Summary
この研究は、標識部位の選択、色素の選択、取得、およびデータ分析を含むFRETマッピングの方法論を詳述している。この方法論は、タンパク質系における結合部位、立体構造変化、および動的運動を決定するのに有効であり、既存の3D構造情報と組み合わせて実行される場合に最も有用である。
Abstract
Förster共鳴エネルギー移動(FRET)は、 インビトロ および細胞内の生体分子間および生体分子間の距離を首尾よく測定するために使用される確立された蛍光ベースの方法です。FRETにおいて、蛍光強度または寿命の変化によって測定されるエネルギー移動の効率は、2つの蛍光分子または標識間の距離に関する。距離からのダイナミクスと立体構造変化の決定は、この方法の生物学的システムへの応用の一例にすぎません。特定の条件下では、この方法論は、ダイナミクス、柔軟性、および結合表面への適応に関する情報を提供することにより、既存のX線結晶構造に追加し、強化することができる。我々は、結合部位または二量体サブユニットの配向の同定を通じて、構造特性を解明するためのFRETおよび関連する距離決定の使用について記述する。標識部位の賢明な選択、および多くの場合、複数の標識戦略の採用を通じて、タンパク質-DNA複合体およびSecA-SecEGタンパク質転座システムにおけるグローバルな構造特性を決定するために、これらのマッピング法を首尾よく適用しました。SecA-SecYEGシステムでは、FRETマッピング法を使用して、プレタンパク質結合部位を同定し、結合したシグナル配列領域の局所立体構造を決定しました。この研究は、適切な標識部位の同定、非天然アミノ酸残基を含む可能な標識の議論、標識手順、測定の実施方法、およびデータの解釈を含む、FRETマッピング研究を実施するためのステップを概説する。
Introduction
タンパク質については、3次元(3次元)構造知識とともにダイナミクスを解明することで、生体分子系の構造と機能の関係の理解を深めることができます。X線結晶学や極低温電子顕微鏡などの構造的方法は、静的構造を捉え、生体分子結合やダイナミクスの側面を解明するために複数の構造の決定を必要とすることが多い1。この記事では、結合部位や結合相互作用など、静的な方法ではキャプチャしにくい可能性のあるグローバル構造要素をマッピングするためのソリューションベースの方法について説明します。この方法論の有力な候補系は、X線結晶学、NMR分光法、または他の構造法によって3次元構造が以前に決定されたものである。この場合、タンパク質一般分泌経路の中心プレーヤーであるSecA-SecYEG複合体のX線結晶構造を利用して、膜2を横切るプレタンパク質の輸送の前にフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を用いてシグナルペプチド結合部位の位置をマッピングする。遺伝子改変による生体系の操作と3次元構造に関する我々の知識を組み合わせることで、チャネル 3への挿入直前のシグナル配列と早期成熟領域の立体構造の決定が可能となった。
FRETは、空間4,5を通る距離依存的な方法で、ある分子(ドナー)から別の分子(アクセプター)へのエネルギーの放射線のない移動を含む。この転送の効率は、ドナーの減少またはアクセプター蛍光強度の増加のいずれかによってモニターされます。エネルギー移動の効率は、次のように記述できます。
E = R 0 6/(R0 6 + R 6)
ここで、R0値は、転送が50%効率的である距離である6。この技術は、以前に分子定規として記載されており、ドナー - アクセプター色素4,7,8,9の同一性に応じて、2.5〜12nmの範囲の距離を決定するのに有効である。ドナーの蛍光強度および寿命は、アクセプターの有無にかかわらず、転写効率の決定を可能にし、その結果、距離5,8である。この技術の利用可能性、方法の感度、および使いやすさにより、FRETは、単一分子蛍光分光法および共焦点顕微鏡6などの分野でも幅広い用途を見出しました。緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の出現により、細胞内動態の観察および生細胞イメージングが比較的容易になった10,11。このような多くのFRETアプリケーションについては、この仮想問題で詳しく説明します。
この研究では、構造の詳細を決定するための距離値を得るためにFRET測定を使用することに特に焦点を合わせています。これまで、FRET測定は、タンパク質12、13、14に結合したときのDNA分子の立体構造、タンパク質の内部動態、およびタンパク質結合相互作用15、16、17を決定するために効果的に使用されてきた。この方法の利点は、比較的少量の材料を含むソリューション中で柔軟で動的な構造要素を決定する能力にあります。重要なことに、この方法は、既存の構造情報と組み合わせて使用する場合に特に効果的であり、3次元構造決定の手段として使用することはできません。この方法は、作業がしばしば計算シミュレーションと組み合わされた既存の構造情報に基づいて構築されている場合、構造の最良の洞察と洗練を提供する18,19。ここでは、定常状態および時間分解FRET測定から得られた距離を使用して、SecA-SecYEG複合体の既存の結晶学的構造上の結合部位を、一般分泌経路3の主要なタンパク質上に位置が知られていなかった。
一般分泌経路は、原核生物から真核生物、古細菌まで高度に保存された系であり、細胞内の機能的位置への膜を横切ってまたは膜内へのタンパク質の輸送を媒介する。我々の研究で使用された生物である大腸菌などのグラム陰性菌の場合、タンパク質は内膜を横切ってペリプラズムに挿入または転座する。細菌のSecYチャネル複合体(トランスロコンと呼ばれる)は、他のタンパク質と協調して、新たに合成されたタンパク質を転座させ、これは、典型的にはN末端に位置するシグナル配列を介して細胞内のその正しい位置に向けられる20,21。ペリプラズムに結合したタンパク質の場合、ATPase SecAタンパク質はリボソームの出口トンネルと会合し、約100残基が翻訳された後のプレタンパク質と会合する22。SecBシャペロンタンパク質とともに、プレタンパク質を折り畳まれていない状態に維持する。SecAは、SecYEGトランスロコンに結合し、そしてATP加水分解の多くのサイクルを経て、膜を横切るタンパク質輸送を促進する23、24。
SecAは、細胞質ゾルおよび膜結合形態で存在するマルチドメインタンパク質である。細胞質ゾル中のホモ二量体タンパク質であるSecAは、プレタンパク質結合または架橋ドメイン25、2つのヌクレオチド結合ドメイン、ヘリカルウィングドメイン、ヘリカルスキャフォールドドメイン、および2つのヘリックスフィンガー(THF)26、27、28、29からなる(図1)。SecA-SecYEG複合体の以前の結晶学的研究において、THFの位置は、それがタンパク質転座に積極的に関与していることを示唆し、その後のシグナルペプチドとの架橋実験は、タンパク質転座におけるこの領域の重要性をさらに確立した30,31。FRETマッピング方法論を用いた以前の研究では、外因性シグナルペプチドがSecA2,32のこの領域に結合することが実証された。SecYEGチャネルへの挿入前のプレタンパク質のシグナル配列と初期成熟領域の立体構造と位置を完全に理解するために、初期成熟領域のシグナル配列と残基がSer-Glyリンカーを介してSecAに結合したタンパク質キメラを作成した(図1)。この生物学的に生存可能な構築物を用いて、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が並行してTHFに結合することをさらに実証した2。続いて、FRETマッピング方法論を用いて、下記3のようにSecYEG存在下におけるシグナル配列および初期成熟領域の立体構造および位置を解明した。
SecA-SecYEG複合体33,34,35の3次元構造と結合部位の可能な位置に関する知識により、個々のFRET距離の交点が結合部位の位置を特定する場所にドナー-アクセプター標識を慎重に配置することができました。これらのFRETマッピング測定は、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が、先端がSecEGチャネルの口に位置するヘアピンを形成することを明らかにし、ヘアピン構造がチャネル挿入前にテンプレート化されることを実証した。
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Protocol
1. ラベリングサイトの選択
- 既存のタンパク質構造上の推定結合部位を三角測量するための少なくとも3つの潜在的な標識部位を同定する。このとき、遺伝子融合によりSecA、SecYEG、およびSecAに結合したプレタンパク質が同定された2。
- 推定結合部位の25〜75Å以内およびタンパク質の比較的静的な領域における標識部位を選択し、その距離は、使用する特定のFRET色素対を決定するであろう36。互いに比較的異なるタンパク質領域内の標識部位の位置を特定し、それらの部位が三角形の頂点を記述し、推定結合部位が中央に位置するようにします(図1A-D)。
- 他のCys残基を有さないタンパク質における目的の標識部位にシステイン(Cys)残基を導入または同定し、特定部位の標識効率を向上させる37、38。
- 非天然アミノ酸、例えばp−アジドフェニルアラニンを、異なる色素で2つの異なる位置で1つのタンパク質を効果的に標識するために、クリックケミストリーで標識するために導入する39、40。
- Cys変異体の機能喪失について試験する。Cysレス変異体および非天然アミノ酸変異体の活性を、適切な活性アッセイを用いて検証する。この場合、活性は、増殖アッセイとそれに続くインビトロマラカイトグリーンATPaseアッセイ32、41、42で検証した。
2. タンパク質の標識
- 正確な標識のために、目的のタンパク質を少なくとも95%の純度に精製します。SecAおよびSecYEGタンパク質を、参考文献3に詳述されているプロトコールに従って精製する。標識プロセス中に一部のタンパク質が失われるため、このステップで少なくとも5 μgの精製タンパク質があることを確認してください。
- FRET測定には、R0値と標識部位間の予測距離に応じて2つの色素を選択します。R0値を推定し、蛍光タンパク質データベースからの情報を使用してドナー発光とアクセプター吸光度が重なり合うのを観察し、これは一般的に使用される色素のスペクトルも与える(https://www.fpbase.org/spectra/)36。
注:R0は、所定の色素対の転写効率が50 %になる距離として定義されます。マッピング実験では、予測距離を色素ペアのR0 値に近づけて、距離を正確に測定できるようにする必要があります。 - ステップ 1.1.1 で識別した位置にラベルを付けます。ドナー - アクセプター色素対を有する。
- 最適なタンパク質濃度、温度、pH、時間の長さ、および使用される特定の色素の緩衝液などのパラメータに特に注意を払って、製造業者の指示に従ってタンパク質を標識する43,44.
- 25 mM トリス塩酸 (pH 7.5)、25 mM KCl、1 mM EDTA(TKE) バッファー中で、1 ~ 2 mg/mL または約 10 μM の濃度でタンパク質を調製します。色素をジメチルホルムアミド(DMF)またはジメチルスルホキシド(DMSO)に終濃度1mMまで溶解する。攪拌しながら溶液に色素を滴下し、色素:タンパク質のモル比が5:1(50 μM色素:10 μMタンパク質)に達するまで加える。
- 穏やかに揺動させるガラスバイアル中で室温(RT)で4時間、または4°Cで一晩反応を進行させる。 β-メルカプトエタノールを加えて反応を停止する。
注:タンパク質がトリス緩衝液と適合しない場合は、リン酸またはHEPES緩衝液を使用することができる。pHを7.0〜7.5の範囲に維持してください。タンパク質がジスルフィド結合を有する場合、標識の前にDTTまたはTCEPなどの還元剤を添加する。色素を添加する前に透析またはゲルろ過によってDTTを除去する。
- 正確なFRET測定のために、適切な分子量カットオフ(MWCO)を備えた遠心濃縮器で遊離色素を除去し、標識タンパク質を保持したまま遊離色素を通過させます。
- 3 mL の濃縮器の上部に ~ 1 mL の水を入れて濃縮器膜を作製し、膜を通して水を遠心分離します (4,300 x g で少なくとも 10 分間)。
- 標識サンプルを濃縮器で遠心分離して遊離色素を除去します(4,300 x gで20分)。3〜4回繰り返し、流れを処分します。
- UV-Vis吸収分光法を用いて標識タンパク質の標識効率を確認してください。
注:FRET測定には、50%以上のラベリング効率が必要です。ラベリング効率が低いとFRET信号が減少し、測定の不正確さにつながる可能性があります。 - 250〜700nmの範囲で標識タンパク質のUV-Visスペクトルを取得し、タンパク質吸収バンドと色素極大吸収バンドの両方を観察する。色素の吸収ピークおよびタンパク質の280nmにおける吸光度を測定する。
- タンパク質の濃度を決定し、補正係数CF、および以下の式45、46を使用して色素からの寄与を補正する:
ここで、Cはタンパク質(M)の濃度、A280は280nmにおけるサンプル吸光度、Amaxは色素吸収極大における吸光度、εタンパク質は280nmにおけるタンパク質の吸光係数、CFは補正係数A'280/A'max、A'280は280nmにおける吸光度、A'maxは色素のみのピーク極大における吸光度である。 - 次の式を使用してラベリング効率を決定します。
ここで 、ε色素 は色素のモル吸光係数、Cはステップ2.4.5で決定されたタンパク質の濃度、Eは標識効率です。ラベリング効率の値が頭打ちになり、100% 未満になるまで、手順 2.4.2 を繰り返します。
3. R 0 値を決定する
- R0 値をその場で測定します。同じ濃度の全タンパク質(4 μM)で2つのタンパク質サンプルを調製し、1つはドナー色素のみで標識されたタンパク質で、もう1つはアクセプター色素のみで標識されたタンパク質で調製します。SecAの場合、4μM SecAモノマーのタンパク質濃度は、これらの測定に適しています。
- 1 cm x 1 cm のキュベットの場合は 2.5 mL、5 mm x 5 mm のキュベットの場合は 600 μL、3 mm x 3 mm のキュベットの場合は 200 μL のサンプル容量を準備します。
- 分光蛍光光度計を使用している場合は、蛍光計をオンにし、蛍光ソフトウェアでスペクトル取得および分析プログラムを開きます。赤い M をクリックしてコンピュータを計測器に接続し(図2A)、 発光スペクトルを選択します。
- 励起波長、発光スキャンの範囲、温度、サンプルチェンジャー位置などのスキャンパラメータを、[実験の収集]メニュー項目を使用して入力します(図2B)。
- RTCをクリックし、色素の吸収極大に設定された励起波長を使用してピーク時の蛍光発光を監視することにより、機器の設定(スペクトルスリットなど)を最適化します。SecA の場合は、バンドパスを 1 nm に設定します。励起スリットおよび発光スリットをそれぞれ1および1.5mmとして、温度を25°Cおよび攪拌速度を250rpmとした。
メモ:計測器の1秒あたりのカウント数(cps)容量(通常は2 x 106 cps)を超えないようにしてください。
- ドナー標識タンパク質サンプルをサンプルホルダーに入れ、「 実行 」をクリックして、色素吸収極大(例えば、AF488の場合は488 nm)でサンプルを励起し、発光ピーク(AF488で標識されたドナーのみのSecAタンパク質の場合は505-750 nm)をスキャンすることにより、ドナー色素のみ(ドナーのみのタンパク質)で標識されたタンパク質の発光スキャンを生成します。
- ピークの終わりを越えてスキャンを25〜50nm延長することによって、スキャンのベースラインを確立します。ドナーのみのタンパク質の量子収率を測定し、47に記載の異なる濃度のサンプルに対して吸収および蛍光測定を行うことによって。これらの測定では、同じスリット設定を維持します。
- 量子収率の基準として遊離ドナー色素を使用する。正確な測定のために、ドナー専用タンパク質および遊離色素の少なくとも4つの測定値を異なる濃度で取得する。
- ドナー専用タンパク質および遊離色素または基準についての吸光度に対する蛍光強度または積分面積をプロットする。ドナー専用タンパク質の傾き(傾きD)と基準(傾きR)を決定します。
- 量子収率(Φ)は、次の式を使用して計算されます。
ここでΦDはドナーのみのタンパク質の量子収率であり、ΦRは遊離色素の量子収率であり(これは通常製造業者から入手できる)、スロープDおよびスロープRはドナーのみのタンパク質についてステップ3.4.2で求めた傾きをそれぞれ参照し、ηDおよびη Rとする。 ドナー専用タンパク質およびリファレンスフリー色素溶液の屈折の指標をそれぞれ表す47。
- アクセプターのみのタンパク質の吸収スペクトルを、1cmの経路長の細胞を用いて取得する。アクセプターのみのタンパク質の吸光係数スペクトルを生成するには、吸収スペクトルを色素濃度で除算します。
- スペクトル重なり積分を生成し、 J(λ) をグラフィカル解析プログラムを用いて行う。標準的なワークシートプログラム(スプレッドシートなど)もこのプロセスに使用できます。
- ドナー専用タンパク質の蛍光発光スペクトルにアクセプター専用タンパク質の吸光係数スペクトルを乗算し(ステップ3.4)、オーバーラップスペクトルを生成する。
- 得られたオーバーラップスペクトルにλ4を掛けます。
- 重なり領域の積分によって曲線の下の領域を決定する。オーバーラップ領域は、ドナー発光スペクトルにアクセプター吸光係数スペクトルを掛けた値が正の値をもたらす領域として定義される。スペクトルオーバーラップ積分は次のように定義されます。
ここで、FD(λ)はドナー専用タンパク質(ステップ3.4で取得)の発光スペクトルであり、εA(λ)はアクセプターのみタンパク質の吸光係数スペクトルであり、M-1 cm-1(ステップ3.5で取得)の単位を有する。結果として得られるスペクトル重なり積分は、M-1 cm-1nm4の単位を有するべきである。 - スペクトル重なり積分を正規化します。重なり積分を、同じスペクトル範囲にわたるドナーのみのタンパク質スペクトルの積分領域で除算する:
- 次の式を使用して、Å の R0 値を計算します。
ここで、κ2は配向係数であり、典型的には自由に回転する染料の2/3として取られ、ηは屈折率であり、希薄水溶液の場合は1.33として近似することができ、QDはドナーの量子収率(ステップ3.4)、J(λ)はステップ3.6.35で決定されたスペクトル重なり積分である。注:染料が自由に回転していない場合は、Ivanov 48によって記述され、Auclair49およびZhang 2,3によって実装されるように補正を導入することができます。
4. FRETスペクトル測定の実行
- ドナーのみのタンパク質、アクセプターのみのタンパク質、およびドナー - アクセプタータンパク質のサンプルを同じ濃度で調製する。4 μM の濃度を推奨します。3 mm x 3 mm のキュベットを使用する場合は 200 μL、5 mm x 5 mm のキュベットを使用する場合は 600 μL、1 cm x 1 cm のキュベットを使用する場合は 2.5 mL の溶液を使用します。
- ドナー・アクセプタータンパク質サンプルは、ドナーのみとアクセプターのみの等モル量を用いて調製する。
- ドナーのみまたはアクセプターのみのサンプルのいずれかに等モル量の非標識タンパク質を導入することを通して、対照ドナーのみおよびアクセプターのみのタンパク質サンプルにおいて同じ量の標識サンプルを維持する。例えば、同じ濃度の溶液の場合、各ドナー専用FRETサンプルは、200μLの容量に対して100μLのドナー専用タンパク質および100μLの非標識タンパク質を含むであろう。
- ドナーのみ、アクセプターのみ、およびドナー-アクセプターサンプルの蛍光発光スペクトルを生成します。ステップ 3.2 の説明に従って信号を最適化します。最適化が完了したら、すべてのサンプルに対して同じ設定を維持します。
- ステップ 3.3 の説明に従ってドナー専用スキャンを取得します。ドナー色素吸収極大で溶液を励起し、ドナーおよび(予想される)アクセプター発光ピークにわたってスキャンする。
- サンプルをアクセプターのみのタンパク質に交換するか、サンプルチェンジャーの位置をアクセプターのみのタンパク質を含むキュベットに変更します。
- アクセプター色素のみで標識したタンパク質(アクセプターのみタンパク質)の発光スキャンをステップ4.2.1と同じ設定で取得します。ドナー励起波長で試料を励起する。
注:このスペクトルは、ドナー波長で励起されるアクセプタの量を補正します(ステップ5.1.2のFA ) - サンプルをドナーアクセプタータンパク質サンプルに交換するか、またはドナーアクセプター標識タンパク質を含むキュベットにサンプルチェンジャー位置を変更します。
- ステップ4.2.1および4.2.3と同じ設定を使用して、ドナー - アクセプタータンパク質サンプルの発光スキャンを取得します。
- すべてのスペクトルについて、スキャンの終了時に測定されたバックグラウンドカウントを差し引いてバックグラウンド蛍光を補正します。
- ドナーのみのドナー寿命を測定し、ステップ4.1.2で説明したように調製したドナー-アクセプターサンプルを測定します。ナノ秒(10-9 秒)の時間範囲で蛍光減衰を測定および解決できる時間相関単一光子計数蛍光装置を使用します。
メモ: FRET色素対の場合、励起光源をドナー色素の吸収極大に合わせます。- 楽器の電源を入れます。集録ソフトウェアを開き、蛍光分光器でデータ集録用の機器制御ソフトウェアを使用します。
- 集録には、時間範囲が55ns、ゲインが1~4096チャネルの TCSPCディケイを選択します。
- 非乳製品クリーマーまたは市販の散乱溶液の溶液を用いて機器応答関数(IRF)を取得し、490nmでの散乱をモニターする。スリット設定を調整し、必要に応じてニュートラル密度フィルタを使用して、パルスパイルアップ5を回避するのに十分な低いカウントレートを維持します。 [同意する] をクリックし、[ 開始] をクリックします。これにより、買収が開始されます。
メモ: 180 kHz の繰り返しレートには、4000 cps の最大カウント レートが使用されます。 - ピークチャネルが最大20,000カウントになるまで、IRFを490nmで収集します。各蛍光減衰を測定する前後にIRFを採取する。
- ドナー発光波長、520nmにおける蛍光発光をモニターすることによりドナーのみおよびドナー・アクセプターサンプルの蛍光減衰を得る。
- スリット設定を調整して、最大カウントレートを 4000 cps 以下にします。スリット設定は、通常、タンパク質サンプルの15~20 nmバンドパスです。ピークチャネルで20,000カウントが得られるまで減衰を収集します。
- 蛍光寿命(τ)に対する時間(t)の関数として減衰または蛍光強度(I)を分析する。次の式で減衰を指数の合計に当てはめます。
ここで、α I は i番目の成分の事前指数係数であり、τI は寿命である。フィット感は、蛍光減衰と一致するようにIRFと再畳み込まれます。減少したΧ2パラメータから適合の質を判断します。
5. FRETデータの解析
- ドナーに対するドナー・アクセプター試料のドナー強度の低下からFRET効率を次式のみで算出する。
ここで、FDA はドナー・アクセプター試料の蛍光強度であり、 FDはドナー蛍光のピークにおけるドナーのみ試料の蛍光強度である。データがノイズが多い場合は、ピークの統合領域を使用します。- ドナーのみとドナー-アクセプターサンプルの間の標識の違いを訂正してください。ドナーのラベリングの程度に基づいて、次のように補正を計算します。
ここで、fDAはドナー-アクセプターサンプルにおけるドナー標識効率であり、fDはドナーのみサンプルにおける標識効率である。 - ドナー-アクセプタータンパク質スペクトルからアクセプターのみのタンパク質スペクトルを減算することによって(ステップ4.2)、ドナー励起スペクトルへのアクセプター蛍光の寄与を補正します。
- ドナー-アクセプタータンパク質サンプルに対するアクセプターのみのタンパク質の標識効率の違いを補正し、効率を計算するための次の式を生成します。
ここで 、fA は アクセプター標識の小数部数を示します。この式には、色素標識およびアクセプター蛍光によるすべての補正が含まれます。 - 次の式を使用して、効率からのFRET距離を計算します。
ステップ3.6.5で取得したR0値を使用する。 - ドナーのみの蛍光寿命と、ステップ4.3.3-4.3.5で測定されたドナー-アクセプターサンプルを使用してFRET効率を計算します。
- 振幅加重寿命を使用してFRET効率を計算し、定常状態の結果と比較します5。
- ステップ5.1.4のように、蛍光寿命によって決定される効率から距離を計算します。FRETの効率と距離について定常状態と時間分解値を比較し、それらが互いの誤差内にあることを確認します。
- ドナーのみとドナー-アクセプターサンプルの間の標識の違いを訂正してください。ドナーのラベリングの程度に基づいて、次のように補正を計算します。
6. 距離のマッピング
- 計算された距離を使用して、結合部位を 3 次元構造にマッピングします。ステップ5.1.4で与えられた式と、各FRETペアのステップ3.6.5で得られたR0 値を使用して、調べたすべての色素ペアと位置の距離と誤差を計算します。
- PyMOL50 などの3Dグラフィカル表示プログラムを使用して、距離を構造にマップします( 補足ファイルに記載されているスクリプト)。スクリプトからのコマンドは、適切な距離情報とともにコマンドウィンドウに直接入力できます。
- 測定された距離と関連する誤差ごとにシェルを生成します(図3、図4、補足図1-3)。
- 異なるシェルの交点を通る位置をマッピングします (補足図 1-3)。シグナルペプチド結合部位は、SecAおよびSecYEG上の3つの異なる位置およびシグナルペプチド上の4つの異なる位置を介してマッピングされた(図1)。
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Representative Results
この研究は、SecYEGチャネルへのプレタンパク質の挿入前に、SecA上のプレタンパク質結合部位の位置を決定することに焦点を当てた。結合部位をマッピングするために、プレタンパク質の異なる領域と、SecAおよびSecYEGタンパク質上の3つの異なる位置との間でFRET実験を行った(図1A−D)。得られた距離とSecA、SecYEG、およびプレタンパク質の三次元構造から、プレタンパク質結合部位の位置を予測した。これらの測定を行うために3つの別個の実体(SecA、SecYEG、およびプレタンパク質)を使用するのではなく、Gly-Serリンカー2,3の組み込み後に遺伝子改変を介してPhoAシグナル配列をSecAに結合させた。色素による容易な標識のために、PhoAプレタンパク質中の残基2、22、35、および45にCys残基またはアンバー変異を導入した(図1E)。
サイトの識別とラベリング
シグナル配列の推定結合部位は、同様のFRETマッピング法2、32を用いて以前に同定されていた。これらの研究および他の研究は、THF 33、51、52、53、54に平行な位置に示唆された配向を有するシグナルペプチドの可能な結合部位として、2らせんフィンガー(THF)およびプレタンパク質架橋ドメインを同定した(図1F)。したがって、SecAおよびSecYEGタンパク質上の潜在的な標識部位の同定は、SecAおよびSecYEG結晶構造における推定結合部位の位置に基づいて行われた(図1A〜Dにおいて緑色で示す)。推定結合部位の位置を三角測量するために3つの部位が選択され、ここで、本質的に3つの部位は推定結合部位の周囲に三角形を形成する。図1に示すように、3つの部位は、結合部位のFRET範囲内(50〜70Å)内にあった。Alexa Fluor 488(AF488)とAlexa Fluor 647(AF647)の色素ペアは、55.7Å36のR0値が標識部位と推定結合部位との間の予想される距離とよく対応しているため、測定精度を確保します。
標識のために選択された3つの部位、SecA37、SecA321、およびSecY292(図1A-Dではマゼンタ、バイオレット、シアンの球体として示されている)は、タンパク質複合体全体に位置し、推定結合部位の周囲に三角形を形成している。3つの部位をCysレス変異体中のCys残基に別々に変異させ、正しい位置のみが標識された2,37を確保した。SecY292実験のために、PhoAプレタンパク質部位をAF647で標識し、SecY残基292をマレイミド化学を用いてAF488で標識した。キメラタンパク質において、部位SecA37およびSecA321をAF647で標識し、プレタンパク質をAF488で標識した。SecA−PhoAキメラタンパク質において、PhoAプレタンパク質セグメントの残基2、22、37、および45は、それぞれ、個々のタンパク質においてアンバーコドンに変異した。琥珀色のコドン変異により、これらの位置に非天然アミノ酸p-アジドフェニルアラニンの導入が可能となり、その後、クリックケミストリー39,40を用いてAF488で標識された。各変異を生成し、独立して標識して、タンパク質成分の正確で異なる標識を確実にしました。標識の程度はすべてのタンパク質について決定され、サンプルを続行するためには一般に50%以上である必要がありました。
転送効率と距離の決定
エネルギー移動測定を行う前に、ドナー量子収率、重なり積分およびR0値を決定した(ステップ3.4〜3.6)。ドナー量子収率は、0.1MNaOH47において0.79の量子収率を有する色素フルオレセインに対して測定された。吸収および蛍光発光スペクトルを一連の濃度で取得し、蛍光発光強度に対する吸収の線形プロットを生成し、量子収率を決定した。これらの測定では、線形範囲(0.1-1.0)の吸収を測定することが重要であり、すべての発光測定値を同じスリット設定で生成する必要があります。これらの値は重なり積分とR0値を決定するために使用されるため、FRET条件下で測定する必要があります。タンパク質局所環境は色素放出に深く影響するため、ドナー量子収率は調査対象の各部位について測定されるべきである。我々は、SecAおよびSecYEG上のサイトが、キメラのPhoA部分上のサイトよりもR0値に強く影響することに留意する。同じSecAまたはSecYEG部位を有する色素対の場合、R0値は典型的には互いに5Å以内である。一方、R0値は、2つの異なるSecA位置(残基37対321)で最大20Å異なる可能性があり、各色素ペアのR0値を決定することの重要性を強調しています(表1)。
R0の計算は、ドナー色素とアクセプター色素が自由に回転しており、色素が回転しない程度が測定における全体的な不確実性に寄与することを前提としています。色素の相対運動およびそれらの配向を適切に考慮に入れるために、定常状態蛍光異方性測定を、異なる標識位置にあるすべてのドナー色素およびアクセプター色素について実施した。これらの値は0.10-0.21の範囲にあり、距離測定値2,3,48に関連する誤差を計算するために使用されました。ドナー色素とアクセプター色素の両方について観察される比較的高い異方性値は、色素回転の減少に対応し、これは自由回転の仮定と矛盾する。自由回転がないと、距離計算で19%〜25%の誤差が生成されます。表1に示すように、これは測定距離の平均不確実性を最大で15ű導いた。FRET距離をマッピングする場合、以下で説明するように、距離測定におけるこれらの不確実性は重要な考慮事項です。
ドナー - アクセプター対間の計算された距離は、効率と距離の関係に基づいており、より高い効率は、より短い距離で分離されたドナー - アクセプター対を示す。FRET効率を決定するために、ドナー励起波長(488nm)で励起された蛍光発光スペクトルをドナー専用サンプルおよびドナーアクセプターサンプルで取得します。典型的には、ドナー放出強度の低下は、エネルギー移動の存在を意味する(ステップ5.1)。 図1G は、PhoAキメラの残基2または22のいずれかを有するSecA37残基についてのドナー - アクセプタースペクトルを描いている。SecA37残基はAF647またはアクセプター色素で標識され、PhoA残基はAF488またはドナー色素で標識される。いずれの位置においても、ドナー蛍光は減少し、ドナー-アクセプターサンプルにおいてアクセプター蛍光強度のわずかな増加が見られる。励起は488nmのドナー励起波長で行われ、アクセプターを直接励起しないので、観察されたアクセプター蛍光はエネルギー移動から生じる。したがって、ドナー強度の減少およびそれに伴うアクセプター強度の増加は、2つの色素間のエネルギー移動から生じる。有意に、ドナー蛍光強度は、アクセプターの存在下でのPhoA22位置(黄色)に対してPhoA2位置(青色)に対してより高い。ドナー強度減少のこの相対的な差は、PhoA2残基とSecA37残基との間のエネルギー移動が、PhoA22残基とSecA37残基との間の移動よりも弱いことを示し、これは、PhoA2残基がPhoA22よりもSecA37から遠く離れていることを意味する。距離は、効率と R0 値の関係から決定されます (ステップ 5.1.4)。
定常状態の蛍光測定は2つ以上の距離の平均を表すことができるため、時間分解蛍光測定も実施しました。これらの実験のために、ドナー色素の寿命は、アクセプターの存在下および非存在下で測定される(図1G)。測定された定常状態の蛍光効率に寄与する2つの異なるエネルギー移動プロセスがある場合、機器の時間分解能内で解決可能であれば、それらは控えめな寿命として観察されます。寿命を解決する能力を高めるためには、ピーク時に10,000カウント以上を収集する必要があります。ただし、ピーク高さまたはピークチャンネル数は、集録時およびサンプルの潜在的な損傷とのバランスをとる必要があります。時間分解測定により、各ドナー - アクセプターペアの単一の寿命が得られ、染料間の1つの向きまたは距離のみが一致しました。我々は、我々のFRETマッピング技術によって明らかにされた領域で観察された距離のわずかな違いが、我々のシステムにおける解決可能な寿命につながらないことに留意する。さらに、時間分解蛍光測定によって決定される効率は、定常状態測定から決定された効率とよく一致しており、測定された効率が色素対3間の1つの距離のみから生じることをさらに裏付ける。
FRET距離を3次元構造にマッピングする
共鳴エネルギー移動測定は、SecA上のシグナル配列の結合部位および配向を同定するのに十分な距離情報をもたらす。SecAおよびSecYEG上の3つの位置は、SecA−PhoAキメラのPhoA領域上の4つの位置とともに、結合部位をマッピングするために使用される12の異なる距離を提供する(表1)。12の距離をサーモトガ・マリティマSecA-SecYEG複合体(PDBID:3DIN)の3次元X線共結晶構造にマッピングし、シグナル配列33の結合部位を同定した。SecA-SecYEG複合体の構造は、in vivo光架橋研究によって証明されるように、大腸菌で観察されたものと類似している55。
我々は、SecA-PhoAキメラにおけるPhoAシグナル配列の開始(PhoA2)残基および末端(PhoA22)残基を用いて、SecA-SecYEG複合体上の残基位置がどのように同定されたかを説明する。エネルギー移動はあらゆる方向で起こり得るので、FRET距離および関連する誤差は、ドナー - アクセプター対からの色素位置の1つが中心として指定された球状シェルを記述する。この研究では、残基SecA37、SecA321、およびSecY292は、シグナル配列のPhoA2残基の位置を記述する3つの球状シェルの中心を形成する。図 3 に、SecA37 (マゼンタ)、SecA321 (パープル)、および SecY292 (シアン) の 3 つの別々の場所から生じる重なり合う領域の視覚化を示します。各FRETシェルの一部のみがタンパク質構造と交差し、そのシェル内にある残基および骨格が強調表示される。したがって、SecA37-PhoA2 距離によって定義されるシェル内のタンパク質領域はマゼンタで示され (図 3A,E)、SecA321-PhoA2 および SecY292-PhoA2 シェルによって定義される領域は、それぞれ紫色 (図 3B,F) およびシアン (図 3C,G) で示されます。主に2つのらせんの指からなる推定結合部位は緑色で示されている。
図3に示すように、これらのFRETシェルの各々は、タンパク質複合体の比較的大きなセクションを画定する。3つの位置すべてについて、FRETシェルは推定結合部位と交差する。しかしながら、例えばSecA321残基の場合、交差する領域はより小さく、ヘリカル足場ドメインと有意に重なり合う指の端部に向かって位置する。3つのFRETシェルすべての交点または共通領域(図3D、H)は、PhoA2残基の位置を定義する。この領域は、各FRETシェルよりもかなり小さく、ヘリカル足場からの大きな寄与を伴うTHFのごく一部のみを含む。FRETシェルの生成に使用されるスクリプトと、分子可視化プログラムPyMOLの交差領域については、補足情報を参照してください。シェルの一部は、補足図 1 ~ 3 の SecA-SecYEG 複合体上のピンク色の点として視覚化されます。
同様の戦略を用いて、PhoA22残基の位置を同定した。PhoA22 FRET距離(図4A-C、E-G)によって定義されるFRETシェルは、PhoA2残基に対してより小さな面積を記述します(図4D、H対図3D、H)。我々は、この違いを、PhoA2残基および関連領域がPhoA22よりも柔軟で不安定であることを示唆すると解釈する。有意に、PhoA22残基に起因する領域は、THFの先端およびSecYEGチャネルの口の近くに位置し、SecYの領域は共通領域で同定される(図3D、H)。3つの色素対形成はすべて、推定結合部位とともに領域を同定する。ただし、交差する共通領域は、PhoA2 位置 (図 3D,H) に対して THF の反対側の端にある PhoA22 位置 (図 4D,H) の中央に配置されます。これらの知見は、残基2〜22から延びるプレタンパク質のシグナル配列が、比較的非構造化状態でTHFに沿って存在することを示唆するであろう。この結果は、シグナル配列が拡張状態でTHFに沿ってタンパク質に結合し、枯草菌結晶構造におけるSecAのC末端末端が本質的にシグナルペプチドの構造をモデル化し、同じ位置を占めることを示唆する以前の研究と一致している(赤色の図1Fに示される)2,26.我々は、同様のアプローチを用いて、SecA-PhoA前タンパク質キメラの初期成熟領域(残基37および45)の2つの位置を同定し、以下で論じるようにシグナル配列および早期成熟領域の結合および配向をさらに定義した。他の研究では、FRET距離は、既存の構造または分子動力学模倣由来モデルを改良するために効果的に使用されている18、19、56;SecAにバインドされたシグナルシーケンスの構造が存在しないため、これを行うことができませんでした。
図1:代表的なFRETスペクトルを有するSecA-SecYEG複合体中の標識部位(A-D)SecA37、SecA321、およびSecY292の標識部位がそれぞれマゼンタ、バイオレット、シアン球として示されているSecA-SecYEG共結晶構造(PDBID:3DIN)33の4つの異なる図。A ~ C は複合体の側面図、D は上面図です。SecAは明るい灰色で示され、SecYEGは濃い灰色で示され、推定される結合部位であるTHFは緑色で示されている。(e)Ser-Glyリンカーを介してSecAタンパク質をPhoAプレタンパク質に接続するSecA-PhoAキメラ構築物の概略図(スケールに描かれていない)。キメラのPhoA部分上の標識部位は、残基2、22、37、および45に対応する青色、緑色、黄色、および赤色で与えられる。(f)枯草菌SecAタンパク質(PDBID:1M6N)の結晶構造のリボン図で、ヌクレオチド結合ドメイン1および2がそれぞれ青色および水色で示され、プレタンパク質架橋ドメインが金色で示され、中央らせんが緑色で、2らせん指がシアンで示され、ヘリカルウィングドメインが濃い緑色に、C末端リンカーが赤色で示されている26.非構造化C末端は、以前のFRETマッピング研究2に基づく結合PhoAシグナルペプチドのモデルとして役立つ。(g)SecA37-AF647およびPhoA2-AF488 FRETペアならびにSecA37-AF647およびPhoA22-AF488 FRETペアのドナーのみおよびドナーアクセプターサンプルの定常状態蛍光スペクトル。ドナー - アクセプターサンプルのドナー強度の低下は、エネルギー移動の指標である。より大きなエネルギー移動は、ドナー強度の減少に基づいて、PhoA2部位に対してPhoA22から起こる。(h)SecA37-AF647およびPhoA22-AF488 FRETペアの時間分解蛍光ドナーのみ(マゼンタ)およびドナー-アクセプター(ライトマゼンタ)減衰スペクトル。計測器応答関数は灰色で表示されます。ドナー - アクセプター複合体は、より短い崩壊を与え、その結果、エネルギー移動と一致するより速い寿命を与える。すべての分子構造は、示されたPDBファイルおよびPyMOL50を用いて生成した。図1E-HはZhangら3から改変されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:FluorEssenceプログラムのユーザーインターフェイス(A)オープニングウィンドウが赤いMの周りに円で示されています。プログラムを蛍光光度計に接続するには、これをクリックする必要があります。(B)実験のセットアップウィンドウには、スキャン関連パラメータが入力されるさまざまな領域(モノラル、検出器、アクセサリ)が表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: SecA-PhoA2 の位置について決定された FRET 距離シェル。FRET距離とそれに関連する不確実性(表1)から構築されたFRET距離シェルは、SecA-SecYEG複合体(PDBID:3DIN)に描かれています。(A-C)PhoA2 位置の FRET距離シェルは、それぞれ中心位置に SecA37 (マゼンタ)、SecA321 (バイオレット)、および SecY292 (シアン) で構築されています。シェルは中心の残留物に従って着色されます。(D) 3 つの FRET シェルの交点は、青色で示されている PhoA2 の位置を定義します。(E-H)ビューは A-D から約 180° 回転します。すべての分子構造は、示されたPDBファイルおよびPyMOL50を用いて生成した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:SecA-PhoA22の位置について決定されたFRET距離シェル。 FRET距離とそれに関連する不確実性(表1)から構築されたFRET距離シェルは、SecA-SecYEG複合体(PDBID:3DIN)に描かれています。(A-C)PhoA22 位置の FRET距離シェルは、それぞれ中心位置に SecA37 (マゼンタ)、SecA321 (バイオレット)、および SecY292 (シアン) で構築されています。シェルは中心の残留物に従って着色されます。(D) 3つのFRET砲弾の交点がPhoA22の位置を定義し、黄色で示した。(E-H)ビューは A-D から約 180° 回転します。すべての分子構造は、示されたPDBファイルおよびPyMOL50を用いて生成した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:枯草菌SecA-ジオバチルス・サーモデニトリフィカンスSecYE共結晶構造(PDBID:5EUL)に投影されたPhoA2、PhoA22、PhoA37、およびPhoA45のFRETマッピング位置。THFの末端に挿入されたOmpAペプチド基質はピンク色で示されている。FRETマップ領域はATP-γSの存在下で生成され、PhoA2は青色、PhoA22は緑色、PhoA37は黄色、PhoA45は赤色で示された。オーバーラップ領域は、オリーブ(PhoA22およびPhoA37)およびオレンジ色(PhoA37およびPhoA45)で示されている。ペプチド基質(残基749〜791、シアン)を元の構造から切り出し、構造に何の変化も伴わずに推定結合領域(赤色で丸で囲んだ)にモデル化した。(b)モデル化したペプチド基質の拡大図。OmpAペプチド基質の残基2(Lys)、22(Tyr)、および37(Gly)は、それぞれ青、緑、および黄色でスティック状に描かれている。モデル化されたペプチド中のこれらの残基は、予測されたFRETマッピング位置と優れた一致を示す。明確にするために、元の構造におけるナノボディは省略されている。この図はZhang et al.3から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| SecA-PhoA-SecYEG複合体上の標識部位 | SecA-PhoAキメラのPhoAペプチド部分上の標識部位 | |||
| フォア2-AF488 | PhoA22-AF488 | フォア37-AF488 | フォア45-AF488 | |
| SecA 37-AF467-PhoA | ||||
| R0 = 57 | R0 = 57 | R0 = 57 | R0 = 60 | |
| フレット効率 | 0.27 +/- .01 | 0.52 +/- .02 | 0.39 +/- .03 | 0.36 +/- .03 |
| 距離 | 67 +/- 15 | 56 +/- 12 | 62 +/- 13 | 66 +/- 15 |
| SecA321-AF647-PhoA | ||||
| R0 = 40 | R0 = 38 | R0 = 37 | R0 = 38 | |
| フレット効率 | 0.16 +/- .04 | 0.62 +/- .01 | 0.39 +/- 0.02 | 0.43 +/- 0.02 |
| 距離 | 53 +/- 11 | 34.9 +/- 7.3 | 39.7 +/- 7.9 | 39.7 +/- 7.5 |
| フォア2-AF647 | PhoA22-AF647 | フォア37-AF647 | フォア45-AF647 | |
| SecY292-AF488 EG | ||||
| R0 = 57 | R0 = 50 | R0 = 53 | R0 = 54 | |
| フレット効率 | 0.25 +/- .06 | 0.46 +/- .06 | 0.24 +/- .05 | 0.30 +/- .01 |
| 距離 | 68 +/- 15 | 51.3 +/- 9.2 | 64 +/- 14 | 62 +/- 13 |
| 参考文献3から適応。 | ||||
| オングストロームで与えられたR0値は、テキストに記載されているように計算されました | ||||
| FRET効率を、記載したようにアクセプターの存在下でのドナー蛍光強度の減少から計算した。誤差は、3つの独立した測定からSDとして報告されます。 | ||||
| ドナー-アクセプター距離(R)はオングストロームで与えられ、テキストに記述されているように計算される。報告された誤差は、実験誤差と染料の向きから生じる誤差の考慮の結果である。 定常状態蛍光異方性から推定される色素配向 | ||||
表1:SecA-PhoA-SecYEG複合体について決定された転送効率と距離。 FRET効率、距離、およびR0 値は、プレタンパク質結合部位のマッピングに使用される12の距離について与えられる。
補足図1: シェルのFRET距離を、ピンク色の点で示し、SecA−SecYEG複合体上のSecA37残基およびPhoA37残基について決定した(PDBID:3DIN)。Sec Aは明るい灰色で示され、SecYEGは濃い灰色で示され、SecA37残基はマゼンタで示されている。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2: FREDT距離シェルは、ピンク色のドットで示され、SecA−SecYEG複合体上のSecA321残基およびPhoA 37残基について決定された(PDBID:3DIN)。Sec Aは明るい灰色で示され、SecYEGは濃い灰色で示され、SecA321残基は紫色で示されている。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 3: FRET距離シェルを、ピンク色のドットで示し、SecA−SecYEG複合体上のSecY292残基およびPhoA 37残基について決定した(PDBID:3DIN)。Sec Aは明るい灰色で示され、SecYEGは濃い灰色で示され、SecY292残基はシアンで示されている。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
FRETマッピング方法論を用いて、我々はSecAタンパク質上のシグナル配列結合部位を同定した。重要なことに、複合体の3次元結晶構造の存在は、我々の研究を大いに促進した。このマッピング手法の強みは、既存の構造を使用してラベル付けする場所を特定できることにあります。この方法論を使用して 3-D 構造を決定することはできません。しかしながら、構造要素56の決定、既存の構造49の精緻化、結合部位位置2、32の決定、または動的運動57の解明は、すべてこの方法の可能な応用である。
SecYEG-SecA-PhoA複合体では、3つの標識部位が推定結合部位の周囲に三角形を形成している(図1)。この三角形の頂点から同じ残基までの複数の距離測定値を採用することで、GPSナビゲーション方法に似た位置情報が絞り込まれます。3つの部位、SecA37、SecA341、およびSecY292を、4つの部位と共にSecAおよびSecY上で同定し、PhoA2、PhoA22、PhoA37、PhoA45のシグナル配列および前タンパク質の早期成熟領域におけるシグナルペプチドの位置をマッピングするための合計12の距離を得た(表1)。重要なことに、距離測定の精度を向上させるために、標識部位は、ループではなく二次構造要素など、タンパク質の比較的静的な領域に位置するべきである。さらに、標識を容易にし、効率を高めるために、溶媒が比較的アクセスしやすい場所にもサイトを配置する必要があります。SecA-PhoA-SecYEG複合体内では、三角形の部位または頂点から結合基質中の残基までの距離測定の性能は、結合基質中の残基を比較的小さな領域に配置するのに十分であった(図3D,Hおよび図4D,H)。図3および図4に示すように、複数距離測定から交差する領域を特定すると、単一の距離測定から位置が大幅に絞り込まれます。したがって、この方法を使用する場合は、複数の距離の測定を強くお勧めします。この方法は、例えば、結合に関与する分子の領域を同定することができるが、正確な構造情報を提供しない。このような情報は、X線、NMR、クライオEMなどの他の構造方法から最もよく得られます。FRET距離は、既存の構造18、19またはモデルを効果的に絞り込むために使用することができるが、この場合、SecAに結合したシグナル配列のモデルが存在しないため不可能であった。
色素標識が所望の位置でのみ起こり、FRET距離測定が正確であることを保証するために、標識のための突然変異誘発の使用が好ましい。Cysレス変異体の作製は、部位特異的変異誘発法を用いたSerまたはそれ以外の野生型タンパク質中の類似の残基に対するCys残基の比較的保存的な変異を必要とする。現在の研究では、Cys変異がSecAおよびSecYEGのCysフリーバージョンに導入され、37を標識した。変異タンパク質の活性を、増殖アッセイとそれに続くインビトロマラカイトグリーンATPaseアッセイ41、42で検証した。関連する活性アッセイは、タンパク質の機能に依存し、例えばDNA結合タンパク質については、DNA結合アッセイが適切であろう58。1 か所のみで標識を確保できないと、同じ色素で複数の部位が標識され、距離の決定が著しく複雑になる可能性があります。したがって、同じタンパク質上の第2の標識の導入は、部位特異的突然変異誘発による非天然アミノ酸の組み込みを介して行うことができる。我々はこの方法論を採用し、非天然アミノ酸p-アジドフェニルアラニンを導入し、クリックケミストリー39,40で標識することにより、Cys残基とは異なる位置でSecA-PhoAキメラを標識した。
この方法のさらなる重要な考慮事項は、使用される染料の選択および関連するR0値である。潜在的な標識部位を特定した後、測定される距離を3次元構造から推定することができる。この情報を使用して、研究者は、予想される距離の所望の範囲にまたがるR0値を有する染料ペアを選択することができる。例えば、AF488-AF647色素対は、計算されたR0が55.7Åであり、推定結合部位から推定40〜75Å離れた位置に位置する標識部位に良好な範囲を提供する。ステップ 2.2 で計算された R0 値は、システムに使用する色素ペアを選択するのに役立ちますが、色素をタンパク質に付着させると、その特性が大幅に変化する可能性があります。より高い精度を得るには、標識タンパク質を用いて実施されたin situ実験からR0値を計算すべきである(ステップ3.1~3.6.5)。
伝達効率の測定は、定常状態の蛍光発光をモニタリングし、ドナー発光の減少またはアクセプター放出の増加のいずれかを観察することによって行うことができる。両方の効果の観察が望ましいが、効率は、5、8に記載されるようにいずれかから計算することができる。効率はまた、ドナーのみのサンプルに対するドナー・アクセプター・サンプルにおけるドナー寿命の減少から計算することもできる。複数の方法による効率の決定、特に測定される効率の相対的な均質性を確立するための時間分解法の使用が推奨される。
マッピング法はまた、SecAおよび推定結合部位に対するPhoAプレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域の相対的配向を決定することを可能にした。SecA-SecYEG X線結晶構造およびその後のクライオ-EM研究は、チャネルおよびSecA34,35に対するプレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域の構造に関する明瞭さを提供した。X線構造では、OmpAプレタンパク質の残基1〜41が2らせん指の先端に付着し、チャネル内のヘアピン構造で可視化された(ピンク色、図5で示す)。SecA−PhoAキメラ中の4つのPhoA残基の位置を、上記と同じプロトコルを用いてこの構造上にマッピングした。図5に示すように、PhoA37およびPhoA45残基(黄色、橙色、赤色)の位置は、PhoA2とPhoA22の間にあり、PhoA45はPhoA2に近い。これらの知見、特にPhoA45の位置は、PhoAプレタンパク質がヘアピン構造を形成していることを示唆した。
FRET同定結合部位をさらに検証するために、我々は、41残基のプレタンパク質構造をチャネルから切り出し、FRETマッピングによって定義された領域にモデル化することによって、マッピングされた位置をOmpAプレタンパク質の位置と比較した(図5、シアン)。プレプロテインX線構造の変化なしに、我々は、OmpAプレプロテイン断片切除構造上の残基2、22、および37の位置(青、緑、黄色で示す)がFRETマッピングされた位置(図5B)と著しくよく一致し、ヘアピンがチャネルエントリの前に形成されることを示唆している。OmpAプレタンパク質は、X線結晶構造中の残基41で終わる;しかし、構造化されていないSecYのC末端は、PhoA45の可能な位置を示す。我々のモデル化された構造では、ヘアピンループはチャネルの口に位置し、膜を横切るプレタンパク質の転座を容易にする態勢を整えている。したがって、この例では、FRETマッピング方法論は、膜を横切るタンパク質転座に必要な動的運動のヒントを提供することによって、静的SecA−SecYEG構造の既存の情報を強化する。 de novo 構造決定には適していませんが、3次元構造情報が利用可能な場合、FRETマッピング方法論は、結合部位と動的運動の解明を通じて、構造-機能関係の現在の理解を促進することができます。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所助成金R15GM135904(IMに授与)および国立衛生研究所助成金GM110552(DBOに授与)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecylmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| extended signal peptide SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| FluorEssence | Horiba | version 2.4 | spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer |
| Fluoromax 4 spectrofluorometer | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | spectral analysis program for time-resolved decays | |
| H4AzidoPheOH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Broth | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | dilution is needed to make a proper scattering solution |
| PTI Felix GX | Horiba | version 4.1.0.4096 | spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
| Pymol Molecular Graphics Program | Schrodinger | version 2.4 | |
| Water bath | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
References
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