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Biochemistry

फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण मानचित्रण: वैश्विक संरचनात्मक विशेषताओं को स्पष्ट करने के लिए एक नई पद्धति

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

अध्ययन में लेबलिंग साइटों के चयन, रंगों की पसंद, अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण सहित एफआरईटी मैपिंग की पद्धति का विवरण दिया गया है। यह पद्धति प्रोटीन प्रणालियों में बाध्यकारी साइटों, रचनात्मक परिवर्तनों और गतिशील गतियों को निर्धारित करने में प्रभावी है और मौजूदा 3-डी संरचनात्मक जानकारी के साथ संयोजन के रूप में प्रदर्शन करने पर सबसे उपयोगी है।

Abstract

फोरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) एक स्थापित प्रतिदीप्ति-आधारित विधि है जिसका उपयोग इन विट्रो में और साथ ही कोशिकाओं के भीतर बायोमोलेक्यूल्स के बीच की दूरी को सफलतापूर्वक मापने के लिए किया जाता है। एफआरईटी में, प्रतिदीप्ति तीव्रता या जीवनकाल में परिवर्तन से मापा गया ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता, दो फ्लोरोसेंट अणुओं या लेबल के बीच की दूरी से संबंधित है। दूरी से गतिशीलता और रचनात्मक परिवर्तनों का निर्धारण जैविक प्रणालियों के लिए इस पद्धति के अनुप्रयोगों के कुछ उदाहरण हैं। कुछ शर्तों के तहत, यह पद्धति गतिशीलता, लचीलापन और बाध्यकारी सतहों के अनुकूलन के बारे में जानकारी प्रदान करके मौजूदा एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाओं को जोड़ और बढ़ा सकती है। हम एक बाध्यकारी साइट की पहचान या डिमर सबयूनिट्स के झुकाव के माध्यम से संरचनात्मक गुणों को स्पष्ट करने के लिए एफआरईटी और संबंधित दूरी निर्धारण के उपयोग का वर्णन करते हैं। लेबलिंग साइटों की विवेकपूर्ण पसंद के माध्यम से, और अक्सर कई लेबलिंग रणनीतियों के रोजगार के माध्यम से, हमने प्रोटीन-डीएनए कॉम्प्लेक्स और एसईसीए-एसईसीवाईईजी प्रोटीन ट्रांसलोकेशन सिस्टम में वैश्विक संरचनात्मक गुणों को निर्धारित करने के लिए इन मानचित्रण विधियों को सफलतापूर्वक लागू किया है। एसईसीए-सेकिएग प्रणाली में, हमने प्रीप्रोटीन-बाइंडिंग साइट की पहचान करने और बाध्य सिग्नल अनुक्रम क्षेत्र के स्थानीय विरूपण को निर्धारित करने के लिए एफआरईटी मैपिंग विधियों का उपयोग किया है। यह अध्ययन उचित लेबलिंग साइटों की पहचान, गैर-देशी अमीनो एसिड अवशेषों सहित संभावित लेबल की चर्चा, लेबलिंग प्रक्रियाओं, माप कैसे करें, और डेटा की व्याख्या सहित एफआरईटी मैपिंग अध्ययन करने के चरणों की रूपरेखा तैयार करता है।

Introduction

प्रोटीन के लिए, 3-आयामी (3-डी) संरचनात्मक ज्ञान के साथ गतिशीलता की व्याख्या जैव-आणविक प्रणालियों के संरचना-कार्य संबंधों की बढ़ी हुई समझ की ओर ले जाती है। संरचनात्मक तरीके, जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एक स्थिर संरचना पर कब्जा करते हैं और अक्सर बायोमोलेक्यूल बाइंडिंग और गतिशीलता के पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए कई संरचनाओं के निर्धारण की आवश्यकता होती है1. यह आलेख वैश्विक संरचनात्मक तत्वों, जैसे बाध्यकारी साइटों या बाइंडिंग इंटरैक्शन को मैप करने के लिए समाधान-आधारित विधि पर चर्चा करता है, जो संभावित रूप से अधिक क्षणिक हैं और स्थिर विधियों द्वारा कम आसानी से कैप्चर किए जाते हैं। इस पद्धति के लिए मजबूत उम्मीदवार सिस्टम वे हैं जिनमें एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी या अन्य संरचनात्मक तरीकों द्वारा पहले 3-डी संरचना निर्धारित की गई है। इस मामले में, हम झिल्ली2 में प्रीप्रोटीन के परिवहन से पहले फोरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) का उपयोग करके सिग्नल पेप्टाइड बाइंडिंग साइट के स्थान को मैप करने के लिए प्रोटीन सामान्य स्रावी मार्ग में एक केंद्रीय खिलाड़ी, एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का लाभ उठाते हैं। 3-डी संरचना के हमारे ज्ञान के साथ युग्मित आनुवंशिक संशोधनों के माध्यम से जैविक प्रणाली के हेरफेर ने चैनल 3 में सम्मिलन से तुरंत पहले सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के विरूपण के निर्धारण को सक्षम किया।

एफआरईटी में एक अणु (दाता) से दूसरे (स्वीकर्ता) तक ऊर्जा का विकिरण-कम हस्तांतरण एक दूरी-निर्भर फैशन में शामिल है जो अंतरिक्ष 4,5 के माध्यम से है। दाता में कमी या स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के माध्यम से इस हस्तांतरण की दक्षता की निगरानी की जाती है। ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता के रूप में वर्णित किया जा सकता है

ई = आर06/(आर06 + आर6)

जिसमें आर0 मान वह दूरी है जिस पर स्थानांतरण 50% कुशलहै 6. तकनीक को पहले एक आणविक शासक के रूप में वर्णित किया गया है और दाता-स्वीकर्ता रंगों 4,7,8,9 की पहचान के आधार पर 2.5-12 एनएम रेंज में दूरी निर्धारित करने में प्रभावी है। दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता और स्वीकर्ता के साथ या उसके बिना जीवनकाल हस्तांतरण क्षमता के निर्धारण की अनुमति देते हैं और परिणामस्वरूप, दूरी 5,8। प्रौद्योगिकी की उपलब्धता, विधि की संवेदनशीलता और उपयोग में आसानी के कारण, एफआरईटी ने एकल-अणु प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी6 जैसे क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोग भी पाया है। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के आगमन ने इंट्रासेल्युलर गतिशीलता और लाइव-सेल इमेजिंग के अवलोकन को अपेक्षाकृत आसान10,11 बना दिया है। इस आभासी मुद्दे में इस तरह के कई FRET अनुप्रयोगों पर विस्तार से चर्चा की जाती है।

इस अध्ययन में, हम विशेष रूप से संरचनात्मक विवरण निर्धारित करने के लिए दूरी मूल्यों को प्राप्त करने के लिए एफआरईटी माप के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इससे पहले, एफआरईटी माप का उपयोग डीएनए अणुओं के विरूपण को निर्धारित करने के लिए प्रभावी ढंग से किया गया है जब प्रोटीन 12,13,14, प्रोटीन की आंतरिक गतिशीलता और प्रोटीन बाध्यकारी बातचीत 15,16,17 से बंधे होते हैं। इस पद्धति के फायदे अपेक्षाकृत कम मात्रा में सामग्री के साथ समाधान में लचीले और गतिशील संरचनात्मक तत्वों को निर्धारित करने की क्षमता में निहित हैं। गौरतलब है कि यह विधि विशेष रूप से प्रभावी है जब मौजूदा संरचनात्मक जानकारी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग 3-डी संरचना निर्धारण के साधन के रूप में नहीं किया जा सकता है। विधि संरचना की सर्वोत्तम अंतर्दृष्टि और शोधन प्रदान करती है यदि काम मौजूदा संरचनात्मक जानकारी पर बनाता है जो अक्सर कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन18,19 के साथ युग्मित होता है। यहां, स्थिर-अवस्था और समय-हल किए गए एफआरईटी माप से प्राप्त दूरी का उपयोग एक बाध्यकारी साइट को मैप करने के लिए वर्णित किया गया है, जिसका स्थान ज्ञात नहीं था, एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स की मौजूदा क्रिस्टलोग्राफिक संरचना पर, सामान्य स्रावी मार्ग में प्रमुख प्रोटीन3.

सामान्य स्रावी मार्ग, प्रोकैरियोट्स से यूकेरियोट्स से आर्किया तक एक अत्यधिक संरक्षित प्रणाली, कोशिका में उनके कार्यात्मक स्थान पर झिल्ली के पार या अंदर प्रोटीन के परिवहन की मध्यस्थता करती है। ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए, जैसे कि ई कोलाई, हमारे अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले जीव, प्रोटीन को आंतरिक झिल्ली में डाला जाता है या पेरिप्लाज्म में स्थानांतरित किया जाता है। बैक्टीरियल SecY चैनल कॉम्प्लेक्स (जिसे ट्रांसलोकॉन कहा जाता है) नए संश्लेषित प्रोटीन को स्थानांतरित करने के लिए अन्य प्रोटीनों के साथ समन्वय करता है, जिसे आमतौर पर एन-टर्मिनस20,21 में स्थित सिग्नल अनुक्रम के माध्यम से सेल में अपने सही स्थान पर निर्देशित किया जाता है। पेरिप्लाज्म के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए, एटीपीस एसईसीए प्रोटीन राइबोसोम की निकास सुरंग के साथ जुड़ता है, और लगभग 100 अवशेषों के बाद प्रीप्रोटीन के साथ22 का अनुवाद किया गया है। एसईसीबी चैपरोन प्रोटीन के साथ, यह प्रीप्रोटीन को एक खुली अवस्था में बनाए रखता है। एसईसीए एसईसीवाईईजी ट्रांसलोकन को बांधता है, और एटीपी हाइड्रोलिसिस के कई चक्रों के माध्यम से, झिल्ली23,24 में प्रोटीन परिवहन की सुविधा प्रदान करता है।

एसईसीए एक बहु-डोमेन प्रोटीन है जो साइटोसोलिक और झिल्ली-बाध्य रूपों में मौजूद है। साइटोसोल में एक होमोडिमेरिक प्रोटीन, एसईसीए में एक प्रीप्रोटीन बाइंडिंग या क्रॉस-लिंकिंग डोमेन25, दो न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग डोमेन, एक पेचदार विंग डोमेन, एक पेचदार मचान डोमेन और दो हेलिक्स फिंगर (टीएचएफ) 26,27,28,29 (चित्रा 1) होते हैं। एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स के पिछले क्रिस्टलोग्राफिक अध्ययनों में, टीएचएफ के स्थान ने सुझाव दिया कि यह प्रोटीन अनुवाद में सक्रिय रूप से शामिल था और सिग्नल पेप्टाइड के साथ बाद के क्रॉस-लिंकिंग प्रयोगों ने प्रोटीन ट्रांसलोकेशन30,31 में इस क्षेत्र के महत्व को और स्थापित किया। पिछले अध्ययनों ने एफआरईटी मैपिंग पद्धति का उपयोग करते हुए दिखाया कि बहिर्जात सिग्नल पेप्टाइड्स एसईसीए2,32 के इस क्षेत्र से बंधते हैं। SecYEG चैनल में सम्मिलन से पहले सिग्नल अनुक्रम और प्रीप्रोटीन के शुरुआती परिपक्व क्षेत्र के विरूपण और स्थान को पूरी तरह से समझने के लिए, एक प्रोटीन चिमेरा जिसमें प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के सिग्नल अनुक्रम और अवशेष एक सेर-ग्ली लिंकर के माध्यम से एसईसीए से जुड़े थे (चित्रा 1)। इस जैविक रूप से व्यवहार्य निर्माण का उपयोग करते हुए, यह आगे प्रदर्शित किया गया था कि प्रीप्रोटीन का सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र समानांतर फैशन2 में टीएचएफ से बंधता है। इसके बाद, एफआरईटी मैपिंग पद्धति का उपयोग सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के विरूपण और स्थान को स्पष्ट करने के लिए किया गया था, जैसाकि नीचे वर्णित है।

एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स33,34,35 की 3-डी संरचना का ज्ञान और बाध्यकारी साइट के संभावित स्थान ने हमें उन स्थानों पर दाता-स्वीकर्ता लेबल को विवेकपूर्ण ढंग से रखने की अनुमति दी जहां व्यक्तिगत एफआरईटी दूरी का चौराहा बाध्यकारी साइट स्थान की पहचान करता है। इन एफआरईटी मैपिंग मापों से पता चला है कि सिग्नल अनुक्रम और प्रीप्रोटीन का प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र SecYEG चैनल के मुंह पर स्थित टिप के साथ एक हेयरपिन बनाता है, यह दर्शाता है कि चैनल सम्मिलन से पहले हेयरपिन संरचना टेम्पलेट की जाती है।

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Protocol

1. लेबलिंग साइटों का चयन

  1. मौजूदा प्रोटीन संरचनाओं पर पुटेटिव बाइंडिंग साइट को त्रिकोणीय करने के लिए कम से कम तीन संभावित लेबलिंग साइटों की पहचान करें। इस मामले में, आनुवंशिक संलयन के माध्यम से एसईसीए से जुड़े एसईसीए, एसईसीवाईईजी और प्रीप्रोटीन की पहचान की गई थी2.
    1. पुटेटिव बाइंडिंग साइट के 25-75 ए के भीतर लेबलिंग साइटों का चयन करें और प्रोटीन के अपेक्षाकृत स्थिर क्षेत्रों में, दूरी36 का उपयोग करने के लिए विशिष्ट एफआरईटी डाई जोड़ी का निर्धारण करेगी। प्रोटीन क्षेत्रों में लेबलिंग साइटों का पता लगाएं जो एक दूसरे से अपेक्षाकृत अलग हैं, इसलिए साइटें केंद्र में स्थित बाध्यकारी बाध्यकारी साइट (चित्रा 1 ए-डी) के साथ त्रिकोण के कोने का वर्णन करती हैं।
    2. विशिष्ट साइट37,38 की लेबलिंग दक्षता में सुधार करने के लिए, प्रोटीन में रुचि के लेबलिंग साइटों पर सिस्टीन (सिस) अवशेषों का परिचय या पहचान करें जिसमें कोई अन्य सिस अवशेष नहीं है।
    3. अप्राकृतिक अमीनो एसिड का परिचय दें, उदाहरण के लिए, क्लिक रसायन विज्ञान के साथ लेबलिंग के लिए पी-एज़िडोफेनीलएलनिन, अलग-अलग रंगों39,40 के साथ दो अलग-अलग पदों पर एक प्रोटीन को प्रभावी ढंग से लेबल करने के लिए।
    4. फ़ंक्शन के नुकसान के लिए सिस म्यूटेंट का परीक्षण करें। एक उपयुक्त गतिविधि परख का उपयोग करके सिस-कम उत्परिवर्ती और अप्राकृतिक अमीनो एसिड उत्परिवर्ती की गतिविधि को सत्यापित करें। इस मामले में, गतिविधि को इन विट्रो मैलाकाइट ग्रीन एटीपीस परख 32,41,42 के बाद एक विकास परख के साथ सत्यापित किया गया था

2. प्रोटीन को लेबल करना

  1. सटीक लेबलिंग के लिए कम से कम 95% शुद्धता के लिए ब्याज के प्रोटीन या प्रोटीन शुद्ध करें। संदर्भ3 में विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद एसईसीए और एसईसीवाईईजी प्रोटीन को शुद्ध करें। सुनिश्चित करें कि आपके पास इस चरण के लिए कम से कम 5 μg शुद्ध प्रोटीन है, क्योंकि लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान कुछ प्रोटीन खो जाएगा।
  2. उनके आर 0 मूल्य और लेबल वाली साइटों के बीच अनुमानित दूरी के आधार पर एफआरईटी माप के लिए दोरंग चुनें। आर0 मूल्यों का अनुमान लगाएं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन डेटाबेस से जानकारी का उपयोग करके दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता अवशोषण ओवरलैप का निरीक्षण करें, जो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले रंगों (https://www.fpbase.org/spectra/) 36 के लिए स्पेक्ट्रा भी देता है।
    नोट: आर0 को उस दूरी के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर किसी दिए गए डाई जोड़ी के लिए स्थानांतरण दक्षता 50% है। मानचित्रण प्रयोगों के लिए, भविष्यवाणी की गई दूरी डाई जोड़ी के आर0 मूल्य के करीब होनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दूरी को सटीक रूप से मापा जा सके।
  3. चरण 1.1.1 में पहचाने गए पदों को लेबल करें। दाता-स्वीकर्ता डाई जोड़ी के साथ।
    1. इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता, तापमान, पीएच, समय की लंबाई, और43,44 का उपयोग किए गए विशिष्ट रंगों के लिए बफर जैसे मापदंडों पर विशेष ध्यान देने के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन को लेबल करें।
    2. एमएल या 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5), 25 एमएम केसीएल, 1 एमएम ईडीटीए (टीकेई) बफर में लगभग 10 μM की एकाग्रता पर प्रोटीन तैयार करें। डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ) या डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में डाई को 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता में भंग करें। डाई तक पहुंचने के लिए सरगर्मी करते समय समाधान में डाई ड्रॉपवाइज जोड़ें: 5: 1 का प्रोटीन दाढ़ अनुपात (50 μM डाई: 10 μM प्रोटीन)।
    3. कोमल रॉकिंग के साथ एक गिलास शीशी में कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 घंटे के लिए प्रतिक्रिया को आगे बढ़ने की अनुमति दें या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। β-मर्कैप्टोएथेनॉल जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
      नोट: यदि प्रोटीन ट्रिस बफर के साथ संगत नहीं है, तो फॉस्फेट या एचईपीईएस बफर का उपयोग किया जा सकता है। पीएच को 7.0-7.5 रेंज में बनाए रखें। यदि प्रोटीन में डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड हैं, तो लेबलिंग से पहले डीटीटी या टीसीईपी जैसे कम करने वाले एजेंट को जोड़ें। डाई जोड़ने से पहले डायलिसिस या जेल निस्पंदन द्वारा डीटीटी निकालें।
  4. सटीक एफआरईटी माप के लिए लेबल किए गए प्रोटीन को बनाए रखते हुए मुक्त डाई को प्रवाहित करने के लिए उपयुक्त आणविक भार कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) के साथ एक केन्द्रापसारक सांद्रता के साथ मुक्त डाई को हटा दें।
    1. एक 3 एमएल कंसंट्रेटर के ऊपरी हिस्से में ~ 1 मिलीलीटर पानी रखकर कंसंट्रेटर झिल्ली तैयार करें और फिर झिल्ली के माध्यम से पानी को अपकेंद्रित्र करें (4,300 एक्स जी पर कम से कम 10 मिनट)।
    2. कंसंट्रेटर में सेंट्रीफ्यूजिंग लेबल नमूना द्वारा नि: शुल्क डाई निकालें (4,300 एक्स जी पर 20 मिनट)। 3-4 बार दोहराएं और प्रवाह का निपटान करें।
    3. यूवी-विज़ अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके लेबल किए गए प्रोटीन की लेबलिंग दक्षता की जांच करें।
      नोट: एफआरईटी माप के लिए 50% या उससे अधिक की लेबलिंग क्षमता की आवश्यकता होती है। कम लेबलिंग क्षमता एफआरईटी सिग्नल को कम करती है और माप में अशुद्धियों को जन्म दे सकती है।
    4. प्रोटीन अवशोषण बैंड और डाई अधिकतम अवशोषण बैंड दोनों का निरीक्षण करने के लिए 250-700 एनएम से सीमा के साथ लेबल प्रोटीन का यूवी-विज़ स्पेक्ट्रम प्राप्त करें। डाई के अवशोषण शिखर पर और प्रोटीन के लिए 280 एनएम पर अवशोषण को मापें।
    5. प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करें और सुधार कारक, सीएफ, और निम्नलिखितसमीकरण45,46 का उपयोग करके डाई से किसी भी योगदान के लिए सही:
      Equation 1
      जहां सी प्रोटीन (एम) की एकाग्रता है, ए280 280 एनएम पर नमूना अवशोषण है, एअधिकतम डाई अवशोषण अधिकतम पर अवशोषण है, ε प्रोटीन 280 एनएम पर प्रोटीन के लिए विलुप्त होने का गुणांक है और सीएफ सुधार कारक है, ए'280 /
    6. निम्न समीकरण का उपयोग करके लेबलिंग दक्षता निर्धारित करें:
      Equation 2
      जहां डाई डाई ε दाढ़ विलुप्त होने गुणांक है, सी प्रोटीन की एकाग्रता है जैसा कि चरण 2.4.5 में निर्धारित किया गया है, और ई लेबलिंग दक्षता है। चरण 2.4.2 दोहराएँ जब तक लेबलिंग दक्षता मान पठार है और 100% से कम है।

3. R 0 मान निर्धारित करें

  1. सीटू में आर0 मानों को मापें। कुल प्रोटीन, 4 μM की एक ही एकाग्रता पर दो प्रोटीन नमूने तैयार करें, केवल दाता डाई के साथ लेबल किए गए प्रोटीन के साथ एक और केवल स्वीकर्ता डाई के साथ लेबल किए गए प्रोटीन के साथ एक। एसईसीए के लिए, 4 μM SecA मोनोमर की प्रोटीन एकाग्रता इन मापों के लिए अच्छी तरह से काम करती है।
    1. एक 1 सेमी x 1 सेमी क्युवेट के लिए 2.5 एमएल का नमूना संस्करण तैयार करें, 5 मिमी एक्स 5 मिमी क्युवेट के लिए 600 μL या 3 मिमी x 3 मिमी क्युवेट के लिए 200 μL।
  2. फ्लोरोमीटर चालू करें और स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करते समय प्रतिदीप्ति सॉफ्टवेयर में वर्णक्रमीय अधिग्रहण और विश्लेषण कार्यक्रम खोलें। कंप्यूटर को उपकरण (चित्रा 2 ए) से कनेक्ट करने और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा चुनने के लिए लाल एम पर क्लिक करें।
    1. इस तरह के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, उत्सर्जन स्कैन, तापमान, और नमूना परिवर्तक स्थिति के लिए सीमा के रूप में स्कैन मापदंडों दर्ज करें कलेक्ट प्रयोग मेनू आइटम (चित्रा 2 बी) का उपयोग कर।
    2. आरटीसी पर क्लिक करें और डाई के अवशोषण अधिकतम पर सेट उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके चरम पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की निगरानी करके साधन सेटिंग्स (जैसे, वर्णक्रमीय स्लिट्स) का अनुकूलन करें। एसईसीए के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स सेट करें: बैंडपास 1 एनएम के रूप में; उत्तेजना और उत्सर्जन क्रमशः 1 और 1.5 मिमी के रूप में स्लिट्स, 25 डिग्री सेल्सियस पर तापमान और 250 आरपीएम पर सरगर्मी गति के साथ।
      नोट: साधन की प्रति सेकंड (सीपीएस) क्षमता (आमतौर पर 2 x 106 सीपीएस) की गणना से अधिक न करें।
  3. नमूना धारक में दाता लेबल प्रोटीन नमूना रखें और डाई अवशोषण अधिकतम (जैसे, एएफ 488 के लिए 488 एनएम) पर नमूना रोमांचक द्वारा दाता डाई (दाता केवल प्रोटीन) के साथ लेबल प्रोटीन का उत्सर्जन स्कैन उत्पन्न करने के लिए रन पर क्लिक करें और उत्सर्जन शिखर पर स्कैनिंग (दाता के लिए 505-750 एनएम केवल एएफ 488 के साथ लेबल एसईसीए प्रोटीन)।
  4. चोटी के अंत में स्कैन 25-50 एनएम का विस्तार करके स्कैन के लिए एक आधार रेखा स्थापित करें। 47 वर्णित के रूप में विभिन्न सांद्रता के नमूनों पर अवशोषण और प्रतिदीप्ति माप प्रदर्शन करके दाता-केवल प्रोटीन की क्वांटम उपज को मापें। इन मापों के लिए एक ही भट्ठा सेटिंग्स बनाए रखें।
    1. क्वांटम उपज के लिए संदर्भ के रूप में मुक्त दाता डाई का उपयोग करें। एक सटीक निर्धारण के लिए दाता-केवल प्रोटीन और विभिन्न सांद्रता पर मुक्त डाई के कम से कम चार माप प्राप्त करें।
    2. प्रतिदीप्ति तीव्रता या एकीकृत क्षेत्र बनाम दाता-केवल प्रोटीन और मुक्त डाई या संदर्भ के लिए अवशोषण प्लॉट करें। दाता-केवल प्रोटीन (ढलान डी) और संदर्भ (ढलान आर) के लिए ढलानों का निर्धारण करें।
    3. क्वांटम उपज (Φ) की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की जाती है:
      Equation 3
      यहां ΦD दाता केवल प्रोटीन की क्वांटम उपज है, ΦR मुक्त डाई की क्वांटम उपज है (यह आमतौर पर निर्माता से प्राप्त किया जा सकता है), ढलानD और ढलानR क्रमशः दाता केवल प्रोटीन और संदर्भ के लिए चरण 3.4.2 में निर्धारित ढलान हैं और ηD और ηR दाता-केवल प्रोटीन और संदर्भ मुक्त डाई समाधान के अपवर्तन के सूचकांक का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः 47.
  5. 1 सेमी पथलेंथ सेल का उपयोग करके अपने स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन का अवशोषण स्पेक्ट्रम प्राप्त करें। डाई एकाग्रता द्वारा अवशोषण स्पेक्ट्रम को विभाजित करके अपने स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन का एक विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रम उत्पन्न करें।
  6. एक ग्राफिकल विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न, जे (ω) उत्पन्न करें। इस प्रक्रिया के लिए एक मानक वर्कशीट प्रोग्राम (जैसे, स्प्रेडशीट) का भी उपयोग किया जा सकता है।
    1. ओवरलैप स्पेक्ट्रम उत्पन्न करने के लिए स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन के विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रम द्वारा दाता-केवल प्रोटीन (चरण 3.4) के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को गुणा करें।
    2. परिणामी ओवरलैप स्पेक्ट्रम को α4 से गुणा करें।
    3. ओवरलैप क्षेत्र के एकीकरण द्वारा वक्र के तहत क्षेत्र निर्धारित करें। ओवरलैप क्षेत्र को उस क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है जहां स्वीकर्ता विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रम द्वारा गुणा किया गया दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम सकारात्मक मूल्य पैदा करता है। वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न के रूप में परिभाषित किया गया है:
      Equation 4
      जहां एफडी (ω) दाता-केवल प्रोटीन का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है (चरण 3.4 में प्राप्त) और εए (ω) स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन का विलुप्त होने गुणांक स्पेक्ट्रम है और इसमें एम -1सेमी -1 (चरण 3.5 में प्राप्त) की इकाइयां हैं। परिणामी वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न में एम -1 सेमी -1एनएम4 की इकाइयां होनी चाहिए।
    4. वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न को सामान्य करें। एक ही वर्णक्रमीय रेंज पर दाता केवल प्रोटीन स्पेक्ट्रम के एकीकृत क्षेत्र द्वारा ओवरलैप अभिन्न विभाजित करें:
      Equation 5
    5. निम्न समीकरण का उपयोग करके ए में आर0 मान की गणना करें:
      Equation 6
      जहां ε2 अभिविन्यास कारक है, आमतौर पर स्वतंत्र रूप से घूर्णन रंगों के लिए 2/3 के रूप में लिया जाता है, η अपवर्तन का सूचकांक है और पतला जलीय घोल के लिए 1.33 के रूप में अनुमानित किया जा सकता है, क्यूडी दाता की क्वांटम उपज है (चरण 3.4) और जे (λ) वर्णक्रमीय ओवरलैप अभिन्न है जैसा कि चरण 3.6.35 में निर्धारित किया गया है। नोट: यदि रंग स्वतंत्र रूप से घूर्णन नहीं कर रहे हैं, तो सुधार इवानोव 48 द्वारा वर्णित के रूप में पेश किया जा सकता है और ऑक्लेयर49 और झांग 2,3 द्वारा कार्यान्वित किया जा सकता है।

4. एफआरईटी वर्णक्रमीय माप करें

  1. एक ही एकाग्रता पर दाता-केवल प्रोटीन, स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन, और दाता-स्वीकर्ता प्रोटीन नमूने तैयार करें; 4 μM की एकाग्रता की सिफारिश की जाती है। समाधान के 200 μL का उपयोग करें, यदि 3 मिमी x 3 मिमी क्युवेट का उपयोग कर रहे हैं, तो 600 μL यदि 5 मिमी x 5 मिमी क्युवेट का उपयोग कर रहे हैं, या 2.5 एमएल यदि 1 सेमी x 1 सेमी क्युवेट का उपयोग कर रहे हैं।
    1. केवल दाता और स्वीकर्ता केवल प्रोटीन के बराबर दाढ़ मात्रा का उपयोग करके दाता-स्वीकर्ता प्रोटीन नमूना तैयार करें।
    2. नियंत्रण दाता में लेबल किए गए नमूने की समान मात्रा को बनाए रखें और केवल दाता या स्वीकर्ता केवल नमूनों के बराबर दाढ़ की मात्रा में बिना लेबल वाले प्रोटीन की शुरूआत के माध्यम से केवल प्रोटीन के नमूने। उदाहरण के लिए, एक ही एकाग्रता के समाधान के लिए, प्रत्येक दाता-केवल एफआरईटी नमूने में 200 μL मात्रा के लिए दाता-केवल प्रोटीन के 100 μL और बिना लेबल वाले प्रोटीन के 100 μL होंगे।
  2. केवल दाता, स्वीकर्ता, और दाता-स्वीकर्ता नमूने के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा उत्पन्न करें। चरण 3.2 में वर्णित के रूप में संकेत का अनुकूलन करें। एक बार अनुकूलित नमूनों के सभी के लिए एक ही सेटिंग्स बनाए रखने.
    1. चरण 3.3 में वर्णित के रूप में दाता-केवल स्कैन प्राप्त करें। दाता डाई अवशोषण अधिकतम पर समाधान उत्तेजित करें और दाता और (अपेक्षित) स्वीकर्ता उत्सर्जन चोटियों पर स्कैन करें।
    2. या तो स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन के लिए नमूना का आदान-प्रदान करें या स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन युक्त क्युवेट में नमूना परिवर्तक स्थिति बदलें।
    3. चरण 4.2.1 के समान सेटिंग्स का उपयोग करके केवल स्वीकर्ता डाई (स्वीकर्ता केवल प्रोटीन) के साथ लेबल किए गए प्रोटीन का उत्सर्जन स्कैन प्राप्त करें। दाता उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर नमूना उत्तेजित करें।
      नोट: यह स्पेक्ट्रम दाता तरंग दैर्ध्य पर उत्साहित स्वीकर्ता की मात्रा के लिए एक सुधार प्रदान करता है (चरण 5.1.2 में एफए )
    4. दाता-स्वीकर्ता प्रोटीन नमूने के लिए नमूना का आदान-प्रदान करें या दाता-स्वीकर्ता लेबल प्रोटीन युक्त क्युवेट में नमूना परिवर्तक स्थिति बदलें।
    5. चरण 4.2.1 और 4.2.3 के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर दाता-स्वीकर्ता प्रोटीन नमूने का उत्सर्जन स्कैन प्राप्त करें।
    6. सभी स्पेक्ट्रा के लिए, स्कैन के अंत में मापा पृष्ठभूमि गिनती घटाकर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए सही है।
  3. केवल दाता के दाता जीवनकाल को मापें और चरण 4.1.2 में वर्णित के रूप में तैयार दाता-स्वीकर्ता नमूने। नैनोसेकंड (10-9 एस) समय सीमा में फ्लोरोसेंट क्षय को मापने और हल करने में सक्षम एक समय-सहसंबद्ध एकल-फोटॉन गिनती प्रतिदीप्ति उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: एफआरईटी डाई जोड़े के लिए, दाता डाई के अवशोषण अधिकतम के लिए उत्तेजना प्रकाश स्रोत से मेल खाते हैं।
    1. साधन चालू करें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमीटर के साथ डेटा अधिग्रहण के लिए साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    2. अधिग्रहण के लिए, 55 एनएस की समय सीमा, 1 और 4096 चैनलों के लाभ के साथ टीसीएसपीसी क्षय का चयन करें।
    3. गैर-डेयरी क्रीमर या वाणिज्यिक बिखरने वाले समाधान के समाधान का उपयोग करके एक उपकरण प्रतिक्रिया फ़ंक्शन (आईआरएफ) प्राप्त करें और 490 एनएम पर बिखरने की निगरानी करें। भट्ठा सेटिंग समायोजित करें और पल्स ढेर से बचने के लिए कम पर्याप्त गिनती दर बनाए रखने के लिए आवश्यकतानुसार तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करें5. स्वीकार करें क्लिक करें , और तब प्रारंभ करें. इससे अधिग्रहण शुरू हो जाएगा।
      नोट: 180 किलोहर्ट्ज़ पुनरावृत्ति दर के लिए 4000 सीपीएस की अधिकतम गिनती दर का उपयोग किया जाता है।
    4. चोटी चैनल 20,000 मायने रखता है की एक अधिकतम है जब तक 490 एनएम पर आईआरएफ ले लीजिए। प्रत्येक प्रतिदीप्ति क्षय को मापने से पहले और बाद में एक आईआरएफ लीजिए।
    5. दाता उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, 520 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की निगरानी करके केवल दाता और दाता-स्वीकर्ता नमूनों के प्रतिदीप्ति क्षय प्राप्त करें।
    6. 4000 सीपीएस या उससे कम की अधिकतम गणना दर के लिए भट्ठा सेटिंग्स समायोजित करें। भट्ठा सेटिंग्स आमतौर पर प्रोटीन नमूनों के लिए 15-20 एनएम बैंडपास हैं। चरम चैनल में 20,000 गिनती प्राप्त कर रहे हैं जब तक क्षय ले लीजिए।
  4. प्रतिदीप्ति जीवनकाल (ω) के लिए समय (टी) के एक समारोह के रूप में क्षय या प्रतिदीप्ति तीव्रता (मैं) का विश्लेषण करें। क्षय को निम्न समीकरण के साथ घातांकों के योग में फ़िट करें:
    Equation 7
    जहां αमैं घटक का प्रीएक्सपोनेंशियल फैक्टर है और ωआई जीवनकाल है। प्रतिदीप्ति क्षय से मेल खाने के लिए फिट को आईआरएफ के साथ फिर से संगठित किया जाता है। कम Χ2 मापदंडों से फिट की गुणवत्ता का न्याय करें।

5. एफआरईटी डेटा का विश्लेषण

  1. केवल निम्नलिखित समीकरण के साथ दाता के सापेक्ष दाता-स्वीकर्ता नमूने की दाता तीव्रता में कमी से एफआरईटी दक्षता की गणना करें।
    Equation 8
    जहां एफडीए दाता-स्वीकर्ता नमूने की प्रतिदीप्ति तीव्रता है और एफडी दाता प्रतिदीप्ति के चरम पर दाता की प्रतिदीप्ति तीव्रता केवल नमूना है। यदि डेटा शोर है तो चोटियों के एकीकृत क्षेत्रों का उपयोग करें।
    1. केवल दाता और दाता-स्वीकर्ता नमूनों के बीच लेबलिंग में किसी भी अंतर के लिए सही है। निम्नानुसार लेबलिंग की दाता डिग्री के आधार पर सुधार की गणना करें।
      Equation 9
      जहां एफडीए दाता-स्वीकर्ता नमूने में दाता लेबलिंग दक्षता है और एफडी दाता-केवल नमूने में लेबलिंग दक्षता है।
    2. दाता-स्वीकर्ता प्रोटीन स्पेक्ट्रम से स्वीकर्ता-केवल प्रोटीन स्पेक्ट्रम (चरण 4.2) के घटाव के माध्यम से दाता-उत्साहित स्पेक्ट्रम में स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति के किसी भी योगदान के लिए सही है।
      Equation 14
    3. दाता-स्वीकर्ता प्रोटीन नमूने के सापेक्ष स्वीकर्ता की लेबलिंग दक्षता में अंतर के लिए सही दक्षता की गणना के लिए निम्नलिखित समीकरण उत्पन्न करता है:
      Equation 10
      जहां एफए स्वीकर्ता लेबलिंग की आंशिक मात्रा को दर्शाता है। इस समीकरण में डाई लेबलिंग और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति के कारण सभी सुधार शामिल हैं।
    4. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके दक्षता से एफआरईटी दूरी की गणना करें:
      Equation 11
      चरण 3.6.5 में प्राप्त आर0 मान का उपयोग करना।
    5. केवल दाता के प्रतिदीप्ति जीवनकाल और चरण 4.3.3-4.3.5 में मापा दाता स्वीकर्ता नमूने का उपयोग कर FRET दक्षता की गणना करें:
      Equation 12
    6. एफआरईटी क्षमता की गणना करने और स्थिर-राज्य परिणामों के साथ तुलना करने के लिए आयाम-भारित जीवनकाल का उपयोग करें5.
      Equation 13
    7. प्रतिदीप्ति जीवनकाल द्वारा निर्धारित क्षमता से चरण 5.1.4 के रूप में दूरी की गणना करें। एफआरईटी दक्षता और दूरी के लिए स्थिर-राज्य और समय-हल किए गए मूल्यों की तुलना करें और सुनिश्चित करें कि वे एक दूसरे की त्रुटि के भीतर हैं।

6. दूरी का मानचित्रण

  1. त्रि-आयामी संरचना पर बाध्यकारी साइट को मैप करने के लिए गणना की गई दूरी का उपयोग करें। प्रत्येक एफआरईटी जोड़ी के लिए चरण 3.6.5 में प्राप्त चरण 5.1.4 और आर0 मानों में दिए गए समीकरण का उपयोग करके जांच किए गए सभी डाई जोड़े और स्थानों के लिए दूरी और त्रुटियों की गणना करें।
    1. संरचना पर दूरी को मैप करने के लिए 3-डी ग्राफिकल व्यूइंग प्रोग्राम जैसे पिमोल50 का उपयोग करें ( पूरक फ़ाइल में दी गई स्क्रिप्ट)। स्क्रिप्ट से कमांड को सीधे उचित दूरी की जानकारी के साथ कमांड विंडो में दर्ज किया जा सकता है।
    2. मापा प्रत्येक दूरी और संबंधित त्रुटि (चित्रा 3, चित्रा 4, पूरक आंकड़े 1-3) के लिए एक खोल उत्पन्न करते हैं।
    3. विभिन्न गोले के चौराहे के माध्यम से स्थिति का नक्शा (पूरक आंकड़े 1-3)। सिग्नल पेप्टाइड बाइंडिंग साइट को एसईसीए और एसईसीवाईईजी पर तीन अलग-अलग स्थानों और सिग्नल पेप्टाइड (चित्रा 1) पर चार अलग-अलग स्थानों के माध्यम से मैप किया गया था।

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Representative Results

इस अध्ययन ने एसईसीवाईईजी चैनल में प्रीप्रोटीन के सम्मिलन से पहले एसईसीए पर प्रीप्रोटीन बाइंडिंग साइट के स्थान को निर्धारित करने पर ध्यान केंद्रित किया। बाध्यकारी साइट को मैप करने के लिए, प्रीप्रोटीन के विभिन्न क्षेत्रों और एसईसीए और एसईसीवाईईजी प्रोटीन (चित्रा 1 ए-डी) पर तीन अलग-अलग स्थानों के बीच एफआरईटी प्रयोग किए गए थे। प्राप्त दूरी और एसईसीए, एसईसीवाईईजी और प्रीप्रोटीन की त्रि-आयामी संरचनाओं से, प्रीप्रोटीन बाइंडिंग साइट के स्थान की भविष्यवाणी की गई थी। इन मापों को करने के लिए तीन अलग-अलग संस्थाओं (एसईसीए, एसईसीवाईईजी और प्रीप्रोटीन) को नियोजित करने के बजाय, फोआ सिग्नल अनुक्रम को ग्ली-सेर लिंकर 2,3 के समावेश के बाद आनुवंशिक संशोधन के माध्यम से एसईसीए से जोड़ा गया था। रंगों के साथ आसान लेबलिंग के लिए, सिस अवशेषों या एम्बर उत्परिवर्तन को फोए प्रीप्रोटीन (चित्रा 1 ई) में अवशेष 2, 22, 35 और 45 पर पेश किया गया था।

साइटों की पहचान और लेबलिंग
सिग्नल अनुक्रम के लिए एक पुटेटिव बाइंडिंग साइट को पहले समान एफआरईटी मैपिंग विधियों2,32 का उपयोग करके पहचाना गया था। इन और अन्य अध्ययनों ने टीएचएफ 33,51,52,53,54 (चित्रा 1 एफ) के समानांतर स्थिति में सुझाए गए अभिविन्यास के साथ सिग्नल पेप्टाइड के संभावित बाध्यकारी साइटों के रूप में दो-हेलिक्स उंगली (टीएचएफ) और प्रीप्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग डोमेन की पहचान की थी। इस प्रकार, एसईसीए और एसईसीवाईईजी प्रोटीन पर संभावित लेबलिंग साइटों की पहचान एसईसीए और एसईसीवाईईजी क्रिस्टल संरचना (चित्रा 1 ए-डी में हरे रंग में दिखाया गया है) में पुटेटिव बाइंडिंग साइट के स्थान के आधार पर की गई थी। पुटेटिव बाइंडिंग साइट की स्थिति को त्रिकोणीय बनाने के लिए तीन साइटों को चुना गया था, जहां अनिवार्य रूप से तीन साइटें पुटेटिव बाइंडिंग साइट के चारों ओर एक त्रिकोण बनाती हैं। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, तीन साइटें बाध्यकारी साइट (50-70 ए) की एफआरईटी सीमा के भीतर थीं। एलेक्सा फ्लोर 488 (एएफ 488) और एलेक्सा फ्लोर 647 (एएफ 647) की डाई जोड़ी को चुना गया था, क्योंकि 55.7 ए36 का आर0 मान लेबल वाली साइटों और माप सटीकता सुनिश्चित करने वाली पुटेटिव बाइंडिंग साइट के बीच अपेक्षित दूरी के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है।

लेबलिंग के लिए चुनी गई तीन साइटें, एसईसीए 37, एसईसीए 321, और एसईसीवाई 2 9 2 (चित्रा 1 ए-डी में मैजेंटा, वायलेट और सियान क्षेत्रों के रूप में दिखाया गया है) पूरे प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में स्थित हैं जो पुटेटिव बाइंडिंग साइट के चारों ओर एक त्रिकोण बनाते हैं। तीन साइटों को अलग-अलग सिस-कम उत्परिवर्ती में सिस अवशेषों में उत्परिवर्तित किया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि केवल सही स्थितिको 2,37 लेबल किया गया था। SecY292 प्रयोगों के लिए, फोए प्रीप्रोटीन साइटों को एएफ 647 के साथ लेबल किया गया था और एसईसीवाई अवशेष 292 को मैलिमाइड रसायन विज्ञान का उपयोग करके एएफ 488 के साथ लेबल किया गया था। चिमेरिक प्रोटीन में, साइटों एसईसीए 37 और एसईसीए 321 को एएफ 647 के साथ लेबल किया गया था और प्रीप्रोटीन को एएफ 488 के साथ लेबल किया गया था। एसईसीए-फोए चिमेरिक प्रोटीन में, फोआ प्रीप्रोटीन सेगमेंट के अवशेष 2, 22, 37 और 45 प्रत्येक को व्यक्तिगत प्रोटीन में एम्बर कोडन में उत्परिवर्तित किया गया था। एम्बर कोडन म्यूटेशन ने उन पदों पर अप्राकृतिक अमीनो एसिड, पी-एज़िडोफेनीलएलनिन की शुरूआत की अनुमति दी, जिन्हें बाद में क्लिक रसायन विज्ञान39,40 का उपयोग करके एएफ 488 के साथ लेबल किया गया था। प्रोटीन घटकों के सही, अंतर लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक उत्परिवर्तन को स्वतंत्र रूप से उत्पन्न और लेबल किया गया था। लेबलिंग की डिग्री सभी प्रोटीनों के लिए निर्धारित की गई थी और आम तौर पर नमूने के साथ आगे बढ़ने के लिए 50% या बेहतर होने की आवश्यकता होती है।

स्थानांतरण क्षमता और दूरी का निर्धारण
ऊर्जा हस्तांतरण माप करने से पहले, दाता क्वांटम उपज, ओवरलैप अभिन्न और आर0 मान निर्धारित किए गए थे (चरण 3.4-3.6)। दाता क्वांटम उपज डाई, फ्लोरोसिन के सापेक्ष मापा गया था, जिसमें 0.1 एम एनएओएच47 में 0.79 की क्वांटम उपज है। अवशोषण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा क्वांटम उपज निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता के सापेक्ष अवशोषण की एक रैखिक साजिश उत्पन्न करने के लिए सांद्रता की एक श्रृंखला में प्राप्त किए गए थे। इन मापों में, रैखिक रेंज (0.1-1.0) में अवशोषण को मापना महत्वपूर्ण है और सभी उत्सर्जन मापों को एक ही भट्ठा सेटिंग्स के साथ उत्पन्न करने की आवश्यकता है। चूंकि इन मानों का उपयोग ओवरलैप इंटीग्रल और आर0 मानों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, इसलिए उन्हें एफआरईटी स्थितियों के तहत मापा जाना चाहिए। प्रोटीन स्थानीय वातावरण डाई उत्सर्जन को गहराई से प्रभावित करता है और परिणामस्वरूप, दाता क्वांटम पैदावार को जांच की गई प्रत्येक साइट के लिए मापा जाना चाहिए। हम ध्यान दें कि एसईसीए और एसईसीवाईईजी पर साइटें चिमेरा के फोए हिस्से की तुलना में आर0 मूल्यों को अधिक दृढ़ता से प्रभावित करती हैं। एक ही एसईसीए या एसईसीवाईईजी साइट के साथ डाई जोड़े के लिए, आर0 मान आमतौर पर एक दूसरे के 5 ए के भीतर होते हैं; जबकि आर0 मान दो अलग-अलग एसईसीए स्थानों (अवशेष 37 बनाम 321) के लिए 20 ए से भिन्न हो सकते हैं, प्रत्येक डाई जोड़ी (तालिका 1) के लिए आर0 मूल्यों को निर्धारित करने के महत्व को रेखांकित करते हैं।

आर0 की गणना मानती है कि दाता और स्वीकर्ता रंजक स्वतंत्र रूप से घूर्णन कर रहे हैं और जिस डिग्री पर रंजक घूमते नहीं हैं, वह माप में समग्र अनिश्चितता में योगदान देता है। रंगों की सापेक्ष गति और उनके झुकाव को उचित रूप से ध्यान में रखने के लिए, विभिन्न लेबलिंग पदों में सभी दाता और स्वीकर्ता रंगों पर स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति अनिसोट्रॉपी माप किए गए थे। ये मान, जो 0.10-0.21 रेंज में थे, का उपयोग दूरी माप 2,3,48 से जुड़ी त्रुटिकी गणना करने के लिए किया गया था। दाता और स्वीकर्ता रंगों दोनों के लिए देखे गए अपेक्षाकृत उच्च अनिसोट्रॉपी मान डाई रोटेशन में कमी के अनुरूप हैं, जो मुक्त रोटेशन की धारणा के साथ असंगत है। मुक्त रोटेशन की कमी दूरी की गणना में 19% -25% की त्रुटि उत्पन्न करती है। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, इससे अधिकतम 15 ए की मापी गई दूरी में औसत अनिश्चितता ±। एफआरईटी दूरी का मानचित्रण करते समय, दूरी माप में ये अनिश्चितताएं एक महत्वपूर्ण विचार हैं, जैसा कि नीचे चर्चा की गई है।

दाता-स्वीकर्ता जोड़े के बीच गणना की गई दूरी दक्षता और दूरी के बीच संबंध पर आधारित है, जिसमें एक उच्च दक्षता कम दूरी से अलग दाता-स्वीकर्ता जोड़े का संकेत है। एफआरईटी क्षमता निर्धारित करने के लिए, दाता उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (488 एनएम) पर उत्तेजित प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दाता-केवल और दाता-स्वीकर्ता नमूनों पर प्राप्त किया जाता है। आमतौर पर, दाता उत्सर्जन तीव्रता में कमी ऊर्जा हस्तांतरण (चरण 5.1) की उपस्थिति को दर्शाती है। चित्रा 1 जी में एसईसीए 37 अवशेषों के लिए दाता-स्वीकर्ता स्पेक्ट्रा को फोआ चिमेरा के अवशेष 2 या 22 के साथ दर्शाया गया है। एसईसीए 37 अवशेषों को एएफ 647 या स्वीकर्ता डाई के साथ लेबल किया गया है, और फोआ अवशेषों को एएफ 488 या दाता डाई के साथ लेबल किया गया है। किसी भी स्थिति में, दाता प्रतिदीप्ति कम हो जाती है और दाता-स्वीकर्ता नमूनों में स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति तीव्रता में थोड़ी वृद्धि देखी जा सकती है। चूंकि उत्तेजना 488 एनएम के दाता उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर की जाती है, जो सीधे स्वीकर्ता को उत्तेजित नहीं करती है, इसलिए किसी भी स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति ने ऊर्जा हस्तांतरण के परिणाम देखे। इस प्रकार, दाता तीव्रता में कमी और स्वीकर्ता तीव्रता में सहवर्ती वृद्धि दो रंगों के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के परिणामस्वरूप होती है। गौरतलब है कि दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता स्वीकर्ता की उपस्थिति में फोए 22 स्थिति (पीला) के सापेक्ष फोए 2 स्थिति (नीला) के लिए अधिक है। दाता तीव्रता में कमी में यह सापेक्ष अंतर इंगित करता है कि फोए 2 अवशेषों और एसईसीए 37 अवशेषों के बीच ऊर्जा हस्तांतरण फोए 22 और एसईसीए 37 अवशेषों के बीच हस्तांतरण से कमजोर है, जिसका अर्थ है कि फोए 2 अवशेष फोए 22 की तुलना में एसईसीए 37 से दूर स्थित है। दक्षता और आर0 मानों (चरण 5.1.4) के बीच संबंध से दूरी निर्धारित की जाती है।

चूंकि स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति माप औसतन दो या दो से अधिक दूरी का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, इसलिए हमने समय-हल प्रतिदीप्ति माप भी किया। इन प्रयोगों के लिए, दाता डाई के जीवनकाल को स्वीकर्ता (चित्रा 1 जी) की उपस्थिति और अनुपस्थिति में मापा जाता है। यदि मापा स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति दक्षता में योगदान देने वाली दो अलग-अलग ऊर्जा हस्तांतरण प्रक्रियाएं थीं, तो उन्हें विचारशील जीवनकाल के रूप में देखा जाएगा, बशर्ते वे साधन के समय संकल्प के भीतर हल करने योग्य हों। जीवनकाल को हल करने की क्षमता को बढ़ाने के लिए, शिखर पर 10,000 गिनती या उससे अधिक एकत्र की जानी चाहिए; हालांकि, शिखर ऊंचाई या चोटी चैनल गिनती अधिग्रहण के समय और नमूने को संभावित क्षति के साथ संतुलित करने की आवश्यकता है। समय-हल किए गए मापों ने प्रत्येक दाता-स्वीकर्ता जोड़ी के लिए केवल एक अभिविन्यास या रंगों के बीच की दूरी के अनुरूप एकल जीवनकाल प्राप्त किया। हम ध्यान दें कि हमारी एफआरईटी मैपिंग तकनीक द्वारा प्रकट क्षेत्रों में देखी गई दूरी में छोटे अंतर से हमारे सिस्टम में हल करने योग्य जीवनकाल नहीं होगा। इसके अलावा, समय-हल प्रतिदीप्ति माप द्वारा निर्धारित क्षमताएं स्थिर-राज्य माप से निर्धारित लोगों के साथ अच्छे समझौते में थीं, आगे समर्थन प्रदान करती हैं कि मापा क्षमता डाई जोड़े3 के बीच केवल एक दूरी से उत्पन्न होती है।

3-आयामी संरचना पर एफआरईटी दूरी का मानचित्रण
अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण माप बाध्यकारी साइट और एसईसीए पर सिग्नल अनुक्रम के अभिविन्यास की पहचान करने के लिए पर्याप्त दूरी की जानकारी प्रदान करते हैं। एसईसीए-फोआ चिमेरा के फोए क्षेत्र पर चार पदों के साथ-साथ एसईसीए और एसईसीवाईईजी पर तीन स्थान बाध्यकारी साइट (तालिका 1) को मैप करने के लिए उपयोग की जाने वाली 12 अलग-अलग दूरी प्रदान करते हैं। सिग्नल अनुक्रम33 की बाध्यकारी साइट की पहचान करने के लिए थर्मोटोगा मैरिटिमा सेकए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) की त्रि-आयामी एक्स-रे कोक्रिस्टल संरचना पर बारह दूरी को मैप किया गया था। एसईसीए-सेकिएग कॉम्प्लेक्स की संरचना ई कोलाई में देखी गई समान है जैसा कि इन विवो फोटोक्रॉसलिंकिंग अध्ययन55 द्वारा प्रमाणित किया गया है।

हम एसईसीए-फोए चिमेरा में फोए सिग्नल अनुक्रम की शुरुआत (फोए 2) और अंत (फोए 22) अवशेषों का उपयोग करते हैं ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स पर अवशेष स्थानों की पहचान कैसे की गई थी। चूंकि ऊर्जा हस्तांतरण सभी दिशाओं में हो सकता है, एफआरईटी दूरी और संबंधित त्रुटियां एक गोलाकार खोल का वर्णन करती हैं, जिसमें दाता-स्वीकर्ता जोड़ी से डाई स्थानों में से एक को केंद्र के रूप में नामित किया जाता है। इस अध्ययन में, अवशेष एसईसीए 37, एसईसीए 321 और एसईसीवाई 2 9 2 तीन गोलाकार गोले के केंद्र बनाते हैं जो सिग्नल अनुक्रम के फोए 2 अवशेषों के स्थान का वर्णन करते हैं। तीन अलग-अलग स्थानों, एसईसीए 37 (मैजेंटा), एसईसीए 321 (बैंगनी), और एसईसीवाई 292 (सियान) से उत्पन्न अतिव्यापी क्षेत्रों के दृश्य चित्रा 3 में दिखाए गए हैं। प्रत्येक एफआरईटी खोल का केवल एक हिस्सा प्रोटीन संरचना के साथ प्रतिच्छेद करता है, और उस खोल के भीतर आने वाले अवशेषों और रीढ़ की हड्डी को हाइलाइट किया जाता है। इस प्रकार, एसईसीए 37-फोए 2 दूरी द्वारा परिभाषित खोल के भीतर प्रोटीन क्षेत्रों को मैजेंटा (चित्रा 3 ए, ई) में दिखाया गया है, जबकि एसईसीए 321-फोए 2 और एसईसीवाई 2 9 2-फोए 2 गोले द्वारा परिभाषित क्षेत्रों को क्रमशः बैंगनी (चित्रा 3 बी, एफ) और सियान (चित्रा 3 सी, जी) में दिखाया गया है। पुटेटिव बाइंडिंग साइट, जिसमें मुख्य रूप से दो-हेलिक्स उंगली शामिल है, को हरे रंग में दिखाया गया है।

जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, इनमें से प्रत्येक एफआरईटी गोले प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के अपेक्षाकृत बड़े खंड को परिभाषित करता है। सभी तीन स्थानों के लिए, एफआरईटी खोल पुटेटिव बाइंडिंग साइट के साथ प्रतिच्छेद करता है; हालाँकि, SecA321 अवशेषों के लिए, उदाहरण के लिए, प्रतिच्छेदित क्षेत्र छोटा है और पेचदार मचान डोमेन के साथ महत्वपूर्ण ओवरलैप के साथ उंगलियों के सिरों की ओर स्थित है। चौराहा या सभी तीन एफआरईटी गोले (चित्रा 3 डी, एच) का सामान्य क्षेत्र, फोए 2 अवशेषों के स्थान को परिभाषित करता है। यह क्षेत्र प्रत्येक एफआरईटी खोल की तुलना में काफी छोटा है और पेचदार मचान से बड़े योगदान के साथ टीएचएफ का केवल एक छोटा सा हिस्सा शामिल है। एफआरईटी गोले उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्क्रिप्ट और आणविक दृश्य कार्यक्रम, पायमोल के लिए प्रतिच्छेदित क्षेत्र, पूरक जानकारी में दिए गए हैं। गोले के कुछ हिस्सों को पूरक आंकड़े 1-3 में एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स पर गुलाबी बिंदुओं के रूप में देखा जाता है।

फोए 22 अवशेषों के स्थान की पहचान करने के लिए एक समान रणनीति का उपयोग किया गया था। फोए 22 एफआरईटी दूरी (चित्रा 4 ए-सी, ई-जी) द्वारा परिभाषित एफआरईटी गोले फोए 2 अवशेषों (चित्रा 4 डी, एचबनाम चित्रा 3 डी, एच) के सापेक्ष एक छोटे क्षेत्र का वर्णन करते हैं। हम इस अंतर की व्याख्या यह सुझाव देने के लिए करते हैं कि फोए 2 अवशेष और संबंधित क्षेत्र फोए 22 की तुलना में अधिक लचीला और लेबिल हैं। गौरतलब है कि फोए 22 अवशेषों के लिए जिम्मेदार क्षेत्र टीएचएफ की नोक और एसईसीवाईईजी चैनल के मुंह के करीब स्थित है, जिसमें सामान्य क्षेत्र (चित्रा 3 डी, एच) में एसईसीवाई के क्षेत्रों की पहचान की गई है। सभी तीन डाई युग्मन पुटेटिव बाइंडिंग साइट के साथ क्षेत्रों की पहचान करते हैं; हालांकि, प्रतिच्छेदित सामान्य क्षेत्र पीएचओए 2 स्थान (चित्रा 3 डी, एच) के सापेक्ष टीएचएफ के विपरीत छोर पर फोए 22 स्थान (चित्रा 4 डी, एच) को केंद्रित करते हैं। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रीप्रोटीन का सिग्नल अनुक्रम जो अवशेष 2-22 से फैला हुआ है, अपेक्षाकृत असंरचित अवस्था में टीएचएफ के साथ स्थित है। यह परिणाम पहले के अध्ययनों के अनुरूप है जो संकेत अनुक्रम एक विस्तारित अवस्था में टीएचएफ के साथ प्रोटीन को बांधता है और बी सबटिलिस क्रिस्टल संरचना में एसईसीए का सी-टर्मिनल अंत अनिवार्य रूप से सिग्नल पेप्टाइड की संरचना को मॉडल करता है और एक ही स्थान पर कब्जा कर लेता है (लाल चित्रा 1 एफ में दिखाया गया है)2,26 . हमने सिग्नल अनुक्रम और प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र के बंधन और अभिविन्यास को परिभाषित करने के लिए एसईसीए-फोए प्रीप्रोटीन चिमेरा के प्रारंभिक परिपक्व क्षेत्र (अवशेष 37 और 45) में दो स्थानों की पहचान करने के लिए एक समान दृष्टिकोण नियोजित किया जैसा कि नीचे चर्चा की गई है। अन्य अध्ययनों में एफआरईटी दूरी का उपयोग मौजूदा संरचना या आणविक गतिशीलता-व्युत्पन्न मॉडल 18,19,56 को परिष्कृत करने के लिए प्रभावी ढंग से किया गया है; हम ऐसा करने में सक्षम नहीं थे, क्योंकि एसईसीए से बंधे सिग्नल अनुक्रम के लिए कोई संरचना मौजूद नहीं है।  

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि एफआरईटी स्पेक्ट्रा के साथ सेकए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स में लेबलिंग साइटें (ए-डी) एसईसीए-एसईसीवाईजी सह-क्रिस्टल संरचना (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) 33 के चार अलग-अलग विचार जिसमें एसईसीए 37, एसईसीए 321 और एसईसीवाई 2 9 2 की लेबलिंग साइटों को क्रमशः मैजेंटा, वायलेट और सियान क्षेत्रों के रूप में दिखाया गया है। ए-सी कॉम्प्लेक्स के साइड व्यू हैं और डी एक शीर्ष दृश्य है। एसईसीए को हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है, एसईसीवाईईजी को गहरे भूरे रंग में दिखाया गया है और पुटेटिव बाइंडिंग साइट, टीएचएफ को हरे रंग में दिखाया गया है। (ई) एसईसीए-फोआ चिमेरा निर्माण की योजनाबद्ध, जो एसईसीए प्रोटीन को सेर-ग्लाइ लिंकर (पैमाने पर तैयार नहीं) के माध्यम से फोए प्रीप्रोटीन से जोड़ती है। चिमेरा के फोआ भाग पर लेबलिंग साइटें नीले, हरे, पीले और लाल रंग में दी गई हैं, जो अवशेष 2, 22, 37 और 45 के अनुरूप हैं। (एफ) बी सबटिलिस एसईसीए प्रोटीन (पीडीबीआईडी: 1 एम 6 एन) की क्रिस्टल संरचना का रिबन आरेख डोमेन द्वारा रंगीन जहां न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग डोमेन 1 और 2 क्रमशः नीले और हल्के नीले रंग में दिखाए जाते हैं, प्रीप्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग डोमेन को सोने में दिखाया गया है, हरे रंग में केंद्रीय हेलिक्स, सियान में दो-हेलिक्स उंगली, गहरे हरे रंग में पेचदार विंग डोमेन और लालरंग में सी-टर्मिनल लिंकर . असंरचित सी-टर्मिनस पिछले एफआरईटी मैपिंग अध्ययन 2 के आधार पर बाध्य फोए सिग्नल पेप्टाइड के मॉडल के रूप में कार्य करताहै। (जी) केवल दाता के स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा और एसईसीए 37-एएफ 647 और फोए 2-एएफ 488 एफआरईटी जोड़ी और एसईसीए 37-एएफ 647 और फोए 22-एएफ 488 एफआरईटी जोड़ी के दाता-स्वीकर्ता नमूने। दाता-स्वीकर्ता नमूने के लिए दाता तीव्रता में कमी ऊर्जा हस्तांतरण का संकेत है। दाता तीव्रता में कमी के आधार पर फोए 2 साइट के सापेक्ष पीएचओए 22 से अधिक ऊर्जा हस्तांतरण होता है। (एच) समय-हल प्रतिदीप्ति दाता केवल (मैजेंटा) और दाता-स्वीकर्ता (प्रकाश मैजेंटा) एसईसीए 37-एएफ 647 और फोए 22-एएफ 488 एफआरईटी जोड़ी के क्षय स्पेक्ट्रा। साधन प्रतिक्रिया फ़ंक्शन ग्रे में दिखाया गया है। दाता-स्वीकर्ता कॉम्प्लेक्स एक छोटा क्षय देता है और परिणामस्वरूप ऊर्जा हस्तांतरण के अनुरूप एक तेज जीवनकाल देता है। सभी आणविक संरचनाएं इंगित पीडीबी फ़ाइल और पायमोल50 के साथ उत्पन्न हुई थीं। चित्रा 1ई-एच झांग एट अल 3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरसेंस प्रोग्राम का यूजर इंटरफेस( ए) उद्घाटन विंडो को लाल एम के चारों ओर एक सर्कल के साथ दिखाया गया है। यह फ्लोरोमीटर के साथ प्रोग्राम कनेक्ट करने के लिए क्लिक किया जाना चाहिए। (बी) प्रयोग सेट-अप विंडो विभिन्न क्षेत्रों (मोनोस, डिटेक्टरों, सहायक उपकरण) को दर्शाती है जहां स्कैन प्रासंगिक पैरामीटर दर्ज किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एफआरईटी दूरी गोले एसईसीए-फोए 2 स्थिति के लिए निर्धारित किए गए हैं। एफआरईटी दूरी और संबंधित अनिश्चितताओं (तालिका 1) से निर्मित एफआरईटी दूरी के गोले को एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) पर दर्शाया गया है। (ए-सी) केंद्र की स्थिति में क्रमशः एसईसीए 37 (मैजेंटा), एसईसीए 321 (वायलेट), और एसईसीवाई 2 9 2 (सियान) के साथ निर्मित फोए 2 स्थान के लिए एफआरईटी दूरी के गोले। गोले केंद्र अवशेषों के अनुसार रंगीन होते हैं। (डी) तीन एफआरईटी गोले का प्रतिच्छेदन नीले रंग में दिखाए गए फोए 2 के स्थान को परिभाषित करता है। (ई-एच) दृश्यों को ए-डी से लगभग 180 ° घुमाया जाता है। सभी आणविक संरचनाएं इंगित पीडीबी फ़ाइल और पायमोल50 के साथ उत्पन्न हुई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एफआरईटी दूरी गोले एसईसीए-फोए 22 स्थिति के लिए निर्धारित किए गए हैं। एफआरईटी दूरी और संबंधित अनिश्चितताओं (तालिका 1) से निर्मित एफआरईटी दूरी के गोले को एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) पर दर्शाया गया है। (ए-सी) केंद्र की स्थिति में क्रमशः एसईसीए 37 (मैजेंटा), एसईसीए 321 (वायलेट) और एसईसीवाई 292 (सियान) के साथ निर्मित फोए 22 स्थान के लिए एफआरईटी दूरी के गोले। गोले केंद्र अवशेषों के अनुसार रंगीन होते हैं। (डी) तीन एफआरईटी गोले का प्रतिच्छेदन पीले रंग में दिखाए गए फोए 22 के स्थान को परिभाषित करता है। (ई-एच) दृश्यों को ए-डी से लगभग 180 ° घुमाया जाता है। सभी आणविक संरचनाएं इंगित पीडीबी फ़ाइल और पायमोल50 के साथ उत्पन्न हुई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पीएचओए 2, फोआ 22, फोए 37, और फोए 45 के एफआरईटी-मैप किए गए स्थानों को बी सबटिलिस सेकए -जियोबैसिलस थर्मोडेनिट्रिफिकन्स एसईसीवाईई कोक्रिस्टल संरचना (पीडीबीआईडी: 5 ईयूएल) पर प्रक्षेपित किया गया है। टीएचएफ के अंत में डाले गए ओएमपीए पेप्टाइड सब्सट्रेट को गुलाबी रंग में दिखाया गया है। एफआरईटी-मैप किए गए क्षेत्रों को एटीपी-αS की उपस्थिति में उत्पन्न किया गया था, जिसमें फोए 2 नीले रंग में दिखाया गया था, हरे रंग में फोए 22, पीले रंग में फोए 37 और लाल रंग में फोए 45 दिखाया गया था। ओवरलैप क्षेत्रों को जैतून (फोए 22 और फोए 37) और नारंगी (फोए 37 और फोए 45) में दिखाया गया है। पेप्टाइड सब्सट्रेट (अवशेष 749-791, सियान) को मूल संरचना से निकाला गया था और संरचना में किसी भी बदलाव के बिना पुटेटिव बाइंडिंग क्षेत्र में मॉडलिंग की गई थी (लाल रंग में परिक्रमा की गई)। (बी) मॉडलिंग पेप्टाइड सब्सट्रेट का बढ़ा हुआ दृश्य। ओएमपीए पेप्टाइड सब्सट्रेट के अवशेष 2 (लिस), 22 (टायर), और 37 (ग्लाई) को क्रमशः नीले, हरे और पीले रंग में छड़ी के रूप में दर्शाया गया है। मॉडलिंग पेप्टाइड्स में ये अवशेष अनुमानित एफआरईटी मैप किए गए स्थानों के साथ उत्कृष्ट समझौते का प्रदर्शन करते हैं। स्पष्टता के लिए, मूल संरचना में नैनोबॉडी को छोड़ दिया गया है। इस आंकड़े को झांग एट अल 3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एसईसीए-फोआ-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स पर लेबल साइट एसईसीए-फोआ चिमेरा के फोए पेप्टाइड भाग पर लेबल साइट
फोए 2-एएफ 488 फोए 22-एएफ 488 फोए 37-एएफ 488 फोए 45-एएफ 488
एसईसीए 37-एएफ 467-फोआ
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
एफआरईटी दक्षता 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
दूरी 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
एसईसीए 321-एएफ 647-फोआ
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
एफआरईटी दक्षता 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
दूरी 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
फोए 2-एएफ 647 फोए 22-एएफ 647 फोए 37-एएफ 647 फोए 45-एएफ 647
सेक्शन 292-एएफ 488 ईजी
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
एफआरईटी दक्षता 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
दूरी 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
संदर्भ 3 से अनुकूलित।
एंगस्ट्रॉम में दिए गए आर 0 मानों की गणना पाठ में वर्णित के रूप में की गई थी
एफआरईटी दक्षता की गणना स्वीकर्ता की उपस्थिति में दाता प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी से की गई थी जैसा कि वर्णित है। त्रुटि को तीन स्वतंत्र मापों से एसडी के रूप में रिपोर्ट किया गया है।
दाता-स्वीकर्ता दूरी (आर) एंगस्ट्रॉम में दी जाती है और पाठ में वर्णित के रूप में गणना की जाती है। त्रुटि प्रयोगात्मक त्रुटि के विचार से परिणाम की सूचना दी और रंगों के अभिविन्यास से उत्पन्न होती है।  डाई अभिविन्यास स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति अनिसोट्रॉपी से अनुमान लगाया जाता है

तालिका 1: एसईसीए-फोए-सेकिएग कॉम्प्लेक्स के लिए निर्धारित स्थानांतरण क्षमता और दूरी। प्रीप्रोटीन बाइंडिंग साइट के मानचित्रण के लिए उपयोग की जाने वाली 12 दूरी के लिए एफआरईटी क्षमता, दूरी और आर0 मान दिए गए हैं।

अनुपूरक चित्र 1: गुलाबी डॉट्स में दिखाए गए एफआरईटी दूरी खोल, एसईसीए 37 अवशेषों और एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) पर फोआ 37 अवशेषों के लिए निर्धारित किया गया है। सेकंड ए को हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है, एसईसीवाईईजी को गहरे भूरे रंग में दिखाया गया है और एसईसीए 37 अवशेषों को मैजेंटा में दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2: गुलाबी डॉट्स में दिखाए गए एफआरईटी दूरी खोल, एसईसीए 321 अवशेषों और एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) पर फोआ 37 अवशेषों के लिए निर्धारित किया गया है। सेकंड ए को हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है, एसईसीवाईईजी को गहरे भूरे रंग में दिखाया गया है और एसईसीए 321 अवशेषों को वायलेट में दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 3: गुलाबी डॉट्स में दिखाए गए एफआरईटी दूरी खोल, एसईसीवाई 292 अवशेषों और एसईसीए-एसईसीवाईईजी कॉम्प्लेक्स (पीडीबीआईडी: 3 डीआईएन) पर फोआ 37 अवशेषों के लिए निर्धारित किया गया है। एसईसी ए को हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है, एसईसीवाईईजी को गहरे भूरे रंग में दिखाया गया है और एसईसीवाई 292 अवशेषों को सियान में दिखाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एफआरईटी मैपिंग पद्धति के उपयोग के माध्यम से, हमने एसईसीए प्रोटीन पर सिग्नल अनुक्रम बाध्यकारी साइट की पहचान की। महत्वपूर्ण बात यह है कि परिसर की 3-डी क्रिस्टल संरचना की उपस्थिति ने हमारे अध्ययन को बहुत सुविधाजनक बनाया। इस मानचित्रण पद्धति की ताकत लेबलिंग के लिए स्थानों की पहचान करने के लिए मौजूदा संरचना का उपयोग करने की क्षमता में निहित है। इस पद्धति का उपयोग 3-डी संरचना निर्धारित करने के लिए नहीं किया जा सकता है; हालाँकि, संरचनात्मक तत्वों का निर्धारण56, एक मौजूदा संरचनाका शोधन 49, एक बाध्यकारी साइट स्थान 2,32 का निर्धारण, या गतिशील गति57 का स्पष्टीकरण, इस पद्धति के सभी संभावित अनुप्रयोग हैं।

SecYEG-SecA-FoA कॉम्प्लेक्स में, तीन लेबलिंग साइटें पुटेटिव बाइंडिंग साइट (चित्रा 1) के चारों ओर एक त्रिकोण बनाती हैं। इस त्रिभुज के कोने से एक ही अवशेष तक कई दूरी माप का रोजगार जीपीएस नेविगेशन विधियों के समान स्थान की जानकारी को परिष्कृत करता है। सिग्नल अनुक्रम में चार साइटों, फोए 2, फोए 22, फोए 37, फोए 37, फोए 45 और सिग्नल पेप्टाइड (तालिका 1) के स्थान के मानचित्रण के लिए कुल 12 दूरी देने के लिए प्रीप्रोटीन के शुरुआती परिपक्व क्षेत्र के साथ एसईसीए और एसईसीवाई 2 9 2 पर तीन साइटों, एसईसीए 37, एसईसीए 341 और एसईसीवाई 2 9 2 की पहचान की गई थी। महत्वपूर्ण बात यह है कि दूरी माप की सटीकता में सुधार करने के लिए, लेबलिंग साइटों को प्रोटीन के अपेक्षाकृत स्थिर क्षेत्रों में स्थित होना चाहिए, जैसे कि छोरों के बजाय माध्यमिक संरचना तत्वों में। इसके अलावा, साइटों को उन स्थानों पर भी होना चाहिए जो लेबलिंग की दक्षता में आसानी और वृद्धि के लिए विलायक के लिए अपेक्षाकृत सुलभ हैं। एसईसीए-फोआ-सेकिएग कॉम्प्लेक्स के भीतर, बाध्यकारी सब्सट्रेट में अवशेषों के लिए त्रिकोण साइटों या कोने से दूरी माप का प्रदर्शन अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र (चित्रा 3 डी, एच और चित्रा 4 डी, एच) के लिए बाध्यकारी सब्सट्रेट में अवशेषों का पता लगाने के लिए पर्याप्त था। कई दूरी माप से प्रतिच्छेदित क्षेत्र की पहचान एकल दूरी माप से स्थान को काफी परिष्कृत करती है, जैसा कि चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया गया है। इस प्रकार, इस पद्धति का उपयोग करते समय, कई दूरी के माप की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। यद्यपि यह विधि बाध्यकारी में शामिल अणुओं के क्षेत्रों की पहचान कर सकती है, उदाहरण के लिए, यह सटीक संरचनात्मक जानकारी प्रदान नहीं करती है; इस तरह की जानकारी अन्य संरचनात्मक तरीकों जैसे एक्स-रे, एनएमआर और क्रायो-ईएम से सबसे अच्छी तरह से प्राप्त की जाती है। एफआरईटी दूरी का उपयोग मौजूदा संरचना18,19 या मॉडल को प्रभावी ढंग से परिष्कृत करने के लिए किया जा सकता है, इस मामले में, यह संभव नहीं था क्योंकि एसईसीए से बंधे सिग्नल अनुक्रम का कोई मॉडल मौजूद नहीं है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाई लेबलिंग केवल वांछित स्थानों पर होती है और एफआरईटी दूरी माप सटीक हैं, लेबलिंग के लिए उत्परिवर्तन का उपयोग पसंद किया जाता है। एक सिस-कम उत्परिवर्ती की पीढ़ी के लिए साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन विधियों का उपयोग करके अन्यथा जंगली प्रकार के प्रोटीन में सेर या इसी तरह के अवशेषों के लिए सिस अवशेषों के अपेक्षाकृत रूढ़िवादी उत्परिवर्तन की आवश्यकता होती है। वर्तमान अध्ययन में, सिस म्यूटेशन को37 लेबलिंग के लिए एसईसीए और एसईसीवाईईजी के सिस-मुक्त संस्करणों में पेश किया गया था। उत्परिवर्ती प्रोटीन की गतिविधि को एक विकास परख के साथ सत्यापित किया गया था, जिसके बाद इन विट्रो मैलाकाइट ग्रीन एटीपीस परख41,42 था। प्रासंगिक गतिविधि परख प्रोटीन के कार्य पर निर्भर करते हैं, उदाहरण के लिए डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए, एक डीएनए बाध्यकारी परख उपयुक्त58 होगा। केवल एक स्थान पर लेबलिंग सुनिश्चित करने में विफलता एक ही डाई के साथ एक से अधिक साइटों की लेबलिंग का कारण बन सकती है, जो दूरी निर्धारण को काफी जटिल बनाती है। इस प्रकार, एक ही प्रोटीन पर एक दूसरे लेबल की शुरूआत साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन द्वारा अप्राकृतिक अमीनो एसिड के समावेश के माध्यम से की जा सकती है। हमने इस पद्धति को अप्राकृतिक अमीनो एसिड, पी-एज़िडोफेनीलएलनिन और क्लिक रसायन विज्ञान 39,40 के साथ लेबलिंग पेश करके सिस अवशेषों से अलग स्थानों पर एसईसीए-फोआ चिमेरा को लेबल करनेके लिए नियोजित किया।

इस पद्धति का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण विचार उपयोग किए जाने वाले रंगों की पसंद और संबंधित आर0 मान है। संभावित लेबलिंग साइटों की पहचान के बाद, मापा जाने वाली दूरी का अनुमान 3-डी संरचना से लगाया जा सकता है। इस जानकारी के साथ, जांचकर्ता आर0 मानों के साथ रंजक जोड़े चुन सकते हैं जो अपेक्षित दूरी की वांछित सीमा को फैलाते हैं। उदाहरण के लिए, एएफ 488-एएफ 647 डाई जोड़ी में 55.7 ए की गणना की गई आर0 है जो पुटेटिव बाइंडिंग साइट से अनुमानित 40-75 ए दूर स्थित साइटों को लेबलिंग के लिए एक अच्छी श्रृंखला प्रदान करती है। यद्यपि चरण 2.2 में गणना किए गए आर0 मान आपके सिस्टम के लिए किस डाई जोड़ी का उपयोग करने के लिए चुनने के लिए उपयोगी हैं, प्रोटीन के लिए रंगों का लगाव उनके गुणों को काफी बदल सकता है। अधिक सटीकता के लिए, आर0 मानों की गणना लेबल प्रोटीन (चरण 3.1 - 3.6.5) के साथ किए गए सीटू प्रयोगों से की जानी चाहिए।

स्थानांतरण दक्षता का मापन या तो स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की निगरानी करके और दाता उत्सर्जन में कमी या स्वीकर्ता उत्सर्जन में वृद्धि का अवलोकन करके किया जा सकता है। यद्यपि दोनों प्रभावों का अवलोकन वांछनीय है, दक्षता की गणना 5,8 वर्णित के रूप में या तो की जा सकती है। दक्षता की गणना दाता-केवल नमूने के सापेक्ष दाता-स्वीकर्ता नमूने में दाता जीवनकाल में कमी से भी की जा सकती है। एक से अधिक विधियों द्वारा दक्षता के निर्धारण की सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से मापी गई क्षमताओं की सापेक्ष एकरूपता स्थापित करने के लिए समय-हल किए गए तरीकों का उपयोग।

मैपिंग विधि ने हमें सिग्नल अनुक्रम के सापेक्ष अभिविन्यास और एसईसीए और पुटेटिव बाइंडिंग साइट के सापेक्ष फोए प्रीप्रोटीन के शुरुआती परिपक्व क्षेत्रों को निर्धारित करने की अनुमति दी। एक एसईसीए-सेकिएग एक्स-रे क्रिस्टल संरचना और बाद में क्रायो-ईएम अध्ययन ने सिग्नल अनुक्रम की संरचना और चैनल और एसईसीए34,35 के संबंध में प्रीप्रोटीन के शुरुआती परिपक्व क्षेत्र के बारे में स्पष्टता प्रदान की। एक्स-रे संरचना में, ओएमपीए प्रीप्रोटीन के अवशेष 1-41 दो-हेलिक्स उंगली की नोक से जुड़े थे और चैनल में एक हेयरपिन संरचना में कल्पना की गई थी (गुलाबी, चित्रा 5 में दिखाया गया है)। एसईसीए-फोआ चिमेरा में चार फोआ अवशेषों के स्थानों को ऊपर वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके इस संरचना पर मैप किया गया था। जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, फोए 37 और फोए 45 अवशेषों (पीले, नारंगी, लाल) का स्थान फोए 2 और फोए 22 के बीच में है, जिसमें फोए 45 फोए 2 के करीब है। इन निष्कर्षों, विशेष रूप से फोए 45 के स्थान ने सुझाव दिया कि फोए प्रीप्रोटीन एक हेयरपिन संरचना बना रहा था।

हमारी एफआरईटी-पहचानी गई बाध्यकारी साइट को और अधिक मान्य करने के लिए, हमने चैनल से 41 अवशेष प्रीप्रोटीन संरचना को बाहर निकालकर और इसे एफआरईटी मैपिंग (चित्रा 5, सियान) द्वारा परिभाषित क्षेत्रों में मॉडलिंग करके, ओएमपीए प्रीप्रोटीन के साथ हमारे मैप किए गए स्थानों की तुलना की। प्रीप्रोटीन एक्स-रे संरचना के किसी भी परिवर्तन के बिना, हम पाते हैं कि ओएमपीए प्रीप्रोटीन टुकड़ा संरचना पर अवशेष 2, 22 और 37 (नीले, हरे और पीले रंग में दिखाया गया है) के स्थान एफआरईटी मैप किए गए स्थानों (चित्रा 5 बी) के साथ उल्लेखनीय रूप से अच्छी तरह से सहमत हैं और सुझाव देते हैं कि हेयरपिन चैनल प्रविष्टि से पहले बनता है। ओएमपीए प्रीप्रोटीन एक्स-रे क्रिस्टल संरचना में अवशेष 41 पर समाप्त होता है; हालाँकि, SecY का सी-टर्मिनल, जो असंरचित है, PhoA45 के संभावित स्थान का संकेत प्रदान करता है। हमारी मॉडलिंग संरचना में, हेयरपिन लूप चैनल के मुंह पर बैठता है, झिल्ली के पार प्रीप्रोटीन के अनुवाद को सुविधाजनक बनाने के लिए तैयार है। इस प्रकार, इस उदाहरण में, एफआरईटी मैपिंग पद्धति झिल्ली में प्रोटीन अनुवाद के लिए आवश्यक गतिशील गति का संकेत प्रदान करके स्थिर एसईसीए-एसईसीवाईईजी संरचना की मौजूदा जानकारी को बढ़ाती है। यद्यपि डे नोवो संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त नहीं है, यदि 3-आयामी संरचनात्मक जानकारी उपलब्ध है, तो एफआरईटी मैपिंग पद्धति बाध्यकारी साइटों और गतिशील गतियों के स्पष्टीकरण के माध्यम से संरचना-कार्य संबंधों की वर्तमान समझ को आगे बढ़ा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर 15 जीएम 135904 (आईएम को सम्मानित) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट जीएम 110552 (डीबीओ को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

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References

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Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

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