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Biochemistry

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist eine etablierte fluoreszenzbasierte Methode, mit der Abstände in und zwischen Biomolekülen sowohl in vitro als auch innerhalb von Zellen erfolgreich gemessen werden. In FRET bezieht sich die Effizienz der Energieübertragung, gemessen an Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Lebensdauer, auf den Abstand zwischen zwei fluoreszierenden Molekülen oder Markierungen. Die Bestimmung von Dynamik und Konformationsänderungen aus den Entfernungen sind nur einige Beispiele für die Anwendung dieser Methode auf biologische Systeme. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Methodik bestehende Röntgenkristallstrukturen ergänzen und verbessern, indem sie Informationen über Dynamik, Flexibilität und Anpassung an Bindungsoberflächen liefert. Wir beschreiben die Verwendung von FRET und zugehörigen Entfernungsbestimmungen zur Aufklärung struktureller Eigenschaften durch die Identifizierung einer Bindungsstelle oder der Orientierungen von Dimer-Untereinheiten. Durch die umsichtige Auswahl der Markierungsstellen und oft den Einsatz mehrerer Markierungsstrategien haben wir diese Mapping-Methoden erfolgreich angewendet, um globale strukturelle Eigenschaften in einem Protein-DNA-Komplex und dem SecA-SecYEG-Proteintranslokationssystem zu bestimmen. Im SecA-SecYEG-System haben wir FRET-Mapping-Methoden verwendet, um die Präproteinbindungsstelle zu identifizieren und die lokale Konformation der gebundenen Signalsequenzregion zu bestimmen. Diese Studie beschreibt die Schritte zur Durchführung von FRET-Mapping-Studien, einschließlich der Identifizierung geeigneter Markierungsstellen, der Diskussion möglicher Markierungen einschließlich nicht-nativer Aminosäurereste, der Markierungsverfahren, der Durchführung von Messungen und der Interpretation der Daten.

Introduction

Für Proteine führt die Aufklärung der Dynamik zusammen mit 3-dimensionalem (3-D) Strukturwissen zu einem verbesserten Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen biomolekularer Systeme. Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie und kryogene Elektronenmikroskopie erfassen eine statische Struktur und erfordern häufig die Bestimmung mehrerer Strukturen, um Aspekte der Biomolekülbindung und -dynamik aufzuklären1. In diesem Artikel wird eine lösungsbasierte Methode zum Zuordnen globaler Strukturelemente wie Bindungsstellen oder Bindungsinteraktionen erläutert, die potenziell vorübergehender sind und von statischen Methoden weniger leicht erfasst werden können. Starke Kandidatensysteme für diese Methodik sind solche, bei denen eine 3D-Struktur zuvor durch Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie oder andere Strukturmethoden bestimmt wurde. In diesem Fall nutzen wir die Röntgenkristallstruktur des SecA-SecYEG-Komplexes, einem zentralen Akteur im allgemeinen Sekretionsweg des Proteins, um die Position einer Signalpeptid-Bindungsstelle mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) vor dem Transport des Präproteins über die Membranabzubilden 2. Die Manipulation des biologischen Systems durch genetische Modifikationen in Verbindung mit unserem Wissen über die 3-D-Struktur ermöglichte die Bestimmung der Konformation der Signalsequenz und der frühen reifen Region unmittelbar vor dem Einfügen in den Kanal 3.

FRET beinhaltet die strahlungslose Übertragung von Energie von einem Molekül (Donor) zu einem anderen (Akzeptor) in einer entfernungsabhängigen Weise, die durch Raum 4,5 erfolgt. Die Effizienz dieses Transfers wird entweder durch eine Abnahme des Spenders oder eine Erhöhung der Akzeptorfluoreszenzintensität überwacht. Die Effizienz der Energieübertragung kann wie folgt beschrieben werden:

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

wobei derR0-Wert der Abstand ist, bei dem die Übertragung einen Wirkungsgradvon 50 % aufweist 6. Die Technik wurde zuvor als molekulares Lineal beschrieben und ist wirksam bei der Bestimmung von Abständen im Bereich von 2,5-12 nm, abhängig von der Identität der Spender-Akzeptor-Farbstoffe 4,7,8,9. Die Fluoreszenzintensitäten und Lebensdauern des Spenders mit oder ohne Akzeptor ermöglichen die Bestimmung der Transfereffizienzen und folglich der Abstände 5,8. Aufgrund der Verfügbarkeit der Technologie, der Empfindlichkeit der Methode und der Benutzerfreundlichkeit hat FRET auch breite Anwendung in Bereichen wie der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und der konfokalen Mikroskopiegefunden 6. Das Aufkommen fluoreszierender Proteine wie grün fluoreszierendes Protein hat die Beobachtung der intrazellulären Dynamik und der Lebendzellbildgebung relativ einfach gemacht10,11. Viele FRET-Anwendungen wie diese werden in dieser virtuellen Ausgabe ausführlich diskutiert.

In dieser Studie konzentrieren wir uns insbesondere auf die Verwendung von FRET-Messungen, um Abstandswerte zur Bestimmung struktureller Details zu erhalten. Bisher wurden FRET-Messungen effektiv verwendet, um die Konformation von DNA-Molekülen zu bestimmen, wenn sie an Protein 12,13,14, die interne Dynamik von Proteinen und Proteinbindungsinteraktionen 15,16,17 gebunden sind. Die Vorteile dieser Methode liegen in der Fähigkeit, flexible und dynamische Strukturelemente in einer Lösung mit relativ geringen Materialmengen zu bestimmen. Bezeichnenderweise ist diese Methode besonders effektiv, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen Strukturinformationen verwendet wird, und kann nicht als Mittel zur 3D-Strukturbestimmung verwendet werden. Die Methode bietet den besten Einblick und die beste Verfeinerung der Struktur, wenn die Arbeit auf vorhandenen Strukturinformationen aufbaut, die häufig mit einer computergestützten Simulation gekoppelt sind18,19. Hierbei wird die Verwendung von Abständen beschrieben, die aus stationären und zeitaufgelösten FRET-Messungen gewonnen werden, um eine Bindungsstelle, deren Lage nicht bekannt war, auf einer bestehenden kristallographischen Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes, Hauptproteinen im allgemeinen sekretorischen Weg3, abzubilden.

Der allgemeine sekretorische Weg, ein hochkonserviertes System von Prokaryoten über Eukaryoten bis hin zu Archaeen, vermittelt den Transport von Proteinen entweder über oder in die Membran zu ihrem funktionellen Ort in der Zelle. Für gramnegative Bakterien, wie E. coli, den in unserer Studie verwendeten Organismus, werden Proteine in das Periplasma eingeführt oder über diese transloziert. Der bakterielle SecY-Kanalkomplex (Translokon genannt) koordiniert sich mit anderen Proteinen, um das neu synthetisierte Protein zu translozieren, das durch eine Signalsequenz, die sich typischerweise am N-Terminus20,21 befindet, zu seiner korrekten Position in der Zelle geleitet wird. Für Proteine, die für das Periplasma gebunden sind, assoziiert das ATPase SecA-Protein mit dem Austrittstunnel des Ribosoms und mit dem Präprotein, nachdem etwa 100 Reste transzitiert wurden22. Zusammen mit dem SecB-Chaperonprotein hält es das Präprotein in einem entfalteten Zustand. SecA bindet an den SecYEG-Translokon und erleichtert durch viele Zyklen der ATP-Hydrolyse den Proteintransport über die Membran23,24.

SecA ist ein Multi-Domain-Protein, das in zytosolischer und membrangebundener Form vorkommt. SecA ist ein homodimeres Protein im Zytosol und besteht aus einer Präproteinbindungs- oder Vernetzungsdomäne25, zwei Nukleotid-bindenden Domänen, einer helikalen Flügeldomäne, einer spiralförmigen Gerüstdomäne und dem Zwei-Helix-Finger (THF) 26,27,28,29 (Abbildung 1). In früheren kristallographischen Studien des SecA-SecYEG-Komplexes deutete die Lage des THF darauf hin, dass er aktiv an der Proteintranslokation beteiligt war, und nachfolgende Vernetzungsexperimente mit dem Signalpeptid belegten die Bedeutung dieser Region bei der Proteintranslokation30,31. Frühere Studien unter Verwendung der FRET-Mapping-Methodik zeigten, dass exogene Signalpeptide an diese Region von SecA 2,32 binden. Um die Konformation und Lage der Signalsequenz und der frühen reifen Region des Präproteins vor dem Einfügen in den SecYEG-Kanal vollständig zu verstehen, wurde eine Proteinchimäre erstellt, in der die Signalsequenz und die Reste der früh reifen Region durch einen Ser-Gly-Linker an SecA gebunden wurden (Abbildung 1). Unter Verwendung dieses biologisch lebensfähigen Konstrukts wurde weiter gezeigt, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins parallel an den THF binden2. Anschließend wurde die FRET-Mapping-Methodik verwendet, um die Konformation und Position der Signalsequenz und der frühen reifen Region in Gegenwart von SecYEG aufzuklären, wie untenbeschrieben 3.

Die Kenntnis der 3D-Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes33,34,35 und der möglichen Lage der Bindungsstelle ermöglichte es uns, Spender-Akzeptor-Etiketten umsichtig an Orten zu platzieren, an denen der Schnittpunkt einzelner FRET-Entfernungen den Standort der Bindungsstelle identifiziert. Diese FRET-Mapping-Messungen zeigten, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins eine Haarnadel bilden, wobei sich die Spitze an der Mündung des SecYEG-Kanals befindet, was zeigt, dass die Haarnadelstruktur vor dem Einfügen des Kanals mit einer Vorlage versehen ist.

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Protocol

1. Auswahl der Kennzeichnungsstellen

  1. Identifizieren Sie mindestens drei potenzielle Markierungsstellen, um die mutmaßliche Bindungsstelle auf den vorhandenen Proteinstrukturen zu triangulieren. In diesem Fall wurden SecA, SecYEG und Präprotein, die durch genetische Fusion an SecA gebunden sind, identifiziert2.
    1. Wählen Sie Markierungsstellen innerhalb von 25-75 Å der mutmaßlichen Bindungsstelle und in relativ statischen Regionen des Proteins bestimmt der Abstand das spezifische FRET-Farbstoffpaar, das verwendet werdensoll 36. Lokalisieren Sie die Markierungsstellen in Proteinregionen, die sich relativ voneinander unterscheiden, so dass die Stellen die Eckpunkte eines Dreiecks mit der mutmaßlichen Bindungsstelle in der Mitte beschreiben (Abbildung 1A-D).
    2. Führen Sie Cysteinrückstände (Cys) an Markierungsstellen von Interesse in einem Protein ein, das keine anderen Cys-Rückstände enthält, um die Markierungseffizienz der spezifischen Stellezu verbessern 37,38.
    3. Unnatürliche Aminosäuren, z.B. p-Azidophenylalanin zur Markierung mit Klickchemie einführen, um ein Protein an zwei verschiedenen Positionen mit unterschiedlichen Farbstoffen effektiv zu markieren39,40.
    4. Testen Sie die Cys-Mutanten auf Funktionsverlust. Überprüfen Sie die Aktivität der Cys-losen Mutante und der unnatürlichen Aminosäuremutante mit einem geeigneten Aktivitätsassay. In diesem Fall wurde die Aktivität mit einem Wachstumsassay überprüft, gefolgt von einem in vitro Malachit-Green-ATPase-Assay32,41,42

2. Kennzeichnung des Proteins

  1. Reinigen Sie das Protein oder die Proteine von Interesse auf mindestens 95% Reinheit für eine genaue Markierung. Reinigen Sie SecA- und SecYEG-Proteine gemäß den in Referenz3 aufgeführten Protokollen. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 5 μg gereinigtes Protein für diesen Schritt haben, da während des Markierungsprozesses etwas Protein verloren geht.
  2. Wählen Sie zwei Farbstoffe für FRET-Messungen in Abhängigkeit von ihremR0-Wert und den vorhergesagten Abständen zwischen den markierten Standorten. SchätzenSie R0-Werte und beobachten Sie die Überlappung von Donoremission und Akzeptorabsorption unter Verwendung der Informationen aus der fluoreszierenden Proteindatenbank, die auch Spektren für häufig verwendete Farbstoffe liefert (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    HINWEIS: R 0 ist definiert als der Abstand, bei dem derÜbertragungswirkungsgrad für ein gegebenes Farbstoffpaar 50% beträgt. Für Mapping-Experimente sollten die vorhergesagten Entfernungen nahe demR0-Wert des Farbstoffpaares liegen, um sicherzustellen, dass die Entfernungen genau gemessen werden können.
  3. Beschriften Sie die in Schritt 1.1.1 identifizierten Positionen. mit dem Spender-Akzeptor-Farbstoffpaar.
    1. Kennzeichnen Sie das Protein gemäß den Anweisungen des Herstellers unter besonderer Berücksichtigung von Parametern wie optimaler Proteinkonzentration, Temperatur, pH-Wert, Zeitdauer und Puffer für die spezifischen verwendeten Farbstoffe43,44.
    2. Das Protein wird in einer Konzentration von 1-2 mg/ml oder etwa 10 μM in einem 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) Puffer hergestellt. Farbstoff in Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mM auflösen. Fügen Sie den Farbstoff unter Rühren tropfenweise zur Lösung hinzu, um ein Farbstoff: Proteinmolverhältnis von 5:1 (50 μM Farbstoff: 10 μM Protein) zu erreichen.
    3. Lassen Sie die Reaktion 4 h bei Raumtemperatur (RT) in einem Glasfläschchen mit sanftem Schaukeln oder über Nacht bei 4 °C ablaufen. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie β-Mercaptoethanol hinzufügen.
      HINWEIS: Wenn Protein nicht mit Tris-Puffer kompatibel ist, können Phosphat- oder HEPES-Puffer verwendet werden. Halten Sie den pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,5 aufrecht. Wenn das Protein Disulfidbindungen aufweist, fügen Sie vor der Markierung ein Reduktionsmittel wie DTT oder TCEP hinzu. Entfernen Sie DTT durch Dialyse oder Gelfiltration, bevor Sie Farbstoff hinzufügen.
  4. Für genaue FRET-Messungen entfernen Sie den freien Farbstoff mit einem Zentrifugalkonzentrator mit einem geeigneten Molekulargewichts-Cut-off (MWCO), um den freien Farbstoff durchfließen zu lassen, während das markierte Protein erhalten bleibt.
    1. Bereiten Sie die Konzentratormembran vor, indem Sie ~ 1 ml Wasser in den oberen Teil eines 3-ml-Konzentrators geben und dann das Wasser durch die Membran zentrifugieren (mindestens 10 min bei 4.300 x g).
    2. Entfernen Sie den freien Farbstoff, indem Sie die markierte Probe im Konzentrator zentrifugieren (20 min bei 4.300 x g). Wiederholen Sie dies 3-4 Mal und entsorgen Sie den Durchfluss.
    3. Überprüfen Sie die Markierungseffizienz des markierten Proteins mithilfe der UV-Vis-Absorptionsspektroskopie.
      HINWEIS: FRET-Messungen erfordern Kennzeichnungswirkungsgrade von 50% oder mehr. Geringere Kennzeichnungseffizienzen reduzieren das FRET-Signal und können zu Ungenauigkeiten bei der Messung führen.
    4. Erhalten Sie ein UV-Vis-Spektrum des markierten Proteins mit einem Bereich von 250-700 nm, um sowohl das Proteinabsorptionsband als auch das maximale Farbstoffabsorptionsband zu beobachten. Messen Sie die Absorption an der Absorptionsspitze des Farbstoffs und bei 280 nm für Protein.
    5. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und korrigieren Sie alle Beiträge des Farbstoffs mit dem Korrekturfaktor CF und den folgenden Gleichungen45,46:
      Equation 1
      wobei C die Konzentration des Proteins (M), A 280 die Probenabsorption bei 280 nm, A max die Absorption am Farbstoffabsorptionsmaximum, ε Protein der Extinktionskoeffizient für das Protein bei 280 nm und CF der Korrekturfaktor ist, A'280/A'max, wobei A'280 die Absorption bei 280 nm und A'max die Absorption am Peak-Maximum für den Farbstoff ist.
    6. Bestimmen Sie die Beschriftungseffizienz mithilfe der folgenden Gleichung:
      Equation 2
      wobei ε Farbstoff der molare Extinktionskoeffizient des Farbstoffs ist, C die Konzentration des Proteins gemäß Schritt 2.4.5 und E die Markierungseffizienz ist. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2, bis der Etikettiereffizienzwert ein Plateau erreicht hat und weniger als 100 % beträgt.

3. Ermitteln Sie die R0-Werte

  1. MessenSie die R0-Werte in situ. Bereiten Sie zwei Proteinproben mit der gleichen Konzentration des Gesamtproteins vor, 4 μM, eine mit dem Protein, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist, und eine mit dem Protein, das nur mit dem Akzeptorfarbstoff markiert ist. Für SecA eignet sich eine Proteinkonzentration von 4 μM SecA-Monomer gut für diese Messungen.
    1. Bereiten Sie Probenvolumina von 2,5 ml für eine 1 cm x 1 cm große Küvette, 600 μL für eine 5 mm x 5 mm Küvette oder 200 μL für eine 3 mm x 3 mm Küvette vor.
  2. Schalten Sie das Fluorometer ein und öffnen Sie das Spektralerfassungs- und Analyseprogramm in der Fluoreszenzsoftware, wenn Sie ein Spektrofluorometer verwenden. Klicken Sie auf das rote M, um den Computer mit dem Gerät zu verbinden (Abbildung 2A) und wählen Sie Emission Spectra.
    1. Geben Sie über den Menüpunkt "Experiment sammeln" Scanparameter wie die Anregungswellenlänge, den Bereich für den Emissionsscan, die Temperatur und die Position des Probenwechslers ein (Figure 2B).
    2. Klicken Sie auf RTC und optimieren Sie die Instrumenteneinstellungen (z. B. spektrale Schlitze), indem Sie die Fluoreszenzemission am Peak mit einer Anregungswellenlänge überwachen, die auf das Absorptionsmaximum des Farbstoffs eingestellt ist. Legen Sie für SecA die folgenden Einstellungen fest: Bandpass als 1 nm; Anregungs- und Emissionsschlitze als 1 bzw. 1,5 mm, wobei die Temperatur bei 25 °C und die Rührgeschwindigkeit bei 250 U/min liegen.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Anzahl pro Sekunde (cps) Kapazität des Instruments (typischerweise 2 x 106 cps).
  3. Legen Sie die vom Spender markierte Proteinprobe in den Probenhalter und klicken Sie auf Ausführen , um einen Emissionsscan des Proteins zu erstellen, das nur mit dem Spenderfarbstoff markiert ist (nur Spenderprotein), indem Sie die Probe am Farbstoffabsorptionsmaximum anregen (z. B. 488 nm für AF488) und über den Emissionspeak scannen (505-750 nm für SecA-Protein nur für Spender, das mit AF488 markiert ist).
  4. Legen Sie eine Baseline für den Scan fest, indem Sie den Scan um 25 bis 50 nm über das Ende des Peaks hinaus verlängern. Messen Sie die Quantenausbeute des reinen Spenderproteins, indem Sie Absorptions- und Fluoreszenzmessungen an Proben unterschiedlicher Konzentration durchführen, wie beschrieben47. Pflegen Sie die gleichen Spalteinstellungen für diese Messungen.
    1. Verwenden Sie freien Donorfarbstoff als Referenz für die Quantenausbeute. Erhalten Sie mindestens vier Messungen des reinen Spenderproteins und des freien Farbstoffs in verschiedenen Konzentrationen für eine genaue Bestimmung.
    2. Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität oder den integrierten Bereich im Vergleich zur Absorption für das reine Spenderprotein und den freien Farbstoff oder die Referenz auf. Bestimmen Sie die Steigungen für das reine Spenderprotein (SteigungD) und die Referenz (SteigungR).
    3. Die Quantenausbeute (Φ) wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
      Equation 3
      hier ist Φ D die Quantenausbeute des reinen Donorproteins, Φ R ist die Quantenausbeute des freien Farbstoffs (diese kann in der Regel vom Hersteller bezogen werden), Steigung D und Steigung R sind die in Schritt 3.4.2 für das reine Donorprotein bzw. Referenz bestimmten Steigungen und η D und ηR stellen den Brechungsindex des reinen Spenderproteins bzw. der referenzfreien Farbstofflösungen dar 47.
  5. Erhalten Sie ein Absorptionsspektrum Ihres reinen Akzeptorproteins mit einer Zelllänge von 1 cm. Erzeugen Sie ein Extinktionskoeffizientenspektrum Ihres reinen Akzeptorproteins, indem Sie das Absorptionsspektrum durch die Farbstoffkonzentration dividieren.
  6. Erzeugen Sie das spektrale Überlappungsintegral J (λ) mit einem grafischen Analyseprogramm. Für diesen Prozess kann auch ein Standard-Arbeitsblattprogramm (z. B. Tabellenkalkulation) verwendet werden.
    1. Multiplizieren Sie das Fluoreszenzemissionsspektrum des reinen Donorproteins (Schritt 3.4) mit dem Extinktionskoeffizientenspektrum des reinen Akzeptorproteins, um das Überlappungsspektrum zu erzeugen.
    2. Multiplizieren Sie das resultierende Überlappungsspektrum mit λ4.
    3. Bestimmen Sie die Fläche unter der Kurve durch Integration des Überlappungsbereichs. Die Überlappungsregion ist definiert als der Bereich, in dem das Spenderemissionsspektrum multipliziert mit dem Akzeptorextinktionskoeffizientenspektrum positive Werte ergibt. Das spektrale Überlappungsintegral ist definiert als:
      Equation 4
      wobei FD (λ) das Emissionsspektrum des reinen Donorproteins (erhalten in Schritt 3.4) und εA(λ) das Extinktionskoeffizientenspektrum des reinen Akzeptorproteins ist und Einheiten von M-1 cm-1(erhalten in Schritt 3.5) aufweist. Das resultierende spektrale Überlappungsintegral sollte Einheiten von M-1 cm-1nm 4 haben.
    4. Normalisieren Sie das spektrale Überlappungsintegral. Teilen Sie das Überlappungsintegral durch den integrierten Bereich des reinen Donorproteinspektrums über den gleichen Spektralbereich:
      Equation 5
    5. Berechnen Sie den Wert R0 in Å mit der folgenden Gleichung:
      Equation 6
      wobei κ2 der Orientierungsfaktor ist, typischerweise als 2/3 für frei rotierende Farbstoffe, η der Brechungsindex ist und für verdünnte wässrige Lösungen als 1,33 angenähert werden kann, Q D die Quantenausbeute des Donors (Schritt 3.4) und J(λ) das spektrale Überlappungsintegral gemäß Schritt 3.6.35 ist. HINWEIS: Wenn sich die Farbstoffe nicht frei drehen, können Korrekturen eingeführt werden, wie von Ivanov 48 beschrieben und von Auclair49 und Zhang 2,3 implementiert.

4. Führen Sie FRET-Spektralmessungen durch

  1. Bereiten Sie Spenderprotein, reines Akzeptorprotein und Spender-Akzeptor-Proteinproben in der gleichen Konzentration vor; eine Konzentration von 4 μM wird empfohlen. Verwenden Sie 200 μL Lösung, wenn Sie eine 3 mm x 3 mm große Küvette verwenden, 600 μL bei Verwendung einer 5 mm x 5 mm Küvette oder 2,5 ml, wenn Sie eine 1 cm x 1 cm große Küvette verwenden.
    1. Bereiten Sie die Spender-Akzeptor-Proteinprobe vor, indem Sie gleiche molare Mengen des Spender-Only- und des Acceptor-Only-Proteins verwenden.
    2. Halten Sie die gleiche Menge der markierten Probe in Kontrollspender- und Akzeptor-Only-Proteinproben durch die Einführung von nicht markiertem Protein in gleicher molarer Menge entweder nur für den Spender oder nur für Akzeptorproben. Zum Beispiel würde für Lösungen mit der gleichen Konzentration jede FRET-Probe nur für Spender 100 μL Spenderprotein und 100 μL unmarkiertes Protein für ein Volumen von 200 μL enthalten.
  2. Erzeugen Sie Fluoreszenzemissionsspektren nur der Spender-, Akzeptor- und Spender-Akzeptor-Proben. Optimieren Sie das Signal wie in Schritt 3.2 beschrieben. Nach der Optimierung behalten Sie die gleichen Einstellungen für alle Stichproben bei.
    1. Holen Sie sich den Scan nur für Spender, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Erregen Sie die Lösung am maximalen Absorptionsmaximum des Spenderfarbstoffs und scannen Sie über die Spender- und (erwarteten) Akzeptoremissionsspitzen.
    2. Tauschen Sie entweder die Probe in das reine Akzeptorprotein aus oder ändern Sie die Position des Probenwechslers in die Küvette, die das reine Akzeptorprotein enthält.
    3. Sie erhalten einen Emissionsscan des Proteins, das nur mit Akzeptorfarbstoff (nur Akzeptorprotein) markiert ist, mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 4.2.1. Stimulieren Sie die Probe bei der Wellenlänge der Spenderanregung.
      HINWEIS: Dieses Spektrum liefert eine Korrektur für die Menge des Akzeptors, der bei der Spenderwellenlänge angeregt wird (FA in Schritt 5.1.2).
    4. Tauschen Sie die Probe in die Spender-Akzeptor-Proteinprobe aus oder ändern Sie die Position des Probenwechslers in die Küvette, die das mit dem Spender-Akzeptor markierte Protein enthält.
    5. Es wird ein Emissionsscan der Spender-Akzeptor-Proteinprobe mit den gleichen Einstellungen wie in den Schritten 4.2.1 und 4.2.3 durchgeführt.
    6. Korrigieren Sie für alle Spektren die Hintergrundfluoreszenz, indem Sie die am Ende des Scans gemessenen Hintergrundzahlen subtrahieren.
  3. Messen Sie nur die Lebensdauer des Spenders und die Spender-Annahme-Proben, die wie in Schritt 4.1.2 beschrieben hergestellt wurden. Verwenden Sie ein zeitkorreliertes Einzelphotonen-Zähl-Fluoreszenzinstrument, das in der Lage ist, fluoreszierende Zerfälle im Nanosekunden-Zeitbereich (10-9 s) zu messen und aufzulösen.
    HINWEIS: Passen Sie bei FRET-Farbstoffpaaren die Anregungslichtquelle an das Absorptionsmaximum des Spenderfarbstoffs an.
    1. Schalten Sie das Instrument ein. Öffnen Sie die Erfassungssoftware, verwenden Sie die Gerätesteuerungssoftware für die Datenerfassung mit dem Fluoreszenzspektrometer.
    2. Wählen Sie für die Erfassung TCSPC Decay mit einem Zeitbereich von 55 ns, einer Verstärkung von 1 und 4096 Kanälen.
    3. Erhalten Sie eine Instrumentenreaktionsfunktion (IRF) unter Verwendung einer Lösung von Nicht-Milchkännchen oder kommerzieller Streulösung und überwachen Sie die Streuung bei 490 nm. Passen Sie die Spalteinstellung an und verwenden Sie bei Bedarf Neutraldichtefilter, um eine ausreichend niedrige Zählrate aufrechtzuerhalten, um eine Impulsstapelungzu vermeiden 5. Klicken Sie auf Akzeptieren und dann auf Starten. Damit wird die Akquisition beginnen.
      HINWEIS: Für eine Wiederholungsrate von 180 kHz wird eine maximale Zählrate von 4000 cps verwendet.
    4. Sammeln Sie den IRF bei 490 nm, bis der Spitzenkanal maximal 20.000 Zähler aufweist. Sammeln Sie einen IRF vor und nach der Messung jedes Fluoreszenzzerfalls.
    5. Erhalten Sie die Fluoreszenzzerfälle nur des Spenders und der Spender-Akzeptor-Proben, indem Sie die Fluoreszenzemission bei der Spenderemissionswellenlänge von 520 nm überwachen.
    6. Passen Sie die Spalteinstellungen für eine maximale Zählrate von 4000 cps oder weniger an. Die Spalteinstellungen sind typischerweise 15-20 nm Bandpass für Proteinproben. Sammeln Sie den Zerfall, bis 20.000 Zählungen im Peakkanal erhalten sind.
  4. Analysieren Sie den Zerfall oder die Fluoreszenzintensität ( I ) als Funktion der Zeit ( t) für die Fluoreszenzlebensdauer (τ). Passen Sie den Zerfall mit der folgenden Gleichung an eine Summe von Exponentialen an:
    Equation 7
    wobei α I der präexponentielle Faktor der i-ten Komponente und τ I die Lebensdauer ist. Die Passform wird mit dem IRF neu verwoben, um dem Fluoreszenzzerfall zu entsprechen. Beurteilen Sie die Qualität der Passform anhand der reduzierten Parameter Χ2.

5. Analyse von FRET-Daten

  1. Berechnen Sie die FRET-Effizienz aus der Abnahme der Spenderintensität der Spender-Akzeptor-Stichprobe relativ zum Spender nur mit der folgenden Gleichung.
    Equation 8
    wobei FDA die Fluoreszenzintensität der Spender-Akzeptor-Probe und FD die Fluoreszenzintensität der Spenderprobe auf dem Höhepunkt der Spenderfluoreszenz ist. Verwenden Sie die integrierten Bereiche der Peaks, wenn die Daten verrauscht sind.
    1. Korrigieren Sie alle Unterschiede in der Kennzeichnung zwischen der Spender-Only- und der Spender-Akzeptor-Probe. Berechnen Sie Korrekturen basierend auf dem Spendergrad der Kennzeichnung wie folgt.
      Equation 9
      wobei f DA die Spenderkennzeichnungseffizienz in der Spender-Akzeptor-Probe und fD die Etikettierungseffizienz in der reinen Spenderprobe ist.
    2. Korrigieren Sie alle Beiträge der Akzeptorfluoreszenz zum Donor-angeregten Spektrum durch Subtraktion des reinen Akzeptor-Proteinspektrums (Schritt 4.2) vom Spender-Akzeptor-Proteinspektrum.
      Equation 14
    3. Korrigieren Sie die Unterschiede in der Markierungseffizienz des Akzeptorproteins relativ zur Spender-Akzeptor-Proteinprobe, was die folgende Gleichung für die Berechnung der Effizienz ergibt:
      Equation 10
      wobei fA den Bruchteil der Akzeptorkennzeichnung bezeichnet. Diese Gleichung umfasst alle Korrekturen aufgrund der Farbstoffmarkierung und Akzeptorfluoreszenz.
    4. Berechnen Sie FRET-Abstände aus den Wirkungsgraden mit der folgenden Gleichung:
      Equation 11
      unter Verwendung des in Schritt 3.6.5 erhaltenen R0-Werts.
    5. Berechnen Sie die FRET-Effizienz unter Verwendung der Fluoreszenzlebensdauer nur des Spenders und der in Schritt 4.3.3-4.3.5 gemessenen Spender-Akzeptor-Proben:
      Equation 12
    6. Verwenden Sie die amplitudengewichtete Lebensdauer, um FRET-Wirkungsgrade zu berechnen und mit stationären Ergebnissenzu vergleichen 5.
      Equation 13
    7. Berechnen Sie den Abstand wie in Schritt 5.1.4 von den Wirkungsgraden, die durch die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden. Vergleichen Sie stationäre und zeitaufgelöste Werte für FRET-Wirkungsgrade und -Entfernungen und stellen Sie sicher, dass sie innerhalb des Fehlers voneinander liegen.

6. Kartierung der Entfernungen

  1. Verwenden Sie die berechneten Entfernungen, um die Bindungsstelle auf der dreidimensionalen Struktur abzubilden. Berechnen Sie die Abstände und Fehler für alle untersuchten Farbstoffpaare und -stellen unter Verwendung der in Schritt 5.1.4 angegebenen Gleichung undR0-Werte, die in Schritt 3.6.5 für jedes FRET-Paar erhalten wurden.
    1. Verwenden Sie ein grafisches 3D-Anzeigeprogramm wie PyMOL50, um die Entfernungen auf die Struktur abzubilden (Skript in der Zusatzdatei angegeben). Befehle aus dem Skript können direkt in das Befehlsfenster mit den entsprechenden Entfernungsinformationen eingegeben werden.
    2. Generieren Sie eine Shell für jede gemessene Entfernung und den zugehörigen Fehler (Abbildung 3, Abbildung 4, Ergänzende Abbildungen 1-3).
    3. Bilden Sie die Position durch den Schnittpunkt der verschiedenen Schalen ab (Ergänzende Abbildungen 1-3). Die Signalpeptid-Bindungsstelle wurde durch die drei verschiedenen Positionen auf SecA und SecYEG und vier verschiedene Positionen auf dem Signalpeptid abgebildet (Abbildung 1).

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Representative Results

Diese Studie konzentrierte sich auf die Bestimmung der Position der Präproteinbindungsstelle auf SecA vor dem Einfügen des Präproteins in den SecYEG-Kanal. Um die Bindungsstelle zu kartieren, wurden FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen an den Proteinen SecA und SecYEG durchgeführt (Abbildung 1A-D). Aus den erhaltenen Entfernungen und dreidimensionalen Strukturen von SecA, SecYEG und dem Präprotein wurde der Ort der Präproteinbindungsstelle vorhergesagt. Anstatt drei separate Entitäten (SecA, SecYEG und Präprotein) zu verwenden, um diese Messungen durchzuführen, wurde die PhoA-Signalsequenz nach dem Einbau eines Gly-Ser-Linkers 2,3 durch genetische Modifikation an SecA gebunden. Zur einfachen Markierung mit Farbstoffen wurden Cys-Reste oder Bernsteinmutationen an den Resten 2, 22, 35 und 45 im PhoA-Präprotein eingeführt (Abbildung 1E).

Identifizierung von Standorten und Kennzeichnung
Eine mutmaßliche Bindungsstelle für die Signalsequenz war zuvor mit ähnlichen FRET-Mapping-Methodenidentifiziert worden 2,32. Diese und andere Studien hatten den Zwei-Helix-Finger (THF) und die Präprotein-Vernetzungsdomäne als mögliche Bindungsstellen des Signalpeptids mit einer vorgeschlagenen Orientierung in einer parallelen Position zum THF 33,51,52,53,54 identifiziert (Abbildung 1F). Daher wurde die Identifizierung potenzieller Markierungsstellen auf den SecA- und SecYEG-Proteinen basierend auf der Position der mutmaßlichen Bindungsstelle in der SecA- und SecYEG-Kristallstruktur durchgeführt (grün dargestellt in Abbildung 1A-D). Drei Stellen wurden ausgewählt, um die Position der mutmaßlichen Bindungsstelle zu triangulieren, wobei im Wesentlichen die drei Standorte ein Dreieck um die mutmaßliche Bindungsstelle bilden. Wie in Abbildung 1 dargestellt, lagen die drei Standorte innerhalb des FRET-Bereichs der Bindungsstelle (50-70 Å). Das Farbstoffpaar Alexa Fluor 488 (AF488) und Alexa Fluor 647 (AF647) wurde gewählt, da derR0-Wert von 55,7 Å36 gut mit den erwarteten Abständen zwischen den markierten Stellen und der mutmaßlichen Bindungsstelle übereinstimmt und die Messgenauigkeit gewährleistet.

Die drei für die Markierung ausgewählten Stellen SecA37, SecA321 und SecY292 (in Abbildung 1A-D als Magenta-, violette und cyanfarbene Kugeln dargestellt), befinden sich im gesamten Proteinkomplex und bilden ein Dreieck um die mutmaßliche Bindungsstelle. Die drei Stellen wurden separat zu Cys-Rückständen in einer Cys-losen Mutante mutiert, um sicherzustellen, dass nur die korrekte Position mit 2,37 gekennzeichnet wurde. Für die SecY292-Experimente wurden die PhoA-Präproteinstellen mit AF647 markiert und SecY-Rest 292 mit Hilfe der Malemidchemie mit AF488 markiert. Im chimären Protein wurden die Stellen SecA37 und SecA321 mit AF647 markiert und das Präprotein mit AF488 markiert. Im chimären SecA-PhoA-Protein wurden die Reste 2, 22, 37 und 45 des PhoA-Präproteinsegments in einzelnen Proteinen jeweils zu einem bernsteinfarbenen Codon mutiert. Die bernsteinfarbenen Codon-Mutationen ermöglichten die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure, p-Azidophenylalanin, an diesen Positionen, die anschließend mit dem AF488 mittels Klickchemie39,40 markiert wurden. Jede Mutation wurde unabhängig voneinander erzeugt und markiert, um eine korrekte, differentielle Markierung der Proteinkomponenten zu gewährleisten. Der Grad der Markierung wurde für alle Proteine bestimmt und musste im Allgemeinen 50% oder besser betragen, um mit der Probe fortzufahren.

Bestimmung von Transferwirkungsgraden und -entfernungen
Vor der Durchführung der Energietransfermessungen wurden die Donorquantenausbeute, das Überlappungsintegral und dieR0-Werte bestimmt (Schritte 3.4-3.6). Die Spenderquantenausbeute wurde relativ zum Farbstoff Fluorescein gemessen, der eine Quantenausbeute von 0,79 in 0,1 M NaOH47 aufweist. Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren wurden in einer Reihe von Konzentrationen erhalten, um ein lineares Diagramm der Absorption relativ zur Fluoreszenzemissionsintensität zu erzeugen, um die Quantenausbeute zu bestimmen. Bei diesen Messungen ist es wichtig, die Absorption im linearen Bereich (0,1-1,0) zu messen, und alle Emissionsmessungen müssen mit den gleichen Spalteinstellungen generiert werden. Da diese Werte zur Bestimmung von Überlappungsintegralen undR0-Werten verwendet werden, sollten sie unter FRET-Bedingungen gemessen werden. Die lokale Proteinumgebung beeinflusst die Farbstoffemission tiefgreifend, und folglich sollten die Quantenausbeuten der Spender für jeden der untersuchten Standorte gemessen werden. Wir stellen fest, dass Standorte aufSecA und SecYEG die R0-Werte stärker beeinflussen als die auf dem PhoA-Teil der Chimäre. Für Farbstoffpaare mit derselben SecA- oderSecYEG-Stelle liegen die R0-Werte typischerweise innerhalb von 5 Å voneinander; während die R0-Werte für die beiden verschiedenenSecA-Stellen (Rückstände 37 vs. 321) um bis zu 20 Å voneinander abweichen können, unterstreicht die Bedeutung der Bestimmung vonR0-Werten für jedes Farbstoffpaar (Tabelle 1).

Die Berechnung vonR0 geht davon aus, dass die Spender- und Akzeptorfarbstoffe frei rotieren und der Grad, in dem sich die Farbstoffe nicht drehen, zur Gesamtunsicherheit in der Messung beiträgt. Um die Relativbewegung der Farbstoffe und ihre Orientierungen angemessen zu berücksichtigen, wurden stationäre Fluoreszenz-Anisotropiemessungen an allen Donor- und Akzeptorfarbstoffen in den verschiedenen Markierungspositionen durchgeführt. Diese Werte, die im Bereich von 0,10-0,21 lagen, wurden verwendet, um den Fehler zu berechnen, der mit den Entfernungsmessungen 2,3,48 verbunden war. Die relativ hohen Anisotropiewerte, die sowohl für die Donor- als auch für die Akzeptorfarbstoffe beobachtet wurden, entsprechen einer Verringerung der Farbstoffrotation, was mit der Annahme der freien Rotation unvereinbar ist. Das Fehlen einer freien Rotation erzeugt einen Fehler von 19% -25% in den Entfernungsberechnungen. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, führte dies zu einer durchschnittlichen Unsicherheit in den gemessenen Abständen von höchstens ± 15 Å. Bei der Abbildung der FRET-Entfernungen sind diese Unsicherheiten bei den Entfernungsmessungen eine wichtige Überlegung, wie unten erläutert.

Der berechnete Abstand zwischen Spender-Akzeptor-Paaren basiert auf der Beziehung zwischen Effizienz und Entfernung, in der eine höhere Effizienz auf Spender-Akzeptor-Paare hinweist, die durch einen kürzeren Abstand getrennt sind. Zur Bestimmung der FRET-Wirkungsgrade werden Fluoreszenzemissionsspektren, die bei der Wellenlänge der Donoranregung (488 nm) angeregt werden, an reinen Spender- und Spenderakzeptorproben erhalten. Typischerweise bedeutet eine Verringerung der Spenderemissionsintensität das Vorhandensein einer Energieübertragung (Schritt 5.1). Abbildung 1G zeigt die Spender-Akzeptor-Spektren für den SecA 37-Rückstand mit entweder Rückstand 2 oder 22 der PhoA-Chimäre. Der SecA37-Rückstand wird mit AF647 oder dem Akzeptorfarbstoff markiert, und die PhoA-Rückstände werden mit AF488 oder dem Spenderfarbstoff markiert. An beiden Positionen wird die Spenderfluoreszenz reduziert und eine kleine Zunahme der Akzeptorfluoreszenzintensität kann in den Spender-Akzeptor-Proben beobachtet werden. Da die Anregung bei der Donoranregungswellenlänge von 488 nm erfolgt, die den Akzeptor nicht direkt anregt, resultiert jede beobachtete Akzeptorfluoreszenz aus der Energieübertragung. Somit resultiert die Abnahme der Spenderintensität und die damit einhergehende Erhöhung der Akzeptorintensität aus der Energieübertragung zwischen den beiden Farbstoffen. Signifikanterweise ist die Fluoreszenzintensität des Spenders für die PhoA2-Position (blau) höher als für die PhoA22-Position (gelb) in Gegenwart des Akzeptors. Dieser relative Unterschied in der Abnahme der Spenderintensität deutet darauf hin, dass der Energietransfer zwischen dem PhoA2-Rückstand und dem SecA37-Rückstand schwächer ist als der Transfer zwischen den PhoA22- und SecA37-Rückständen, was bedeutet, dass der PhoA2-Rückstand weiter von SecA37 entfernt ist als PhoA22. Abstände werden aus dem Verhältnis zwischen Wirkungsgrad undR0-Werten ermittelt (Schritt 5.1.4).

Da die stationären Fluoreszenzmessungen einen Mittelwert von zwei oder mehr Entfernungen darstellen konnten, führten wir auch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen durch. Für diese Experimente wird die Lebensdauer des Spenderfarbstoffs in Anwesenheit und Abwesenheit des Akzeptors gemessen (Abbildung 1G). Wenn es zwei unterschiedliche Energieübertragungsprozesse gäbe, die zur gemessenen stationären Fluoreszenzeffizienz beitragen, würden sie als diskrete Lebensdauern beobachtet werden, vorausgesetzt, sie wären innerhalb der Zeitauflösung des Instruments auflösbar. Um die Fähigkeit zu verbessern, die Lebensdauern aufzulösen, sollten 10.000 Zählungen oder mehr auf dem Höhepunkt gesammelt werden. Die Anzahl der Spitzenhöhen oder Peakkanäle muss jedoch mit dem Zeitpunkt der Erfassung und einer möglichen Beschädigung der Probe in Einklang gebracht werden. Zeitaufgelöste Messungen ergaben eine einzelne Lebensdauer für jedes Donor-Akzeptor-Paar, das mit nur einer Orientierung oder einem Abstand zwischen den Farbstoffen übereinstimmte. Wir stellen fest, dass kleine Unterschiede in der Entfernung, wie sie in den Bereichen beobachtet werden, die durch unsere FRET-Kartierungstechnik aufgedeckt werden, nicht zu auflösbaren Lebensdauern in unserem System führen würden. Darüber hinaus stimmten die Wirkungsgrade, wie sie durch die zeitaufgelösten Fluoreszenzmessungen bestimmt wurden, in guter Übereinstimmung mit denen, die aus den stationären Messungen bestimmt wurden, was eine weitere Unterstützung dafür liefert, dass die gemessenen Wirkungsgrade nur aus einem Abstand zwischen den Farbstoffpaarenresultieren 3.

Abbildung der FRET-Abstände auf die 3-dimensionale Struktur
Die Resonanzenergieübertragungsmessungen liefern ausreichende Entfernungsinformationen, um die Bindungsstelle und die Ausrichtung der Signalsequenz auf SecA zu identifizieren. Die drei Standorte auf SecA und SecYEG zusammen mit den vier Positionen auf der PhoA-Region der SecA-PhoA-Chimäre liefern die 12 verschiedenen Entfernungen, die zur Kartierung der Bindungsstelle verwendet wurden (Tabelle 1). Die zwölf Entfernungen wurden auf die dreidimensionale Röntgenkokristallstruktur des Thermotoga maritima SecA-SecYEG-Komplexes (PDBID: 3DIN) abgebildet, um die Bindungsstelle der Signalsequenz33 zu identifizieren. Die Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes ähnelt derjenigen, die in E. coli beobachtet wurde, wie eine in vivo Photocrosslinking-Studie 55 zeigt.

Wir verwenden die Anfangs- (PhoA2) und Endrückstände (PhoA22) der PhoA-Signalsequenz in der SecA-PhoA-Chimäre, um zu veranschaulichen, wie Rückstandsorte auf dem SecA-SecYEG-Komplex identifiziert wurden. Da die Energieübertragung in alle Richtungen erfolgen kann, beschreiben die FRET-Abstände und die damit verbundenen Fehler eine sphärische Schale, wobei eine der Farbstoffpositionen des Spender-Akzeptor-Paares als Zentrum bezeichnet wird. In dieser Studie bilden die Reste SecA37, SecA321 und SecY292 die Zentren von drei sphärischen Schalen, die die Lage des PhoA2-Rests der Signalsequenz beschreiben. Die Darstellung der überlappenden Bereiche, die sich aus den drei getrennten Standorten SecA37 (Magenta), SecA321 (lila) und SecY292 (cyan) ergeben, ist in Abbildung 3 dargestellt. Nur ein Teil jeder FRET-Schale schneidet sich mit der Proteinstruktur, und die Rückstände und das Rückgrat, die in diese Schale fallen, werden hervorgehoben. So sind die Proteinregionen innerhalb der durch den SecA37-PhoA2-Abstand definierten Hülle in Magenta (Abbildung 3A,E) dargestellt, während die durch die SecA321-PhoA2- und SecY292-PhoA2-Schalen definierten Bereiche violett (Abbildung 3B,F) bzw. cyan (Abbildung 3C,G) dargestellt sind. Die mutmaßliche Bindungsstelle, die hauptsächlich aus dem Zwei-Helix-Finger besteht, ist grün dargestellt.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, definiert jede dieser FRET-Schalen einen relativ großen Abschnitt des Proteinkomplexes. Für alle drei Standorte schneidet sich die FRET-Shell mit der mutmaßlichen Bindungsstelle. Für den SecA321-Rückstand ist beispielsweise die Schnittfläche jedoch kleiner und liegt an den Enden der Finger mit deutlicher Überlappung mit der spiralförmigen Gerüstdomäne. Der Schnittpunkt oder die gemeinsame Fläche aller drei FRET-Schalen (Abbildung 3D,H) definiert die Position des PhoA2-Rückstands. Diese Fläche ist wesentlich kleiner als jede FRET-Schale und umfasst nur einen kleinen Teil des THF mit einem großen Beitrag des spiralförmigen Gerüsts. Die Skripte, die zum Generieren der FRET-Shells und der überschnittenen Bereiche für das molekulare Visualisierungsprogramm PyMOL verwendet werden, sind in den ergänzenden Informationen angegeben. Teile der Schalen werden als rosa Punkte auf dem SecA-SecYEG-Komplex in den Ergänzungsabbildungen 1-3 visualisiert.

Eine ähnliche Strategie wurde verwendet, um den Ort des PhoA22-Rückstands zu identifizieren. Die durch die FRET-Abstände von PhoA22 definierten FRET-Schalen (Abbildung 4A-C,E-G) beschreiben eine kleinere Fläche relativ zum PhoA2-Rest (Abbildung 4D,H vs. Abbildung 3D,H). Wir interpretieren diesen Unterschied so, dass der PhoA2-Rückstand und die assoziierte Region flexibler und labiler sind als PhoA22. Bezeichnenderweise befindet sich der Bereich, der dem PhoA22-Rückstand zugeschrieben wird, näher an der Spitze des THF und der Mündung des SecYEG-Kanals, wobei Bereiche von SecY im gemeinsamen Bereich identifiziert wurden (Abbildung 3D, H). Alle drei Farbstoffpaarungen identifizieren Regionen zusammen mit der mutmaßlichen Bindungsstelle; Die überschnittenen öffentlichen Bereiche zentrieren jedoch den PhoA22-Standort (Abbildung 4D, H) am gegenüberliegenden Ende des THF relativ zum PhoA2-Standort (Abbildung 3D, H). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Signalsequenz des Präproteins, die sich von den Resten 2-22 erstreckt, entlang des THF in einem relativ unstrukturierten Zustand liegt. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Studien überein, die darauf hindeuten, dass die Signalsequenz in einem ausgedehnten Zustand an das Protein entlang des THF bindet und dass das C-terminale Ende von SecA im B. subtilis-Kristall im Wesentlichen die Struktur des Signalpeptids modelliert und die gleiche Stelle einnimmt (in roter Abbildung 1F dargestellt)2,26 . Wir verwendeten einen ähnlichen Ansatz, um zwei Orte in der frühreifen Region (Reste 37 und 45) der SecA-PhoA-Präproteinchimäre zu identifizieren, um die Bindung und Orientierung der Signalsequenz und der frühen reifen Region weiter zu definieren, wie unten diskutiert. In anderen Studien wurden FRET-Abstände effektiv verwendet, um ein bestehendes Struktur- oder Molekulardynamik-Simulationsmodell zu verfeinern, das von der Simulation abgeleitet wurde18,19,56; Dies ist uns nicht gelungen, da keine Struktur für die an SecA gebundene Signalsequenz existiert.  

Figure 1
Abbildung 1: Markierungsstellen im SecA-SecYEG-Komplex mit repräsentativen FRET-Spektren. (A-D) Vier verschiedene Ansichten der SecA-SecYEG-Co-Kristallstruktur (PDBID: 3DIN)33, in denen die Markierungsstellen von SecA37, SecA321 und SecY292 als Magenta-, violette und cyanfarbene Kugeln dargestellt sind. A-C sind Seitenansichten des Komplexes und D ist eine Draufsicht. SecA ist hellgrau, SecYEG dunkelgrau und die mutmaßliche Bindungsstelle, die THF, grün dargestellt. (E) Schematische Darstellung des SecA-PhoA-Chimärenkonstrukts, das das SecA-Protein über einen Ser-Gly-Linker (nicht maßstabsgetreu) mit dem PhoA-Präprotein verbindet. Die Markierungsstellen auf dem PhoA-Teil der Chimäre sind in Blau, Grün, Gelb und Rot angegeben, entsprechend den Rückständen 2, 22, 37 und 45. (F) Farbbanddiagramm der Kristallstruktur des B. subtilis SecA-Proteins (PDBID: 1M6N) nach Domäne gefärbt, wobei die Nukleotid-bindenden Domänen 1 und 2 in Blau bzw. Hellblau dargestellt sind, die Präprotein-Vernetzungsdomäne in Gold, die Zentralhelix in Grün, der Zwei-Helix-Finger in Cyan, die Helixflügeldomäne in Dunkelgrün und der C-Terminal-Linker in Rot26 . Der unstrukturierte C-Terminus dient als Modell des gebundenen PhoA-Signalpeptids, das auf einer früheren FRET-Mapping-Studie2 basiert. (G) stationäre Fluoreszenzspektren des reinen Spenders und Spenderakzeptorproben des FRET-Paares SecA37-AF647 und PhoA2-AF488 sowie des FRET-Paares SecA37-AF647 und PhoA22-AF488. Die Verringerung der Spenderintensität für die Spender-Annahme-Probe ist ein Hinweis auf den Energietransfer. Eine größere Energieübertragung erfolgt von PhoA22 relativ zur PhoA2-Stelle, basierend auf der Abnahme der Spenderintensität. (H) Time-resolved fluorescence donor only (magenta) und donor-acceptor (light magenta) decay spectra of the SecA37-AF647 and PhoA22-AF488 FRET pair. Die Instrumentenansprechfunktion ist grau dargestellt. Der Donor-Akzeptor-Komplex führt zu einem kürzeren Zerfall und folglich zu einer schnelleren Lebensdauer, die mit der Energieübertragung übereinstimmt. Alle molekularen Strukturen wurden mit der angegebenen PDB-Datei und PyMOL50 erzeugt. Abbildung 1E-H wurde gegenüber Zhang et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Benutzeroberfläche des FluorEssence-Programms. (A) Das sich öffnende Fenster wird mit einem Kreis um das rote M dargestellt. Dies muss angeklickt werden, um das Programm mit dem Fluorometer zu verbinden. (B) Das Fenster zum Versuchsaufbau veranschaulicht die verschiedenen Bereiche (Monos, Detektoren, Zubehör), in denen scanrelevante Parameter eingegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: FRET-Distanzschalen, die für die SecA-PhoA2-Position bestimmt wurden. FRET-Distanzschalen, die aus den FRET-Abständen und den damit verbundenen Unsicherheiten (Tabelle 1) konstruiert wurden, sind auf dem SecA-SecYEG-Komplex (PDBID: 3DIN) dargestellt. (A-C) FRET-Distanzschalen für den PhoA2-Standort, die mit SecA37 (Magenta), SecA321 (violett) bzw. SecY292 (Cyan) an der Mittelposition konstruiert sind. Die Schalen werden entsprechend dem Mittelrest eingefärbt. (D) Der Schnittpunkt der drei FRET-Schalen definiert die Position von PhoA2, blau dargestellt. (E-H) Die Ansichten werden von A-D um ca. 180° gedreht. Alle molekularen Strukturen wurden mit der angegebenen PDB-Datei und PyMOL50 erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: FRET-Distanzschalen, die für die SecA-PhoA22-Position bestimmt wurden. FRET-Abstandsschalen, die aus den FRET-Abständen und den damit verbundenen Unsicherheiten (Tabelle 1) konstruiert wurden, sind auf dem SecA-SecYEG-Komplex (PDBID: 3DIN) dargestellt. (A-C) FRET-Distanzschalen für den PhoA22-Standort, die mit SecA37 (Magenta), SecA321 (violett) bzw. SecY292 (Cyan) an der Mittelposition konstruiert wurden. Die Schalen werden entsprechend dem Mittelrest eingefärbt. (D) Der Schnittpunkt der drei FRET-Schalen definiert die Position von PhoA22, gelb dargestellt. (E-H) Die Ansichten werden von A-D um ca. 180° gedreht. Alle molekularen Strukturen wurden mit der angegebenen PDB-Datei und PyMOL50 erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: FRET-kartierte Positionen von PhoA2, PhoA22, PhoA37 und PhoA45 projiziert auf die B. subtilis SecA-Geobacillus thermodenitrificans SecYE Kokristallstruktur (PDBID: 5EUL). (A) Färbung von SecA-SecYE wie in Abbildung 1. Das OmpA-Peptidsubstrat, das am Ende des THF eingefügt wurde, ist rosa dargestellt. FRET-kartierte Regionen wurden in Gegenwart von ATP-γS generiert, wobei PhoA2 in Blau, PhoA22 in Grün, PhoA37 in Gelb und PhoA45 in Rot dargestellt waren. Überlappungsregionen sind oliv (PhoA22 und PhoA37) und orange (PhoA37 und PhoA45) dargestellt. Das Peptidsubstrat (Reste 749-791, Cyan) wurde aus der ursprünglichen Struktur herausgeschnitten und in den mutmaßlichen Bindungsbereich modelliert, ohne dass die Struktur verändert wurde (rot eingekreist). (B) Erweiterte Ansicht des modellierten Peptidsubstrats. Die Reste 2 (Lys), 22 (Tyr) und 37 (Gly) des OmpA-Peptidsubstrats sind in Stockform in Blau, Grün bzw. Gelb dargestellt. Diese Reste in den modellierten Peptiden zeigen eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit den vorhergesagten FRET-kartierten Standorten. Der Klarheit halber wurde der Nanobody in der ursprünglichen Struktur weggelassen. Diese Figur wurde von Zhang et al.3 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

beschrifteter Standort auf SecA-PhoA-SecYEG-Komplex Markierte Stelle auf PhoA-Peptid-Teil von SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET-Effizienz 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
Abstand 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET-Effizienz 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
Abstand 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET-Effizienz 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
Abstand 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
angepasst an Referenz 3.
R0-Werte, die in Angström angegeben sind, wurden wie im Text beschrieben berechnet
Die FRET-Effizienz wurde aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität des Spenders in Gegenwart des Akzeptors wie beschrieben berechnet. Der Fehler wird als SD aus drei unabhängigen Messungen gemeldet.
Spender-Akzeptor-Abstände (R) werden in Angström angegeben und wie im Text beschrieben berechnet. Der gemeldete Fehler resultiert aus einer Betrachtung des experimentellen Fehlers und des Fehlers, der sich aus der Ausrichtung der Farbstoffe ergibt.  Die Farbstofforientierung wird aus der stationären Fluoreszenzanisotropie abgeschätzt

Tabelle 1: Für den SecA-PhoA-SecYEG-Komplex ermittelte Übertragungswirkungsgrade und -abstände. FRET-Wirkungsgrade, Entfernungen undR0-Werte werden für die 12 Abstände angegeben, die für die Abbildung der Präproteinbindungsstelle verwendet werden.

Ergänzende Abbildung 1: FRET-Abstandsschale, dargestellt in rosa Punkten, bestimmt für den SecA37-Rückstand und den PhoA-37-Rückstand auf dem SecA-SecYEG-Komplex (PDBID: 3DIN). Sec A ist hellgrau, SecYEG dunkelgrau und der SecA37-Rest in Magenta dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: FRET-Abstandsschale, dargestellt in rosa Punkten, bestimmt für den SecA321-Rückstand und den PhoA-37-Rückstand auf dem SecA-SecYEG-Komplex (PDBID: 3DIN). Sec A ist hellgrau, SecYEG dunkelgrau und der SecA321-Rückstand violett dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: FRET-Abstandsschale, dargestellt in rosa Punkten, bestimmt für den SecY292-Rückstand und den PhoA-37-Rückstand auf dem SecA-SecYEG-Komplex (PDBID: 3DIN). Sec A ist hellgrau, SecYEG dunkelgrau und der SecY292-Rest in Cyan dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Durch die Verwendung der FRET-Mapping-Methodik identifizierten wir die Signalsequenz-Bindungsstelle auf dem SecA-Protein. Wichtig ist, dass das Vorhandensein einer 3D-Kristallstruktur des Komplexes unsere Studie erheblich erleichtert hat. Die Stärke dieser Mapping-Methodik liegt in der Fähigkeit, eine vorhandene Struktur zu verwenden, um Standorte für die Kennzeichnung zu identifizieren. Diese Methodik kann nicht verwendet werden, um eine 3D-Struktur zu bestimmen; Die Bestimmung der Strukturelemente 56, die Verfeinerung einer bestehenden Struktur49, die Bestimmung einer Bindungsstelle 2,32 oder die Aufklärung der dynamischen Bewegung57 sind jedoch mögliche Anwendungen dieser Methode.

Im SecYEG-SecA-PhoA-Komplex bilden die drei Markierungsstellen ein Dreieck um die mutmaßliche Bindungsstelle (Abbildung 1). Die Verwendung mehrerer Entfernungsmessungen von den Eckpunkten dieses Dreiecks zum gleichen Rückstand verfeinert die Standortinformationen ähnlich wie bei GPS-Navigationsmethoden. Drei Standorte, SecA37, SecA341 und SecY292, wurden auf SecA und SecY zusammen mit vier Stellen, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 in der Signalsequenz und der früh reifen Region des Präproteins, identifiziert, um insgesamt 12 Entfernungen für die Kartierung der Position des Signalpeptids zu erhalten (Tabelle 1). Um die Genauigkeit der Abstandsmessungen zu verbessern, sollten sich Markierungsstellen in relativ statischen Bereichen des Proteins befinden, z. B. in sekundären Strukturelementen und nicht in Schleifen. Darüber hinaus sollten sich Standorte auch an Orten befinden, die für Lösungsmittel relativ zugänglich sind, um die Etikettierung zu vereinfachen und effizienter zu gestalten. Innerhalb des SecA-PhoA-SecYEG-Komplexes war die Durchführung von Abstandsmessungen von den Dreiecksstellen oder Eckpunkten zu Rückständen im Bindungssubstrat ausreichend, um die Reste im Bindungssubstrat auf einer relativ kleinen Fläche zu lokalisieren (Abbildung 3D,H und Abbildung 4D,H). Die Identifizierung der geschnittenen Fläche aus den Mehrfachentfernungsmessungen verfeinert die Position gegenüber der Einzelentfernungsmessung erheblich, wie in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigt. Daher wird bei der Verwendung dieser Methode die Messung mehrerer Entfernungen dringend empfohlen. Obwohl diese Methode Regionen von Molekülen identifizieren kann, die beispielsweise an der Bindung beteiligt sind, liefert sie keine genauen Strukturinformationen; Solche Informationen werden am besten aus anderen strukturellen Methoden wie Röntgen, NMR und Kryo-EM gewonnen. FRET-Abstände können verwendet werden, um eine bestehende Struktur18,19 effektiv zu verfeinern oder in diesem Fall zu modellieren, was nicht möglich war, da kein Modell der an SecA gebundenen Signalsequenz existiert.

Um sicherzustellen, dass die Farbstoffkennzeichnung nur an den gewünschten Stellen erfolgt und die FRET-Abstandsmessungen genau sind, wird die Verwendung der Mutagenese für die Markierung bevorzugt. Die Erzeugung einer Cys-losen Mutante erfordert eine relativ konservative Mutation von Cys-Resten zu Ser oder ähnlichen Rückständen in dem ansonsten Wildtyp-Protein unter Verwendung von ortsgerichteten Mutagenesemethoden. In der aktuellen Studie wurden Cys-Mutationen in Cys-freie Versionen von SecA und SecYEG zur Markierungvon 37 eingeführt. Die Aktivität des mutierten Proteins wurde mit einem Wachstumsassay überprüft, gefolgt von einem in vitro Malachit-Green-ATPase-Assay41,42. Relevante Aktivitätsassays hängen von der Funktion des Proteins ab, zum Beispiel für DNA-bindende Proteine wäre ein DNA-bindender Assay angemessen58. Wenn die Kennzeichnung nicht nur an einem Ort sichergestellt wird, kann dies dazu führen, dass mehr als ein Standort mit demselben Farbstoff etikettiert wird, was die Entfernungsbestimmungen erheblich erschwert. So kann die Einführung einer zweiten Markierung auf demselben Protein durch den Einbau unnatürlicher Aminosäuren durch ortsgerichtete Mutagenese erfolgen. Wir haben diese Methodik angewendet, um die SecA-PhoA-Chimäre an Orten zu markieren, die sich von Cys-Resten unterscheiden, indem wir die unnatürliche Aminosäure p-Azidophenylalanin einbringen und mit Klickchemie39,40 markieren.

Eine weitere wichtige Überlegung dieser Methode ist die Wahl der verwendeten Farbstoffe und der zugehörigeR0-Wert . Nach der Identifizierung der potentiellen Markierungsstellen können die zu messenden Entfernungen aus der 3-D-Struktur abgeschätzt werden. Mit diesen Informationen können Forscher Farbstoffpaare mitR0-Werten auswählen, die den gewünschten Bereich der erwarteten Entfernungen abdecken. Zum Beispiel hat das AF488-AF647-Farbstoffpaar eineberechnete R 0 von 55,7 Å, was einen guten Bereich für die Kennzeichnung von Stellen bietet, die sich schätzungsweise 40-75 Å von der mutmaßlichen Bindungsstelle entfernt befinden. Obwohl die in Schritt 2.2berechneten R0-Werte nützlich sind, um auszuwählen, welches Farbstoffpaar für Ihr System verwendet werden soll, kann das Anhängen der Farbstoffe an das Protein ihre Eigenschaften erheblich verändern. Für eine höhere Genauigkeit solltenR0-Werte aus In-situ-Experimenten mit markiertem Protein berechnet werden (Schritte 3.1 - 3.6.5).

Die Messung der Transfereffizienz kann entweder durch Überwachung der stationären Fluoreszenzemission und Beobachtung einer Abnahme der Donoremission oder einer Erhöhung der Akzeptoremission erfolgen. Obwohl die Beobachtung beider Effekte wünschenswert ist, kann der Wirkungsgrad aus beiden wie beschriebenberechnet werden 5,8. Die Effizienz kann auch aus der Abnahme der Spenderlebensdauer in der Spender-Akzeptor-Probe im Verhältnis zur reinen Spenderprobe berechnet werden. Es wird empfohlen, den Wirkungsgrad mit mehr als einer Methode zu bestimmen, insbesondere die Verwendung zeitaufgelöster Methoden zur Bestimmung der relativen Homogenität der gemessenen Wirkungsgrade.

Die Mapping-Methode ermöglichte es uns auch, die relative Orientierung der Signalsequenz und der früh reifen Regionen des PhoA-Präproteins relativ zu SecA und der mutmaßlichen Bindungsstelle zu bestimmen. Eine SecA-SecYEG-Röntgenkristallstruktur und anschließende Kryo-EM-Studie lieferten Klarheit über die Struktur der Signalsequenz und die frühe reife Region des Präproteins in Bezug auf den Kanal und SecA34,35. In der Röntgenstruktur wurden die Rückstände 1-41 des OmpA-Präproteins an die Spitze des Zwei-Helix-Fingers gebunden und in einer Haarnadelstruktur im Kanal visualisiert (rosa, Abbildung 5). Die Standorte der vier PhoA-Reste in der SecA-PhoA-Chimäre wurden mit dem gleichen Protokoll wie oben beschrieben auf diese Struktur abgebildet. Wie in Abbildung 5 gezeigt, liegt der Ort der PhoA37- und PhoA45-Rückstände (gelb, orange, rot) zwischen PhoA2 und PhoA22, wobei PhoA45 näher an PhoA2 liegt. Diese Ergebnisse, insbesondere die Lage von PhoA45, deuteten darauf hin, dass das PhoA-Präprotein eine Haarnadelstruktur bildete.

Um unsere FRET-identifizierte Bindungsstelle weiter zu validieren, haben wir einen Vergleich unserer kartierten Standorte mit denen des OmpA-Präproteins durchgeführt, indem wir die 41-Rest-Präproteinstruktur aus dem Kanal herausgeschnitten und in die durch FRET-Kartierung definierten Regionen modelliert haben (Abbildung 5, Cyan). Ohne jegliche Veränderung der Präprotein-Röntgenstruktur stellen wir fest, dass die Positionen der Reste 2, 22 und 37 (blau, grün und gelb) auf der ausgeschnittenen Struktur des OmpA-Präproteinfragments bemerkenswert gut mit den FRET-kartierten Stellen übereinstimmen (Abbildung 5B) und darauf hindeuten, dass sich die Haarnadelbildung vor dem Kanaleintritt bildet. Das OmpA-Präprotein endet bei Rest 41 in der Röntgenkristallstruktur; Das C-Terminal von SecY, das unstrukturiert ist, liefert jedoch einen Hinweis auf den möglichen Standort von PhoA45. In unserer modellierten Struktur sitzt die Haarnadelschleife an der Mündung des Kanals und ist bereit, die Translokation des Präproteins über die Membran zu erleichtern. In diesem Beispiel verbessert die FRET-Mapping-Methodik die vorhandenen Informationen der statischen SecA-SecYEG-Struktur, indem sie einen Hinweis auf die dynamische Bewegung liefert, die für die Proteintranslokation über die Membran benötigt wird. Obwohl die FRET-Mapping-Methodik nicht für De-novo-Strukturbestimmungen geeignet ist, kann sie, wenn 3-dimensionale Strukturinformationen verfügbar sind, das derzeitige Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen durch die Aufklärung von Bindungsstellen und dynamischen Bewegungen fördern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health-Zuschuss R15GM135904 (verliehen an IM) und den National Institutes of Health Grant GM110552 (an DBO vergeben) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

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Biochemie Ausgabe 181 Fluoreszenz Energietransfer SecA Proteintranslokation FRET Mapping
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale
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Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

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