Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

В исследовании подробно описывается методология картирования FRET, включая выбор мест маркировки, выбор красителей, сбор и анализ данных. Эта методология эффективна при определении сайтов связывания, конформационных изменений и динамических движений в белковых системах и наиболее полезна, если выполняется в сочетании с существующей 3-D структурной информацией.

Abstract

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) является признанным методом на основе флуоресценции, используемым для успешного измерения расстояний внутри и между биомолекулами in vitro , а также внутри клеток. В FRET эффективность передачи энергии, измеряемая изменениями интенсивности флуоресценции или времени жизни, относится к расстоянию между двумя флуоресцентными молекулами или метками. Определение динамики и конформационных изменений с расстояний является лишь некоторыми примерами применения этого метода к биологическим системам. При определенных условиях эта методология может дополнять и улучшать существующие рентгеновские кристаллические структуры, предоставляя информацию о динамике, гибкости и адаптации к связывающим поверхностям. Мы описываем использование FRET и связанных с ним определений расстояний для выяснения структурных свойств путем идентификации сайта связывания или ориентации субъединиц димера. Благодаря разумному выбору сайтов маркировки и часто использованию нескольких стратегий маркировки, мы успешно применили эти методы картирования для определения глобальных структурных свойств в комплексе белок-ДНК и системе транслокации белка SecA-SecYEG. В системе SecA-SecYEG мы использовали методы картирования FRET для идентификации сайта препротеин-связывания и определения локальной конформации области связанной последовательности сигналов. В этом исследовании описываются этапы выполнения картографических исследований FRET, включая идентификацию соответствующих мест маркировки, обсуждение возможных этикеток, включая ненативные аминокислотные остатки, процедуры маркировки, как выполнять измерения и интерпретацию данных.

Introduction

Для белков выяснение динамики наряду с 3-мерными (3-D) структурными знаниями приводит к лучшему пониманию структурно-функциональных отношений биомолекулярных систем. Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия, захватывают статическую структуру и часто требуют определения нескольких структур для выяснения аспектов связывания биомолекул и динамики1. В этой статье обсуждается основанный на решении метод отображения глобальных структурных элементов, таких как сайты связывания или взаимодействия привязки, которые потенциально более преходящи и менее легко захватываются статическими методами. Сильными системами-кандидатами для этой методологии являются те, в которых 3D-структура была ранее определена рентгеновской кристаллографией, ЯМР-спектроскопией или другими структурными методами. В этом случае мы используем рентгеновскую кристаллическую структуру комплекса SecA-SecYEG, центрального игрока в общем секреторном пути белка, для отображения местоположения сайта связывания сигнального пептида с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) до переноса препротеина через мембрану2. Манипулирование биологической системой с помощью генетических модификаций в сочетании с нашими знаниями о 3D-структуре позволило определить конформацию сигнальной последовательности и ранней зрелой области непосредственно перед введением в канал 3.

FRET включает в себя безрадиационную передачу энергии от одной молекулы (донора) к другой (акцептору) в зависимости от расстояния, то есть через пространство 4,5. Эффективность этого переноса контролируется либо через уменьшение донора, либо через увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции. Эффективность передачи энергии можно охарактеризовать как

E = R06/(R06 + R6)

в котором значение R0 — это расстояние, на котором передача эффективна на 50%6. Методика ранее была описана как молекулярная линейка и эффективна при определении расстояний в диапазоне 2,5-12 нм в зависимости от идентичности донор-акцепторных красителей 4,7,8,9. Интенсивность и срок службы донорской флуоресценции с акцептором или без него позволяют определить эффективность переноса и, следовательно, расстояния 5,8. Благодаря доступности технологии, чувствительности метода и простоте использования, FRET также нашел широкое применение в таких областях, как одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия и конфокальная микроскопия6. Появление флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок, сделало наблюдение за внутриклеточной динамикой и визуализацией живых клеток относительно легким10,11. Многие приложения FRET, подобные этим, подробно обсуждаются в этом виртуальном выпуске.

В этом исследовании мы уделяем особое внимание использованию измерений FRET для получения значений расстояния для определения структурных деталей. Ранее измерения FRET эффективно использовались для определения конформации молекул ДНК при связывании с белком 12,13,14, внутренней динамики белков и белковосвязывающих взаимодействий 15,16,17. Преимущества этого метода заключаются в возможности определения гибких и динамичных конструктивных элементов в растворе с относительно небольшим количеством материала. Примечательно, что этот метод особенно эффективен при использовании в сочетании с существующей структурной информацией и не может быть использован в качестве средства определения 3D-структуры. Метод обеспечивает наилучшее понимание и уточнение структуры, если работа основывается на существующей структурной информации, часто в сочетании с вычислительным моделированием18,19. Здесь описано использование расстояний, полученных из стационарных и разрешенных по времени измерений FRET, для картирования сайта связывания, местоположение которого не было известно, на существующей кристаллографической структуре комплекса SecA-SecYEG основных белков в общем секреторном пути3.

Общий секреторный путь, высококонсервативная система от прокариот до эукариот и архей, опосредует транспорт белков либо через мембрану, либо в мембрану к их функциональному расположению в клетке. Для грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, организма, используемого в нашем исследовании, белки вставляются или перемещаются через внутреннюю мембрану в периплазму. Бактериальный комплекс каналов SecY (называемый транслоконом) координируется с другими белками для перемещения вновь синтезированного белка, который направляется к его правильному расположению в клетке через сигнальную последовательность, обычно расположенную на N-конце20,21. Для белков, связанных с периплазмой, белок АТФазы SecA связывается с выходным туннелем рибосомы и с препротеином после того, как приблизительно 100 остатков были переведены22. Наряду с белком шаперона SecB он поддерживает препротеин в развернутом состоянии. SecA связывается с транслоконом SecYEG и через многие циклы гидролиза АТФ облегчает транспорт белка через мембрану23,24.

SecA представляет собой многодоменный белок, который существует в цитозольной и мембраносвязанной формах. Гомодимерный белок в цитозоле, SecA состоит из препротеин-связывающего или сшивающего домена25, двух нуклеотид-связывающих доменов, спирального домена крыла, спирального каркасного домена и двух спиральных пальцев (THF)26,27,28,29 (Рисунок 1). В предыдущих кристаллографических исследованиях комплекса SecA-SecYEG расположение ТГФ предполагало, что он активно участвовал в транслокации белка, а последующие эксперименты по сшиванию с сигнальным пептидом дополнительно установили значение этой области в транслокации белка 30,31. Предыдущие исследования с использованием методологии картирования FRET показали, что экзогенные сигнальные пептиды связываются с этой областью SecA 2,32. Чтобы полностью понять конформацию и местоположение сигнальной последовательности и ранней зрелой области препротеина до вставки в канал SecYEG, была создана белковая химера, в которой сигнальная последовательность и остатки ранней зрелой области были прикреплены к SecA через линкер Ser-Gly (рисунок 1). Используя эту биологически жизнеспособную конструкцию, было дополнительно продемонстрировано, что сигнальная последовательность и ранняя зрелая область препротеина связываются с ТГФ параллельным образом2. Впоследствии методология картирования FRET была использована для выяснения конформации и местоположения последовательности сигналов и ранней зрелой области в присутствии SecYEG, как описано ниже3.

Знание 3-D структуры комплекса SecA-SecYEG 33,34,35 и возможного местоположения места связывания позволило нам разумно разместить донорско-акцепторные этикетки в местах, где пересечение отдельных расстояний FRET определяет местоположение места связывания. Эти измерения картирования FRET показали, что последовательность сигналов и ранняя зрелая область препротеина образуют шпильку с наконечником, расположенным в устье канала SecYEG, демонстрируя, что структура шпильки шаблонизируется до вставки канала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подбор сайтов маркировки

  1. Определите по меньшей мере три потенциальных участка маркировки для триангуляции предполагаемого сайта связывания на существующих белковых структурах. В этом случае были идентифицированы SecA, SecYEG и препротеин, присоединенный к SecA посредством генетического слияния2.
    1. Выберите сайты маркировки в пределах 25-75 Å от предполагаемого сайта связывания и в относительно статических областях белка расстояние будет определять конкретную пару красителей FRET, которая будет использоваться36. Расположите сайты маркировки в белковых областях, которые относительно отличаются друг от друга, поэтому сайты описывают вершины треугольника с предполагаемым сайтом связывания, расположенным в центре (рисунок 1A-D).
    2. Вводить или идентифицировать остатки цистеина (Cys) в местах маркировки, представляющих интерес в белке, который не имеет других остатков Cys, для повышения эффективности маркировки конкретного участка37,38.
    3. Вводят ненатуральные аминокислоты, например,-азидофенилаланин для маркировки с помощью щелочной химии, чтобы эффективно маркировать один белок в двух различных положениях с разными красителями39,40.
    4. Протестируйте мутантов Cys на потерю функции. Проверьте активность мутанта без Cys и неестественного аминокислотного мутанта с помощью соответствующего анализа активности. В этом случае активность была проверена с помощью анализа роста, за которым последовал анализ in vitro малахитовой зеленой АТФазы 32,41,42

2. Маркировка белка

  1. Очистите интересующий белок или белки не менее 95% чистоты для точной маркировки. Очищайте белки SecA и SecYEG в соответствии с протоколами, описанными в ссылке3. Убедитесь, что у вас есть по крайней мере 5 мкг очищенного белка для этого этапа, так как часть белка будет потеряна в процессе маркировки.
  2. Выберите два красителя для измерений FRET в зависимости от их значения R0 и прогнозируемых расстояний между маркированными участками. Оцените значения R0 и наблюдайте за перекрытием выбросов доноров и абсорбции акцепторов, используя информацию из базы данных флуоресцентных белков, которая также дает спектры для часто используемых красителей (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    ПРИМЕЧАНИЕ: R0 определяется как расстояние, на котором эффективность передачи составляет 50% для данной пары красителей. Для картографических экспериментов прогнозируемые расстояния должны быть близки к значению R0 пары красителей, чтобы обеспечить точное измерение расстояний.
  3. Обозначьте позиции, указанные на этапе 1.1.1. с парой донор-акцептор краситель.
    1. Маркируют белок в соответствии с инструкциями производителя с особым вниманием к таким параметрам, как оптимальная концентрация белка, температура, рН, продолжительность времени и буфер для конкретных используемых красителей43,44.
    2. Готовят белок в концентрации 1-2 мг/мл или приблизительно 10 мкМ в буфере 25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 25 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА (TKE). Растворить краситель в диметилформамиде (ДМФ) или диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации 1 мМ. Добавьте краситель по каплям в раствор во время перемешивания, чтобы достичь красителя: молярного соотношения белка 5:1 (краситель 50 мкМ: белок 10 мкМ).
    3. Дайте реакции продолжаться в течение 4 ч при комнатной температуре (RT) в стеклянном флаконе с мягким раскачиванием или на ночь при 4 °C. Остановите реакцию, добавив β-меркаптоэтанол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если белок не совместим с буфером Tris, можно использовать фосфатные или HEPES буферы. Поддерживать pH в диапазоне 7,0-7,5. Если белок имеет дисульфидные связи, добавьте восстановитель, такой как DTT или TCEP, перед маркировкой. Удалите DTT путем диализа или гелевой фильтрации перед добавлением красителя.
  4. Для точных измерений FRET удалите свободный краситель с помощью центробежного концентратора с соответствующей отсечкой молекулярной массы (MWCO), чтобы позволить свободному красителю протекать, сохраняя при этом меченый белок.
    1. Подготовьте мембрану концентратора, поместив ~ 1 мл воды в верхнюю часть концентратора объемом 3 мл, а затем центрифугируйте воду через мембрану (не менее 10 мин при 4 300 х г).
    2. Удаляют свободный краситель путем центрифугирования меченого образца в концентраторе (20 мин при 4 300 х г). Повторите 3-4 раза и утилизируйте поток.
    3. Проверьте эффективность маркировки меченого белка с помощью абсорбционной спектроскопии UV-Vis.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения FRET требуют эффективности маркировки 50% или выше. Более низкая эффективность маркировки снижает сигнал FRET и может привести к неточностям в измерении.
    4. Получают UV-Vis спектр меченого белка с диапазоном от 250-700 нм для наблюдения как за полосой поглощения белка, так и за полосой максимального поглощения красителя. Измеряют абсорбцию на пике поглощения красителя и при 280 нм для белка.
    5. Определите концентрацию белка и скорректируйте любые вклады красителя, используя поправочный коэффициент CF и следующие уравнения45,46:
      Equation 1
      где C - концентрация белка (M), A280 - абсорбция образца при 280 нм, Amax - абсорбция на максимуме поглощения красителя, ε белок - коэффициент вымирания для белка при 280 нм, а CF - поправочный коэффициент, A'280/A'max, где A'280 - абсорбция при 280 нм, а A'max - абсорбция на пиковом максимуме только для красителя.
    6. Определите эффективность маркировки с помощью следующего уравнения:
      Equation 2
      где εкраситель - коэффициент молярного вымирания красителя, С - концентрация белка, определенная на этапе 2.4.5, а Е - эффективность маркировки. Повторяйте шаг 2.4.2 до тех пор, пока значение эффективности маркировки не стабилизируется и не составит менее 100%.

3. Определите значения R 0

  1. Измерьте значения R0 in situ. Подготовьте два образца белка в той же концентрации общего белка, 4 мкМ, один с белком, помеченным только донорским красителем, и один с белком, помеченным только акцепторным красителем. Для SecA концентрация белка 4 мкМ мономера SecA хорошо работает для этих измерений.
    1. Подготовьте объем образца 2,5 мл для кюветы 1 см x 1 см, 600 мкл для кюветы 5 мм x 5 мм или 200 мкл для кюветы 3 мм x 3 мм.
  2. Включите флуорометр и откройте программу спектрального сбора и анализа в флуоресцентном программном обеспечении при использовании спектрофлуфлюорометра. Нажмите на красный M , чтобы подключить компьютер к прибору (рисунок 2A) и выберите Спектры излучения.
    1. Введите параметры сканирования, такие как длина волны возбуждения, диапазон сканирования излучения, температура и положение устройства смены образцов с помощью пункта меню Collect Experiment (рисунок 2B).
    2. Нажмите на RTC и оптимизируйте настройки прибора (например, спектральные щели) путем мониторинга флуоресцентного излучения на пике с использованием длины волны возбуждения, установленной на максимуме поглощения красителя. Для SecA установите следующие настройки: полоса пропускания равна 1 нм; отверстия возбуждения и излучения составляют 1 и 1,5 мм соответственно, с температурой 25 °C и скоростью перемешивания при 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте количество секунд (cps) производительности прибора (обычно 2 x 106 cps).
  3. Поместите помеченный донором образец белка в держатель образца и нажмите кнопку Выполнить , чтобы создать сканирование выбросов белка, помеченного только донорским красителем (только донорский белок), возбуждая образец на максимуме поглощения красителя (например, 488 нм для AF488) и сканируя пик выбросов (505-750 нм для донорского белка SecA, помеченного AF488).
  4. Установите базовый уровень для сканирования, расширив сканирование на 25-50 нм после конца пика. Измерьте квантовый выход донорского белка, выполнив измерения абсорбции и флуоресценции на образцах различных концентраций, как описано47. Поддерживайте те же настройки щели для этих измерений.
    1. Используйте свободный донорский краситель в качестве эталона для квантового выхода. Получите по меньшей мере четыре измерения только донорского белка и свободного красителя в разных концентрациях для точного определения.
    2. График интенсивности флуоресценции или интегрированной области по сравнению с абсорбцией для белка, предназначенного только для донора, и свободного красителя или эталона. Определите склоны для донорского белка (SlopeD) и эталонного (SlopeR).
    3. Квантовый выход (Φ) рассчитывается по следующему уравнению:
      Equation 3
      здесь ΦD - квантовый выход только донорского белка, ΦR - квантовый выход свободного красителя (это обычно можно получить у производителя), SlopeD и SlopeR - наклоны, определенные на шаге 3.4.2 для донорского только белка и эталона, соответственно и ηD и ηR представляют собой показатель преломления донорского белка и нереференсных растворов красителей, соответственно 47.
  5. Получите спектр поглощения вашего акцепторного белка, используя клетку длиной 1 см. Сгенерируйте спектр коэффициента вымирания вашего белка, предназначенного только для акцептора, разделив спектр поглощения на концентрацию красителя.
  6. Сгенерируйте интеграл спектрального перекрытия, J (λ) с помощью программы графического анализа. Для этого процесса также может использоваться стандартная программа для работы с рабочими листами (например, электронная таблица).
    1. Умножьте спектр флуоресцентного излучения донорского белка (этап 3.4) на спектр коэффициента вымирания белка только акцептора, чтобы получить спектр перекрытия.
    2. Умножьте результирующий спектр перекрытия на λ4.
    3. Определите площадь под кривой путем интеграции области перекрытия. Область перекрытия определяется как область, где спектр донорского излучения, умноженный на спектр коэффициента вымирания акцептора, дает положительные значения. Интеграл спектрального перекрытия определяется как:
      Equation 4
      где FD (λ) - спектр излучения только донорского белка (полученного на стадии 3.4), а εA(λ) - спектр коэффициента вымирания белка, содержащего только акцептор, и имеет единицы M-1 см-1 (полученные на стадии 3.5). Полученный интеграл спектрального перекрытия должен иметь единицы М-1 см-1нм4.
    4. Нормализуйте интеграл спектрального перекрытия. Разделите интеграл перекрытия на интегрированную область спектра только донорского белка в том же спектральном диапазоне:
      Equation 5
    5. Вычислите значение R0 в Å, используя следующее уравнение:
      Equation 6
      где κ2 - коэффициент ориентации, обычно принимаемый как 2/3 для свободно вращающихся красителей, η - показатель преломления и может быть аппроксимирован как 1,33 для разбавленных водных растворов, QD - квантовый выход донора (шаг 3.4) и J(λ) - спектральный интеграл перекрытия, как определено в шаге 3.6.35. ПРИМЕЧАНИЕ: Если красители не вращаются свободно, могут быть введены поправки, описанные Ивановым 48 и реализованные Оклером49 иЧжаном 2,3.

4. Выполнение спектральных измерений FRET

  1. Подготовка образцов только донорского белка, только акцепторного белка и донорско-акцепторного белка в одной и той же концентрации; рекомендуется концентрация 4 мкМ. Используйте 200 мкл раствора, если используется кювета 3 мм x 3 мм, 600 мкл, если используется кювета 5 мм x 5 мм, или 2,5 мл, если используется кювета 1 см x 1 см.
    1. Подготовьте образец донорско-акцепторного белка, используя равные молярные количества только донора и только акцепторного белка.
    2. Поддерживать одинаковое количество меченого образца только в контрольных донорских и только акцепторных образцах белка путем введения немаркированного белка в равном молярном количестве либо в донорские, либо только акцепторные образцы. Например, для растворов одинаковой концентрации каждый образец FRET, предназначенный только для донора, будет содержать 100 мкл донорского белка и 100 мкл немаркированного белка на объем 200 мкл.
  2. Генерация флуоресцентных спектров излучения только донора, только акцептора и донора-акцептора образцов. Оптимизируйте сигнал, как описано в шаге 3.2. После оптимизации поддерживайте одинаковые настройки для всех образцов.
    1. Получите сканирование только для доноров, как описано в шаге 3.3. Возбуждайте раствор на максимуме поглощения донорского красителя и сканируйте над донором и (ожидаемым) пиком излучения акцептора.
    2. Либо замените образец на белок, поддерживающий только акцептор, либо измените положение устройства смены образца на кювету, содержащую белок, содержащий только акцепторный белок.
    3. Получите сканирование излучения белка, меченого только акцепторным красителем (только акцепторным белком), используя те же настройки, что и на этапе 4.2.1. Возбуждайте образец на длине волны возбуждения донора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот спектр обеспечивает коррекцию количества акцептора, возбуждаемого на длине волны донора (FA на шаге 5.1.2)
    4. Замените образец на образец донорско-акцепторного белка или измените положение сменщика образца на кювету, содержащую меченый донор-акцептор белка.
    5. Получить сканирование излучения образца донорно-акцепторного белка с использованием тех же настроек, что и на этапах 4.2.1 и 4.2.3.
    6. Для всех спектров исправьте фоновую флуоресценцию, вычитая количество фона, измеренное в конце сканирования.
  3. Измерьте срок службы донора только донора и образцы донора-акцептора, подготовленные в соответствии с описанием, описанным в шаге 4.1.2. Используйте коррелированный по времени флуоресцентный прибор для подсчета одиночных фотонов, способный измерять и разрешать флуоресцентные распады в наносекундном (10-9 с) временном диапазоне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пар красителей FRET сопоставьте источник света возбуждения с максимальным поглощением донорского красителя.
    1. Включите прибор. Откройте программное обеспечение для сбора, используйте программное обеспечение управления прибором для сбора данных с помощью флуоресцентного спектрометра.
    2. Для получения выберите TCSPC Decay с временным диапазоном 55 нс, коэффициентом усиления 1 и 4096 каналов.
    3. Получите функцию отклика прибора (IRF) с помощью раствора немолочного сливочного или коммерческого раствора для рассеяния и контролируйте рассеяние при 490 нм. Отрегулируйте настройку щели и используйте фильтры нейтральной плотности по мере необходимости для поддержания достаточно низкой скорости подсчета, чтобы избежать нагромождения импульсов5. Нажмите кнопку Принять , а затем Запустить. Это положит начало приобретению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная скорость подсчета 4000 cps используется для частоты повторения 180 кГц.
    4. Собирайте IRF при 490 нм до тех пор, пока пиковый канал не достигнет максимум 20 000 отсчетов. Соберите IRF до и после измерения каждого флуоресцентного распада.
    5. Получение флуоресцентных распадов только донорских и донор-акцепторных образцов путем мониторинга флуоресцентного излучения на длине волны донорского излучения, 520 нм.
    6. Настройте параметры щели для максимальной скорости подсчета 4000 cps или меньше. Настройки щелей обычно составляют полосу пропускания 15-20 нм для образцов белка. Собирайте распад до тех пор, пока в пиковом канале не будет получено 20 000 отсчетов.
  4. Анализ распада или интенсивности флуоресценции (I) в зависимости от времени (t) для времени жизни флуоресценции (τ). Приведите распад к сумме экспоненциалов со следующим уравнением:
    Equation 7
    где αI — преэкспоненциальный множитель i-й компонента, а τI — время жизни. Припадок повторно конвуируется с IRF, чтобы соответствовать флуоресцентному распаду. Судите о качестве посадки по сниженным параметрам Χ2.

5. Анализ данных FRET

  1. Рассчитать эффективность FRET исходя из снижения донорской интенсивности донорско-акцепторной выборки относительно донора только с помощью следующего уравнения.
    Equation 8
    где FDA - интенсивность флуоресценции образца донора-акцептора, а FD - интенсивность флуоресценции образца только донора на пике донорской флуоресценции. Используйте интегрированные области пиков, если данные зашумлены.
    1. Корректируйте любые различия в маркировке между образцами только донора и образцами донора-акцептора. Рассчитайте корректировки на основе донорской степени маркировки следующим образом.
      Equation 9
      где fDA - эффективность маркировки доноров в образце донора-акцептора, а fD - эффективность маркировки в образце, предназначенном только для донора.
    2. С поправкой на любые вклады акцепторной флуоресценции в донор-возбужденный спектр путем вычитания только акцепторного белкового спектра (шаг 4.2) из донорско-акцепторного белкового спектра.
      Equation 14
    3. С поправкой на различия в эффективности маркировки акцепторного только белка относительно образца донор-акцепторного белка получается следующее уравнение для расчета эффективности:
      Equation 10
      где fA обозначает дробное количество маркировки акцептора. Это уравнение включает в себя все поправки, обусловленные маркировкой красителя и акцепторной флуоресценцией.
    4. Рассчитайте расстояния FRET от эффективности, используя следующее уравнение:
      Equation 11
      используя значение R0 , полученное на шаге 3.6.5.
    5. Расчет эффективности FRET с использованием сроков флуоресценции только донорских и донорско-акцепторных образцов, измеренных на этапе 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Используйте амплитудно-взвешенный срок службы для расчета эффективности FRET и сравнения с стационарными результатами5.
      Equation 13
    7. Рассчитайте расстояние, как показано на шаге 5.1.4, от эффективности, определяемой временем жизни флуоресценции. Сравните стационарные и разрешенные по времени значения эффективности и расстояний FRET и убедитесь, что они находятся в пределах погрешности друг друга.

6. Отображение расстояний

  1. Используйте вычисляемые расстояния для отображения сайта привязки на трехмерную структуру. Рассчитайте расстояния и погрешности для всех исследованных пар красителей и местоположений с использованием уравнения, приведенного на шаге 5.1.4, и значений R0 , полученных на этапе 3.6.5 для каждой пары FRET.
    1. Используйте 3D-графическую программу просмотра, такую как PyMOL50 , чтобы сопоставить расстояния со структурой (скрипт, приведенный в дополнительном файле). Команды из скрипта могут быть непосредственно введены в командное окно с соответствующей информацией о расстоянии.
    2. Сгенерируйте оболочку для каждого измеренного расстояния и связанной с ним погрешности (рисунок 3, рисунок 4, дополнительные рисунки 1-3).
    3. Нанесите на карту положение через пересечение различных раковин (дополнительные рисунки 1-3). Сайт связывания сигнального пептида был нанесен на карту через три различных места на SecA и SecYEG и четыре разных места на сигнальном пептиде (рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Это исследование было сосредоточено на определении местоположения сайта связывания препротеинов на SecA до введения препротеина в канал SecYEG. Чтобы отобразить место связывания, эксперименты FRET проводились между различными областями препротеина и тремя различными местами на белках SecA и SecYEG (рисунок 1A-D). По полученным расстояниям и трехмерным структурам SecA, SecYEG и препротеина прогнозировалось местоположение сайта связывания препротеинов. Вместо того, чтобы использовать три отдельных объекта (SecA, SecYEG и препротеин) для выполнения этих измерений, последовательность сигналов PhoA была присоединена к SecA посредством генетической модификации после включения линкера Gly-Ser 2,3. Для легкой маркировки красителями остатки Cys или янтарные мутации вводили в остатки 2, 22, 35 и 45 в препротеине PhoA (рисунок 1E).

Идентификация объектов и маркировка
Предполагаемый сайт связывания для последовательности сигналов был ранее идентифицирован с использованием аналогичных методов картирования FRET 2,32. Эти и другие исследования идентифицировали двухспиральный палец (THF) и препротеиновую сшивочную область как возможные сайты связывания сигнального пептида с предполагаемой ориентацией в параллельном положении с THF 33,51,52,53,54 (рисунок 1F). Таким образом, идентификация потенциальных сайтов маркировки на белках SecA и SecYEG была выполнена на основе местоположения предполагаемого сайта связывания в кристаллической структуре SecA и SecYEG (показан зеленым цветом на рисунке 1A-D). Три участка были выбраны для триангуляции положения предполагаемого сайта связывания, где по существу три участка образуют треугольник вокруг предполагаемого сайта связывания. Как показано на рисунке 1, три участка находились в пределах диапазона FRET связующего участка (50-70 Å). Была выбрана красильная пара Alexa Fluor 488 (AF488) и Alexa Fluor 647 (AF647), поскольку значение R0 55,7 Å36 хорошо соответствует ожидаемым расстояниям между маркированными участками и предполагаемым сайтом связывания, обеспечивающим точность измерений.

Три участка, выбранные для маркировки, SecA37, SecA321 и SecY292 (показаны как пурпурные, фиолетовые и голубые сферы на рисунке 1A-D), расположены по всему белковому комплексу, образуя треугольник вокруг предполагаемого сайта связывания. Три участка были отдельно мутированы в остатки Cys в мутанте без Cys, чтобы гарантировать, что только правильное положение было помечено 2,37. Для экспериментов SecY292 сайты препротеинов PhoA были помечены AF647, а остаток SecY 292 был помечен AF488 с использованием химии малеимида. В химерном белке сайты SecA37 и SecA321 были помечены AF647, а препротеин был помечен AF488. В химерном белке SecA-PhoA остатки 2, 22, 37 и 45 препротеинового сегмента PhoA были мутированы в янтарный кодон в отдельных белках. Мутации янтарного кодона позволили ввести неестественную аминокислоту,-азидофенилаланин, в те позиции, которые впоследствии были помечены AF488 с использованием химии кликов39,40. Каждая мутация генерировалась и маркировалась независимо, чтобы обеспечить правильную, дифференциальную маркировку белковых компонентов. Степень маркировки определялась для всех белков и, как правило, должна была составлять 50% или выше, чтобы продолжить работу с образцом.

Определение эффективности передачи и расстояний
Перед выполнением измерений переноса энергии были определены значения квантового выхода донора, интеграла перекрытия и R0 (этапы 3.4-3.6). Квантовый выход донора был измерен относительно красителя, флуоресцеина, который имеет квантовый выход 0,79 в 0,1 М NaOH47. Спектры поглощения и флуоресцентного излучения были получены при серии концентраций для получения линейного графика поглощения относительно интенсивности флуоресцентного излучения для определения квантового выхода. При этих измерениях крайне важно измерить поглощение в линейном диапазоне (0,1-1,0), и все измерения выбросов должны быть произведены с одинаковыми настройками щели. Поскольку эти значения используются для определения перекрывающихся интегралов и значений R0 , они должны измеряться в условиях FRET. Локальная среда белка оказывает глубокое влияние на эмиссию красителя, и, следовательно, донорские квантовые выходы должны быть измерены для каждого из исследованных участков. Отметим, что сайты на SecA и SecYEG влияют на значения R0 сильнее, чем сайты на PhoA части химеры. Для пар красителей с одним и тем же участком SecA или SecYEG значения R0 обычно находятся в пределах 5 Å друг от друга; в то время как значения R0 могут отличаться на целых 20 Å для двух различных местоположений SecA (остатки 37 против 321), что подчеркивает важность определения значений R0 для каждой пары красителей (таблица 1).

Расчет R0 предполагает, что донорские и акцепторные красители свободно вращаются, и степень, в которой красители не вращаются, способствует общей неопределенности в измерении. Чтобы надлежащим образом учесть относительное движение красителей и их ориентацию, измерения стационарной флуоресцентной анизотропии были выполнены на всех донорских и акцепторных красителях в различных положениях маркировки. Эти значения, которые находились в диапазоне 0,10-0,21, использовались для расчета погрешности, связанной с измерениями расстояния 2,3,48. Относительно высокие значения анизотропии, наблюдаемые как для донорских, так и для акцепторных красителей, соответствуют уменьшению вращения красителя, что несовместимо с предположением о свободном вращении. Отсутствие свободного вращения порождает погрешность 19%-25% в расчетах расстояния. Как показано в таблице 1, это привело к средней неопределенности в измеренных расстояниях не более ± 15 Å. При отображении расстояний FRET эти неопределенности в измерениях расстояний являются важным соображением, как обсуждается ниже.

Рассчитанное расстояние между парами донор-акцептор основано на соотношении между эффективностью и расстоянием, в котором более высокая эффективность свидетельствует о парах донор-акцептор, разделенных более коротким расстоянием. Для определения эффективности FRET на образцах, только донорских и донор-акцепторных образцах получают флуоресцентные спектры излучения, возбуждаемые на длине волны возбуждения донора (488 нм). Как правило, снижение интенсивности выбросов доноров означает наличие передачи энергии (этап 5.1). На рисунке 1G изображены донорно-акцепторные спектры для остатка SecA 37 с остатком 2 или 22 химеры PhoA. Остаток SecA37 маркируется AF647 или акцепторным красителем, а остатки PhoA маркируются AF488 или донорским красителем. В любом положении флуоресценция донора снижается, и небольшое увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции можно увидеть в образцах донор-акцептор. Поскольку возбуждение осуществляется на длине волны возбуждения донора 488 нм, которая непосредственно не возбуждает акцептор, любая наблюдаемая флуоресценция акцептора является результатом передачи энергии. Таким образом, снижение донорской интенсивности и сопутствующее увеличение интенсивности акцепторов является результатом передачи энергии между двумя красителями. Примечательно, что интенсивность донорской флуоресценции выше для положения PhoA2 (синий) относительно положения PhoA22 (желтый) в присутствии акцептора. Эта относительная разница в снижении интенсивности донорства указывает на то, что передача энергии между остатком PhoA2 и остатком SecA37 слабее, чем передача между остатками PhoA22 и SecA37, что означает, что остаток PhoA2 расположен дальше от SecA37, чем PhoA22. Расстояния определяются на основе соотношения между эффективностью и значениямиR0 (этап 5.1.4).

Поскольку стационарные флуоресцентные измерения могут представлять собой в среднем два или более расстояний, мы также выполнили измерения флуоресценции с временным разрешением. Для этих экспериментов срок службы донорского красителя измеряется при наличии и отсутствии акцептора (рисунок 1G). Если бы существовали два различных процесса передачи энергии, способствующих измеренной стационарной флуоресцентной эффективности, они наблюдались бы как незаметные сроки жизни, при условии, что они разрешаемы в пределах временного разрешения прибора. Для повышения способности разрешать сроки жизни на пике должно быть собрано 10 000 или более отсчетов; однако пиковая высота или количество пиковых каналов должны быть сбалансированы со временем получения и потенциальным повреждением образца. Измерения с временным разрешением дали один срок службы для каждой пары донор-акцептор в соответствии только с одной ориентацией или расстоянием между красителями. Мы отмечаем, что небольшие различия в расстоянии, наблюдаемые в областях, выявленных нашей техникой картирования FRET, не приведут к разрешимым срокам жизни в нашей системе. Кроме того, эффективность, определенная измерениями флуоресценции с временным разрешением, была в хорошем согласии с эффективностью, определенной на основе стационарных измерений, что обеспечивает дополнительную поддержку того, что измеренная эффективность возникает только на одном расстоянии между парами красителей3.

Отображение расстояний FRET на 3-мерную структуру
Измерения резонансной передачи энергии дают достаточную информацию о расстоянии для идентификации места связывания и ориентации последовательности сигналов на SecA. Три местоположения на SecA и SecYEG вместе с четырьмя позициями в области PhoA химеры SecA-PhoA обеспечивают 12 различных расстояний, используемых для отображения места привязки (таблица 1). Двенадцать расстояний были нанесены на трехмерную рентгеновскую сокристалльную структуру комплекса Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) для идентификации места связывания сигнальной последовательности33. Структура комплекса SecA-SecYEG аналогична структуре, наблюдаемой у E. coli, о чем свидетельствует исследование55 фотосхлесковых связей in vivo.

Мы используем начальные (PhoA2) и конечные (PhoA22) остатки сигнальной последовательности PhoA в химере SecA-PhoA, чтобы проиллюстрировать, как были идентифицированы местоположения остатков на комплексе SecA-SecYEG. Поскольку передача энергии может происходить во всех направлениях, расстояния FRET и связанные с ними ошибки описывают сферическую оболочку, причем одно из мест красителя из пары донор-акцептор обозначено как центр. В этом исследовании остатки SecA37, SecA321 и SecY292 образуют центры трех сферических оболочек, которые описывают местоположение остатка PhoA2 сигнальной последовательности. Визуализация перекрывающихся областей, возникающих из трех отдельных местоположений: SecA37 (пурпурный), SecA321 (фиолетовый) и SecY292 (голубой), показана на рисунке 3. Только часть каждой оболочки FRET пересекается со структурой белка, и остатки и основа, которые попадают в эту оболочку, выделяются. Таким образом, белковые области в оболочке, определенные расстоянием SecA37-PhoA2, показаны пурпурным цветом (рисунок 3A,E), в то время как области, определенные оболочками SecA321-PhoA2 и SecY292-PhoA2, показаны фиолетовым (рисунок 3B,F) и голубым (рисунок 3C,G) соответственно. Предполагаемый сайт связывания, состоящий в основном из двухспирального пальца, показан зеленым цветом.

Как показано на рисунке 3, каждая из этих оболочек FRET определяет относительно большой участок белкового комплекса. Для всех трех мест оболочка FRET пересекается с предполагаемым местом связывания; однако для остатка SecA321, например, пересекаемая область меньше и лежит к концам пальцев со значительным перекрытием со спиральным доменом каркаса. Пересечение или общая площадь всех трех оболочек FRET (рисунок 3D, H) определяет местоположение остатка PhoA2. Эта область значительно меньше, чем каждая оболочка FRET, и включает в себя только небольшую часть THF с большим вкладом от спирального каркаса. Скрипты, используемые для генерации оболочек FRET и пересекающихся областей для программы молекулярной визуализации PyMOL, приведены в Дополнительной информации. Части оболочек визуализируются в виде розовых точек на комплексе SecA-SecYEG на дополнительных рисунках 1-3.

Аналогичная стратегия была использована для определения местоположения остатка PhoA22. Оболочки FRET, определенные расстояниями PheA22 FRET (рисунок 4A-C,E-G), описывают меньшую площадь относительно остатка PhoA2 (рисунок 4D,H против рисунка 3D,H). Мы интерпретируем это различие, чтобы предположить, что остаток PhoA2 и связанная с ним область являются более гибкими и лабильными, чем PhoA22. Примечательно, что область, приписываемая остатку PhoA22, расположена ближе к кончику ТГФ и устью канала SecYEG, причем области SecY идентифицированы в общей зоне (рисунок 3D, H). Все три пары красителей идентифицируют области вместе с предполагаемым местом связывания; однако пересекающиеся общие области центрируют местоположение PhoA22 (рисунок 4D, H) на противоположном конце THF относительно местоположения PhoA2 (рисунок 3D, H). Эти результаты свидетельствуют о том, что сигнальная последовательность препротеина, которая простирается от остатков 2-22, лежит вдоль ТГФ в относительно неструктурированном состоянии. Этот результат согласуется с более ранними исследованиями, предполагающими, что сигнальная последовательность связывается с белком вдоль ТГФ в расширенном состоянии и что С-концевой конец SecA в кристаллической структуре B. subtilis по существу моделирует структуру сигнального пептида и занимает то же место (показано красным рисунком 1F)2,26 . Мы использовали аналогичный подход для идентификации двух мест в ранней зрелой области (остатки 37 и 45) препротеиновой химеры SecA-PhoA для дальнейшего определения связывания и ориентации последовательности сигналов и ранней зрелой области, как обсуждается ниже. В других исследованиях расстояния FRET эффективно использовались для уточнения существующей структуры или молекулярной динамики модели 18,19,56; мы не смогли этого сделать, так как не существует структуры для последовательности сигналов, привязанной к SecA.  

Figure 1
Рисунок 1: Маркировка участков в комплексе SecA-SecYEG с репрезентативными спектрами FRET. (A-D) Четыре различных вида кокристаллической структуры SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33, в которых сайты маркировки SecA37, SecA321 и SecY292 показаны в виде пурпурных, фиолетовых и голубых сфер соответственно. A-C - вид сбоку на комплекс, а D - вид сверху. SecA показан светло-серым цветом, SecYEG показан темно-серым, а предполагаемый сайт связывания, THF, показан зеленым. (E) Схема конструкции химеры SecA-PhoA, которая соединяет белок SecA с препротеином PhoA через линкер Ser-Gly (не нарисованный в масштабе). Участки маркировки на части химеры PhoA даны синим, зеленым, желтым и красным цветом, что соответствует остаткам 2, 22, 37 и 45. (F) Ленточная диаграмма кристаллической структуры белка B. subtilis SecA (PDBID: 1M6N), окрашенная доменом, где нуклеотидсвязывающие домены 1 и 2 показаны синим и светло-синим цветом, соответственно, домен сшивки препротеинов показан золотом, центральная спираль зеленого цвета, палец с двумя спиралями в голубом, спиральный домен крыла в темно-зеленом и C-концевой линкер красным26 . Неструктурированный С-конец служит моделью связанного сигнального пептида PhoA на основе предыдущего картографического исследования FRET2. (G) Стационарные флуоресцентные спектры только донорских и донор-акцепторных образцов пары SecA37-AF647 и PhoA2-AF488 FRET и пары SecA37-AF647 и PhoA22-AF488 FRET. Снижение интенсивности донорства для образца донор-акцептор свидетельствует о передаче энергии. Большая передача энергии происходит от PhoA22 относительно сайта PhoA2 на основе снижения интенсивности доноров. (H) Спектры распада только флуоресцентного донора с временным разрешением (пурпурный) и донор-акцептор (светло-пурпурный) пары SecA37-AF647 и PhoA22-AF488 FRET. Функция отклика прибора показана серым цветом. Донор-акцепторный комплекс дает более короткий распад и, следовательно, более быстрый срок службы, соответствующий передаче энергии. Все молекулярные структуры были сгенерированы с помощью указанного PDB-файла и PyMOL50. Рисунок 1E-H был изменен по сравнению с Zhang et al.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Пользовательский интерфейс программы FluorEssence. (A) Открывающееся окно показано с кругом вокруг красного M. Это необходимо щелкнуть, чтобы подключить программу к флуорометру. (B) Окно настройки эксперимента иллюстрирует различные области (моно, детекторы, аксессуары), где вводятся соответствующие параметры сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Расстояние до ладовых оболочек, определяемое для положения SecA-PhoA2. Оболочки расстояний FRET, построенные из расстояний FRET и связанных с ними неопределенностей (таблица 1), изображены на комплексе SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (А-С) Фретовые оболочки расстояния для местоположения PhoA2 построены с SecA37 (пурпурный), SecA321 (фиолетовый) и SecY292 (голубой) соответственно в центральном положении. Раковины окрашены в соответствии с центральным остатком. (D) Пересечение трех оболочек FRET определяет местоположение PhoA2, показанного синим цветом. (Э-Н) Виды поворачиваются примерно на 180° от A-D. Все молекулярные структуры были сгенерированы с помощью указанного PDB-файла и PyMOL50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Расстояние до ЛАДовых оболочек, определенных для положения SecA-PhoA22. Оболочки расстояний FRET, построенные из расстояний FRET и связанных с ними неопределенностей (таблица 1), изображены на комплексе SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (А-С) Фретовые дистанционные оболочки для местоположения PhoA22 построены с SecA37 (пурпурный), SecA321 (фиолетовый) и SecY292 (голубой) соответственно в центральном положении. Раковины окрашены в соответствии с центральным остатком. (D) Пересечение трех корпусов FRET определяет местоположение PhoA22, показанного желтым цветом. (Э-Н) Виды поворачиваются примерно на 180° от A-D. Все молекулярные структуры были сгенерированы с помощью указанного PDB-файла и PyMOL50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Отображенные FRET местоположения сокристалльной структуры PhoA2, PhoA22, PhoA37 и PhoA45, проецируемые на сокристалльную структуру B. subtilis SecA-Geobacillus thermodenitrificans SecYE (PDBID: 5EUL). (A) Окраска SecA-SecYE, как показано на рисунке 1. Пептидный субстрат OmpA, вставленный в конце ТГФ, показан розовым цветом. Области, нанесенные на карту FRET, были сгенерированы в присутствии ATP-γS, причем PhoA2 показан синим, PhoA22 - зеленым, PhoA37 - желтым и PhoA45 - красным. Области перекрытия показаны оливковым (PhoA22 и PhoA37) и оранжевым (PhoA37 и PhoA45). Пептидный субстрат (остатки 749-791, голубой) вырезали из исходной структуры и смоделировали в предполагаемую область связывания без каких-либо изменений в структуре (обведены красным цветом). (B) Увеличенный вид смоделированного пептидного субстрата. Остатки 2 (Lys), 22 (Tyr) и 37 (Gly) пептидного субстрата OmpA изображены в виде палочки в синем, зеленом и желтом цветах соответственно. Эти остатки в смоделированных пептидах демонстрируют отличное соответствие с предсказанными местами отображения FRET. Для ясности нанотело в исходной структуре было опущено. Эта цифра была изменена по сравнению с Zhang et al.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

маркированный сайт на комплексе SecA-PhoA-SecYEG Маркированный сайт на пептидной части PhoA Химеры SecA-PhoA
ФоА2-АФ488 ФоА22-АФ488 ФоА37-АФ488 ФоА45-АФ488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
Эффективность ФРЕТа 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
расстояние 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
Эффективность ФРЕТа 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
расстояние 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
ФоА2-АФ647 ФоА22-АФ647 ФоА37-АФ647 ФоА45-АФ647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
Эффективность ФРЕТа 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
расстояние 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
адаптировано из ссылки 3.
Значения R0, приведенные в ангстремах, были рассчитаны так, как описано в тексте
Эффективность FRET была рассчитана на основе снижения интенсивности флуоресценции донора в присутствии акцептора, как описано. Погрешность сообщается как SD из трех независимых измерений.
Расстояния донор-акцептор (R) приведены в ангстремах и рассчитаны так, как описано в тексте. Сообщенная ошибка является результатом рассмотрения экспериментальной ошибки и ошибки, возникающей в результате ориентации красителей.  Ориентация красителя оценивается по стационарной флуоресцентной анизотропии

Таблица 1: Эффективность передачи и расстояния, определенные для комплекса SecA-PhoA-SecYEG. Эффективность FRET, расстояния и значения R0 приведены для 12 расстояний, используемых для отображения сайта связывания препротеинов.

Дополнительный рисунок 1: Оболочка расстояния FRET, показанная розовыми точками, определена для остатка SecA37 и остатка PhoA 37 на комплексе SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A показан светло-серым, SecYEG - темно-серым, а остаток SecA37 - пурпурным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Оболочка расстояния FRET, показанная розовыми точками, определена для остатка SecA321 и остатка PhoA 37 на комплексе SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A показан светло-серым, SecYEG показан темно-серым, а остаток SecA321 показан фиолетовым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Оболочка расстояния ЛАД, показанная розовыми точками, определена для остатка SecY292 и остатка PhoA 37 на комплексе SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A показан светло-серым цветом, SecYEG показан темно-серым, а остаток SecY292 показан голубым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Используя методологию картирования FRET, мы идентифицировали сайт связывания сигнальной последовательности на белке SecA. Важно отметить, что наличие 3-D кристаллической структуры комплекса значительно облегчило наше исследование. Сила этой методологии картографирования заключается в способности использовать существующую структуру для определения мест для маркировки. Эта методология не может быть использована для определения 3D-структуры; однако определение структурных элементов56, уточнение существующей структуры49, определение местоположения сайта связывания 2,32 или выяснение динамического движения57 являются возможными приложениями этого метода.

В комплексе SecYEG-SecA-PhoA три участка маркировки образуют треугольник вокруг предполагаемого сайта связывания (рисунок 1). Использование множественных измерений расстояния от вершин этого треугольника до одного и того же остатка уточняет информацию о местоположении, аналогичную методам GPS-навигации. Три участка, SecA37, SecA341 и SecY292, были идентифицированы на SecA и SecY вместе с четырьмя сайтами: PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 в последовательности сигналов и ранней зрелой области препротеина, чтобы дать в общей сложности 12 расстояний для отображения местоположения сигнального пептида (таблица 1). Важно отметить, что для повышения точности измерений расстояния сайты маркировки должны быть расположены в относительно статических областях белка, таких как вторичные элементы структуры, а не петли. Кроме того, участки также должны находиться в местах, которые относительно доступны для растворителей для удобства и повышения эффективности маркировки. В комплексе SecA-PhoA-SecYEG выполнение измерений расстояния от участков треугольника или вершин до остатков в связующей подложке было достаточным для размещения остатков в связующей подложке на относительно небольшой площади (рисунок 3D, H и рисунок 4D, H). Идентификация пересекающейся области по множественным измерениям расстояния значительно улучшает местоположение по сравнению с измерением одного расстояния, как показано на рисунке 3 и рисунке 4. Таким образом, при использовании данного метода настоятельно рекомендуется измерение нескольких расстояний. Хотя этот метод может идентифицировать области молекул, участвующих в связывании, например, он не дает точной структурной информации; такую информацию лучше всего получать из других структурных методов, таких как рентген, ЯМР и крио-ЭМ. Расстояния FRET могут быть использованы для эффективного уточнения существующей структуры 18,19 или модели, в данном случае, что было невозможно, поскольку не существует модели последовательности сигналов, связанной с SecA.

Для обеспечения того, чтобы маркировка красителей происходила только в желаемых местах, а измерения расстояния FRET были точными, предпочтительно использовать мутагенез для маркировки. Генерация мутанта без Cys требует относительно консервативной мутации остатков Cys в Ser или аналогичных остатков в белке дикого типа с использованием методов мутагенеза, направленных на сайт. В текущем исследовании мутации Cys были введены в версии SecA и SecYEG без Cys для маркировки37. Активность мутантного белка была подтверждена с помощью анализа роста, за которым последовал анализ in vitro малахитовой зеленой АТФазы41,42. Соответствующие анализы активности зависят от функции белка, например, для ДНК-связывающих белков, днк-связывающий анализ будет подходящим58. Неспособность обеспечить маркировку только в одном месте может привести к маркировке более чем одного участка одним и тем же красителем, что значительно усложняет определение расстояния. Таким образом, введение второй метки на тот же белок может быть сделано путем включения неестественной аминокислоты путем сайт-направленного мутагенеза. Мы использовали эту методологию для маркировки химеры SecA-PhoA в местах, отличных от остатков Cys, путем введения неестественной аминокислоты,-азидофенилаланина и маркировки с помощью химии щелчка39,40.

Дополнительным важным соображением этого метода является выбор используемых красителей и связанное с ними значениеR0 . После идентификации потенциальных мест маркировки расстояния, подлежащие измерению, могут быть оценены по 3D-структуре. С помощью этой информации исследователи могут выбирать пары красителей со значениями R0 , которые охватывают желаемый диапазон ожидаемых расстояний. Например, пара красителей AF488-AF647 имеет расчетный R0 55,7 Å, что обеспечивает хороший диапазон для маркировки участков, расположенных примерно на расстоянии 40-75 Å от предполагаемого места связывания. Хотя значения R0 , рассчитанные на этапе 2.2, полезны для выбора пары красителей для использования в вашей системе, прикрепление красителей к белку может значительно изменить их свойства. Для большей точности значенияR0 должны быть рассчитаны на основе экспериментов in situ , проведенных с меченым белком (этапы 3.1 - 3.6.5).

Измерение эффективности переноса может осуществляться либо путем мониторинга стационарного флуоресцентного излучения и наблюдения либо за уменьшением выбросов доноров, либо за увеличением выбросов акцепторов. Хотя наблюдение обоих эффектов желательно, эффективность может быть рассчитана из любого из них, как описано 5,8. Эффективность также может быть рассчитана на основе уменьшения срока службы донора в образце донора-акцептора по сравнению с образцом, предназначенным только для донора. Рекомендуется определение эффективности более чем одним методом, в частности использование методов с временным разрешением для установления относительной однородности измеряемой эффективности.

Метод картирования также позволил определить относительную ориентацию последовательности сигналов и ранних зрелых областей препротеина PhoA относительно SecA и предполагаемого сайта связывания. Рентгеновская кристаллическая структура SecA-SecYEG и последующее исследование крио-ЭМ обеспечили ясность в отношении структуры последовательности сигналов и ранней зрелой области препротеина по отношению к каналу и SecA34,35. В рентгеновской структуре остатки 1-41 препротеина OmpA были прикреплены к кончику пальца с двумя спиралями и визуализированы в структуре шпильки в канале (показан розовым цветом, рисунок 5). Местоположения четырех остатков PhoA в химере SecA-PhoA были нанесены на эту структуру с использованием того же протокола, что и описанный выше. Как показано на рисунке 5, расположение остатков PhoA37 и PhoA45 (желтый, оранжевый, красный) находится между PhoA2 и PhoA22, а PhoA45 ближе к PhoA2. Эти результаты, особенно местоположение PhoA45, предполагали, что препротеин PhoA образует структуру шпильки.

Для дальнейшей проверки нашего сайта связывания, идентифицированного FRET, мы провели сравнение наших нанесенных на карту местоположений с препротеином OmpA, путем исключения структуры препротеина 41 остатка из канала и моделирования его в областях, определенных картированием FRET (рисунок 5, голубой). Без какого-либо изменения структуры рентгеновского излучения препротеина мы обнаруживаем, что местоположения остатков 2, 22 и 37 (показанные синим, зеленым и желтым цветом) на иссеченной структуре фрагмента препротеина OmpA удивительно хорошо согласуются с картографированными местоположениями FRET (рисунок 5B) и предполагают, что шпилька образуется до входа в канал. Препротеин OmpA заканчивается на остатке 41 в кристаллической структуре рентгеновского излучения; однако C-терминал SecY, который является неструктурированным, дает представление о возможном местоположении PhoA45. В нашей смоделированной структуре петля шпильки находится в устье канала, чтобы облегчить транслокацию препротеина через мембрану. Таким образом, в этом примере методология картирования FRET улучшает существующую информацию о статической структуре SecA-SecYEG, предоставляя намек на динамическое движение, необходимое для транслокации белка через мембрану. Хотя методология картирования FRET не подходит для определения структуры de novo , если доступна трехмерная структурная информация, она может способствовать текущему пониманию отношений структура-функция путем выяснения сайтов связывания и динамических движений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения R15GM135904 (присуждается IM) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM110552 (присуждается DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Биохимия выпуск 181 флуоресценция передача энергии SecA транслокация белка картирование FRET
Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter