Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

De studie beschrijft de methodologie van FRET-mapping, inclusief de selectie van etiketteringslocaties, keuze van kleurstoffen, acquisitie en data-analyse. Deze methodologie is effectief bij het bepalen van bindingsplaatsen, conformatieveranderingen en dynamische bewegingen in eiwitsystemen en is het meest nuttig als deze wordt uitgevoerd in combinatie met bestaande 3D-structurele informatie.

Abstract

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een gevestigde fluorescentie-gebaseerde methode die wordt gebruikt om met succes afstanden in en tussen biomoleculen in vitro en binnen cellen te meten. In FRET heeft de efficiëntie van energieoverdracht, gemeten aan de hand van veranderingen in fluorescentie-intensiteit of levensduur, betrekking op de afstand tussen twee fluorescerende moleculen of labels. Bepaling van dynamica en conformatieveranderingen vanaf de afstanden zijn slechts enkele voorbeelden van toepassingen van deze methode op biologische systemen. Onder bepaalde voorwaarden kan deze methodologie bestaande röntgenkristalstructuren aanvullen en verbeteren door informatie te verstrekken over dynamiek, flexibiliteit en aanpassing aan bindende oppervlakken. We beschrijven het gebruik van FRET en bijbehorende afstandsbepalingen om structurele eigenschappen op te helderen, door de identificatie van een bindingsplaats of de oriëntaties van dimeersubeenheden. Door een verstandige keuze van etiketteringslocaties en vaak het gebruik van meerdere etiketteringsstrategieën, hebben we deze mappingmethoden met succes toegepast om wereldwijde structurele eigenschappen in een eiwit-DNA-complex en het SecA-SecYEG-eiwittranslocatiesysteem te bepalen. In het SecA-SecYEG-systeem hebben we FRET-mappingmethoden gebruikt om de preproteïne-bindingsplaats te identificeren en de lokale conformatie van het gebonden signaalsequentiegebied te bepalen. Deze studie schetst de stappen voor het uitvoeren van FRET-mappingstudies, inclusief identificatie van geschikte etiketteringslocaties, bespreking van mogelijke labels, waaronder niet-inheemse aminozuurresiduen, etiketteringsprocedures, hoe metingen uit te voeren en het interpreteren van de gegevens.

Introduction

Voor eiwitten leidt opheldering van dynamica samen met 3-dimensionale (3D) structurele kennis tot een beter begrip van structuur-functierelaties van biomoleculaire systemen. Structurele methoden, zoals röntgenkristallografie en cryogene elektronenmicroscopie, vangen een statische structuur op en vereisen vaak de bepaling van meerdere structuren om aspecten van biomolecuulbinding en dynamica op te helderen1. In dit artikel wordt een oplossingsgerichte methode besproken voor het in kaart brengen van globale structurele elementen, zoals bindingsplaatsen of bindingsinteracties, die mogelijk meer van voorbijgaande aard zijn en minder gemakkelijk kunnen worden vastgelegd door statische methoden. Sterke kandidaatsystemen voor deze methodologie zijn systemen waarin een 3D-structuur eerder is bepaald door röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie of andere structurele methoden. In dit geval maken we gebruik van de röntgenkristalstructuur van het SecA-SecYEG-complex, een centrale speler in de eiwit-algemene secretoire route, om de locatie van een signaalpeptidebindingsplaats in kaart te brengen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) voorafgaand aan het transport van het preproteïne over het membraan2. Manipulatie van het biologische systeem door genetische modificaties in combinatie met onze kennis van de 3D-structuur maakte het mogelijk om de conformatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied te bepalen onmiddellijk voorafgaand aan het inbrengen in het kanaal 3.

FRET omvat de stralingsloze overdracht van energie van het ene molecuul (donor) naar het andere (acceptor) op een afstandsafhankelijke manier die door de ruimte is 4,5. De efficiëntie van deze overdracht wordt bewaakt door een afname van de donor of een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor. De efficiëntie van energieoverdracht kan worden omschreven als

E = R06/(R06 + R6)

waarbij de R0-waarde de afstand is waarop de overdracht 50% efficiënt is6. De techniek is eerder beschreven als een moleculaire liniaal en is effectief in het bepalen van afstanden in het bereik van 2,5-12 nm, afhankelijk van de identiteit van de donor-acceptorkleurstoffen 4,7,8,9. De fluorescentie-intensiteiten en levensduur van de donor met of zonder acceptor maken het mogelijk om de overdrachtsefficiënties en bijgevolg de afstanden 5,8 te bepalen. Vanwege de beschikbaarheid van de technologie, de gevoeligheid van de methode en het gebruiksgemak, heeft FRET ook een brede toepassing gevonden op gebieden als fluorescentiespectroscopie met één molecuul en confocale microscopie6. De komst van fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit heeft de waarneming van intracellulaire dynamica en live-cell imaging relatief gemakkelijk gemaakt10,11. Veel FRET-toepassingen zoals deze worden in dit virtuele nummer in detail besproken.

In deze studie richten we ons vooral op het gebruik van FRET-metingen om afstandswaarden te genereren om structurele details te bepalen. Voorheen werden FRET-metingen effectief gebruikt om de conformatie van DNA-moleculen te bepalen wanneer ze gebonden zijn aan eiwit 12,13,14, de interne dynamiek van eiwitten en eiwitbindingsinteracties 15,16,17. De voordelen van deze methode liggen in de mogelijkheid om flexibele en dynamische structurele elementen te bepalen in een oplossing met relatief lage hoeveelheden materiaal. Het is veelzeggend dat deze methode bijzonder effectief is wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met bestaande structurele informatie en niet kan worden gebruikt als een middel voor 3D-structuurbepaling. De methode biedt het beste inzicht en de verfijning van de structuur als het werk voortbouwt op bestaande structurele informatie, vaak gekoppeld aan computationele simulatie18,19. Hier wordt het gebruik van afstanden verkregen uit steady-state en time-resolved FRET-metingen beschreven om een bindingsplaats, waarvan de locatie niet bekend was, op een bestaande kristallografische structuur van het SecA-SecYEG-complex, belangrijke eiwitten in de algemene secretoire route 3 in kaart tebrengen.

De algemene secretoire route, een sterk geconserveerd systeem van prokaryoten tot eukaryoten tot archaea, bemiddelt het transport van eiwitten over of in het membraan naar hun functionele locatie in de cel. Voor Gram-negatieve bacteriën, zoals E. coli, het organisme dat in onze studie wordt gebruikt, worden eiwitten ingebracht in of getransloceerd over het binnenmembraan naar het periplasma. Het bacteriële SecY-kanaalcomplex (de translocon genoemd) coördineert met andere eiwitten om het nieuw gesynthetiseerde eiwit te transloceren, dat naar de juiste locatie in de cel wordt geleid via een signaalsequentie die zich meestal bevindt op de N-terminus20,21. Voor eiwitten gebonden aan het periplasma, associeert het ATPase SecA-eiwit zich met de uitgangstunnel van het ribosoom en met het preproteïne nadat ongeveer 100 residuen zijn vertaald22. Samen met het SecB-chaperonne-eiwit houdt het het preproteïne in een ongevouwen toestand. SecA bindt aan de SecYEG-translocon en vergemakkelijkt door vele cycli van ATP-hydrolyse het eiwittransport over het membraan23,24.

SecA is een multi-domein eiwit dat bestaat in cytosolische en membraangebonden vormen. SecA, een homodimeer eiwit in het cytosol, bestaat uit een preproteïnebindend of cross-linking domein25, twee nucleotidebindende domeinen, een spiraalvormig vleugeldomein, een spiraalvormig steigerdomein en de twee helixvingers (THF)26,27,28,29 (figuur 1). In eerdere kristallografische studies van het SecA-SecYEG-complex suggereerde de locatie van de THF dat het actief betrokken was bij eiwittranslocatie en daaropvolgende cross-linking experimenten met het signaalpeptide stelden de betekenis van dit gebied in eiwittranslocatie verder vast30,31. Eerdere studies, met behulp van de FRET-mappingmethodologie, toonden aan dat exogene signaalpeptiden binden aan dit gebied van SecA 2,32. Om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroegrijpe gebied van het preproteïne volledig te begrijpen voorafgaand aan het inbrengen in het SecYEG-kanaal, werd een eiwitchimaera gemaakt waarin de signaalsequentie en residuen van het vroegrijpe gebied via een Ser-Gly-linker aan SecA werden bevestigd (figuur 1). Met behulp van dit biologisch levensvatbare construct werd verder aangetoond dat de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied van het preproteïne op een parallelle manier binden aan de THF2. Vervolgens werd de FRET-mappingmethodologie gebruikt om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied in aanwezigheid van SecYEG op te helderen, zoals hieronder beschreven3.

Kennis van de 3D-structuur van het SecA-SecYEG-complex 33,34,35 en de mogelijke locatie van de bindingsplaats stelde ons in staat om oordeelkundig donor-acceptorlabels te plaatsen op locaties waar de kruising van individuele FRET-afstanden de bindingslocatie identificeert. Deze FRET-mappingmetingen onthulden dat de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied van het preproteïne een haarspeld vormen met de punt aan de monding van het SecYEG-kanaal, wat aantoont dat de haarspeldstructuur wordt gesjabloond voorafgaand aan het inbrengen van het kanaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Selectie van etiketteringssites

  1. Identificeer ten minste drie potentiële etiketteringsplaatsen om de vermeende bindingsplaats op de bestaande eiwitstructuren te trianguleren. In dit geval werden SecA, SecYEG en preproteïne aan SecA bevestigd door genetische fusie geïdentificeerd2.
    1. Kies labelplaatsen binnen 25-75 Å van de vermeende bindingsplaats en in relatief statische gebieden van het eiwit bepaalt de afstand het specifieke FRET-kleurstofpaar dat moet worden gebruikt36. Lokaliseer de etiketteringsplaatsen in eiwitgebieden die relatief van elkaar verschillen, dus de sites beschrijven de hoekpunten van een driehoek met de vermeende bindingsplaats in het midden (figuur 1A-D).
    2. Cysteïneresiduen (Cys) introduceren of identificeren op etiketteringsplaatsen van belang in een eiwit dat geen andere Cys-residuen bevat, om de etiketteringsefficiëntie van de specifieke locatie te verbeteren37,38.
    3. Introduceer onnatuurlijke aminozuren, bijvoorbeeld p-azidofenylalanine voor etikettering met klikchemie, om één eiwit effectief te labelen op twee verschillende posities met verschillende kleurstoffen39,40.
    4. Test de Cys-mutanten op functieverlies. Controleer de activiteit van de Cys-loze mutant en de onnatuurlijke aminozuurmutant met behulp van een geschikte activiteitstest. In dit geval werd de activiteit geverifieerd met een groeitest gevolgd door een in vitro malachietgroene ATPase-test 32,41,42

2. Etikettering van het eiwit

  1. Zuiver het eiwit of de eiwitten van belang tot ten minste 95% zuiverheid voor een nauwkeurige etikettering. Zuiver SecA- en SecYEG-eiwitten volgens protocollen die zijn beschreven in referentie3. Zorg ervoor dat u ten minste 5 μg gezuiverd eiwit hebt voor deze stap, omdat er tijdens het etiketteringsproces wat eiwit verloren gaat.
  2. Kies twee kleurstoffen voor FRET-metingen, afhankelijk van hun R0-waarde en de voorspelde afstanden tussen gelabelde locaties. Schat de R0-waarden en observeer de overlap van donoremissie en acceptorabsorptie met behulp van de informatie uit de fluorescerende eiwitdatabase, die ook spectra geeft voor veelgebruikte kleurstoffen (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    OPMERKING: R0 wordt gedefinieerd als de afstand waarop de overdrachtsefficiëntie 50% is voor een bepaald kleurstofpaar. Voor karteringsexperimenten moeten voorspelde afstanden dicht bij de R0-waarde van het kleurstofpaar liggen om ervoor te zorgen dat afstanden nauwkeurig kunnen worden gemeten.
  3. Label de in stap 1.1.1 aangegeven posities. met het donor-acceptor kleurstofpaar.
    1. Label het eiwit volgens de instructies van de fabrikant met bijzondere aandacht voor parameters zoals optimale eiwitconcentratie, temperatuur, pH, tijdsduur en buffer voor de specifieke gebruikte kleurstoffen43,44.
    2. Bereid het eiwit in een concentratie van 1-2 mg/ml of ongeveer 10 μM in een 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffer. Los kleurstof op in dimethylformamide (DMF) of dimethylsulfoxide (DMSO) tot een eindconcentratie van 1 mM. Voeg de kleurstof druppelsgewijs toe aan de oplossing terwijl u roert om een kleurstof:eiwitkiesverhouding van 5:1 (50 μM kleurstof: 10 μM eiwit) te bereiken.
    3. Laat de reactie gedurende 4 uur bij kamertemperatuur (RT) doorgaan in een glazen injectieflacon met zacht schommelen of een nacht bij 4 °C. Stop de reactie door β-mercaptoethanol toe te voegen.
      OPMERKING: Als eiwit niet compatibel is met Tris-buffer, kunnen fosfaat- of HEPES-buffers worden gebruikt. Handhaaf de pH in het bereik van 7,0-7,5. Als het eiwit disulfidebindingen heeft, voeg dan een reductiemiddel zoals DTT of TCEP toe voordat u het etiketteert. Verwijder DTT door dialyse of gelfiltratie voordat u kleurstof toevoegt.
  4. Verwijder voor nauwkeurige FRET-metingen de vrije kleurstof met een centrifugale concentrator met een geschikte moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) om de vrije kleurstof door te laten stromen met behoud van het gelabelde eiwit.
    1. Bereid het concentratormembraan voor door ~ 1 ml water in het bovenste deel van een 3 ml concentrator te plaatsen en centrifugeer het water vervolgens door het membraan (ten minste 10 minuten bij 4.300 x g)..
    2. Verwijder vrije kleurstof door het gelabelde monster in de concentrator te centrifugeren (20 min bij 4.300 x g). Herhaal dit 3-4 keer en gooi de stroom weg.
    3. Controleer de etiketteringsefficiëntie van het gelabelde eiwit met behulp van UV-Vis-absorptiespectroscopie.
      OPMERKING: FRET-metingen vereisen etiketteringsefficiënties van 50% of meer. Lagere etiketteringsefficiënties verminderen het FRET-signaal en kunnen leiden tot onnauwkeurigheden in de meting.
    4. Verkrijg een UV-Vis-spectrum van het gelabelde eiwit met een bereik van 250-700 nm om zowel de eiwitabsorptieband als de maximale absorptieband van de kleurstof te observeren. Meet de absorptie op de absorptiepiek van kleurstof en bij 280 nm voor eiwit.
    5. Bepaal de concentratie van eiwitten en corrigeer voor eventuele bijdragen van de kleurstof met behulp van de correctiefactor CF en de volgende vergelijkingen45,46:
      Equation 1
      waarbij C de concentratie van het eiwit (M) is, A280 de monsterabsorptie bij 280 nm, Amax de absorptie bij het kleurstofabsorptiemaximum, ε eiwit de extinctiecoëfficiënt voor het eiwit bij 280 nm en CF de correctiefactor, A'280/A'max, waarbij A'280 de absorptie bij 280 nm is en A'max de absorptie op het piekmaximum voor alleen de kleurstof.
    6. Bepaal de efficiëntie van de etikettering met behulp van de volgende vergelijking:
      Equation 2
      waarbij εkleurstof de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof is, C de concentratie van het eiwit zoals bepaald in stap 2.4.5 en E de etiketteringsefficiëntie. Herhaal stap 2.4.2 totdat de efficiëntiewaarde van de etikettering is gestabiliseerd en minder dan 100% is.

3. Bepaal de R 0-waarden

  1. Meet de R0-waarden in situ. Bereid twee eiwitmonsters in dezelfde concentratie van totaal eiwit, 4 μM, één met het eiwit gelabeld met alleen de donorkleurstof en één met het eiwit gelabeld met alleen de acceptorkleurstof. Voor SecA werkt een eiwitconcentratie van 4 μM SecA monomeer goed voor deze metingen.
    1. Bereid monstervolumes van 2,5 ml voor een cuvette van 1 cm x 1 cm, 600 μL voor een cuvette van 5 mm x 5 mm of 200 μL voor een cuvette van 3 mm x 3 mm.
  2. Schakel de fluorometer in en open het spectrale acquisitie- en analyseprogramma in de fluorescentiesoftware als u een spectrofluorometer gebruikt. Klik op de rode M om de computer op het instrument aan te sluiten (figuur 2A) en kies Emissiespectra.
    1. Voer scanparameters in, zoals excitatiegolflengte, het bereik voor emissiescan, temperatuur en monsterwisselaarpositie met behulp van het menu-item Experiment verzamelen (afbeelding 2B).
    2. Klik op RTC en optimaliseer de instrumentinstellingen (bijv. spectrale spleten) door de fluorescentie-emissie op de piek te bewaken met behulp van een excitatiegolflengte die is ingesteld op het absorptiemaximum van de kleurstof. Stel voor SecA de volgende instellingen in: bandpass als 1 nm; excitatie- en emissiespleten van respectievelijk 1 en 1,5 mm, met een temperatuur van 25 °C en een roersnelheid van 250 tpm.
      OPMERKING: Overschrijd de capaciteit van het instrument (cps) niet (typisch 2 x 106 cps).
  3. Plaats het door de donor gelabelde eiwitmonster in de monsterhouder en klik op Uitvoeren om een emissiescan te genereren van het eiwit dat is gelabeld met alleen de donorkleurstof (alleen donoreiwit) door het monster te prikkelen op het kleurstofabsorptiemaximum (bijv. 488 nm voor AF488) en de emissiepiek te scannen (505-750 nm voor alleen donor SecA-eiwit gelabeld met AF488).
  4. Stel een basislijn voor de scan vast door de scan 25-50 nm voorbij het einde van de piek te verlengen. Meet de kwantumopbrengst van het donor-only eiwit, door absorptie- en fluorescentiemetingen uit te voeren op monsters van verschillende concentraties zoals beschreven47. Houd dezelfde spleetinstellingen aan voor deze metingen.
    1. Gebruik vrije donorkleurstof als referentie voor de kwantumopbrengst. Verkrijg ten minste vier metingen van het donoreiwit en de vrije kleurstof in verschillende concentraties voor een nauwkeurige bepaling.
    2. Plot de fluorescentie-intensiteit of het geïntegreerde gebied versus de absorptie voor het donor-only eiwit en de vrije kleurstof of referentie. Bepaal de hellingen voor het donor-only eiwit (hellingD) en de referentie (hellingR).
    3. De kwantumopbrengst (Φ) wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
      Equation 3
      hier is ΦD de kwantumopbrengst van het donoreiwit, ΦR is de kwantumopbrengst van de vrije kleurstof (deze kan meestal worden verkregen van de fabrikant), hellingD en hellingR zijn de hellingen die in stap 3.4.2 zijn bepaald voor respectievelijk het donoreiwit en referentie, en ηD en ηR vertegenwoordigen de brekingsindex van het donoreiwit en de referentievrije kleurstofoplossingen, respectievelijk 47.
  5. Verkrijg een absorptiespectrum van uw acceptor-only eiwit met behulp van een 1 cm pathlength cel. Genereer een extinctiecoëfficiëntspectrum van uw acceptor-only eiwit door het absorptiespectrum te delen door de kleurstofconcentratie.
  6. Genereer de spectrale overlapintegraal, J (λ) met behulp van een grafisch analyseprogramma. Een standaard werkbladprogramma (bijv. Spreadsheet) kan ook worden gebruikt voor dit proces.
    1. Vermenigvuldig het fluorescentie-emissiespectrum van het donor-only eiwit (stap 3.4) met het extinctiecoëfficiëntspectrum van het acceptor-only eiwit om het overlapspectrum te genereren.
    2. Vermenigvuldig het resulterende overlapspectrum met λ4.
    3. Bepaal het gebied onder de curve door integratie van het overlapgebied. Het overlapgebied wordt gedefinieerd als het gebied waar het donoremissiespectrum vermenigvuldigd met het spectrum van de acceptor-extinctiecoëfficiënt positieve waarden oplevert. De spectrale overlapintegraal wordt gedefinieerd als:
      Equation 4
      waarbij FD (λ) het emissiespectrum is van het donoreiwit (verkregen in stap 3.4) en εA(λ) het extinctiecoëfficiëntspectrum is van het eiwit dat alleen voor acceptoren geldt en eenheden van M-1 cm-1 heeft (verkregen in stap 3.5). De resulterende spectrale overlap integraal moet eenheden van M-1 cm-1nm4 hebben.
    4. Normaliseer de spectrale overlap integraal. Deel de overlap integraal door het geïntegreerde gebied van het donor only eiwitspectrum over hetzelfde spectrale bereik:
      Equation 5
    5. Bereken de R0-waarde in Å met behulp van de volgende vergelijking:
      Equation 6
      waarbij κ2 de oriëntatiefactor is, doorgaans genomen als 2/3 voor vrij roterende kleurstoffen, η de brekingsindex is en kan worden benaderd als 1,33 voor verdunde waterige oplossingen, QD de kwantumopbrengst van de donor is (stap 3.4) en J(λ) de spectrale overlapintegraal zoals bepaald in stap 3.6.35. OPMERKING: Als de kleurstoffen niet vrij ronddraaien, kunnen correcties worden aangebracht zoals beschreven door Ivanov 48 en geïmplementeerd door Auclair49 en Zhang 2,3.

4. Voer FRET spectrale metingen uit

  1. Bereid donor-only eiwit, acceptor-only eiwit en donor-acceptor eiwitmonsters in dezelfde concentratie; een concentratie van 4 μM wordt aanbevolen. Gebruik 200 μL oplossing, bij gebruik van een cuvette van 3 mm x 3 mm, 600 μL bij gebruik van een cuvette van 5 mm x 5 mm of 2,5 ml bij gebruik van een cuvette van 1 cm x 1 cm.
    1. Bereid het donor-acceptor eiwitmonster voor door gelijke molaire hoeveelheden van alleen de donor en het acceptor-only eiwit te gebruiken.
    2. Behoud dezelfde hoeveelheid gelabeld monster alleen in controledonor en acceptor alleen eiwitmonsters door de introductie van niet-gelabeld eiwit in gelijke molaire hoeveelheid aan de monsters van alleen de donor of de acceptor. Voor oplossingen met dezelfde concentratie zou elk FRET-monster met alleen donoren bijvoorbeeld 100 μL donoreiwit en 100 μL ongelabeld eiwit bevatten voor een volume van 200 μL.
  2. Genereer fluorescentie-emissiespectra van alleen de donor, alleen acceptor en donor-acceptor monsters. Optimaliseer het signaal zoals beschreven in stap 3.2. Eenmaal geoptimaliseerd, behoudt u dezelfde instellingen voor alle voorbeelden.
    1. Verkrijg de donor-only scan zoals beschreven in stap 3.3. Prikkel de oplossing op het maximale dosisabsorptie van de donorkleurstof en scan de emissiepieken van de donor en (verwachte) acceptor.
    2. Wissel het monster om in het eiwit dat alleen voor acceptoren geldt of verander de positie van de monsterwisselaar in het cuvet dat het alleen-acceptor-eiwit bevat.
    3. Verkrijg een emissiescan van het eiwit dat is geëtiketteerd met alleen acceptorkleurstof (alleen acceptor-eiwit) met dezelfde instellingen als in stap 4.2.1. Prikkel het monster op de donor excitatiegolflengte.
      OPMERKING: Dit spectrum biedt een correctie voor de hoeveelheid acceptor die wordt geëxciteerd op de donorgolflengte (FA in stap 5.1.2)
    4. Wissel het monster om in het donor-acceptor eiwitmonster of verander de positie van de monsterwisselaar in het cuvet dat het donor-acceptor gelabelde eiwit bevat.
    5. Verkrijg een emissiescan van het donor-acceptor eiwitmonster met dezelfde instellingen als in stap 4.2.1 en 4.2.3.
    6. Corrigeer voor alle spectra voor achtergrondfluorescentie door de achtergrondtellingen af te trekken die aan het einde van de scan zijn gemeten.
  3. Meet de levensduur van de donor van alleen de donor en de donor-acceptormonsters die zijn bereid zoals beschreven in stap 4.1.2. Gebruik een tijdgecorreleerd fluorescentie-instrument voor het tellen van één foton dat in staat is om fluorescerend verval in het nanoseconde (10-9 s) tijdsbereik te meten en op te lossen.
    OPMERKING: Voor FRET-kleurstofparen moet u de excitatielichtbron afstemmen op het absorptiemaximum van de donorkleurstof.
    1. Zet het instrument aan. Open de acquisitiesoftware, gebruik de instrumentbesturingssoftware voor gegevensverzameling met de fluorescentiespectrometer.
    2. Selecteer voor acquisitie TCSPC Decay, met een tijdsbereik van 55 ns, een winst van 1 en 4096 kanalen.
    3. Verkrijg een instrumentresponsfunctie (IRF) met behulp van een oplossing van niet-zuivel creamer of commerciële verstrooiingsoplossing en controleer de verstrooiing bij 490 nm. Pas de spleetinstelling aan en gebruik indien nodig filters met neutrale dichtheid om een voldoende lage telsnelheid te behouden om pulsophoping te voorkomen5. Klik op Accepteren en vervolgens op Starten. Hiermee wordt de overname gestart.
      LET OP: Een maximale telsnelheid van 4000 cps wordt gebruikt voor een herhalingsfrequentie van 180 kHz.
    4. Verzamel de IRF bij 490 nm totdat het piekkanaal maximaal 20.000 tellen heeft. Verzamel een IRF voor en na het meten van elk fluorescentieverval.
    5. Verkrijg de fluorescentieverval van de donor- en donoracceptormonsters door de fluorescentie-emissie te controleren op de donoremissiegolflengte, 520 nm.
    6. Pas de spleetinstellingen aan voor een maximale telsnelheid van 4000 cps of minder. Spleetinstellingen zijn meestal 15-20 nm bandpass voor eiwitmonsters. Verzamel het verval totdat 20.000 tellingen worden verkregen in het piekkanaal.
  4. Analyseer het verval of de fluorescentie-intensiteit (I) als functie van de tijd (t) voor de fluorescentielevensduur (τ). Pas het verval aan op een som van exponenten met de volgende vergelijking:
    Equation 7
    waarbij αI de preexponentiële factor is van de ith-component en τI de levensduur is. De pasvorm wordt opnieuw samengesteld met de IRF om het fluorescentieverval te evenaren. Beoordeel de kwaliteit van de pasvorm aan de hand van de verlaagde Χ2-parameters .

5. Analyse van FRET-gegevens

  1. Bereken fret-efficiëntie uit de afname van de donorintensiteit van het donor-acceptormonster ten opzichte van de donor alleen met de volgende vergelijking.
    Equation 8
    waarbij FDA de fluorescentie-intensiteit van het donor-acceptormonster is en FD de fluorescentie-intensiteit van het donormonster alleen op het hoogtepunt van de donorfluorescentie. Gebruik de geïntegreerde gebieden van de pieken als de gegevens luidruchtig zijn.
    1. Corrigeer voor eventuele verschillen in etikettering tussen de monsters van alleen de donor en de donor-acceptor. Bereken correcties op basis van de donorgraad van etikettering als volgt.
      Equation 9
      waarbij fDA de efficiëntie van de donoretikettering is in het donoracceptormonster en fD de etiketteringsefficiëntie in het monster dat alleen donor is.
    2. Correct voor eventuele bijdragen van de acceptorfluorescentie aan het donor-geëxciteerde spectrum door aftrek van het acceptor-only eiwitspectrum (stap 4.2) van het donor-acceptor eiwitspectrum.
      Equation 14
    3. Corrigeer voor de verschillen in etiketteringsefficiëntie van het acceptor-only eiwit ten opzichte van het donor-acceptor-eiwitmonster, wat de volgende vergelijking oplevert voor het berekenen van de efficiëntie:
      Equation 10
      waarbij fA de fractionele hoeveelheid acceptoretikettering aangeeft. Deze vergelijking omvat alle correcties als gevolg van kleurstofetikettering en acceptorfluorescentie.
    4. Bereken FRET-afstanden van de efficiëntie met behulp van de volgende vergelijking:
      Equation 11
      met behulp van de R0-waarde verkregen in stap 3.6.5.
    5. Bereken de FRET-efficiëntie met behulp van fluorescentielevensduur van alleen donor- en donor-acceptormonsters gemeten in stap 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Gebruik de amplitudegewogen levensduur om FRET-efficiëntie te berekenen en vergelijk met steady-state resultaten5.
      Equation 13
    7. Bereken de afstand zoals in stap 5.1.4 tot de efficiëntie bepaald door de fluorescentielevensduur. Vergelijk steady-state en time-resolved waarden voor FRET-efficiëntie en afstanden en zorg ervoor dat ze binnen de fout van elkaar liggen.

6. De afstanden in kaart brengen

  1. Gebruik de berekende afstanden om de bindingsplaats op de driedimensionale structuur in kaart te brengen. Bereken de afstanden en fouten voor alle onderzochte kleurstofparen en -locaties met behulp van de vergelijking in stap 5.1.4 en R0 waarden verkregen in stap 3.6.5 voor elk FRET-paar.
    1. Gebruik een 3D grafisch weergaveprogramma zoals PyMOL50 om de afstanden op de structuur in kaart te brengen (script gegeven in Aanvullend bestand). Opdrachten uit het script kunnen rechtstreeks in het opdrachtvenster worden ingevoerd met de juiste afstandsinformatie.
    2. Genereer een shell voor elke gemeten afstand en de bijbehorende fout (figuur 3, figuur 4, aanvullende figuren 1-3).
    3. Breng de positie in kaart via het snijpunt van de verschillende schelpen (aanvullende figuren 1-3). De signaalpeptidebindingsplaats werd in kaart gebracht via de drie verschillende locaties op SecA en SecYEG en vier verschillende locaties op het signaalpeptide (figuur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze studie richtte zich op het bepalen van de locatie van de preproteïnebindingsplaats op SecA voorafgaand aan het inbrengen van het preproteïne in het SecYEG-kanaal. Om de bindingsplaats in kaart te brengen, werden FRET-experimenten uitgevoerd tussen verschillende regio's van het preproteïne en drie verschillende locaties op de SecA- en SecYEG-eiwitten (figuur 1A-D). Uit de verkregen afstanden en driedimensionale structuren van SecA, SecYEG en het preproteïne werd de locatie van de preproteïnebindingsplaats voorspeld. In plaats van drie afzonderlijke entiteiten (SecA, SecYEG en preprotein) te gebruiken om deze metingen uit te voeren, werd de PhoA-signaalsequentie aan SecA bevestigd door genetische modificatie na opname van een Gly-Ser linker 2,3. Voor gemakkelijke etikettering met kleurstoffen werden Cys-residuen of ambermutaties geïntroduceerd bij residuen 2, 22, 35 en 45 in het PhoA-preproteïne (figuur 1E).

Identificatie van locaties en etikettering
Een vermeende bindingsplaats voor de signaalsequentie was eerder geïdentificeerd met behulp van vergelijkbare FRET-mappingmethoden 2,32. Deze en andere studies hadden de twee-helixvinger (THF) en het preproteïne cross-linking domein geïdentificeerd als mogelijke bindingsplaatsen van het signaalpeptide met een gesuggereerde oriëntatie in een parallelle positie met de THF 33,51,52,53,54 (figuur 1F). Zo werd de identificatie van potentiële etiketteringsplaatsen op de SecA- en SecYEG-eiwitten gedaan op basis van de locatie van de vermeende bindingsplaats in de SecA- en SecYEG-kristalstructuur (groen weergegeven in figuur 1A-D). Drie locaties werden gekozen om de positie van de vermeende bindingsplaats te trianguleren, waar de drie sites in wezen een driehoek vormen rond de vermeende bindingsplaats. Zoals te zien is in figuur 1, lagen de drie locaties binnen het FRET-bereik van de bindingsplaats (50-70 Å). Het kleurstofpaar Alexa Fluor 488 (AF488) en Alexa Fluor 647 (AF647) werd gekozen, omdat de R0-waarde van 55,7 Å36 goed overeenkomt met de verwachte afstanden tussen de gelabelde locaties en de vermeende bindingsplaats die de meetnauwkeurigheid garandeert.

De drie locaties die zijn gekozen voor etikettering, SecA37, SecA321 en SecY292 (weergegeven als magenta-, violet- en cyaanbollen in figuur 1A-D) bevinden zich in het hele eiwitcomplex en vormen een driehoek rond de vermeende bindingsplaats. De drie locaties werden afzonderlijk gemuteerd tot Cys-residuen in een Cys-loze mutant om ervoor te zorgen dat alleen de juiste positie werd gelabeld 2,37. Voor de SecY292-experimenten werden de PhoA-preproteïnesites gelabeld met AF647 en SecY-residu 292 werd gelabeld met AF488 met behulp van maleimidechemie. In het chimere eiwit werden de plaatsen SecA37 en SecA321 gelabeld met AF647 en het preproteïne met AF488. In het SecA-PhoA chimere eiwit werden residuen 2, 22, 37 en 45 van het PhoA-preproteïnesegment elk gemuteerd tot een ambercodon in individuele eiwitten. De amberkleurige codonmutaties maakten de introductie mogelijk van onnatuurlijk aminozuur, p-azidofenylalanine, op die posities, die vervolgens werden gelabeld met de AF488 met behulp van klikchemie39,40. Elke mutatie werd onafhankelijk gegenereerd en gelabeld om een correcte, differentiële etikettering van de eiwitcomponenten te garanderen. De mate van etikettering werd bepaald voor alle eiwitten en moest over het algemeen 50% of beter zijn om door te gaan met het monster.

Bepaling van overdrachtsefficiënties en afstanden
Voorafgaand aan het uitvoeren van de energieoverdrachtsmetingen werden de donorkwantumopbrengst, overlapintegraal en R0-waarden bepaald (stappen 3.4-3.6). De donor kwantumopbrengst werd gemeten ten opzichte van de kleurstof, fluoresceïne, die een kwantumopbrengst heeft van 0,79 in 0,1 M NaOH47. Absorptie- en fluorescentie-emissiespectra werden verkregen bij een reeks concentraties om een lineaire plot van absorptie te genereren ten opzichte van de fluorescentie-emissie-intensiteit om de kwantumopbrengst te bepalen. Bij deze metingen is het van cruciaal belang om de absorptie in het lineaire bereik (0,1-1,0) te meten en alle emissiemetingen moeten met dezelfde spleetinstellingen worden gegenereerd. Aangezien deze waarden worden gebruikt om overlappende integralen en R0-waarden te bepalen, moeten ze worden gemeten onder FRET-omstandigheden. De lokale eiwitomgeving heeft een diepgaande invloed op de uitstoot van kleurstoffen en bijgevolg moeten de kwantumopbrengsten van donoren worden gemeten voor elk van de onderzochte locaties. We merken op dat sites op SecA en SecYEG de R0-waarden sterker beïnvloeden dan die op het PhoA-gedeelte van de chimaera. Voor kleurstofparen met dezelfde SecA- of SecYEG-site liggen de R0-waarden doorgaans binnen 5 Å van elkaar; overwegende dat de R0-waarden met maar liefst 20 Å kunnen verschillen voor de twee verschillende SecA-locaties (residuen 37 versus 321), wat het belang onderstreept van het bepalen van R0-waarden voor elk kleurstofpaar (tabel 1).

De berekening van R0 gaat ervan uit dat de donor- en acceptorkleurstoffen vrij roteren en de mate waarin de kleurstoffen niet roteren, draagt bij aan de algehele onzekerheid in de meting. Om op de juiste manier rekening te houden met de relatieve beweging van de kleurstoffen en hun oriëntaties, werden steady-state fluorescentie-anisotropiemetingen uitgevoerd op alle donor- en acceptorkleurstoffen in de verschillende etiketteringsposities. Deze waarden, die in het bereik van 0,10-0,21 lagen, werden gebruikt om de fout te berekenen die verband houdt met de afstandsmetingen 2,3,48. De relatief hoge anisotropiewaarden die zijn waargenomen voor zowel de donor- als de acceptorkleurstoffen komen overeen met een vermindering van de kleurstofrotatie, wat niet strookt met de aanname van vrije rotatie. Het ontbreken van vrije rotatie genereert een fout van 19%-25% in de afstandsberekeningen. Zoals blijkt uit tabel 1 leidde dit tot een gemiddelde onzekerheid in de gemeten afstanden van maximaal ± 15 Å. Bij het in kaart brengen van de FRET afstanden zijn deze onzekerheden in de afstandsmetingen een belangrijke overweging, zoals hieronder besproken.

De berekende afstand tussen donor-acceptorparen is gebaseerd op de relatie tussen efficiëntie en afstand, waarbij een hogere efficiëntie indicatief is voor donor-acceptorparen gescheiden door een kortere afstand. Om de FRET-efficiëntie te bepalen, worden fluorescentie-emissiespectra geëxciteerd op de donorexcitatiegolflengte (488 nm) verkregen op donor-only en donor-acceptor monsters. Doorgaans betekent een vermindering van de donoremissie-intensiteit de aanwezigheid van energieoverdracht (stap 5.1). Figuur 1G toont de donor-acceptorspectra voor het SecA 37-residu met residu 2 of 22 van de PhoA-chimaera. Het SecA37-residu is gelabeld met AF647 of de acceptorkleurstof en de PhoA-residuen zijn geëtiketteerd met AF488 of de donorkleurstof. Op beide posities wordt de donorfluorescentie verminderd en is een kleine toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor te zien in de donor-acceptormonsters. Aangezien excitatie wordt uitgevoerd op de donor excitatiegolflengte van 488 nm, die de acceptor niet direct prikkelt, is elke waargenomen acceptorfluorescentie het gevolg van energieoverdracht. De afname van de donorintensiteit en de daarmee gepaard gaande toename van de acceptatie-intensiteit is dus het gevolg van energieoverdracht tussen de twee kleurstoffen. Significant is dat de donorfluorescentie-intensiteit hoger is voor de PhoA2-positie (blauw) ten opzichte van de PhoA22-positie (geel) in aanwezigheid van de acceptor. Dit relatieve verschil in afname van de donorintensiteit geeft aan dat de energieoverdracht tussen het PhoA2-residu en het SecA37-residu zwakker is dan de overdracht tussen de PhoA22- en SecA37-residuen, wat impliceert dat het PhoA2-residu zich verder van SecA37 bevindt dan PhoA22. Afstanden worden bepaald uit de relatie tussen efficiëntie en R0-waarden (stap 5.1.4).

Omdat de steady-state fluorescentiemetingen gemiddeld twee of meer afstanden konden vertegenwoordigen, hebben we ook tijd-opgeloste fluorescentiemetingen uitgevoerd. Voor deze experimenten wordt de levensduur van de donorkleurstof gemeten in de aan- en afwezigheid van de acceptor (figuur 1G). Als er twee verschillende energieoverdrachtsprocessen zouden zijn die bijdragen aan de gemeten steady-state fluorescentie-efficiëntie, zouden ze worden waargenomen als discrete levensduur, op voorwaarde dat ze oplosbaar waren binnen de tijdresolutie van het instrument. Om het vermogen om de levens op te lossen te verbeteren, moeten 10.000 tellingen of meer op het hoogtepunt worden verzameld; de piekhoogte of het aantal piekkanalen moet echter in evenwicht worden gebracht met het tijdstip van verwerving en mogelijke schade aan het monster. Tijd-opgeloste metingen leverden enkele levensduur op voor elk donor-acceptorpaar consistent met slechts één oriëntatie of afstand tussen de kleurstoffen. We merken op dat kleine verschillen in de afstand zoals waargenomen in de gebieden die door onze FRET-mappingtechniek worden onthuld, niet zouden leiden tot oplosbare levensduur in ons systeem. Bovendien waren de efficiëntieverbeteringen zoals bepaald door de tijd-opgeloste fluorescentiemetingen in goede overeenstemming met die bepaald op basis van de steady-state metingen, wat verdere ondersteuning biedt dat de gemeten efficiënties voortkomen uit slechts één afstand tussen de kleurstofparen3.

Het in kaart brengen van de FRET afstanden op de 3-dimensionale structuur
De resonantie-energieoverdrachtsmetingen leveren voldoende afstandsinformatie op om de bindingsplaats en oriëntatie van de signaalvolgorde op SecA te identificeren. De drie locaties op SecA en SecYEG samen met de vier posities op het PhoA-gebied van de SecA-PhoA-chimera bieden de 12 verschillende afstanden die worden gebruikt om de bindingsplaats in kaart te brengen (tabel 1). De twaalf afstanden werden in kaart gebracht op de driedimensionale röntgencokristalstructuur van het Thermotoga maritima SecA-SecYEG-complex (PDBID: 3DIN) om de bindingsplaats van de signaalsequentie te identificeren33. De structuur van het SecA-SecYEG-complex is vergelijkbaar met die waargenomen bij E. coli , zoals blijkt uit een in vivo fotocrosslinkingstudie55.

We gebruiken de beginresiduen (PhoA2) en eindresiduen (PhoA22) van de PhoA-signaalsequentie in de SecA-PhoA-chimaera om te illustreren hoe residulocaties werden geïdentificeerd op het SecA-SecYEG-complex. Omdat energieoverdracht in alle richtingen kan plaatsvinden, beschrijven de FRET-afstanden en bijbehorende fouten een bolvormige schil, waarbij een van de kleurstoflocaties van het donor-acceptorpaar als middelpunt wordt aangewezen. In deze studie vormen de residuen SecA37, SecA321 en SecY292 de centra van drie bolvormige schillen die de locatie van het PhoA2-residu van de signaalsequentie beschrijven. Visualisatie van de overlappende gebieden die voortkomen uit de drie afzonderlijke locaties, SecA37 (magenta), SecA321 (paars) en SecY292 (cyaan) worden weergegeven in figuur 3. Slechts een deel van elke FRET-schil kruist de eiwitstructuur en de residuen en ruggengraat die binnen die schaal vallen, worden gemarkeerd. Zo worden de eiwitgebieden binnen de schaal gedefinieerd door de SecA37-PhoA2-afstand weergegeven in magenta (figuur 3A, E), terwijl de regio's gedefinieerd door de SecA321-PhoA2- en SecY292-PhoA2-schillen respectievelijk in paars (figuur 3B, F) en cyaan (figuur 3C, G) worden weergegeven. De vermeende bindingsplaats, die voornamelijk bestaat uit de vinger met twee helixen, wordt in het groen weergegeven.

Zoals te zien is in figuur 3, definieert elk van deze FRET-schillen een relatief groot deel van het eiwitcomplex. Voor alle drie de locaties kruist de FRET-schaal de vermeende bindingsplaats; voor het SecA321-residu is het doorsneden gebied echter kleiner en ligt het aan de uiteinden van de vingers met een aanzienlijke overlap met het spiraalvormige steigerdomein. Het snijpunt of de gemeenschappelijke ruimte van alle drie de FRET-schelpen (figuur 3D, H), definieert de locatie van het PhoA2-residu. Dit gebied is aanzienlijk kleiner dan elke FRET-schaal en omvat slechts een klein deel van de THF met een grote bijdrage van de spiraalvormige steiger. De scripts die worden gebruikt voor het genereren van de FRET-shells en de doorsneden gebieden voor het moleculaire visualisatieprogramma, PyMOL, worden gegeven in de aanvullende informatie. Delen van de schelpen worden gevisualiseerd als roze stippen op het SecA-SecYEG-complex in aanvullende figuren 1-3.

Een vergelijkbare strategie werd gebruikt om de locatie van het PhoA22-residu te identificeren. De FRET-schalen gedefinieerd door de PhoA22 FRET-afstanden (figuur 4A-C, E-G) beschrijven een kleiner gebied ten opzichte van het PhoA2-residu (figuur 4D, Hversus figuur 3D, H). We interpreteren dit verschil om te suggereren dat het PhoA2-residu en het bijbehorende gebied flexibeler en labieler zijn dan PhoA22. Het is veelbetekenend dat het gebied dat wordt toegeschreven aan het PhoA22-residu zich dichter bij de punt van de THF en de monding van het SecYEG-kanaal bevindt, met gebieden van SecY geïdentificeerd in de gemeenschappelijke ruimte (figuur 3D, H). Alle drie de kleurstofparen identificeren regio's samen met de vermeende bindingsplaats; de gekruiste gemeenschappelijke ruimtes centreren echter de PhoA22-locatie (figuur 4D, H) aan het tegenovergestelde uiteinde van de THF ten opzichte van de PhoA2-locatie (figuur 3D, H). Deze bevindingen zouden suggereren dat de signaalsequentie van het preproteïne dat zich uitstrekt van residuen 2-22, langs de THF in een relatief ongestructureerde toestand ligt. Dit resultaat komt overeen met eerdere studies die suggereren dat de signaalsequentie zich bindt aan het eiwit langs de THF in een uitgebreide toestand en dat het C-terminale uiteinde van SecA in de B. subtilis kristalstructuur in wezen de structuur van het signaalpeptide modelleert en dezelfde locatie inneemt (weergegeven in rode figuur 1F) 2,26 . We gebruikten een vergelijkbare aanpak om twee locaties in het vroeg volwassen gebied (residuen 37 en 45) van de SecA-PhoA preproteïne chimaera te identificeren om de binding en oriëntatie van de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied verder te definiëren, zoals hieronder besproken. In andere studies zijn FRET-afstanden effectief gebruikt om een bestaand structuur of moleculair dynamica-simiulatie-afgeleid model te verfijnen 18,19,56; we waren niet in staat om dit te doen, omdat er geen structuur bestaat voor de signaalvolgorde die aan SecA is gebonden.  

Figure 1
Figuur 1: Labeling sites in SecA-SecYEG complex met representatieve FRET spectra. (A-D) Vier verschillende weergaven van de SecA-SecYEG co-kristalstructuur (PDBID: 3DIN)33 waarin de labeling sites van SecA37, SecA321 en SecY292 worden weergegeven als respectievelijk magenta, violet en cyaan bollen. A-C zijn zijaanzichten van het complex en D is een bovenaanzicht. SecA wordt weergegeven in lichtgrijs, SecYEG wordt weergegeven in donkergrijs en de vermeende bindingsplaats, de THF, wordt in groen weergegeven. (E) Schematisch van het SecA-PhoA chimera construct, dat het SecA-eiwit verbindt met het PhoA-preproteïne via een Ser-Gly-linker (niet getekend op schaal). De etiketteringsplaatsen op het PhoA-gedeelte van de chimaera worden gegeven in blauw, groen, geel en rood, overeenkomend met residuen 2, 22, 37 en 45. (F) Lintdiagram van de kristalstructuur van B. subtilis SecA-eiwit (PDBID: 1M6N) gekleurd door domein waar nucleotide-bindende domeinen 1 en 2 worden weergegeven in respectievelijk blauw en lichtblauw, het preproteïne cross-linking domein wordt weergegeven in goud, de centrale helix in groen, de twee-helixvinger in cyaan, het spiraalvormige vleugeldomein in donkergroen en de C-terminale linker in rood26 . De ongestructureerde C-terminus dient als model van het gebonden PhoA-signaalpeptide op basis van een eerdere FRET-mappingstudie2. (G) Steady-state fluorescentiespectra van alleen donor en donor-acceptormonsters van het SecA37-AF647- en PhoA2-AF488 FRET-paar en het SecA37-AF647- en PhoA22-AF488 FRET-paar. De vermindering van de donorintensiteit voor het donor-acceptormonster is indicatief voor energieoverdracht. Er vindt een grotere energieoverdracht plaats van PhoA22 ten opzichte van de PhoA2-site op basis van de afname van de donorintensiteit. (H) Alleen in de tijd opgeloste fluorescentiedonor (magenta) en donor-acceptor (lichtmagenta) vervalspectra van het SecA37-AF647- en PhoA22-AF488 FRET-paar. De responsfunctie van het instrument wordt grijs weergegeven. Het donor-acceptor complex geeft een korter verval en bijgevolg een snellere levensduur in overeenstemming met energieoverdracht. Alle moleculaire structuren werden gegenereerd met het aangegeven PDB-bestand en PyMOL50. Figuur 1E-H is aangepast van Zhang et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Gebruikersinterface van het FluorEssence-programma. (A) Het openingsvenster wordt weergegeven met een cirkel rond de rode M. Hierop moet worden geklikt om het programma met de fluorometer te verbinden. (B) Het venster voor het opzetten van experimenten illustreert de verschillende gebieden (mono's, detectoren, accessoires) waar scanrelevante parameters worden ingevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: FRET-afstandsschalen bepaald voor de SecA-PhoA2-positie. FRET-afstandsschalen opgebouwd uit de FRET-afstanden en de bijbehorende onzekerheden (tabel 1) zijn afgebeeld op het SecA-SecYEG-complex (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET-afstandsschalen voor de PhoA2-locatie geconstrueerd met SecA37 (magenta), SecA321 (violet) en SecY292 (cyaan), respectievelijk op de middelste positie. De schelpen zijn gekleurd volgens het middelste residu. (D) Het snijpunt van de drie FRET-schillen definieert de locatie van PhoA2, weergegeven in blauw. (E-H) Weergaven worden ongeveer 180° van A-D gedraaid. Alle moleculaire structuren werden gegenereerd met het aangegeven PDB-bestand en PyMOL50. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: FRET-afstandsschalen bepaald voor de SecA-PhoA22-positie. FRET-afstandsschalen opgebouwd uit de FRET-afstanden en bijbehorende onzekerheden (tabel 1) zijn afgebeeld op het SecA-SecYEG-complex (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET-afstandsschalen voor de PhoA22-locatie geconstrueerd met SecA37 (magenta), SecA321 (violet) en SecY292 (cyaan), respectievelijk op de middelste positie. De schelpen zijn gekleurd volgens het middelste residu. (D) Het snijpunt van de drie FRET-schillen definieert de locatie van PhoA22, weergegeven in geel. (E-H) Weergaven worden ongeveer 180° van A-D gedraaid. Alle moleculaire structuren werden gegenereerd met het aangegeven PDB-bestand en PyMOL50. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: FRET-in kaart gebrachte locaties van PhoA2, PhoA22, PhoA37 en PhoA45 geprojecteerd op de B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE cocrystalstructuur (PDBID: 5EUL). (A) Kleuring van SecA-SecYE zoals in Figuur 1. Het OmpA-peptidesubstraat dat aan het einde van de THF is ingebracht, wordt in het roze weergegeven. FRET-in kaart gebrachte regio's werden gegenereerd in aanwezigheid van ATP-γS, met PhoA2 in blauw, PhoA22 in groen, PhoA37 in geel en PhoA45 in rood. Overlappende regio's worden weergegeven in olijf (PhoA22 en PhoA37) en oranje (PhoA37 en PhoA45). Het peptidesubstraat (residuen 749-791, cyaan) werd uit de oorspronkelijke structuur weggesneden en gemodelleerd in het vermeende bindingsgebied zonder enige wijziging van de structuur (rood omcirkeld). (B) Vergrote weergave van het gemodelleerde peptidesubstraat. Residuen 2 (Lys), 22 (Tyr) en 37 (Gly) van het OmpA-peptidesubstraat worden in stokvorm weergegeven in respectievelijk blauw, groen en geel. Deze residuen in de gemodelleerde peptiden vertonen een uitstekende overeenkomst met de voorspelde FRET-in kaart gebrachte locaties. Voor de duidelijkheid is het nanobody in de oorspronkelijke structuur weggelaten. Dit cijfer is aangepast van Zhang et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

gelabelde site op SecA-PhoA-SecYEG complex Gelabelde site op PhoA peptide gedeelte van SecA-PhoA Chimera
Phoa2-af488 Phoa22-af488 PhoA37-af488 Phoa45-af488
SecA 37-AF467-Phoa
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET-efficiëntie 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
afstand 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-Phoa
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET-efficiëntie 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
afstand 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 Phoa22-af647 PhoA37-af647 PhoA45-af647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET-efficiëntie 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
afstand 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
aangepast van referentie 3.
R0-waarden in angstroms werden berekend zoals beschreven in de tekst
De FRET-efficiëntie werd berekend op basis van de afname van de donorfluorescentie-intensiteit in aanwezigheid van de acceptor zoals beschreven. De fout wordt gerapporteerd als de SD van drie onafhankelijke metingen.
Donor-acceptor afstanden (R) worden gegeven in angstroms en berekend zoals beschreven in de tekst. De gerapporteerde fout is het resultaat van een beschouwing van de experimentele fout en die welke voortvloeit uit de oriëntatie van de kleurstoffen.  Kleurstoforiëntatie wordt geschat op basis van de steady state fluorescentie-anisotropie

Tabel 1: Overdrachtsefficiënties en afstanden bepaald voor het SecA-PhoA-SecYEG-complex. FRET-efficiënties, afstanden en R0-waarden worden gegeven voor de 12 afstanden die worden gebruikt voor het in kaart brengen van de preproteïnebindingsplaats.

Aanvullende figuur 1: FRET-afstandsschaal, weergegeven in roze stippen, bepaald voor het SecA37-residu en het PhoA 37-residu op het SecA-SecYEG-complex (PDBID: 3DIN). Sec A wordt weergegeven in lichtgrijs, SecYEG wordt weergegeven in donkergrijs en het SecA37-residu wordt weergegeven in magenta. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: FRET-afstandsschaal, weergegeven in roze stippen, bepaald voor het SecA321-residu en het PhoA 37-residu op het SecA-SecYEG-complex (PDBID: 3DIN). Sec A wordt weergegeven in lichtgrijs, SecYEG wordt weergegeven in donkergrijs en het SecA321-residu wordt weergegeven in violet. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: FRET-afstandsschaal, weergegeven in roze stippen, bepaald voor het SecY292-residu en het PhoA 37-residu op het SecA-SecYEG-complex (PDBID: 3DIN). Sec A wordt weergegeven in lichtgrijs, SecYEG wordt weergegeven in donkergrijs en het SecY292-residu wordt weergegeven in cyaan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Door het gebruik van de FRET-mappingmethodologie identificeerden we de signaalsequentiebindingsplaats op het SecA-eiwit. Belangrijk is dat de aanwezigheid van een 3D-kristalstructuur van het complex onze studie aanzienlijk vergemakkelijkte. De kracht van deze mappingmethodologie ligt in de mogelijkheid om een bestaande structuur te gebruiken om locaties voor labeling te identificeren. Deze methodologie kan niet worden gebruikt om een 3D-structuur te bepalen; bepaling van structurele elementen56, verfijning van een bestaande structuur49, bepaling van een bindingslocatie 2,32 of opheldering van dynamische beweging57 zijn echter allemaal mogelijke toepassingen van deze methode.

In het SecYEG-SecA-PhoA-complex vormen de drie labelplaatsen een driehoek rond de vermeende bindingsplaats (figuur 1). Het gebruik van meerdere afstandsmetingen van de hoekpunten van deze driehoek tot hetzelfde residu verfijnt de locatie-informatie vergelijkbaar met GPS-navigatiemethoden. Drie locaties, SecA37, SecA341 en SecY292, werden geïdentificeerd op SecA en SecY, samen met vier locaties, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 in de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied van het preproteïne om in totaal 12 afstanden te geven voor het in kaart brengen van de locatie van het signaalpeptide (tabel 1). Belangrijk is dat om de nauwkeurigheid van de afstandsmetingen te verbeteren, etiketteringslocaties zich in relatief statische gebieden van het eiwit moeten bevinden, zoals in secundaire structuurelementen in plaats van lussen. Bovendien moeten locaties zich ook op locaties bevinden die relatief toegankelijk zijn voor oplosmiddelen voor gemak en verhoogde efficiëntie van etikettering. Binnen het SecA-PhoA-SecYEG-complex waren de uitvoeringen van afstandsmetingen van de driehoeksplaatsen of hoekpunten tot residuen in het bindende substraat voldoende om de residuen in het bindende substraat op een relatief klein gebied te lokaliseren (figuur 3D, H en figuur 4D, H). Identificatie van het doorsneden gebied uit de meervoudige afstandsmetingen verfijnt de locatie aanzienlijk ten opzichte van die van de meting van één afstand, zoals weergegeven in figuur 3 en figuur 4. Bij het gebruik van deze methode wordt het meten van meerdere afstanden dus sterk aanbevolen. Hoewel deze methode bijvoorbeeld gebieden van moleculen kan identificeren die betrokken zijn bij binding, levert het geen precieze structurele informatie op; dergelijke informatie kan het best worden verkregen uit andere structurele methoden zoals röntgenstraling, NMR en cryo-EM. FRET-afstanden kunnen worden gebruikt om een bestaande structuur18,19 of model effectief te verfijnen, in dit geval was dat niet mogelijk omdat er geen model van de signaalsequentie gebonden aan SecA bestaat.

Om ervoor te zorgen dat kleurstofetikettering alleen op gewenste locaties plaatsvindt en FRET-afstandsmetingen nauwkeurig zijn, heeft het gebruik van mutagenese voor etikettering de voorkeur. Het genereren van een Cys-loze mutant vereist een relatief conservatieve mutatie van Cys-residuen in Ser of soortgelijke residuen in het anders wilde eiwit met behulp van locatiegerichte mutagenesemethoden. In de huidige studie werden Cys-mutaties geïntroduceerd in Cys-vrije versies van SecA en SecYEG voor labeling37. De activiteit van het mutante eiwit werd geverifieerd met een groeitest gevolgd door een in vitro malachietgroene ATPase-test41,42. Relevante activiteitstests zijn afhankelijk van de functie van het eiwit, bijvoorbeeld voor DNA-bindende eiwitten zou een DNA-bindingstest geschikt zijn58. Het niet garanderen van etikettering op slechts één locatie kan leiden tot etikettering van meer dan één locatie met dezelfde kleurstof, wat de afstandsbepalingen aanzienlijk bemoeilijkt. De introductie van een tweede label op hetzelfde eiwit kan dus worden gedaan door de opname van onnatuurlijk aminozuur door plaatsgerichte mutagenese. We gebruikten deze methodologie om de SecA-PhoA-chimaera te labelen op locaties die verschillen van Cys-residuen door het onnatuurlijke aminozuur p-azidofenylalanine te introduceren en te labelen met klikchemie39,40.

Een andere belangrijke overweging van deze methode is de keuze van de gebruikte kleurstoffen en de bijbehorende R0-waarde . Na identificatie van de potentiële etiketteringslocaties kunnen de te meten afstanden worden geschat vanaf de 3D-structuur. Met deze informatie kunnen onderzoekers kleurstofparen kiezen met R0-waarden die het gewenste bereik van verwachte afstanden overspannen. Het AF488-AF647 kleurstofpaar heeft bijvoorbeeld een berekende R0 van 55,7 Å, wat een goed bereik biedt voor etiketteringslocaties op een geschatte 40-75 Å afstand van de vermeende bindingsplaats. Hoewel de R0-waarden die in stap 2.2 zijn berekend, nuttig zijn om te kiezen welk kleurstofpaar u voor uw systeem wilt gebruiken, kan de hechting van de kleurstoffen aan het eiwit hun eigenschappen aanzienlijk veranderen. Voor een grotere nauwkeurigheid moeten R0-waarden worden berekend op basis van in situ experimenten uitgevoerd met gelabeld eiwit (stappen 3.1 - 3.6.5).

Het meten van de overdrachtsefficiëntie kan worden uitgevoerd door de steady-state fluorescentie-emissie te monitoren en een afname van de donoremissie of een toename van de acceptoremissie waar te nemen. Hoewel observatie van beide effecten wenselijk is, kan het rendement worden berekend uit beide zoals beschreven 5,8. De efficiëntie kan ook worden berekend op basis van de afname van de levensduur van de donor in het donoracceptormonster ten opzichte van het monster dat alleen door de donor wordt gebruikt. Het wordt aanbevolen de efficiëntie met meer dan één methode te bepalen, met name het gebruik van tijdomvattende methoden om de relatieve homogeniteit van de gemeten efficiëntieverbeteringen vast te stellen.

De mappingmethode stelde ons ook in staat om de relatieve oriëntatie van de signaalsequentie en de vroege volwassen gebieden van het PhoA-preproteïne ten opzichte van SecA en de vermeende bindingsplaats te bepalen. Een SecA-SecYEG röntgenkristalstructuur en daaropvolgende cryo-EM studie gaven duidelijkheid over de structuur van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied van het preproteïne met betrekking tot het kanaal en SecA34,35. In de röntgenstructuur werden residuen 1-41 van het OmpA-preproteïne bevestigd aan de punt van de vinger met twee helixen en gevisualiseerd in een haarspeldstructuur in het kanaal (weergegeven in roze, figuur 5). De locaties van de vier PhoA-residuen in de SecA-PhoA-chimaera werden op deze structuur in kaart gebracht met behulp van hetzelfde protocol als hierboven beschreven. Zoals te zien is in figuur 5, ligt de locatie van de PhoA37- en PhoA45-residuen (geel, oranje, rood) tussen PhoA2 en PhoA22, met PhoA45 dichter bij PhoA2. Deze bevindingen, met name de locatie van PhoA45, suggereerden dat het PhoA-preproteïne een haarspeldstructuur vormde.

Om onze FRET-geïdentificeerde bindingsplaats verder te valideren, hebben we een vergelijking van onze in kaart gebrachte locaties uitgevoerd met die van het OmpA-preproteïne, door de preproteïnestructuur van 41 residuen uit het kanaal te verwijderen en te modelleren in de regio's die zijn gedefinieerd door FRET-mapping (figuur 5, cyaan). Zonder enige wijziging van de preproteïne-röntgenstructuur, vinden we dat de locaties van residuen 2, 22 en 37 (weergegeven in blauw, groen en geel) op de OmpA preproteïnefragment weggesneden structuur opmerkelijk goed overeenkomen met de FRET-in kaart gebrachte locaties (figuur 5B) en suggereren dat de haarspeldvorm zich vormt voorafgaand aan kanaalinvoer. Het OmpA-preproteïne eindigt bij residu 41 in de röntgenkristalstructuur; de C-terminal van SecY, die ongestructureerd is, geeft echter een indicatie van de mogelijke locatie van PhoA45. In onze gemodelleerde structuur zit de haarspeldlus aan de monding van het kanaal, klaar om de translocatie van het preproteïne over het membraan te vergemakkelijken. In dit voorbeeld verbetert de FRET-mappingmethodologie dus de bestaande informatie over de statische SecA-SecYEG-structuur, door een hint te geven van de dynamische beweging die nodig is voor eiwittranslocatie over het membraan. Hoewel niet geschikt voor de novo structuurbepalingen, kan de FRET-mappingmethodologie, als er 3-dimensionale structurele informatie beschikbaar is, het huidige begrip van structuur-functierelaties bevorderen, door opheldering van bindingsplaatsen en dynamische bewegingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health grant R15GM135904 (toegekend aan IM) en National Institutes of Health Grant GM110552 (toegekend aan DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Biochemie fluorescentie energieoverdracht SecA eiwittranslocatie FRET mapping
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter