, y con la preproteína después de que se hayan traducido aproximadamente 100 residuos22. Junto con la proteína chaperona SecB, mantiene la preproteína en un estado desplegado. SecA se une al translocón SecYEG, y a través de muchos ciclos de hidrólisis de ATP, facilita el transporte de proteínas a través de la membrana23,24.

SecA es una proteína multidominio que existe en formas citosólicas y unidas a la membrana. Una proteína homodimérica en el citosol, SecA consiste en un dominio de unión preproteica o de reticulación25, dos dominios de unión a nucleótidos, un dominio de ala helicoidal, un dominio de andamio helicoidal y el dedo de dos hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). En estudios cristalográficos previos del complejo SecA-SecYEG, la ubicación del THF sugirió que participaba activamente en la translocación de proteínas y los experimentos posteriores de reticulación con el péptido señal establecieron aún más la importancia de esta región en la translocación de proteínas30,31. Estudios previos, utilizando la metodología de mapeo FRET, demostraron que los péptidos señal exógenos se unen a esta región de SecA 2,32. Para comprender completamente la conformación y la ubicación de la secuencia de señal y la región madura temprana de la preproteína antes de la inserción en el canal SecYEG, se creó una quimera de proteínas en la que la secuencia de señales y los residuos de la región madura temprana se unieron a SecA a través de un enlazador Ser-Gly (Figura 1). Utilizando esta construcción biológicamente viable, se demostró además que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína se unen al THF de manera paralela2. Posteriormente, se utilizó la metodología de mapeo FRET para dilucidar la conformación y localización de la secuencia de señales y la región madura temprana en presencia de SecYEG como se describe a continuación3.

El conocimiento de la estructura 3-D del complejo SecA-SecYEG 33,34,35 y la posible ubicación del sitio de unión nos permitió colocar juiciosamente etiquetas donante-aceptor en lugares donde la intersección de distancias FRET individuales identifica la ubicación del sitio de unión. Estas mediciones de mapeo FRET revelaron que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína forman una horquilla con la punta ubicada en la boca del canal SecYEG, lo que demuestra que la estructura de la horquilla se modela antes de la inserción del canal.

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Protocol

1. Selección de sitios de etiquetado

  1. Identifique al menos tres posibles sitios de etiquetado para triangular el supuesto sitio de unión en las estructuras proteicas existentes. En este caso, se identificaron SecA, SecYEG y preproteína unida a SecA a través de la fusión genética2.
    1. Elija sitios de etiquetado dentro de 25-75 Å del sitio de unión putativo y en regiones relativamente estáticas de la proteína, la distancia determinará el par de tinte FRET específico que se utilizará36. Localice los sitios de etiquetado en regiones de proteínas que son relativamente distintas entre sí, de modo que los sitios describan los vértices de un triángulo con el supuesto sitio de unión ubicado en el centro (Figura 1A-D).
    2. Introducir o identificar residuos de cisteína (Cys) en los sitios de etiquetado de interés en una proteína que no tiene otros residuos de Cys, para mejorar la eficiencia de etiquetado del sitio específico37,38.
    3. Introducir aminoácidos no naturales, por ejemplo, p-azidofenilalanina para el etiquetado con química de clic, con el fin de etiquetar eficazmente una proteína en dos posiciones distintas con diferentes colorantes39,40.
    4. Pruebe los mutantes cys para detectar la pérdida de función. Verifique la actividad del mutante sin Cys y el mutante de aminoácidos no naturales utilizando un ensayo de actividad apropiado. En este caso, la actividad se verificó con un ensayo de crecimiento seguido de un ensayo in vitro de ATPasa verde de malaquita 32,41,42

2. Etiquetado de la proteína

  1. Purifique la proteína o proteínas de interés hasta al menos un 95% de pureza para un etiquetado preciso. Purificar las proteínas SecA y SecYEG siguiendo los protocolos detallados en la referencia3. Asegúrese de tener al menos 5 μg de proteína purificada para este paso, ya que se perderá algo de proteína durante el proceso de etiquetado.
  2. Elija dos tintes para las mediciones FRET en función de su valor R0 y las distancias previstas entre los sitios etiquetados. Estimar los valores de R0 y observar la superposición de emisiones y absorbancia del aceptor del donante utilizando la información de la base de datos de proteínas fluorescentes, que también proporciona espectros para colorantes de uso común (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOTA: R0 se define como la distancia a la que la eficiencia de transferencia es del 50% para un par de tintes determinado. Para los experimentos de mapeo, las distancias predichas deben estar cerca del valor R0 del par de tintes para garantizar que las distancias se puedan medir con precisión.
  3. Etiquete las posiciones identificadas en el paso 1.1.1. con el par de colorantes donante-aceptor.
    1. Etiquete la proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante, prestando especial atención a parámetros como la concentración óptima de proteínas, la temperatura, el pH, la duración del tiempo y el tampón para los colorantes específicos utilizados43,44.
    2. Prepare la proteína a una concentración de 1-2 mg/mL o aproximadamente 10 μM en un tampón Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) de 25 mM. Disolver el colorante en dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 1 mM. Agregue el colorante gota a gota a la solución mientras se agita para alcanzar una relación molar colorante:proteína de 5:1 (colorante de 50 μM: proteína de 10 μM).
    3. Deje que la reacción continúe durante 4 h a temperatura ambiente (RT) en un vial de vidrio con balanceo suave o durante la noche a 4 °C. Detenga la reacción agregando β-mercaptoetanol.
      NOTA: Si la proteína no es compatible con el tampón Tris, se pueden utilizar tampones de fosfato o HEPES. Mantenga el pH en el rango de 7.0-7.5. Si la proteína tiene enlaces disulfuro, agregue un agente reductor como TDT o TCEP antes del etiquetado. Retire la TDT mediante diálisis o filtración en gel antes de agregar el tinte.
  4. Para mediciones FRET precisas, retire el tinte libre con un concentrador centrífugo con un corte de peso molecular (MWCO) apropiado para dejar que el tinte libre fluya mientras retiene la proteína marcada.
    1. Prepare la membrana concentradora colocando ~ 1 ml de agua en la parte superior de un concentrador de 3 ml y luego centrífique el agua a través de la membrana (al menos 10 min a 4,300 x g).
    2. Retirar el colorante libre centrifugando la muestra etiquetada en concentrador (20 min a 4.300 x g). Repita 3-4 veces y deseche el flujo a través.
    3. Compruebe la eficiencia del etiquetado de la proteína marcada mediante espectroscopia de absorción UV-Vis.
      NOTA: Las mediciones fret requieren eficiencias de etiquetado del 50% o más. Las eficiencias de etiquetado más bajas reducen la señal FRET y pueden provocar imprecisiones en la medición.
    4. Obtener un espectro UV-Vis de la proteína marcada con un rango de 250-700 nm para observar tanto la banda de absorción de proteínas como la banda de absorción máxima del colorante. Mida la absorbancia en el pico de absorción del colorante y a 280 nm para la proteína.
    5. Determinar la concentración de proteína y corregir cualquier contribución del colorante utilizando el factor de corrección, CF, y las siguientes ecuaciones45,46:
      Equation 1
      donde C es la concentración de la proteína (M), A280 es la absorbancia de la muestra a 280 nm, Amax es la absorbancia en el máximo de absorción del colorante, ε proteína es el coeficiente de extinción de la proteína a 280 nm y CF es el factor de corrección, A'280/A'max, donde A'280 es la absorbancia a 280 nm y A'max es la absorbancia en el máximo máximo para el colorante solamente.
    6. Determine la eficiencia del etiquetado mediante la siguiente ecuación:
      Equation 2
      donde εcolorante es el coeficiente de extinción molar del colorante, C es la concentración de la proteína determinada en el paso 2.4.5, y E es la eficiencia de etiquetado. Repita el paso 2.4.2 hasta que el valor de eficiencia de etiquetado se haya estabilizado y sea inferior al 100%.

3. Determinar los valores de R 0

  1. Mida los valores de R0 in situ. Prepare dos muestras de proteínas a la misma concentración de proteína total, 4 μM, una con la proteína marcada solo con el colorante donante y otra con la proteína marcada solo con el colorante aceptor. Para SecA, una concentración de proteína de 4 μM de monómero SecA funciona bien para estas mediciones.
    1. Preparar volúmenes de muestra de 2,5 ml para una cubeta de 1 cm x 1 cm, 600 μL para una cubeta de 5 mm x 5 mm o 200 μL para una cubeta de 3 mm x 3 mm.
  2. Encienda el fluorómetro y abra el programa de adquisición y análisis espectral en el software de fluorescencia si utiliza un espectrofluorómetro. Haga clic en la M roja para conectar la computadora al instrumento (Figura 2A) y elija Espectros de emisión.
    1. Introduzca parámetros de exploración como la longitud de onda de excitación, el rango de exploración de emisión, la temperatura y la posición del cambiador de muestras mediante el elemento de menú Recopilar experimento (Figura 2B).
    2. Haga clic en RTC y optimice la configuración del instrumento (por ejemplo, ranuras espectrales) monitoreando la emisión de fluorescencia en el pico utilizando una longitud de onda de excitación establecida en el máximo de absorción del tinte. Para SecA, establezca la siguiente configuración: bandpass como 1 nm; hendiduras de excitación y emisión de 1 y 1,5 mm respectivamente, con la temperatura a 25 °C y la velocidad de agitación a 250 rpm.
      NOTA: No exceda la capacidad de conteo por segundo (cps) del instrumento (típicamente 2 x 106 cps).
  3. Coloque la muestra de proteína marcada por el donante en el soporte de la muestra y haga clic en Ejecutar para generar un escaneo de emisión de la proteína marcada solo con el colorante del donante (proteína solo del donante) excitando la muestra en el máximo de absorción del tinte (por ejemplo, 488 nm para AF488) y escaneando sobre el pico de emisión (505-750 nm para la proteína SecA solo del donante etiquetada con AF488).
  4. Establezca una línea de base para el análisis extendiendo el análisis 25-50 nm más allá del final del pico. Medir el rendimiento cuántico de la proteína solo donante, realizando mediciones de absorción y fluorescencia en muestras de diferentes concentraciones como se describe47. Mantenga la misma configuración de ranura para estas mediciones.
    1. Utilice el tinte de donante libre como referencia para el rendimiento cuántico. Obtener al menos cuatro mediciones de la proteína solo donante y el colorante libre a diferentes concentraciones para una determinación precisa.
    2. Trazar la intensidad de fluorescencia o el área integrada frente a la absorbancia de la proteína solo donante y el colorante o referencia libre. Determinar las pendientes para la proteína donante(PendienteD) y la referencia (PendienteR).
    3. El rendimiento cuántico (Φ) se calcula utilizando la siguiente ecuación:
      Equation 3
      aquí ΦD es el rendimiento cuántico de la proteína donante solamente, ΦR es el rendimiento cuántico del colorante libre (esto generalmente se puede obtener del fabricante), SlopeD y SlopeR son las pendientes determinadas en el paso 3.4.2 para la proteína donante y referencia, respectivamente y ηD y ηR representan el índice de refracción de la proteína solo donante y las soluciones de colorante sin referencia, respectivamente 47.
  5. Obtenga un espectro de absorción de su proteína solo aceptora utilizando una célula de longitud de trayectoria de 1 cm. Genere un espectro de coeficiente de extinción de su proteína solo aceptora dividiendo el espectro de absorción por la concentración de colorante.
  6. Generar la integral de superposición espectral, J (λ) utilizando un programa de análisis gráfico. También se puede utilizar un programa de hoja de trabajo estándar (por ejemplo, hoja de cálculo) para este proceso.
    1. Multiplique el espectro de emisión de fluorescencia de la proteína solo donante (paso 3.4) por el espectro del coeficiente de extinción de la proteína solo aceptor para generar el espectro de superposición.
    2. Multiplique el espectro de superposición resultante por λ4.
    3. Determine el área bajo la curva mediante la integración de la región de superposición. La región de superposición se define como el área donde el espectro de emisión del donante multiplicado por el espectro del coeficiente de extinción del aceptor produce valores positivos. La integral de superposición espectral se define como:
      Equation 4
      donde FD (λ) es el espectro de emisión de la proteína donante única (obtenida en la etapa 3.4) y εA(λ) es el espectro del coeficiente de extinción de la proteína aceptor única y tiene unidades de M-1 cm-1 (obtenidas en la etapa 3.5). La integral de superposición espectral resultante debe tener unidades de M-1 cm-1nm4.
    4. Normalizar la integral de superposición espectral. Divida la integral de superposición por el área integrada del espectro de proteínas del donante solo en el mismo rango espectral:
      Equation 5
    5. Calcule el valor de R0 en Å utilizando la siguiente ecuación:
      Equation 6
      donde κ2 es el factor de orientación, típicamente tomado como 2/3 para colorantes de rotación libre, η es el índice de refracción y puede aproximarse como 1.33 para soluciones acuosas diluidas, QD es el rendimiento cuántico del donante (paso 3.4) y J(λ) es la integral de superposición espectral según lo determinado en el paso 3.6.35. NOTA: Si los tintes no giran libremente, se pueden introducir correcciones como lo describe Ivanov 48 e implementarlas auclair49 y Zhang 2,3.

4. Realizar mediciones espectrales FRET

  1. Preparar muestras de proteína solo donante, proteína solo aceptor y proteína donante-aceptor a la misma concentración; se recomienda una concentración de 4 μM. Use 200 μL de solución, si usa una cubeta de 3 mm x 3 mm, 600 μL si usa una cubeta de 5 mm x 5 mm, o 2.5 mL si usa una cubeta de 1 cm x 1 cm.
    1. Prepare la muestra de proteína donante-aceptor utilizando cantidades molares iguales de la proteína donante solamente y solo aceptor.
    2. Mantener la misma cantidad de muestra marcada solo en muestras de proteínas del donante de control y solo del aceptor mediante la introducción de proteínas no etiquetadas en la misma cantidad molar a las muestras solo del donante o del aceptor solamente. Por ejemplo, para soluciones de la misma concentración, cada muestra FRET solo para donantes contendría 100 μL de proteína solo para donantes y 100 μL de proteína no etiquetada para un volumen de 200 μL.
  2. Generar espectros de emisión de fluorescencia de las muestras del donante solamente, del aceptor y del donante-aceptor. Optimice la señal como se describe en el paso 3.2. Una vez optimizado, mantenga la misma configuración para todas las muestras.
    1. Obtenga la exploración solo para donantes como se describe en el paso 3.3. Excite la solución en el máximo de absorción del colorante del donante y escanee sobre los picos de emisión del donante y del aceptor (esperado).
    2. Cambie la muestra a la proteína solo aceptora o cambie la posición del cambiador de muestra a la cubeta que contiene la proteína solo aceptor.
    3. Obtenga una exploración de emisión de la proteína marcada solo con colorante aceptor (proteína solo aceptor) utilizando la misma configuración que en el paso 4.2.1. Excitar la muestra en la longitud de onda de excitación del donante.
      NOTA: Este espectro proporciona una corrección para la cantidad de aceptor excitado en la longitud de onda del donante (FA en el paso 5.1.2)
    4. Cambie la muestra a la muestra de proteína donante-aceptor o cambie la posición del cambiador de muestra a la cubeta que contiene la proteína marcada donante-aceptor.
    5. Obtener una exploración de emisión de la muestra de proteína donante-aceptora utilizando los mismos ajustes que en los pasos 4.2.1 y 4.2.3.
    6. Para todos los espectros, corrija la fluorescencia de fondo restando los recuentos de fondo medidos al final de la exploración.
  3. Mida la vida útil del donante únicamente y las muestras del donante-aceptor preparadas como se describe en el paso 4.1.2. Utilice un instrumento de fluorescencia de conteo de fotón único correlacionado en el tiempo capaz de medir y resolver desintegraciones fluorescentes en el rango de tiempo de nanosegundos (10-9 s).
    NOTA: Para los pares de tintes FRET, haga coincidir la fuente de luz de excitación con el máximo de absorción del tinte donante.
    1. Encienda el instrumento. Abra el software de adquisición, use el software de control de instrumentos para la adquisición de datos con el espectrómetro de fluorescencia.
    2. Para la adquisición, seleccione TCSPC Decay, con un rango de tiempo de 55 ns, una ganancia de 1 y 4096 canales.
    3. Obtenga una función de respuesta del instrumento (IRF) utilizando una solución de crema no láctea o una solución de dispersión comercial y supervise la dispersión a 490 nm. Ajuste la configuración de la rendija y use filtros de densidad neutra según sea necesario para mantener una tasa de recuento lo suficientemente baja como para evitar la acumulación depulsos 5. Haga clic en Aceptar y, a continuación, en Iniciar. Esto iniciará la adquisición.
      NOTA: Se utiliza una tasa de recuento máxima de 4000 cps para una tasa de repetición de 180 kHz.
    4. Recoja el IRF a 490 nm hasta que el canal pico tenga un máximo de 20.000 recuentos. Recolecte un IRF antes y después de medir cada decaimiento de fluorescencia.
    5. Obtener las desintegraciones de fluorescencia del donante solamente y las muestras donante-aceptor mediante el monitoreo de la emisión de fluorescencia en la longitud de onda de emisión del donante, 520 nm.
    6. Ajuste la configuración de la ranura para una tasa de recuento máxima de 4000 cps o menos. Los ajustes de ranura suelen ser de 15-20 nm de paso de banda para muestras de proteínas. Recoge la descomposición hasta obtener 20.000 recuentos en el canal pico.
  4. Analizar la desintegración o la intensidad de fluorescencia (I) en función del tiempo (t) para la vida útil de la fluorescencia (τ). Ajuste la decadencia a una suma de exponenciales con la siguiente ecuación:
    Equation 7
    donde αI es el factor preexponencial del componente iésimo y τI es la vida útil. El ajuste se vuelve a involucrar con el IRF para que coincida con la desintegración de la fluorescencia. Juzgue la calidad del ajuste a partir de los parámetros reducidosde Χ 2 .

5. Análisis de los datos de FRET

  1. Calcule la eficiencia de FRET a partir de la disminución de la intensidad del donante de la muestra donante-aceptor en relación con el donante solo con la siguiente ecuación.
    Equation 8
    donde FDA es la intensidad de fluorescencia de la muestra donante-aceptor y FD es la intensidad de fluorescencia de la muestra del donante únicamente en el pico de la fluorescencia del donante. Utilice las áreas integradas de los picos si los datos son ruidosos.
    1. Corrija cualquier diferencia en el etiquetado entre las muestras del donante y las del donante-aceptor. Calcule las correcciones en función del grado de etiquetado del donante de la siguiente manera.
      Equation 9
      donde fDA es la eficiencia de etiquetado del donante en la muestra donante-aceptor y fD es la eficiencia del etiquetado en la muestra solo del donante.
    2. Corregir cualquier contribución de la fluorescencia del aceptor al espectro excitado por el donante mediante la sustracción del espectro de proteínas solo aceptor (paso 4.2) del espectro de proteína donante-aceptor.
      Equation 14
    3. Corregir las diferencias en la eficiencia de etiquetado de la proteína aceptora única en relación con la muestra de proteína donante-aceptor produciendo la siguiente ecuación para calcular la eficiencia:
      Equation 10
      donde fA denota la cantidad fraccional de etiquetado del aceptor. Esta ecuación incluye todas las correcciones debidas al etiquetado del tinte y la fluorescencia del aceptor.
    4. Calcule las distancias FRET a partir de las eficiencias utilizando la siguiente ecuación:
      Equation 11
      utilizando el valor R0 obtenido en el paso 3.6.5.
    5. Calcule la eficiencia de FRET utilizando la vida útil de fluorescencia del donante solo y las muestras de donante-aceptor medidas en los pasos 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Utilice la vida útil ponderada por amplitud para calcular las eficiencias fret y compararlas con los resultados en estadoestacionario 5.
      Equation 13
    7. Calcule la distancia como en el paso 5.1.4 a partir de las eficiencias determinadas por la vida útil de la fluorescencia. Compare los valores de estado estacionario y resueltos en el tiempo para las eficiencias y distancias de FRET y asegúrese de que estén dentro del error entre sí.

6. Mapeo de las distancias

  1. Utilice las distancias calculadas para asignar el sitio de enlace en la estructura tridimensional. Calcule las distancias y errores para todos los pares de tintes y ubicaciones examinados utilizando la ecuación dada en los valores del paso 5.1.4 y R0 obtenidos en el paso 3.6.5 para cada par FRET.
    1. Utilice un programa de visualización gráfica en 3D como PyMOL50 para mapear las distancias en la estructura (script dado en Archivo suplementario). Los comandos del script se pueden ingresar directamente en la ventana de comandos con la información de distancia adecuada.
    2. Genere un shell para cada distancia medida y el error asociado (Figura 3, Figura 4, Figuras suplementarias 1-3).
    3. Mapee la posición a través de la intersección de las diferentes conchas (Figuras suplementarias 1-3). El sitio de unión al péptido de señal se mapeó a través de las tres ubicaciones diferentes en SecA y SecYEG y cuatro ubicaciones diferentes en el péptido de señal (Figura 1).

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Representative Results

Este estudio se centró en determinar la ubicación del sitio de unión a la preproteína en SecA antes de la inserción de la preproteína en el canal SecYEG. Para mapear el sitio de unión, se realizaron experimentos FRET entre diferentes regiones de la preproteína y tres ubicaciones distintas en las proteínas SecA y SecYEG (Figura 1A-D). A partir de las distancias obtenidas y las estructuras tridimensionales de SecA, SecYEG y la preproteína, se predijo la ubicación del sitio de unión de la preproteína. En lugar de emplear tres entidades separadas (SecA, SecYEG y preproteína) para realizar estas mediciones, la secuencia de señales de PhoA se unió a SecA a través de la modificación genética después de la incorporación de un enlazador Gly-Ser 2,3. Para el etiquetado fácil con colorantes, se introdujeron residuos de Cys o mutaciones ámbar en los residuos 2, 22, 35 y 45 en la preproteína PhoA (Figura 1E).

Identificación de sitios y etiquetado
Un supuesto sitio de unión para la secuencia de señales había sido identificado previamente utilizando métodos similares de mapeo FRET 2,32. Estos y otros estudios habían identificado el dedo de dos hélices (THF) y el dominio de reticulación preproteico como posibles sitios de unión del péptido señal con una orientación sugerida en una posición paralela al THF 33,51,52,53,54 (Figura 1F). Por lo tanto, la identificación de posibles sitios de etiquetado en las proteínas SecA y SecYEG se realizó en función de la ubicación del sitio de unión putativo en la estructura cristalina SecA y SecYEG (que se muestra en verde en la Figura 1A-D). Se eligieron tres sitios para triangular la posición del sitio de unión putativo, donde esencialmente los tres sitios forman un triángulo alrededor del sitio de unión putativo. Como se muestra en la Figura 1, los tres sitios estaban dentro del rango FRET del sitio de unión (50-70 Å). Se eligió el par de tintes de Alexa Fluor 488 (AF488) y Alexa Fluor 647 (AF647), ya que el valor R0 de 55.7 Å36 se corresponde bien con las distancias esperadas entre los sitios etiquetados y el sitio de unión putativo que garantiza la precisión de la medición.

Los tres sitios elegidos para el etiquetado, SecA37, SecA321 y SecY292 (que se muestran como esferas magenta, violeta y cian en la Figura 1A-D) se encuentran en todo el complejo de proteínas formando un triángulo alrededor del sitio de unión putativo. Los tres sitios se mutaron por separado a residuos de Cys en un mutante sin Cys para garantizar que solo se etiquetara la posición correcta 2,37. Para los experimentos SecY292, los sitios de preproteína PhoA se etiquetaron con AF647 y el residuo SecY 292 se etiquetó con AF488 utilizando química maleimida. En la proteína quimérica, los sitios SecA37 y SecA321 fueron etiquetados con AF647 y la preproteína fue marcada con AF488. En la proteína quimérica SecA-PhoA, los residuos 2, 22, 37 y 45 del segmento de preproteína PhoA fueron mutados a un codón ámbar en proteínas individuales. Las mutaciones del codón ámbar permitieron la introducción de aminoácido no natural, p-azidofenilalanina, en esas posiciones, que posteriormente se etiquetaron con el AF488 utilizando la química de clic39,40. Cada mutación se generó y etiquetó de forma independiente para garantizar un etiquetado correcto y diferencial de los componentes de la proteína. El grado de etiquetado se determinó para todas las proteínas y generalmente debía ser del 50% o mejor para proceder con la muestra.

Determinación de eficiencias y distancias de transferencia
Antes de realizar las mediciones de transferencia de energía, se determinaron los valores de rendimiento cuántico del donante, integral de superposición y R0 (pasos 3.4-3.6). El rendimiento cuántico del donante se midió en relación con el colorante, la fluoresceína, que tiene un rendimiento cuántico de 0,79 en 0,1 M NaOH47. Los espectros de absorción y emisión de fluorescencia se obtuvieron a una serie de concentraciones para generar una gráfica lineal de absorción en relación con la intensidad de emisión de fluorescencia para determinar el rendimiento cuántico. En estas mediciones, es fundamental medir la absorción en el rango lineal (0.1-1.0) y todas las mediciones de emisión deben generarse con los mismos ajustes de hendidura. Como estos valores se utilizan para determinar integrales superpuestas y valores R0 , deben medirse en condiciones FRET. El entorno local de proteínas afecta profundamente la emisión de colorantes y, en consecuencia, los rendimientos cuánticos de los donantes deben medirse para cada uno de los sitios investigados. Observamos que los sitios en SecA y SecYEG influyen en los valores de R0 más fuertemente que los de la porción PhoA de la quimera. Para los pares de colorantes con el mismo sitio SecA o SecYEG, los valores de R0 suelen estar dentro de 5 Å entre sí; mientras que los valores de R0 pueden diferir hasta en 20 Å para las dos ubicaciones diferentes de SecA (residuos 37 vs. 321), lo que subraya la importancia de determinar los valores de R0 para cada par de colorantes (Tabla 1).

El cálculo de R0 supone que los colorantes donante y aceptor giran libremente y el grado en que los colorantes no giran contribuye a la incertidumbre general en la medición. Para tener en cuenta adecuadamente el movimiento relativo de los colorantes y sus orientaciones, se realizaron mediciones de anisotropía de fluorescencia en estado estacionario en todos los colorantes donantes y aceptores en las diferentes posiciones de etiquetado. Estos valores, que estaban en el rango de 0,10-0,21, se utilizaron para calcular el error asociado con las mediciones de distancia 2,3,48. Los valores de anisotropía relativamente altos observados tanto para los colorantes donantes como para los aceptores corresponden a una reducción en la rotación del colorante, lo que es inconsistente con la suposición de rotación libre. La falta de rotación libre genera un error del 19%-25% en los cálculos de distancia. Como se muestra en la Tabla 1, esto condujo a una incertidumbre promedio en las distancias medidas de al menos ± 15 Å. Al mapear las distancias FRET, estas incertidumbres en las mediciones de distancia son una consideración importante, como se discute a continuación.

La distancia calculada entre los pares donante-aceptor se basa en la relación entre eficiencia y distancia, en la que una mayor eficiencia es indicativa de pares donante-aceptor separados por una distancia más corta. Para determinar las eficiencias de FRET, los espectros de emisión de fluorescencia excitados en la longitud de onda de excitación del donante (488 nm) se obtienen en muestras de donante solo donante y donante-aceptor. Por lo general, una reducción en la intensidad de las emisiones de los donantes significa la presencia de transferencia de energía (paso 5.1). La Figura 1G muestra los espectros donante-aceptor para el residuo SecA 37 con el residuo 2 o 22 de la quimera PhoA. El residuo SecA37 está etiquetado con AF647 o el tinte aceptor, y los residuos PhoA están etiquetados con AF488 o el tinte donante. En cualquier posición, la fluorescencia del donante se reduce y se puede ver un pequeño aumento en la intensidad de la fluorescencia del aceptor en las muestras del donante-aceptor. Dado que la excitación se realiza en la longitud de onda de excitación del donante de 488 nm, que no excita directamente al aceptor, cualquier fluorescencia del aceptor observada resulta de la transferencia de energía. Por lo tanto, la disminución en la intensidad del donante y el aumento concomitante en la intensidad del aceptor resulta de la transferencia de energía entre los dos colorantes. Significativamente, la intensidad de fluorescencia del donante es mayor para la posición PhoA2 (azul) en relación con la posición PhoA22 (amarilla) en presencia del aceptor. Esta diferencia relativa en la disminución de la intensidad del donante indica que la transferencia de energía entre el residuo PhoA2 y el residuo SecA37 es más débil que la transferencia entre los residuos PhoA22 y SecA37, lo que implica que el residuo PhoA2 se encuentra más lejos de SecA37 que PhoA22. Las distancias se determinan a partir de la relación entre la eficiencia y los valores de R0 (paso 5.1.4).

Dado que las mediciones de fluorescencia en estado estacionario podrían representar un promedio de dos o más distancias, también realizamos mediciones de fluorescencia resueltas en el tiempo. Para estos experimentos, la vida útil del colorante donante se mide en presencia y ausencia del aceptor (Figura 1G). Si hubiera dos procesos distintos de transferencia de energía que contribuyeran a la eficiencia de fluorescencia en estado estacionario medido, se observarían como vidas discretas, siempre que fueran resolubles dentro de la resolución temporal del instrumento. Para mejorar la capacidad de resolver las vidas, se deben recolectar 10,000 recuentos o más en el pico; sin embargo, la altura máxima o los recuentos de canales máximos deben equilibrarse con el tiempo de adquisición y el daño potencial a la muestra. Las mediciones resueltas en el tiempo produjeron vidas únicas para cada par donante-aceptor consistentes con una sola orientación o distancia entre los tintes. Observamos que las pequeñas diferencias en la distancia observada en las áreas reveladas por nuestra técnica de mapeo FRET no conducirían a vidas resolubles en nuestro sistema. Además, las eficiencias determinadas por las mediciones de fluorescencia resueltas en el tiempo estuvieron de acuerdo con las determinadas a partir de las mediciones en estado estacionario, lo que proporciona un apoyo adicional de que las eficiencias medidas surgen de una sola distancia entre los pares de tintes3.

Mapeo de las distancias FRET en la estructura tridimensional
Las mediciones de transferencia de energía de resonancia proporcionan suficiente información de distancia para identificar el sitio de unión y la orientación de la secuencia de señales en SecA. Las tres ubicaciones en SecA y SecYEG junto con las cuatro posiciones en la región PhoA de la quimera SecA-PhoA proporcionan las 12 distancias diferentes utilizadas para mapear el sitio de unión (Tabla 1). Las doce distancias se mapearon en la estructura de cocristal de rayos X tridimensional del complejo Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) para identificar el sitio de unión de la secuencia deseñales 33. La estructura del complejo SecA-SecYEG es similar a la observada en E. coli como lo demuestra un estudio de fotoreticulación in vivo 55.

Utilizamos los residuos de principio (PhoA2) y final (PhoA22) de la secuencia de señales de PhoA en la quimera De SecA-PhoA para ilustrar cómo se identificaron las ubicaciones de los residuos en el complejo SecA-SecYEG. Como la transferencia de energía puede ocurrir en todas las direcciones, las distancias FRET y los errores asociados describen una cáscara esférica, con una de las ubicaciones de tinte del par donante-aceptor designada como el centro. En este estudio, los residuos SecA37, SecA321 y SecY292 forman los centros de tres conchas esféricas que describen la ubicación del residuo PhoA2 de la secuencia de señales. La visualización de las regiones superpuestas que surgen de las tres ubicaciones separadas, SecA37 (magenta), SecA321 (púrpura) y SecY292 (cian) se muestran en la Figura 3. Solo una parte de cada cáscara de FRET se cruza con la estructura de la proteína, y se resaltan los residuos y la columna vertebral que caen dentro de esa cáscara. Por lo tanto, las regiones de proteínas dentro de la cáscara definidas por la distancia SecA37-PhoA2 se muestran en magenta (Figura 3A, E), mientras que las regiones definidas por las conchas SecA321-PhoA2 y SecY292-PhoA2 se muestran en púrpura (Figura 3B, F) y cian (Figura 3C, G), respectivamente. El supuesto sitio de unión, que consiste principalmente en el dedo de dos hélices, se muestra en verde.

Como se muestra en la Figura 3, cada una de estas conchas FRET define una sección relativamente grande del complejo proteico. Para las tres ubicaciones, el shell FRET se cruza con el sitio de enlace putativo; sin embargo, para el residuo SecA321, por ejemplo, el área intersectada es más pequeña y se encuentra hacia los extremos de los dedos con una superposición significativa con el dominio del andamio helicoidal. La intersección o el área común de las tres conchas FRET (Figura 3D, H), define la ubicación del residuo PhoA2. Esta área es considerablemente más pequeña que cada proyectil FRET e incluye solo una pequeña porción del THF con una gran contribución del andamio helicoidal. Los scripts utilizados para generar las conchas FRET y las áreas intersectadas para el programa de visualización molecular, PyMOL, se dan en la Información Suplementaria. Partes de las conchas se visualizan como puntos rosados en el complejo SecA-SecYEG en las Figuras Suplementarias 1-3.

Se utilizó una estrategia similar para identificar la ubicación del residuo de PhoA22. Las conchas FRET definidas por las distancias FRET PhoA22 (Figura 4A-C, E-G) describen un área más pequeña en relación con el residuo PhoA2 (Figura 4D, Hvs. Figura 3D, H). Interpretamos esta diferencia para sugerir que el residuo de PhoA2 y la región asociada son más flexibles y lábiles que PhoA22. Significativamente, el área atribuida al residuo PhoA22 se encuentra más cerca de la punta del THF y la boca del canal SecYEG, con regiones de SecY identificadas en el área común (Figura 3D, H). Los tres emparejamientos de colorantes identifican regiones junto con el supuesto sitio de unión; sin embargo, las áreas comunes intersectadas centran la ubicación PhoA22 (Figura 4D, H) en el extremo opuesto del THF en relación con la ubicación PhoA2 (Figura 3D, H). Estos hallazgos sugerirían que la secuencia de señales de la preproteína que se extiende desde los residuos 2-22, se encuentra a lo largo del THF en un estado relativamente desestructurado. Este resultado es consistente con estudios anteriores que sugieren que la secuencia de señales se une a la proteína a lo largo del THF en un estado extendido y que el extremo C-terminal de SecA en la estructura cristalina de B. subtilis esencialmente modela la estructura del péptido señal y ocupa la misma ubicación (se muestra en rojo Figura 1F)2,26 . Empleamos un enfoque similar para identificar dos ubicaciones en la región madura temprana (residuos 37 y 45) de la quimera de preproteína SecA-PhoA para definir aún más la unión y orientación de la secuencia de señales y la región madura temprana como se discute a continuación. En otros estudios se han utilizado distancias FRET de manera efectiva para refinar una estructura existente o dinámica molecular derivada del modelo derivado de la simiulación 18,19,56; no pudimos hacer esto, ya que no existe una estructura para la secuencia de señales enlazada a SecA.  

Figure 1
Figura 1: Sitios de etiquetado en el complejo SecA-SecYEG con espectros FRET representativos. (A-D) Cuatro vistas diferentes de la estructura cocristalina SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33 en las que los sitios de etiquetado de SecA37, SecA321 y SecY292 se muestran como esferas magenta, violeta y cian, respectivamente. A-C son vistas laterales del complejo y D es una vista superior. SecA se muestra en gris claro, SecYEG se muestra en gris oscuro y el sitio de unión putativo, el THF, se muestra en verde. (E) Esquema de la construcción quimera SecA-PhoA, que conecta la proteína SecA con la preproteína PhoA a través de un enlazador Ser-Gly (no dibujado a escala). Los sitios de etiquetado en la porción PhoA de la quimera se dan en azul, verde, amarillo y rojo, correspondientes a los residuos 2, 22, 37 y 45. (F) Diagrama de cinta de la estructura cristalina de la proteína B. subtilis SecA (PDBID: 1M6N) coloreada por dominio donde los dominios de unión a nucleótidos 1 y 2 se muestran en azul y azul claro, respectivamente, el dominio de reticulación de preproteínas se muestra en oro, la hélice central en verde, el dedo de dos hélices en cian, el dominio del ala helicoidal en verde oscuro y el enlazador C-terminal en rojo26 . El C-terminal no estructurado sirve como modelo del péptido de señal PhoA unido basado en un estudio previo de mapeo FRET2. (G) Espectros de fluorescencia en estado estacionario del donante único y muestras donante-aceptor del par FRET SecA37-AF647 y PhoA2-AF488 y del par FRET SecA37-AF647 y PhoA22-AF488. La reducción de la intensidad del donante para la muestra donante-aceptora es indicativa de transferencia de energía. Se produce una mayor transferencia de energía desde PhoA22 en relación con el sitio PhoA2 en función de la disminución de la intensidad del donante. (H) Espectros de desintegración de donante de fluorescencia resueltos en el tiempo solo (magenta) y donante-aceptor (magenta ligero) del par SECA37-AF647 y PhoA22-AF488 FRET. La función de respuesta del instrumento se muestra en gris. El complejo donante-aceptor proporciona una descomposición más corta y, en consecuencia, una vida útil más rápida consistente con la transferencia de energía. Todas las estructuras moleculares se generaron con el archivo PDB indicado y PyMOL50. La Figura 1E-H ha sido modificada a partir de Zhang et al.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Interfaz de usuario del programa FluorEssence. (A) La ventana de apertura se muestra con un círculo alrededor de la M roja. Se debe hacer clic en él para conectar el programa con el fluorómetro. (B) La ventana de configuración del experimento ilustra las diferentes áreas (monos, detectores, accesorios) donde se ingresan los parámetros relevantes del escaneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Proyectiles de distancia FRET determinados para la posición SecA-PhoA2. Las conchas de distancia FRET construidas a partir de las distancias FRET y las incertidumbres asociadas (Tabla 1) se representan en el complejo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Proyectiles de distancia FRET para la ubicación PhoA2 construidos con SecA37 (magenta), SecA321 (violeta) y SecY292 (cian), respectivamente en la posición central. Las conchas están coloreadas de acuerdo con el residuo central. (D) La intersección de las tres conchas FRET define la ubicación de PhoA2, que se muestra en azul. (E-H) Las vistas se giran aproximadamente 180 ° desde A-D. Todas las estructuras moleculares se generaron con el archivo PDB indicado y PyMOL50. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Proyectiles de distancia FRET determinados para la posición SecA-PhoA22. Las conchas de distancia FRET construidas a partir de las distancias FRET y las incertidumbres asociadas (Tabla 1) se representan en el complejo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Conchas de distancia FRET para la ubicación PhoA22 construidas con SecA37 (magenta), SecA321 (violeta) y SecY292 (cian), respectivamente en la posición central. Las conchas están coloreadas de acuerdo con el residuo central. (D) La intersección de las tres conchas FRET define la ubicación de PhoA22, que se muestra en amarillo. (E-H) Las vistas se giran aproximadamente 180 ° desde A-D. Todas las estructuras moleculares se generaron con el archivo PDB indicado y PyMOL50. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ubicaciones mapeadas por FRET de PhoA2, PhoA22, PhoA37 y PhoA45 proyectadas sobre la estructura de cocristal B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE (PDBID: 5EUL). (A) Coloración de SecA-SecYE como en la Figura 1. El sustrato peptídico OmpA insertado al final del THF se muestra en rosa. Las regiones mapeadas por FRET se generaron en presencia de ATP-γS, con PhoA2 en azul, PhoA22 en verde, PhoA37 en amarillo y PhoA45 en rojo. Las regiones superpuestas se muestran en oliva (PhoA22 y PhoA37) y naranja (PhoA37 y PhoA45). El sustrato peptídico (residuos 749-791, cian) se extirpó de la estructura original y se modeló en la región de unión putativa sin ninguna alteración de la estructura (rodeado en rojo). (B) Vista ampliada del sustrato peptídico modelado. Los residuos 2 (Lys), 22 (Tyr) y 37 (Gly) del sustrato peptídico OmpA se representan en forma de palo en azul, verde y amarillo, respectivamente. Estos residuos en los péptidos modelados exhiben un excelente acuerdo con las ubicaciones mapeadas FRET predichas. Para mayor claridad, se ha omitido el nanocuerpo en la estructura original. Esta cifra ha sido modificada a partir de Zhang et al.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

sitio etiquetado en el complejo SecA-PhoA-SecYEG Sitio etiquetado en la porción peptídica PhoA de SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
Eficiencia FRET 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
distancia 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
Eficiencia FRET 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
distancia 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
Eficiencia FRET 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
distancia 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
adaptado de la referencia 3.
Los valores de R0 dados en angstroms se calcularon como se describe en el texto
La eficiencia fret se calculó a partir de la disminución de la intensidad de fluorescencia del donante en presencia del aceptor como se describe. El error se informa como el SD de tres mediciones independientes.
Las distancias donante-aceptor (R) se dan en angstroms y se calculan como se describe en el texto. El error reportado resulta de una consideración del error experimental y el derivado de la orientación de los tintes.  La orientación del colorante se estima a partir de la anisotropía de fluorescencia en estado estacionario

Tabla 1: Eficiencias de transferencia y distancias determinadas para el complejo SecA-PhoA-SecYEG. Las eficiencias FRET, las distancias y los valores R0 se dan para las 12 distancias utilizadas para mapear el sitio de unión de preproteínas.

Figura suplementaria 1: Capa de distancia FRET, mostrada en puntos rosados, determinada para el residuo SecA37 y el residuo PhoA 37 en el complejo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A se muestra en gris claro, SecYEG se muestra en gris oscuro y el residuo SecA37 se muestra en magenta. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Capa de distancia FRET, mostrada en puntos rosados, determinada para el residuo SecA321 y el residuo PhoA 37 en el complejo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A se muestra en gris claro, SecYEG se muestra en gris oscuro y el residuo SecA321 se muestra en violeta. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Capa de distancia FRET, mostrada en puntos rosados, determinada para el residuo SecY292 y el residuo PhoA 37 en el complejo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A se muestra en gris claro, SecYEG se muestra en gris oscuro y el residuo SecY292 se muestra en cian. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente complementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Mediante el uso de la metodología de mapeo FRET, identificamos el sitio de unión a la secuencia de señales en la proteína SecA. Es importante destacar que la presencia de una estructura cristalina 3D del complejo facilitó enormemente nuestro estudio. La fortaleza de esta metodología de mapeo radica en la capacidad de utilizar una estructura existente para identificar ubicaciones para el etiquetado. Esta metodología no se puede utilizar para determinar una estructura 3D; sin embargo, la determinación de elementos estructurales56, el refinamiento de una estructura existente49, la determinación de la ubicación de un sitio de unión 2,32 o la elucidación del movimiento dinámico57, son todas las posibles aplicaciones de este método.

En el complejo SecYEG-SecA-PhoA, los tres sitios de etiquetado forman un triángulo alrededor del supuesto sitio de unión (Figura 1). El empleo de múltiples mediciones de distancia desde los vértices de este triángulo hasta el mismo residuo refina la información de ubicación similar a los métodos de navegación GPS. Se identificaron tres sitios, SecA37, SecA341 y SecY292, en SecA y SecY junto con cuatro sitios, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 en la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína para dar un total de 12 distancias para mapear la ubicación del péptido de señal (Tabla 1). Es importante destacar que, para mejorar la precisión de las mediciones de distancia, los sitios de etiquetado deben ubicarse en regiones relativamente estáticas de la proteína, como en elementos de estructura secundaria en lugar de bucles. Además, los sitios también deben estar en lugares que sean relativamente accesibles para el solvente para facilitar y aumentar la eficiencia del etiquetado. Dentro del complejo SecA-PhoA-SecYEG, la realización de mediciones de distancia desde los sitios del triángulo o vértices hasta los residuos en el sustrato de unión fue suficiente para ubicar los residuos en el sustrato de unión a un área relativamente pequeña (Figura 3D, H y Figura 4D, H). La identificación del área intersectada a partir de las mediciones de distancia múltiple refina significativamente la ubicación de la medición de distancia única, como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4. Por lo tanto, cuando se utiliza este método, se recomienda encarecidamente la medición de múltiples distancias. Aunque este método puede identificar regiones de moléculas involucradas en la unión, por ejemplo, no proporciona información estructural precisa; dicha información se obtiene mejor de otros métodos estructurales como rayos X, RMN y crio-EM. Las distancias FRET se pueden utilizar para refinar efectivamente una estructura existente18,19 o modelo, en este caso, que no era posible ya que no existe un modelo de la secuencia de señales enlazada a SecA.

Para garantizar que el etiquetado del tinte se realice solo en los lugares deseados y que las mediciones de distancia FRET sean precisas, se prefiere el uso de mutagénesis para el etiquetado. La generación de un mutante sin Cys requiere una mutación relativamente conservadora de los residuos de Cys a Ser o residuos similares en la proteína de tipo salvaje utilizando métodos de mutagénesis dirigidos al sitio. En el estudio actual, las mutaciones de Cys se introdujeron en versiones libres de Cys de SecA y SecYEG para etiquetar37. La actividad de la proteína mutante se verificó con un ensayo de crecimiento seguido de un ensayo in vitro de ATPasa verde de malaquita41,42. Los ensayos de actividad relevantes dependen de la función de la proteína, por ejemplo, para las proteínas de unión al ADN, un ensayo de unión al ADN sería apropiado58. No garantizar el etiquetado en un solo lugar puede llevar al etiquetado de más de un sitio con el mismo tinte, lo que complica significativamente las determinaciones de distancia. Por lo tanto, la introducción de una segunda etiqueta en la misma proteína se puede hacer a través de la incorporación de aminoácidos no naturales por mutagénesis dirigida al sitio. Empleamos esta metodología para etiquetar la quimera SecA-PhoA en lugares distintos de los residuos de Cys mediante la introducción del aminoácido no natural, p-azidofenilalanina y el etiquetado con química de clic39,40.

Una consideración importante adicional de este método es la elección de los colorantes utilizados y el valor R0 asociado. Después de la identificación de los posibles sitios de etiquetado, las distancias a medir se pueden estimar a partir de la estructura 3D. Con esta información, los investigadores pueden elegir pares de tintes con valores R0 que abarquen el rango deseado de distancias esperadas. Por ejemplo, el par de tintes AF488-AF647 tiene un R0 calculado de 55.7 Å, lo que proporciona un buen rango para los sitios de etiquetado ubicados a una distancia estimada de 40-75 Å del supuesto sitio de unión. Aunque los valores de R0 calculados en el paso 2.2 son útiles para elegir qué par de colorantes usar para su sistema, la unión de los colorantes a la proteína puede alterar significativamente sus propiedades. Para una mayor precisión, los valores de R0 deben calcularse a partir de experimentos in situ realizados con proteínas marcadas (pasos 3.1 a 3.6.5).

La medición de la eficiencia de la transferencia se puede realizar monitoreando la emisión de fluorescencia en estado estacionario y observando una disminución en la emisión del donante o un aumento en la emisión del aceptor. Aunque la observación de ambos efectos es deseable, la eficiencia se puede calcular a partir de cualquiera de losdescritos 5,8. La eficiencia también se puede calcular a partir de la disminución de la vida útil del donante en la muestra donante-aceptor en relación con la muestra solo del donante. Se recomienda la determinación de la eficiencia por más de un método, en particular el uso de métodos resueltos en el tiempo para establecer la homogeneidad relativa de las eficiencias medidas.

El método de mapeo también nos permitió determinar la orientación relativa de la secuencia de señales y las regiones maduras tempranas de la preproteína PhoA en relación con SecA y el sitio de unión putativo. Una estructura cristalina de rayos X SecA-SecYEG y un posterior estudio crio-EM proporcionaron claridad con respecto a la estructura de la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína con respecto al canal y SecA34,35. En la estructura de rayos X, los residuos 1-41 de la preproteína OmpA se unieron a la punta del dedo de dos hélices y se visualizaron en una estructura de horquilla en el canal (se muestra en rosa, Figura 5). Las ubicaciones de los cuatro residuos de PhoA en la quimera SecA-PhoA se mapearon en esta estructura utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 5, la ubicación de los residuos PhoA37 y PhoA45 (amarillo, naranja, rojo) está entre PhoA2 y PhoA22, con PhoA45 más cerca de PhoA2. Estos hallazgos, particularmente la ubicación de PhoA45, sugirieron que la preproteína PhoA estaba formando una estructura de horquilla.

Para validar aún más nuestro sitio de unión identificado por FRET, realizamos una comparación de nuestras ubicaciones mapeadas con la de la preproteína OmpA, eliminando la estructura de preproteína de 41 residuos del canal y modelándola en las regiones definidas por el mapeo FRET (Figura 5, cian). Sin ninguna alteración de la estructura de rayos X de la preproteína, encontramos que las ubicaciones de los residuos 2, 22 y 37 (mostrados en azul, verde y amarillo) en la estructura extirpada del fragmento de preproteína OmpA concuerdan notablemente bien con las ubicaciones mapeadas fret (Figura 5B) y sugieren que la horquilla se forma antes de la entrada del canal. La preproteína OmpA termina en el residuo 41 en la estructura cristalina de rayos X; sin embargo, el terminal C de SecY, que no está estructurado, proporciona una indicación de la posible ubicación de PhoA45. En nuestra estructura modelada, el bucle de horquilla se encuentra en la boca del canal, preparado para facilitar la translocación de la preproteína a través de la membrana. Por lo tanto, en este ejemplo, la metodología de mapeo FRET mejora la información existente de la estructura estática SecA-SecYEG, al proporcionar una pista del movimiento dinámico necesario para la translocación de proteínas a través de la membrana. Aunque no es adecuado para determinaciones de estructura de novo , si se dispone de información estructural en 3 dimensiones, la metodología de mapeo FRET puede promover la comprensión actual de las relaciones estructura-función, a través de la elucidación de sitios de unión y movimientos dinámicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención R15GM135904 de los Institutos Nacionales de Salud (otorgada a IM) y la Subvención GM110552 de los Institutos Nacionales de Salud (otorgada a DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

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Bioquímica Número 181 fluorescencia transferencia de energía SecA translocación de proteínas mapeo FRET
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features
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Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

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