Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Abstract

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um método baseado em fluorescência estabelecido usado para medir com sucesso distâncias dentro e entre biomoléculas in vitro , bem como dentro das células. No FRET, a eficiência da transferência de energia, medida por mudanças na intensidade ou na vida útil da fluorescência, relaciona-se à distância entre duas moléculas fluorescentes ou rótulos. A determinação da dinâmica e as mudanças conformais a partir das distâncias são apenas alguns exemplos de aplicações desse método aos sistemas biológicos. Sob certas condições, essa metodologia pode adicionar e aprimorar estruturas de cristal de raios-X existentes, fornecendo informações sobre dinâmica, flexibilidade e adaptação a superfícies de ligação. Descrevemos o uso de FRET e determinações de distância associadas para elucidar propriedades estruturais, através da identificação de um local de ligação ou das orientações de subunidades mais fracas. Através da escolha criteriosa de sites de rotulagem, e muitas vezes emprego de múltiplas estratégias de rotulagem, aplicamos com sucesso esses métodos de mapeamento para determinar propriedades estruturais globais em um complexo de DNA proteico e no sistema de translocação de proteínas SecA-SecYEG. No sistema SecA-SecYEG, usamos métodos de mapeamento FRET para identificar o local de ligação pré-proteína e determinar a conformação local da região de sequência de sinal vinculado. Este estudo descreve as etapas para a realização de estudos de mapeamento de FRET, incluindo identificação de locais de rotulagem adequados, discussão de possíveis rótulos, incluindo resíduos de aminoácidos não nativos, procedimentos de rotulagem, como realizar medições e interpretação dos dados.

Introduction

Para as proteínas, a elucidação da dinâmica juntamente com o conhecimento estrutural tridimensional (3-D) leva a uma compreensão aprimorada das relações estrutura-função dos sistemas biomoleculares. Métodos estruturais, como cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica criogênica, capturam uma estrutura estática e muitas vezes requerem a determinação de múltiplas estruturas para elucidar aspectos da ligação biomolécula e da dinâmica1. Este artigo discute um método baseado em soluções para mapear elementos estruturais globais, como locais de vinculação ou interações vinculativas, que são potencialmente mais transitórios e menos facilmente capturados por métodos estáticos. Sistemas fortes candidatos a essa metodologia são aqueles em que uma estrutura 3D foi previamente determinada por cristalografia de raios-X, espectroscopia de NMR ou outros métodos estruturais. Neste caso, aproveitamos a estrutura de cristal de raios-X do complexo SecA-SecYEG, um player central na via secretary geral da proteína, para mapear a localização de um local de ligação de peptídeo de sinal usando a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) antes do transporte da pré-proteína através da membrana2. A manipulação do sistema biológico através de modificações genéticas aliadas ao nosso conhecimento da estrutura 3D possibilitou a determinação da conformação da sequência de sinal e da região madura precoce imediatamente antes da inserção no canal 3.

O FRET envolve a transferência de energia sem radiação de uma molécula (doador) para outra (aceitadora) de forma dependente da distância que é através do espaço 4,5. A eficiência dessa transferência é monitorada através de uma diminuição do doador ou um aumento na intensidade de fluorescência aceitadora. A eficiência da transferência de energia pode ser descrita como

E = R06/(R06 + R6)

em que o valor R0 é a distância em que a transferência é 50% eficiente6. A técnica já foi descrita como uma régua molecular e é eficaz na determinação de distâncias na faixa de 2,5-12 nm, dependendo da identidade dos corantes aceitadores de doadores 4,7,8,9. As intensidades de fluorescência do doador e as vidas com ou sem aceitação permitem a determinação da eficiência de transferência e, consequentemente, distâncias 5,8. Devido à disponibilidade da tecnologia, sensibilidade do método e facilidade de uso, a FRET também encontrou ampla aplicação em áreas como espectroscopia de fluorescência de molécula única e microscopia confocal6. O advento de proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde tornou a observação da dinâmica intracelular e da imagem de células vivas relativamente fácil10,11. Muitas aplicações FRET como essas são discutidas detalhadamente nesta questão virtual.

Neste estudo, focamos particularmente no uso de medidas de FRET para produzir valores de distância para determinar detalhes estruturais. Anteriormente, as medidas de FRET têm sido efetivamente utilizadas para determinar a conformação de moléculas de DNA quando ligadas à proteína 12,13,14, a dinâmica interna das proteínas e interações de ligação proteica 15,16,17. As vantagens deste método residem na capacidade de determinar elementos estruturais flexíveis e dinâmicos em uma solução com quantidades relativamente baixas de material. Significativamente, este método é particularmente eficaz quando utilizado em conjunto com as informações estruturais existentes e não pode ser usado como um meio de determinação da estrutura 3D. O método fornece a melhor visão e refinamento da estrutura se o trabalho se baseia em informações estruturais existentes, muitas vezes acoplado à simulação computacional18,19. Aqui, descreve-se o uso de distâncias obtidas a partir de medições fret de estado estável e tempo resolvidos para mapear um local de ligação, local do qual não se sabia, em uma estrutura cristalográfica existente do complexo SecA-SecYEG, grandes proteínas na via secreta3 geral.

O caminho secreto geral, um sistema altamente conservado de procariotes a eucariotes até arqueias, media o transporte de proteínas através ou para dentro da membrana para sua localização funcional na célula. Para bactérias gram-negativas, como e. coli, o organismo usado em nosso estudo, proteínas são inseridas ou translocadas através da membrana interna para o periplasma. O complexo de canal secy bacteriano (chamado translocon) coordena com outras proteínas para translocar a proteína recém-sintetizada, que é direcionada para sua localização correta na célula através de uma sequência de sinal tipicamente localizada no N-terminus20,21. Para proteínas destinadas ao periplasma, a proteína ATPase SecA associa-se ao túnel de saída do ribossomo, e com a pré-proteína após aproximadamente 100 resíduos terem sido traduzidos22. Juntamente com a proteína acompanhante da SecB, mantém a pré-proteína em um estado desdobrado. A SecA se liga ao translocon SecYEG, e através de muitos ciclos de hidrólise ATP, facilita o transporte de proteínas através da membrana23,24.

SecA é uma proteína multi-domínio que existe em formas citosolísticas e ligadas à membrana. Uma proteína homodimemérica no citosol, a SecA consiste em um domínio de ligação pré-proteína ou cross-linking25, dois domínios de ligação de nucleotídeos, um domínio de asa helicoidal, um domínio helicoidal de andaimes e o dedo de duas hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). Em estudos cristalográficos anteriores do complexo SecA-SecYEG, a localização do THF sugeriu que ele estava ativamente envolvido na translocação de proteínas e subsequentes experimentos de ligação cruzada com o peptídeo de sinal estabeleceu ainda mais a importância desta região na translocação de proteínas30,31. Estudos anteriores, utilizando a metodologia de mapeamento DA FRET, demonstraram que peptídeos de sinal exógenos se ligam a esta região da SecA 2,32. Para compreender completamente a conformação e localização da sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína antes da inserção no canal SecYEG, foi criada uma quimera proteica na qual a sequência de sinal e resíduos da região madura precoce foram anexados à SecA através de um linker Ser-Gly (Figura 1). Usando essa construção biologicamente viável, foi demonstrado ainda que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína se ligam ao THF de forma paralela2. Posteriormente, utilizou-se a metodologia de mapeamento DO FRET para elucidar a conformação e a localização da sequência de sinal e da região madura precoce na presença de SecYEG conforme descrito abaixo de3.

O conhecimento da estrutura 3D do complexo SecA-SecYEG 33,34,35 e a possível localização do local de ligação nos permitiu colocar criteriosamente rótulos de doadores-aceitadores em locais onde a intersecção de distâncias individuais de FRET identifica a localização do local de vinculação. Estas medidas de mapeamento fret revelaram que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína formam um grampo de cabelo com a ponta localizada na boca do canal SecYEG, demonstrando que a estrutura do grampo de cabelo é modelada antes da inserção do canal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Seleção de sites de rotulagem

  1. Identifique pelo menos três potenciais locais de rotulagem para triangular o local de ligação putativa nas estruturas proteicas existentes. Neste caso, foram identificadas2 SecA, SecYEG e pré-proteína anexada à SecA através de fusão genética.
    1. Escolha locais de rotulagem dentro de 25-75 Å do local de ligação putativa e em regiões relativamente estáticas da proteína, a distância determinará o par de corantes FRET específico a ser usado36. Localize os locais de rotulagem em regiões proteicas relativamente distintas umas das outras, de modo que os locais descrevem os vértices de um triângulo com o local de ligação putativa localizado no centro (Figura 1A-D).
    2. Introduzir ou identificar resíduos de cisteína (Cys) em locais de rotulagem de interesse em uma proteína que não tenha outros resíduos de Cys, para melhorar a eficiência de rotulagem do local específico37,38.
    3. Introduza aminoácidos não naturais, por exemplo, p-azidophenylalanine para rotulagem com química de clique, a fim de rotular efetivamente uma proteína em duas posições distintas com diferentes corantes39,40.
    4. Teste os mutantes Cys para perda de função. Verifique a atividade do mutante sem cículas e do mutante aminoácido não natural usando um ensaio de atividade apropriado. Neste caso, a atividade foi verificada com um ensaio de crescimento seguido de um ensaio atpase verde in vitro malachite 32,41,42

2. Rotulagem da proteína

  1. Purificar a proteína ou proteínas de interesse a pelo menos 95% de pureza para rotulagem precisa. Purificar proteínas SecA e SecYEG seguindo protocolos detalhados na referência3. Certifique-se de que você tenha pelo menos 5 μg de proteína purificada para esta etapa, pois alguma proteína será perdida durante o processo de rotulagem.
  2. Escolha dois corantes para medições de FRET, dependendo do valor de R0 e das distâncias previstas entre os locais rotulados. Estimar os valores R0 e observar a emissão de doadores e a absorvência aceitante se sobrepõem utilizando as informações do banco de dados de proteínas fluorescentes, que também fornece espectros para corantes comumente usados (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOTA: R0 é definido como a distância em que a eficiência de transferência é de 50% para um determinado par de corantes. Para experimentos de mapeamento, as distâncias previstas devem ser próximas do valor R0 do par de corantes para garantir que as distâncias possam ser medidas com precisão.
  3. Rotular as posições identificadas na etapa 1.1.1. com o par de corante doador-aceitador.
    1. Rotule a proteína de acordo com as instruções do fabricante com especial atenção prestada a parâmetros como concentração de proteína ideal, temperatura, pH, tempo e tampão para os corantes específicos utilizados43,44.
    2. Prepare a proteína a uma concentração de 1-2 mg/mL ou aproximadamente 10 μM em um buffer Tris-HCl de 25 mM (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE). Dissolver o corante em dimetilformamida (DMF) ou dimetilsulfoxida (DMSO) a uma concentração final de 1 mM. Adicione o corante dropwise à solução enquanto mexe para chegar a um corante: razão molar de proteína de 5:1 (50 μM de corante: 10 μM de proteína).
    3. Deixe a reação prosseguir por 4h à temperatura ambiente (RT) em um frasco de vidro com balanço suave ou durante a noite a 4 °C. Pare a reação adicionando β-mercaptoetanol.
      NOTA: Se a proteína não for compatível com tampão tris, podem ser usados tampões de fosfato ou HEPES. Mantenha o pH na faixa 7.0-7.5. Se a proteína tiver ligações de dissulfeto, adicione um agente redutor como DTT ou TCEP antes da rotulagem. Remova o DTT por diálise ou filtragem de gel antes de adicionar corante.
  4. Para medições precisas de FRET, remova o corante livre com um concentrador centrífugo com um corte de peso molecular apropriado (MWCO) para deixar o corante livre fluir enquanto retém a proteína rotulada.
    1. Prepare a membrana concentradora colocando ~ 1 mL de água na parte superior de um concentrador de 3 mL e, em seguida, centrífugue a água através da membrana (pelo menos 10 min a 4.300 x g).
    2. Remova o corante livre por centrifugação da amostra rotulada no concentrador (20 min a 4.300 x g). Repita 3-4 vezes e descarte o fluxo através.
    3. Verifique a eficiência de rotulagem da proteína rotulada usando espectroscopia de absorção UV-Vis.
      NOTA: As medidas de FRET requerem eficiência de rotulagem de 50% ou mais. Menores eficiências de rotulagem reduzem o sinal FRET e podem levar a imprecisões na medição.
    4. Obtenha um espectro UV-Vis da proteína rotulada com uma faixa de 250-700 nm para observar tanto a banda de absorção de proteínas quanto a faixa de absorção máxima de corante. Meça a absorção no pico de absorção de corante e em 280 nm para proteína.
    5. Determine a concentração de proteína e corrija para quaisquer contribuições do corante utilizando o fator de correção, CF, e as seguintes equações45,46:
      Equation 1
      onde C é a concentração da proteína (M), A280 é a absorvância amostral a 280 nm, Amáxima é a absorção no máximo de absorção de corante, ε proteína é o coeficiente de extinção para a proteína a 280 nm e CF é o fator de correção, A'280/A'max, onde A'280 é a absorvância a 280 nm e A'max é a absorção no máximo máximo para o corante.
    6. Determine a eficiência de rotulagem usando a seguinte equação:
      Equation 2
      onde εcorante é o coeficiente de extinção molar do corante, C é a concentração da proteína conforme determinado na etapa 2.4.5, e E é a eficiência de rotulagem. Repetir o passo 2.4.2 até que o valor de eficiência de rotulagem tenha subido e seja inferior a 100%.

3. Determine os valores R 0

  1. Meça os valores R0 in situ. Prepare duas amostras de proteínas na mesma concentração de proteína total, 4 μM, uma com a proteína rotulada apenas com o corante doador e outra com a proteína rotulada apenas com o corante aceitador. Para a SecA, uma concentração proteica de 4 μM Monômero SecA funciona bem para essas medidas.
    1. Prepare volumes amostrais de 2,5 mL para um cuvette de 1 cm x 1 cm, 600 μL para um cuvette de 5 mm x 5 mm ou 200 μL para um cuvette de 3 mm x 3 mm.
  2. Ligue o fluorômetro e abra o programa de aquisição e análise espectral no software de fluorescência se usar um espectrofluorômetro. Clique no M vermelho para conectar o computador ao instrumento (Figura 2A) e escolha O Espectro de Emissões.
    1. Digite parâmetros de varredura, como comprimento de onda de excitação, a faixa para varredura de emissões, temperatura e posição de trocador de amostras usando o item do menu Coletar experimento (Figura 2B).
    2. Clique no RTC e otimize as configurações do instrumento (por exemplo, fendas espectrais) monitorando a emissão de fluorescência no pico usando um comprimento de onda de excitação no máximo de absorção do corante. Para SecA, defina as seguintes configurações: bandpass como 1 nm; excitação e emissão de fendas como 1 e 1,5 mm, respectivamente, com a temperatura a 25 °C e velocidade de agitação a 250 rpm.
      NOTA: Não exceda a capacidade de contagem por segundo (cps) do instrumento (tipicamente 2 x 106 cps).
  3. Coloque a amostra de proteína rotulada do doador no titular da amostra e clique Em executar para gerar uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com o corante doador (proteína apenas do doador) ao excitar a amostra no máximo de absorção de corante (por exemplo, 488 nm para AF488) e escanear sobre o pico de emissão (505-750 nm para doador apenas proteína SecA rotulada com AF488).
  4. Estabeleça uma linha de base para a varredura estendendo a varredura de 25-50 nm após o final do pico. Meça o rendimento quântico da proteína somente para doadores, realizando medições de absorção e fluorescência em amostras de diferentes concentrações como descrito47. Mantenha as mesmas configurações de fenda para essas medidas.
    1. Use corante doador gratuito como referência para o rendimento quântico. Obtenha pelo menos quatro medidas da proteína somente para doadores e o corante livre em diferentes concentrações para uma determinação precisa.
    2. Plote a intensidade da fluorescência ou área integrada versus a absorvância para a proteína somente do doador e o corante ou referência gratuito. Determine as encostas para a proteína somente para doadores (InclinaçãoD) e a referência (InclinaçãoR).
    3. O rendimento quântico (Φ) é calculado usando a seguinte equação:
      Equation 3
      aqui ΦD é o rendimento quântico da proteína apenas do doador, ΦR é o rendimento quântico do corante livre (isso geralmente pode ser obtido do fabricante), InclinaçãoD e InclinaçãoR são as inclinações determinadas na etapa 3.4.2 para o doador apenas proteína e referência, respectivamente e ηD e ηR representam o índice de refração da proteína somente para doadores e as soluções de corante sem referência, respectivamente 47.
  5. Obtenha um espectro de absorção de sua proteína somente aceitadora usando uma célula de comprimento de 1 cm. Gere um espectro de coeficiente de extinção de sua proteína somente para aceitador dividindo o espectro de absorção pela concentração de corante.
  6. Gerar a sobreposição espectral integral, J (λ) usando um programa de análise gráfica. Um programa de planilha padrão (por exemplo, planilha) também pode ser usado para este processo.
    1. Multiplique o espectro de emissão de fluorescência da proteína somente para doadores (passo 3.4) pelo espectro de coeficiente de extinção da proteína somente aceitadora para gerar o espectro de sobreposição.
    2. Multiplique o espectro de sobreposição resultante por λ4.
    3. Determine a área sob a curva por integração da região de sobreposição. A região de sobreposição é definida como a área onde o espectro de emissão de doadores multiplicado pelo espectro de coeficiente de extinção aceitar produz valores positivos. A sobreposição espectral integral é definida como:
      Equation 4
      onde FD (λ) é o espectro de emissão da proteína somente para doadores (obtida na etapa 3.4) e εA(λ) é o espectro de coeficiente de extinção da proteína somente aceitadora e possui unidades de M-1 cm-1 (obtidas na etapa 3.5). A sobreposição espectral resultante integral deve ter unidades de M-1 cm-1nm4.
    4. Normalize a sobreposição espectral integral. Divida a integração sobreposta pela área integrada do espectro proteico apenas do doador sobre a mesma faixa espectral:
      Equation 5
    5. Calcule o valor R0 em Å usando a seguinte equação:
      Equation 6
      onde κ 2 é o fator de orientação, tipicamente tomado como 2/3 para corantes livremente rotativos, η é o índice de refração e pode ser aproximado como 1,33 para soluções aquosas diluídas, QD é o rendimento quântico do doador (etapa 3.4) e J(λ) é a sobreposição espectral integral como determinado na etapa 3.6.35. NOTA: Se os corantes não estiverem girando livremente, as correções podem ser introduzidas conforme descrito por Ivanov 48 e implementados por Auclair49 e Zhang 2,3.

4. Realizar medições espectrais de FRET

  1. Preparar amostras de proteína somente para doadores, proteínas somente aceitadoras e proteínas aceitadoras de doadores na mesma concentração; recomenda-se uma concentração de 4 μM. Use 200 μL de solução, se usar um cuvette de 3 mm x 3 mm, 600 μL se usar um cuvette de 5 mm x 5 mm, ou 2,5 mL se usar um cuvette de 1 cm x 1 cm.
    1. Prepare a amostra proteica doador-aceitante usando quantidades molares iguais apenas do doador e aceitando apenas proteína.
    2. Manter a mesma quantidade de amostra rotulada apenas no doador de controle e aceitar apenas amostras de proteína através da introdução de proteína sem rótulo em quantidade molar igual ao doador ou apenas amostras aceitadoras. Por exemplo, para soluções da mesma concentração, cada amostra fret somente para doadores conteria 100 μL de proteína somente para doadores e 100 μL de proteína sem rótulo para um volume de 200 μL.
  2. Gerar espectros de emissão de fluorescência apenas do doador, apenas aceitador, e amostras de aceitadores de doadores. Otimize o sinal conforme descrito na etapa 3.2. Uma vez otimizado manter as mesmas configurações para todas as amostras.
    1. Obtenha a varredura somente para doadores, conforme descrito na etapa 3.3. Excite a solução no máximo de absorção de corantes doadores e escaneie sobre os picos de emissão do doador e (esperado).
    2. Ou troca a amostra pela proteína somente para o aceitador ou altera a posição do trocador de amostras para a cuvette que contém a proteína somente aceitadora.
    3. Obtenha uma varredura de emissão da proteína rotulada apenas com corante aceitador (apenas proteína aceitante) utilizando as mesmas configurações da etapa 4.2.1. Excite a amostra no comprimento de onda de excitação do doador.
      NOTA: Este espectro fornece uma correção para a quantidade de aceitador animado no comprimento de onda do doador (FA na etapa 5.1.2)
    4. Troque a amostra para a amostra de proteína aceitadora do doador ou altere a posição do trocador de amostras para a cuvette contendo a proteína rotulada do doador.
    5. Obtenha uma varredura de emissão da amostra de proteína aceitadora do doador utilizando as mesmas configurações das etapas 4.2.1 e 4.2.3.
    6. Para todos os espectros, corrija para fluorescência de fundo subtraindo as contagens de fundo medidas no final da varredura.
  3. Meça a vida útil do doador apenas do doador e amostras de doador-aceitador preparadas conforme descrito na etapa 4.1.2. Use um instrumento de fluorescência de contagem de fótons de contagem de fótons correlacionados com tempo capaz de medir e resolver decaimentos fluorescentes na faixa de tempo nanossegundo (10-9 s).
    NOTA: Para os pares de corantes FRET, combine a fonte de luz de excitação com o máximo de absorção do corante doador.
    1. Ligue o instrumento. Abra o software de aquisição, use o software de controle de instrumentos para aquisição de dados com o espectrômetro de fluorescência.
    2. Para aquisição, selecione TCSPC Decay, com um intervalo de tempo de 55 ns, um ganho de 1 e 4096 canais.
    3. Obtenha uma função de resposta de instrumento (IRF) utilizando uma solução de creme não lácteo ou solução de dispersão comercial e monitore a dispersão a 490 nm. Ajuste a configuração da fenda e use filtros de densidade neutra conforme necessário para manter uma taxa de contagem baixa o suficiente para evitar o acúmulo de pulso5. Clique em Aceitar e, em seguida, Iniciar. Isso vai começar a aquisição.
      NOTA: Uma taxa máxima de contagem de 4000 cps é usada para uma taxa de repetição de 180 kHz.
    4. Colete o IRF a 490 nm até que o canal de pico tenha um máximo de 20.000 contagens. Colete um IRF antes e depois de medir cada decadência de fluorescência.
    5. Obtenha as decaimentos de fluorescência apenas do doador e amostras de doador-aceitador monitorando a emissão de fluorescência no comprimento de onda de emissão do doador, 520 nm.
    6. Ajuste as configurações da fenda para uma taxa máxima de contagem de 4000 cps ou menos. As configurações de fenda são tipicamente de 15-20 nm de bandpass para amostras de proteínas. Recolher a decadência até que 20.000 contagens sejam obtidas no canal de pico.
  4. Analise a decadência ou a intensidade da fluorescência (I) em função do tempo (t) para a vida fluorescência (τ). Encaixe a decadência a uma soma de exponenciais com a seguinte equação:
    Equation 7
    onde αeu sou o fator pré-positivo do i th componentee eu sou a vida toda. O ajuste é reconvolved com o IRF para combinar com a decadência fluorescência. Julgue a qualidade do ajuste a partir dos parâmetros χ2 reduzidos.

5. Análise dos dados do FRET

  1. Calcular a eficiência do FRET a partir da diminuição da intensidade do doador da amostra doador-aceitadora em relação ao doador apenas com a equação a seguir.
    Equation 8
    onde fda é a intensidade de fluorescência da amostra doador-aceitador e FD é a intensidade de fluorescência do doador apenas amostra no auge da fluorescência do doador. Use as áreas integradas dos picos se os dados forem barulhentos.
    1. Corrija para quaisquer diferenças na rotulagem apenas entre as amostras doadoras e aceitadoras de doadores. Calcular correções com base no grau de rotulagem do doador da seguinte forma.
      Equation 9
      onde fDA é a eficiência de rotulagem de doadores na amostra de aceitador de doadores e fD é a eficiência de rotulagem na amostra somente de doadores.
    2. Correto para quaisquer contribuições da fluorescência aceitadora para o espectro animado pelo doador através da subtração do espectro proteico somente aceitador (passo 4.2) do espectro proteico aceitador de doadores.
      Equation 14
    3. Correto para as diferenças na eficiência de rotulagem do aceitador apenas proteína em relação à amostra de proteína aceitadora de doadores, produzindo a seguinte equação para calcular a eficiência:
      Equation 10
      onde fA denota a quantidade fracionada de rotulagem aceitadora. Esta equação inclui todas as correções devido à rotulagem de tingimento e fluorescência aceitadora.
    4. Calcular distâncias DE FRET das eficiências usando a seguinte equação:
      Equation 11
      utilizando o valor R0 obtido na etapa 3.6.5.
    5. Calcule a eficiência do FRET usando a vida útil da fluorescência apenas do doador e amostras aceitadoras de doadores medidas na etapa 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Use a vida útil ponderada por amplitude para calcular a eficiência do FRET e comparar com os resultados de estado estável5.
      Equation 13
    7. Calcule a distância como na etapa 5.1.4 a partir da eficiência determinada pela vida útil da fluorescência. Compare valores de estado estável e tempo resolvidos para eficiências e distâncias de FRET e certifique-se de que eles estão dentro do erro um do outro.

6. Mapeando as distâncias

  1. Use as distâncias calculadas para mapear o local de ligação na estrutura tridimensional. Calcule as distâncias e erros de todos os pares de corantes e locais examinados utilizando a equação dada nos valores passo 5.1.4 e R0 obtidos na etapa 3.6.5 para cada par DE FRET.
    1. Use um programa de visualização gráfica 3D, como o PyMOL50 , para mapear as distâncias na estrutura (script dado em Arquivo Suplementar). Os comandos do script podem ser inseridos diretamente na janela de comando com as informações de distância apropriadas.
    2. Gerar um shell para cada distância medida e o erro associado (Figura 3, Figura 4, Figuras Suplementares 1-3).
    3. Mapeie a posição através da intersecção das diferentes conchas (Figuras Suplementares 1-3). O local de ligação do peptídeo de sinal foi mapeado através dos três locais diferentes na SecA e SecYEG e quatro locais diferentes no peptídeo de sinal (Figura 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Este estudo concentrou-se em determinar a localização do local de ligação pré-proteína na SecA antes da inserção da pré-proteína no canal SecYEG. Para mapear o local de ligação, foram realizados experimentos de FRET entre diferentes regiões da pré-proteína e três locais distintos nas proteínas SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Das distâncias obtidas e estruturas tridimensionais da SecA, SecYEG e pré-proteína, a localização do local de ligação pré-proteína foi prevista. Em vez de empregar três entidades separadas (SecA, SecYEG e pré-proteína) para realizar essas medições, a sequência de sinal PhoA foi anexada à SecA através de modificação genética após a incorporação de um linkerGli-Ser 2,3. Para rotulagem fácil com corantes, resíduos de Cys ou mutações âmbar foram introduzidos nos resíduos 2, 22, 35 e 45 na pré-proteína PhoA (Figura 1E).

Identificação de sites e rotulagem
Um local de ligação putativa para a sequência de sinal havia sido previamente identificado usando métodos de mapeamento FRET semelhantes 2,32. Esses e outros estudos identificaram o dedo de duas hélices (THF) e o domínio transfronteiriço pré-proteína como possíveis locais de ligação do peptídeo de sinal com uma orientação sugerida em posição paralela ao THF 33,51,52,53,54 (Figura 1F). Assim, a identificação de potenciais locais de rotulagem nas proteínas SecA e SecYEG foi feita com base na localização do local de ligação putativa na estrutura cristalina SecA e SecYEG (mostrada em verde na Figura 1A-D). Três locais foram escolhidos para triangular a posição do local de ligação putativa, onde essencialmente os três locais formam um triângulo em torno do local de ligação putativa. Como mostrado na Figura 1, os três locais estavam dentro da faixa FRET do site de ligação (50-70 Å). O par de corantes Alexa Fluor 488 (AF488) e Alexa Fluor 647 (AF647) foi escolhido, pois o valor R0 de 55,7 Å36 corresponde bem com as distâncias esperadas entre os sites rotulados e o local de ligação putativa garantindo a precisão da medição.

Os três locais escolhidos para rotulagem, SecA37, SecA321 e SecY292 (mostrados como esferas magenta, violeta e ciano na Figura 1A-D) estão localizados em todo o complexo proteico formando um triângulo em torno do local de ligação putativa. Os três locais foram mutados separadamente para resíduos de Cys em um mutante sem Cys para garantir que apenas a posição correta fosse rotuladacomo 2,37. Para os experimentos secy292, os locais de pré-proteção PhoA foram rotulados com resíduo AF647 e o resíduo SecY 292 foi rotulado com AF488 usando química de maleimida. Na proteína quimrica, os locais SecA37 e SecA321 foram rotulados com AF647 e a pré-proteína foi rotulada com AF488. Na proteína quimrica SecA-PhoA, os resíduos 2, 22, 37 e 45 do segmento de pré-proteína PhoA foram mutados para um códon âmbar em proteínas individuais. As mutações do codon âmbar permitiram a introdução de aminoácido não natural, p-azidophenylalanina, nessas posições, que foram posteriormente rotulados com o AF488 usando a química do clique39,40. Cada mutação foi gerada e rotulada independentemente para garantir a rotulagem correta e diferencial dos componentes proteicos. O grau de rotulagem foi determinado para todas as proteínas e geralmente precisava ser 50% ou melhor para prosseguir com a amostra.

Determinação de eficiências e distâncias de transferência
Antes de realizar as medições de transferência de energia, foram determinados os valores de rendimento quântico do doador, sobreposição integral e R0 (etapas 3.4-3.6). O rendimento quântico do doador foi medido em relação ao corante, fluoresceína, que tem um rendimento quântico de 0,79 em 0,1 M NaOH47. Espectros de emissão de absorção e fluorescência foram obtidos em uma série de concentrações para gerar um gráfico linear de absorção em relação à intensidade de emissão de fluorescência para determinar o rendimento quântico. Nestas medidas, é fundamental medir a absorção na faixa linear (0.1-1.0) e todas as medidas de emissão precisam ser geradas com as mesmas configurações de fenda. Como esses valores são usados para determinar integrais sobrepostas e valores R0 , eles devem ser medidos em condições de FRET. O ambiente local de proteínas afeta profundamente a emissão de corantes e, consequentemente, os rendimentos quânticos dos doadores devem ser medidos para cada um dos locais investigados. Notamos que os sites da SecA e da SecYEG influenciam os valores R0 mais fortemente do que aqueles na porção PhoA da quimera. Para pares de corantes com o mesmo site SecA ou SecYEG, os valores R0 estão tipicamente dentro de 5 Å um do outro; que os valores R0 podem diferir em até 20 Å para os dois locais diferentes da SecA (resíduos 37 vs. 321), ressaltando a importância de determinar os valores de R0 para cada par de corante (Tabela 1).

O cálculo de R0 pressupõe que os corantes doadores e aceitadores estejam livremente girando e o grau em que os corantes não giram contribui para a incerteza geral na medição. Para levar em conta adequadamente o movimento relativo dos corantes e suas orientações, foram realizadas medidas de anisotropia de fluorescência de estado estável em todos os corantes doadores e aceitadores nas diferentes posições de rotulagem. Esses valores, que estavam na faixa 0,10-0,21, foram utilizados para calcular o erro associado às medições de distância 2,3,48. Os valores relativamente altos de anisotropia observados tanto para os corantes doadores quanto para os aceitadores correspondem a uma redução na rotação de corantes, o que é inconsistente com a suposição de livre rotação. A falta de rotação livre gera um erro de 19%-25% nos cálculos de distância. Como mostrado na Tabela 1, isso levou a uma incerteza média nas distâncias medidas de no máximo ± 15 Å. Ao mapear as distâncias do FRET, essas incertezas nas medições de distância são uma consideração importante, como discutido abaixo.

A distância calculada entre pares doadores-aceitadores baseia-se na relação entre eficiência e distância, na qual uma maior eficiência é indicativa de pares doadores-aceitadores separados por uma distância menor. Para determinar a eficiência do FRET, os espectros de emissão de fluorescência animados com o comprimento de onda de excitação do doador (488 nm) são obtidos em amostras somente de doadores e aceitadores de doadores. Normalmente, uma redução na intensidade de emissão de doadores significa a presença de transferência de energia (etapa 5.1). A Figura 1G retrata o espectro de doadores-aceitadores para o resíduo SecA 37 com resíduo 2 ou 22 da quimera PhoA. O resíduo SecA37 é rotulado com AF647 ou corante aceitador, e os resíduos PhoA são rotulados com AF488 ou corante doador. Em qualquer posição, a fluorescência do doador é reduzida e um pequeno aumento na intensidade de fluorescência aceitadora pode ser visto nas amostras aceitadoras de doadores. Uma vez que a excitação é feita no comprimento de onda de excitação do doador de 488 nm, o que não excita diretamente o aceitador, qualquer fluorescência aceitadora observada resulta da transferência de energia. Assim, a diminuição da intensidade do doador e o aumento concomitante da intensidade do aceitador resulta da transferência de energia entre os dois corantes. Significativamente, a intensidade da fluorescência do doador é maior para a posição PhoA2 (azul) em relação à posição PhoA22 (amarela) na presença do aceitador. Essa diferença relativa na diminuição da intensidade do doador indica que a transferência de energia entre o resíduo PhoA2 e o resíduo SecA37 é mais fraca do que a transferência entre os resíduos PhoA22 e SecA37, o que implica que o resíduo PhoA2 está localizado mais longe da SecA37 do que phoA22. As distâncias são determinadas a partir da relação entre valores de eficiência e R0 (etapa 5.1.4).

Uma vez que as medidas de fluorescência de estado estável poderiam representar uma média de duas ou mais distâncias, também realizamos medições de fluorescência resolvidas por tempo. Para esses experimentos, a vida útil do corante doador é medida na presença e ausência do aceitador (Figura 1G). Se houvesse dois processos distintos de transferência de energia contribuindo para a eficiência de fluorescência de estado estável medido, eles seriam observados como vidas discretas, desde que fossem solucionáveis dentro da resolução temporal do instrumento. Para aumentar a capacidade de resolver as vidas, 10.000 contagens ou mais devem ser coletadas no pico; no entanto, a altura máxima ou contagem de canais de pico precisa ser equilibrada com o tempo de aquisição e danos potenciais à amostra. As medidas resolvidas pelo tempo renderam uma única vida útil para cada par de doadores-aceitadores consistentes com apenas uma orientação ou distância entre os corantes. Notamos que pequenas diferenças na distância observadas nas áreas reveladas por nossa técnica de mapeamento FRET não levariam a vidas solucionáveis em nosso sistema. Além disso, as eficiências determinadas pelas medidas de fluorescência resolvidas por tempo foram de bom acordo com as determinadas a partir das medições de estado estável, fornecendo ainda mais suporte de que as eficiências medidas decorrem de apenas uma distância entre os paresde corantes 3.

Mapeando as distâncias do FRET na estrutura tridimensional
As medições de transferência de energia de ressonância produzem informações de distância suficientes para identificar o local de ligação e orientação da sequência de sinal na SecA. Os três locais na SecA e SecYEG, juntamente com as quatro posições na região PhoA da quimera SecA-PhoA fornecem as 12 distâncias diferentes usadas para mapear o local de ligação (Tabela 1). As doze distâncias foram mapeadas na estrutura cocristasta de raios-X tridimensional do complexo Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) para identificar o local de ligação da sequência de sinal33. A estrutura do complexo SecA-SecYEG é semelhante à observada em E. coli , como evidenciado por um estudo de fotocrosslinking in vivo 55.

Usamos os resíduos in início (PhoA2) e final (PhoA22) da sequência de sinal PhoA na quimera SecA-PhoA para ilustrar como os locais de resíduos foram identificados no complexo SecA-SecYEG. Como a transferência de energia pode ocorrer em todas as direções, as distâncias fret e erros associados descrevem uma concha esférica, com um dos locais de corante do par doador-aceitador designado como centro. Neste estudo, os resíduos SecA37, SecA321 e SecY292 formam os centros de três conchas esféricas que descrevem a localização do resíduo PhoA2 da sequência de sinal. Visualização das regiões sobrepostas decorrentes dos três locais separados, SecA37 (magenta), SecA321 (roxo) e SecY292 (ciano) são mostrados na Figura 3. Apenas uma parte de cada casca DESE se cruza com a estrutura proteica, e os resíduos e espinha dorsal que se enquadram nessa concha são destacados. Assim, as regiões proteicas dentro da concha definidas pela distância SecA37-PhoA2 são mostradas em magenta (Figura 3A,E), enquanto as regiões definidas pelas conchas SecA321-PhoA2 e SecY292-PhoA2 são mostradas em roxo (Figura 3B,F) e ciano (Figura 3C,G), respectivamente. O local de ligação putativa, consistindo principalmente do dedo de duas hélices, é mostrado em verde.

Como mostrado na Figura 3, cada uma dessas conchas FRET define uma seção relativamente grande do complexo proteico. Para os três locais, a concha FRET se cruza com o local de ligação putativa; no entanto, para o resíduo SecA321, por exemplo, a área intersetorial é menor e fica em direção às extremidades dos dedos com sobreposição significativa com o domínio helicoidal do andaime. A intersecção ou a área comum das três conchas FRET (Figura 3D,H), define a localização do resíduo PhoA2. Esta área é consideravelmente menor do que cada concha FRET e inclui apenas uma pequena porção do THF com uma grande contribuição do andaime helicoidal. Os scripts utilizados para a geração das conchas FRET e das áreas intersetoriais para o programa de visualização molecular, PyMOL, são dados nas Informações Suplementares. Partes das conchas são visualizadas como pontos rosa no complexo SecA-SecYEG em Figuras Suplementares 1-3.

Uma estratégia semelhante foi utilizada para identificar a localização do resíduo PhoA22. As conchas FRET definidas pelas distâncias PhoA22 FRET (Figura 4A-C,E-G) descrevem uma área menor em relação ao resíduo PhoA2 (Figura 4D,H vs.Figura 3D,H). Interpretamos essa diferença para sugerir que o resíduo PhoA2 e a região associada são mais flexíveis e labile do que o PhoA22. Significativamente, a área atribuída ao resíduo PhoA22 está localizada mais próxima da ponta do THF e da foz do canal SecYEG, com regiões de SecY identificadas na área comum (Figura 3D,H). Todos os três pares de corantes identificam regiões juntamente com o local de ligação putativa; no entanto, as áreas comuns interseccionadas centralm a localização PhoA22 (Figura 4D,H) na extremidade oposta do THF em relação à localização PhoA2 (Figura 3D,H). Esses achados sugerem que a sequência de sinal da pré-proteína que se estende dos resíduos 2-22, está ao longo do THF em um estado relativamente desestruturado. Este resultado é consistente com estudos anteriores sugerindo que a sequência de sinal se liga à proteína ao longo do THF em um estado estendido e que a extremidade terminal C da SecA na estrutura de cristal B. subtilis essencialmente modela a estrutura do peptídeo de sinal e ocupa o mesmo local (mostrado em vermelho Figura 1F)2,26 . Utilizamos uma abordagem semelhante para identificar dois locais na região madura precoce (resíduos 37 e 45) da quimera pré-proteína SecA-PhoA para definir ainda mais a vinculação e orientação da sequência de sinal e região madura precoce, conforme discutido abaixo. Em outros estudos, as distâncias FRET têm sido utilizadas efetivamente para refinar uma estrutura existente ou dinâmica molecular do modelo derivado de simiulação 18,19,56; não fomos capazes de fazer isso, pois não existe nenhuma estrutura para a sequência de sinal vinculada à SecA.  

Figure 1
Figura 1: Labeling sites no complexo SecA-SecYEG com espectros fret representativos. (A-D) Quatro visões diferentes da estrutura co-cristal SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33 em que os locais de rotulagem das esferas SecA37, SecA321 e SecY292 são mostradas como esferas magenta, violeta e ciano, respectivamente. A-C são vistas laterais do complexo e D é uma vista superior. SecA é mostrado em cinza claro, SecYEG é mostrado em cinza escuro e o site de ligação putativa, o THF, é mostrado em verde. (E) Esquemático da construção da quimera SecA-PhoA, que conecta a proteína SecA à pré-proteína PhoA através de um linker Ser-Gli (não atraído para escala). Os locais de rotulagem na porção PhoA da quimera são dados em azul, verde, amarelo e vermelho, correspondentes aos resíduos 2, 22, 37 e 45. (F) Diagrama de fita da estrutura cristalina de B. proteína subtilis SecA (PDBID: 1M6N) colorida por domínio onde os domínios 1 e 2 de ligação nucleotídeos são mostrados em azul e azul claro, respectivamente, o domínio de ligação cruzada pré-proteína é mostrado em ouro, a hélice central em verde, o dedo de duas hélices em ciano, o domínio da asa helicoidal em verde escuro e o linker terminal C em vermelho26 . O C-terminus não estruturado serve como um modelo do peptídeo de sinal PhoA vinculado com base em um estudo anterior de mapeamento da FRET2. (G) Espectros de fluorescência de estado constante do doador e amostras aceitadoras de doadores do par FRET SecA37-AF647 e PhoA2-AF488 e do par FRET SecA37-AF647 e PhoA22-AF488. A redução da intensidade do doador para a amostra doador-aceitadora é indicativa da transferência de energia. Maior transferência de energia ocorre a partir de PhoA22 em relação ao local PhoA2 com base na diminuição da intensidade do doador. (H) Doador de fluorescência resolvido pelo tempo apenas (magenta) e espectros de decaimento de doadores (magenta leve) do par FRET SecA37-AF647 e PhoA22-AF488. A função de resposta do instrumento é mostrada em cinza. O complexo doador-aceitador dá uma decadência mais curta e, consequentemente, uma vida mais rápida consistente com a transferência de energia. Todas as estruturas moleculares foram geradas com o arquivo PDB indicado e PyMOL50. A Figura 1E-H foi modificada de Zhang et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Interface de usuário do programa FluorEssence. (A) A janela de abertura é mostrada com um círculo em torno do M vermelho. Isso deve ser clicado para conectar o programa com o fluorômetro. (B) A janela de configuração do experimento ilustra as diferentes áreas (monos, detectores, acessórios) onde os parâmetros relevantes da varredura são inseridos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Conchas de distância FRET determinadas para a posição SecA-PhoA2. As conchas de distância FRET construídas a partir das distâncias fret e das incertezas associadas (Tabela 1) são retratadas no complexo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Conchas de distância FRET para o local PhoA2 construído com SecA37 (magenta), SecA321 (violeta) e SecY292 (ciano), respectivamente na posição central. As conchas são coloridas de acordo com o resíduo central. (D) A intersecção das três conchas FRET define a localização de PhoA2, mostrada em azul. (E-H) As visualizações são giradas aproximadamente 180° a partir de A-D. Todas as estruturas moleculares foram geradas com o arquivo PDB indicado e PyMOL50. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Conchas de distância FRET determinadas para a posição SecA-PhoA22. As conchas de distância FRET construídas a partir das distâncias fret e incertezas associadas (Tabela 1) são retratadas no complexo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Conchas de distância FRET para o local PhoA22 construído com SecA37 (magenta), SecA321 (violeta) e SecY292 (ciano), respectivamente na posição central. As conchas são coloridas de acordo com o resíduo central. (D) A intersecção das três conchas FRET define a localização de PhoA22, mostrada em amarelo. (E-H) As visualizações são giradas aproximadamente 180° a partir de A-D. Todas as estruturas moleculares foram geradas com o arquivo PDB indicado e PyMOL50. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Locais mapeados por FRET de PhoA2, PhoA22, PhoA37 e PhoA45 projetados no B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE cocristal structure (PDBID: 5EUL). (A) Coloração de SecA-SecYE como na Figura 1. O substrato de peptídeo OmpA inserido no final do THF é mostrado em rosa. As regiões mapeadas por FRET foram geradas na presença de ATP-γS, com PhoA2 mostrado em azul, PhoA22 em verde, PhoA37 em amarelo e PhoA45 em vermelho. As regiões de sobreposição são mostradas em azeitona (PhoA22 e PhoA37) e laranja (PhoA37 e PhoA45). O substrato de peptídeo (resíduos 749-791, ciano) foi extirpado da estrutura original e modelado para a região de ligação putativa sem alterações na estrutura (circulado em vermelho). (B) Visão ampliada do substrato de peptídeo modelado. Os resíduos 2 (Lys), 22 (Tyr) e 37 (Gly) do substrato de peptídeo OmpA são retratados em forma de vara em azul, verde e amarelo, respectivamente. Esses resíduos nos peptídeos modelados apresentam excelente concordância com os locais mapeados fret previstos. Para clareza, o nanocorpo na estrutura original foi omitido. Este número foi modificado de Zhang et al.3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

site rotulado no complexo SecA-PhoA-SecYEG Site rotulado na porção de peptídeo PhoA da Quimera SecA-PhoA
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 Phoa37-AF488 Phoa45-AF488
Seca 37-AF467-Phoa
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
Eficiência do FRET 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
distância 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
Seca321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
Eficiência do FRET 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
distância 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
Phoa2-AF647 PhoA22-AF647 Phoa37-AF647 Phoa45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
Eficiência do FRET 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
distância 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
adaptado da referência 3.
Os valores de R0 dados em angstroms foram calculados conforme descrito no texto
A eficiência do FRET foi calculada a partir da diminuição da intensidade de fluorescência do doador na presença do aceitador como descrito. O erro é relatado como o SD de três medições independentes.
As distâncias de aceitadores de doadores (R) são dadas em angstroms e calculadas conforme descrito no texto. O erro relatado resulta de uma consideração do erro experimental e que decorre da orientação dos corantes.  A orientação de corante é estimada a partir da anisotropia de fluorescência do estado estável

Tabela 1: Eficiências de transferência e distâncias determinadas para o complexo SecA-PhoA-SecYEG. São dadas eficiências, distâncias e valores R0 para as 12 distâncias utilizadas para mapear o local de ligação pré-proteína.

Figura suplementar 1: A concha de distância FRET, mostrada em pontos cor-de-rosa, determinada para o resíduo SecA37 e o resíduo PhoA 37 no complexo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A é mostrado em cinza claro, SecYEG é mostrado em cinza escuro e o resíduo SecA37 é mostrado em magenta. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: A concha de distância FRET, mostrada em pontos rosas, determinada para o resíduo SecA321 e o resíduo PhoA 37 no complexo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A é mostrado em cinza claro, SecYEG é mostrado em cinza escuro e o resíduo SecA321 é mostrado em violeta. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: A concha de distância FRET, mostrada em pontos cor-de-rosa, determinada para o resíduo SecY292 e o resíduo PhoA 37 no complexo SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A é mostrado em cinza claro, SecYEG é mostrado em cinza escuro e o resíduo SecY292 é mostrado em ciano. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Através do uso da metodologia de mapeamento FRET, identificamos o local de ligação da sequência de sinal na proteína SecA. É importante ressaltar que a presença de uma estrutura de cristal 3D do complexo facilitou muito nosso estudo. A força dessa metodologia de mapeamento está na capacidade de usar uma estrutura existente para identificar locais para rotulagem. Esta metodologia não pode ser usada para determinar uma estrutura 3D; no entanto, a determinação dos elementos estruturais56, o refinamento de uma estruturaexistente 49, a determinação de um local vinculante 2,32, ou a elucidação do movimento dinâmico57, são todas as aplicações possíveis deste método.

No complexo SecYEG-SecA-PhoA, os três locais de rotulagem formam um triângulo em torno do local de ligação putativa (Figura 1). O emprego de medições de distância múltipla dos vértices deste triângulo para o mesmo resíduo refina as informações de localização semelhantes aos métodos de navegação GPS. Três locais, SecA37, SecA341 e SecY292, foram identificados na SecA e secY juntamente com quatro locais, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 na sequência de sinal e região madura precoce da pré-proteína para dar um total de 12 distâncias para mapear a localização do peptídeo de sinal (Tabela 1). É importante ressaltar que, para melhorar a precisão das medições de distância, os locais de rotulagem devem estar localizados em regiões relativamente estáticas da proteína, como em elementos de estrutura secundária em vez de laços. Além disso, os sites também devem estar em locais relativamente acessíveis ao solvente para facilitar e aumentar a eficiência da rotulagem. Dentro do complexo SecA-PhoA-SecYEG, o desempenho de medições de distância dos sítios do triângulo ou vértices a resíduos no substrato de ligação foram suficientes para localizar os resíduos no substrato de ligação para uma área relativamente pequena (Figura 3D,H e Figura 4D,H). A identificação da área intersetorial a partir das medições de múltiplas distâncias refina significativamente a localização da medida de distância única, conforme mostrado na Figura 3 e Figura 4. Assim, ao utilizar este método, a medição de múltiplas distâncias é fortemente recomendada. Embora este método possa identificar regiões de moléculas envolvidas na ligação, por exemplo, não fornece informações estruturais precisas; essas informações são melhor obtidas a partir de outros métodos estruturais, como raio-X, NMR e crio-EM. As distâncias FRET podem ser usadas para refinar efetivamente uma estruturaexistente 18,19 ou modelo, neste caso, que não foi possível, pois nenhum modelo da sequência de sinal vinculado à SecA existe.

Para garantir que a rotulagem de tingimento ocorra apenas em locais desejados e as medidas de distância do FRET sejam precisas, o uso de mutagênese para rotulagem é preferido. A geração de um mutante sem círio requer mutação relativamente conservadora de resíduos de Cys para Ser ou resíduos similares na proteína do tipo selvagem usando métodos de mutagênese direcionados ao local. No presente estudo, as mutações cys foram introduzidas em versões livres de Cys da SecA e SecYEG para rotulagem37. A atividade da proteína mutante foi verificada com um ensaio de crescimento seguido de um ensaio atpase verde in vitro malachite 41,42. Ensaios de atividade relevantes dependem da função da proteína, por exemplo, para proteínas de ligação de DNA, um ensaio de ligação de DNA seria apropriado58. A falha em garantir a rotulagem em apenas um local pode levar à rotulagem de mais de um local com o mesmo corante, o que complica significativamente as determinações de distância. Assim, a introdução de um segundo rótulo na mesma proteína pode ser feita através da incorporação de aminoácidos não naturais por mutagênese direcionada ao local. Utilizamos essa metodologia para rotular a quimera SecA-PhoA em locais distintos dos resíduos de Cys, introduzindo o aminoácido não natural, p-azidophenylalanine e rotulagem com química de clique39,40.

Uma consideração importante adicional deste método é a escolha dos corantes utilizados e o valor associado de R0 . Após a identificação dos potenciais locais de rotulagem, as distâncias a serem medidas podem ser estimadas a partir da estrutura 3D. Com essas informações, os pesquisadores podem escolher pares de corantes com valores R0 que abrangem a faixa desejada de distâncias esperadas. Por exemplo, o par de corantes AF488-AF647 tem um R0 calculado de 55,7 Å, que fornece uma boa gama para sites de rotulagem localizados a uma estimativa de 40-75 Å longe do local de ligação putativa. Embora os valores R0 calculados na etapa 2.2 sejam úteis para escolher qual par de corante usar para o seu sistema, a fixação dos corantes à proteína pode alterar significativamente suas propriedades. Para maior precisão, os valores R0 devem ser calculados a partir de experimentos in situ realizados com proteína rotulada (etapas 3.1 - 3.6.5).

A medição da eficiência da transferência pode ser feita monitorando a emissão de fluorescência de estado estável e observando uma diminuição da emissão de doadores ou um aumento na emissão de aceitadores. Embora a observação de ambos os efeitos seja desejável, a eficiência pode ser calculada a partir de ambos os descritos 5,8. A eficiência também pode ser calculada a partir da diminuição da vida útil do doador na amostra aceitadora de doadores em relação à amostra somente de doadores. Recomenda-se a determinação da eficiência por mais de um método, particularmente o uso de métodos resolvidos pelo tempo para estabelecer a homogeneidade relativa das eficiências medidas.

O método de mapeamento também nos permitiu determinar a orientação relativa da sequência de sinal e as regiões maduras precoces da pré-proteína PhoA em relação à SecA e ao local de ligação putativa. Uma estrutura de cristal de raios-X SecA-SecYEG e um estudo crio-EM subsequente forneceram clareza sobre a estrutura da sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína em relação ao canal e à SecA34,35. Na estrutura do raio-X, os resíduos 1-41 da pré-proteína OmpA foram anexados à ponta do dedo de duas hélices e visualizados em uma estrutura de grampos no canal (mostrado em rosa, Figura 5). As localizações dos quatro resíduos de PhoA na quimera SecA-PhoA foram mapeadas nesta estrutura usando o mesmo protocolo descrito acima. Como mostrado na Figura 5, a localização dos resíduos PhoA37 e PhoA45 (amarelo, laranja, vermelho) está entre PhoA2 e PhoA22, com PhoA45 mais perto de PhoA2. Esses achados, particularmente a localização de PhoA45, sugeriram que a pré-proteína PhoA estava formando uma estrutura de grampos de cabelo.

Para validar ainda mais nosso local de ligação identificado pela FRET, realizamos uma comparação de nossos locais mapeados com o da pré-proteína OmpA, extirando a estrutura de pré-proteína de 41 resíduos do canal e modelando-a nas regiões definidas pelo mapeamento DA FRET (Figura 5, ciano). Sem qualquer alteração da estrutura de raios-X pré-proteína, descobrimos que os locais dos resíduos 2, 22 e 37 (mostrados em azul, verde e amarelo) na estrutura excisada do fragmento de pré-proteína ompA concordam notavelmente bem com os locais mapeados da FRET (Figura 5B) e sugerem que o grampo de cabelo se forma antes da entrada do canal. A pré-proteína OmpA termina no resíduo 41 na estrutura cristalina de raios-X; no entanto, o terminal C da SecY, que não é estruturado, fornece uma indicação da possível localização de PhoA45. Em nossa estrutura modelada, o laço do grampo fica na boca do canal, pronto para facilitar a translocação da pré-proteína através da membrana. Assim, neste exemplo, a metodologia de mapeamento FRET aprimora as informações existentes da estrutura estática SecA-SecYEG, fornecendo uma dica do movimento dinâmico necessário para a translocação de proteínas em toda a membrana. Embora não seja adequada para determinações de estrutura de novo , se houver informações estruturais tridimensionais disponíveis, a metodologia de mapeamento DA FRET pode aprofundar a compreensão atual das relações estrutura-função, por meio da elucidação de locais de ligação e movimentos dinâmicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde doem R15GM135904 (concedido ao IM) e Institutos Nacionais de Saúde GM110552 (concedido à DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Bioquímica Edição 181 fluorescência transferência de energia SecA translocação de proteínas mapeamento FRET
Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter