Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

رسم خرائط نقل الطاقة بالرنين Förster: منهجية جديدة لتوضيح الميزات الهيكلية العالمية

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

تفصل الدراسة منهجية رسم خرائط FRET بما في ذلك اختيار مواقع وضع العلامات ، واختيار الأصباغ ، والاقتناء ، وتحليل البيانات. هذه المنهجية فعالة في تحديد مواقع الربط ، والتغيرات التوافقية ، والحركات الديناميكية في أنظمة البروتين وهي مفيدة للغاية إذا تم تنفيذها بالاقتران مع المعلومات الهيكلية 3-D الحالية.

Abstract

نقل طاقة الرنين Förster (FRET) هي طريقة راسخة قائمة على التألق تستخدم لقياس المسافات بنجاح في الجزيئات الحيوية وبينها في المختبر وكذلك داخل الخلايا. في FRET ، ترتبط كفاءة نقل الطاقة ، التي تقاس بالتغيرات في شدة التألق أو العمر الافتراضي ، بالمسافة بين جزيئين أو ملصقات فلورية. إن تحديد الديناميكيات والتغيرات التوافقية من المسافات ليست سوى بعض الأمثلة على تطبيقات هذه الطريقة على الأنظمة البيولوجية. في ظل ظروف معينة ، يمكن لهذه المنهجية أن تضيف إلى الهياكل البلورية الحالية للأشعة السينية وتعززها من خلال توفير معلومات تتعلق بالديناميكيات والمرونة والتكيف مع الأسطح الملزمة. نحن نصف استخدام FRET وتحديد المسافة المرتبطة به لتوضيح الخصائص الهيكلية ، من خلال تحديد موقع ربط أو اتجاهات الوحدات الفرعية dimer. من خلال الاختيار الحكيم لمواقع وضع العلامات ، وغالبا ما نستخدم استراتيجيات متعددة لوضع العلامات ، نجحنا في تطبيق طرق رسم الخرائط هذه لتحديد الخصائص الهيكلية العالمية في مجمع البروتين والحمض النووي ونظام نقل البروتين SecA-SecYEG. في نظام SecA-SecYEG ، استخدمنا طرق رسم خرائط FRET لتحديد موقع ربط ما قبل البروتين وتحديد التشكيل المحلي لمنطقة تسلسل الإشارة المرتبطة. تحدد هذه الدراسة خطوات إجراء دراسات رسم الخرائط FRET ، بما في ذلك تحديد مواقع وضع العلامات المناسبة ، ومناقشة الملصقات المحتملة بما في ذلك بقايا الأحماض الأمينية غير الأصلية ، وإجراءات وضع العلامات ، وكيفية إجراء القياسات ، وتفسير البيانات.

Introduction

بالنسبة للبروتينات ، يؤدي توضيح الديناميكيات إلى جانب المعرفة الهيكلية ثلاثية الأبعاد (3-D) إلى فهم معزز للعلاقات بين البنية والوظيفة للأنظمة الجزيئية الحيوية. تلتقط الطرق الهيكلية ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني المبرد ، بنية ثابتة وغالبا ما تتطلب تحديد هياكل متعددة لتوضيح جوانب ربط الجزيئات الحيوية وديناميكياتها1. تتناول هذه المقالة طريقة قائمة على الحلول لتعيين العناصر الهيكلية العالمية، مثل مواقع الربط أو تفاعلات الربط، التي يحتمل أن تكون أكثر عابرة وأقل سهولة في التقاطها بواسطة الطرق الثابتة. الأنظمة المرشحة القوية لهذه المنهجية هي تلك التي تم فيها تحديد بنية 3-D مسبقا بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي أو الطرق الهيكلية الأخرى. في هذه الحالة ، نستفيد من البنية البلورية للأشعة السينية لمجمع SecA-SecYEG ، وهو لاعب مركزي في مسار الإفراز العام للبروتين ، لرسم خريطة لموقع ربط ببتيد الإشارة باستخدام نقل طاقة الرنين Förster (FRET) قبل نقل البروتين المسبق عبر الغشاء2. إن التلاعب بالنظام البيولوجي من خلال التعديلات الجينية إلى جانب معرفتنا بالبنية ثلاثية الأبعاد مكن من تحديد تشكيل تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة مباشرة قبل إدخالها في القناة 3.

يتضمن FRET نقل الطاقة بدون إشعاع من جزيء واحد (مانح) إلى آخر (متقبل) بطريقة تعتمد على المسافة التي تتم عبر الفضاء 4,5. يتم رصد كفاءة هذا النقل إما من خلال انخفاض في المتبرع أو زيادة في كثافة التألق المتقبل. يمكن وصف كفاءة نقل الطاقة بأنها

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

حيث تكون قيمة R0 هي المسافة التي يكون فيها النقل فعالا بنسبة 50٪6. وقد وصفت هذه التقنية سابقا بأنها مسطرة جزيئية وهي فعالة في تحديد المسافات في نطاق 2.5-12 نانومتر، اعتمادا على هوية الأصباغ المتقبلة المانحة4،7،8،9. تسمح كثافة التألق المانحة وعمرها الافتراضي مع أو بدون المتقبل بتحديد كفاءات النقل وبالتالي ، المسافات 5,8. نظرا لتوافر التكنولوجيا ، وحساسية الطريقة ، وسهولة الاستخدام ، وجدت FRET أيضا تطبيقا واسعا في مجالات مثل التحليل الطيفي الفلوري أحادي الجزيء والمجهر البؤري6. ظهور البروتينات الفلورية مثل بروتين الفلورسنت الأخضر جعل ملاحظة الديناميكيات داخل الخلايا وتصوير الخلايا الحية سهلة نسبيا10,11. تتم مناقشة العديد من تطبيقات FRET مثل هذه بالتفصيل في هذه المشكلة الافتراضية.

في هذه الدراسة ، نركز بشكل خاص على استخدام قياسات FRET لإنتاج قيم المسافة لتحديد التفاصيل الهيكلية. في السابق ، تم استخدام قياسات FRET بشكل فعال لتحديد تكوين جزيئات الحمض النووي عند ارتباطها بالبروتين 12،13،14 ، والديناميات الداخلية للبروتينات ، وتفاعلات ربط البروتين15،16،17. تكمن مزايا هذه الطريقة في القدرة على تحديد العناصر الهيكلية المرنة والديناميكية في حل بكميات منخفضة نسبيا من المواد. بشكل ملحوظ ، هذه الطريقة فعالة بشكل خاص عند استخدامها بالاقتران مع المعلومات الهيكلية الموجودة ولا يمكن استخدامها كوسيلة لتحديد هيكل 3-D. توفر هذه الطريقة أفضل رؤية وصقل للهيكل إذا كان العمل يعتمد على المعلومات الهيكلية الموجودة غالبا ما يقترن بالمحاكاة الحسابية18,19. هنا ، يتم وصف استخدام المسافات التي تم الحصول عليها من قياسات FRET ذات الحالة الثابتة والوقت المحدد لرسم خريطة لموقع ربط ، لم يكن موقعه معروفا ، على بنية بلورية موجودة لمجمع SecA-SecYEG ، البروتينات الرئيسية في مسار الإفراز العام3.

يتوسط مسار الإفراز العام ، وهو نظام محفوظ للغاية من بدائيات النوى إلى حقيقيات النوى إلى العتائق ، نقل البروتينات إما عبر الغشاء أو داخله إلى موقعها الوظيفي في الخلية. بالنسبة للبكتيريا سالبة الجرام ، مثل الإشريكية القولونية ، الكائن الحي المستخدم في دراستنا ، يتم إدخال البروتينات في الغشاء الداخلي أو نقله عبر الغشاء الداخلي إلى periplasm. ينسق مجمع قناة SecY البكتيري (المسمى translocon) مع البروتينات الأخرى لنقل البروتين المركب حديثا ، والذي يتم توجيهه إلى موقعه الصحيح في الخلية من خلال تسلسل إشارة يقع عادة في N-terminus20,21. بالنسبة للبروتينات المرتبطة بالبيريبلازما ، يرتبط بروتين ATPase SecA بنفق خروج الريبوسوم ، ومع البروتين المسبق بعد ترجمة ما يقرب من 100 بقايا22. جنبا إلى جنب مع بروتين SecB chaperone ، فإنه يحافظ على البروتين المسبق في حالة غير مطوية. يرتبط SecA ب SecYEG translocon ، ومن خلال العديد من دورات التحلل المائي ATP ، يسهل نقل البروتين عبر الغشاء23,24.

SecA هو بروتين متعدد المجالات موجود في أشكال الخلايا والمرتبطة بالغشاء. بروتين متجانس في السيتوسول ، يتكون SecA من مجال ربط ما قبل البروتين أو الربط المتقاطع25 ، ومجالين مرتبطين بالنيوكليوتيدات ، ومجال جناح حلزوني ، ومجال سقالة حلزونية ، وإصبعين حلزوني (THF) 26،27،28،29 (الشكل 1). في الدراسات البلورية السابقة لمجمع SecA-SecYEG ، اقترح موقع THF أنه شارك بنشاط في نقل البروتين والتجارب اللاحقة للربط المتبادل مع ببتيد الإشارة ، مما زاد من أهمية هذه المنطقة في نقل البروتين30,31. أظهرت الدراسات السابقة ، باستخدام منهجية رسم الخرائط FRET ، أن ببتيدات الإشارة الخارجية ترتبط بهذه المنطقة من SecA 2,32. لفهم كامل لتكوين وموقع تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة للبروتين المسبق قبل إدخاله في قناة SecYEG ، تم إنشاء وهم البروتين الذي تم فيه ربط تسلسل الإشارة وبقايا المنطقة الناضجة المبكرة ب SecA من خلال رابط Ser-Gly (الشكل 1). باستخدام هذا البناء القابل للحياة بيولوجيا ، ثبت كذلك أن تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق ترتبط ب THF بطريقة متوازية2. وفي وقت لاحق، استخدمت منهجية رسم الخرائط FRET لتوضيح تشكيل وموقع تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة في وجود SecYEG كما هو موضح أدناه3.

سمحت لنا معرفة الهيكل ثلاثي الأبعاد لمجمع SecA-SecYEG 33,34,35 والموقع المحتمل لموقع الربط بوضع ملصقات المانحين والمتقبلين بحكمة في المواقع التي يحدد فيها تقاطع مسافات FRET الفردية موقع موقع الربط. كشفت قياسات رسم الخرائط FRET هذه أن تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق يشكلان دبوس شعر مع وجود الطرف عند فم قناة SecYEG ، مما يدل على أن بنية دبوس الشعر يتم تشكيلها قبل إدخال القناة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اختيار مواقع وضع العلامات

  1. حدد ما لا يقل عن ثلاثة مواقع محتملة لوضع العلامات لتثليث موقع الربط المفترض على هياكل البروتين الحالية. في هذه الحالة ، تم تحديد SecA و SecYEG و preprotein المرتبطة ب SecA من خلال الاندماج الجيني2.
    1. اختر مواقع وضع العلامات ضمن 25-75 Å من موقع الربط المفترض وفي المناطق الثابتة نسبيا من البروتين ، ستحدد المسافة زوج صبغة FRET المحدد الذي سيتم استخدامه36. حدد موقع وضع العلامات في مناطق البروتين المتميزة نسبيا عن بعضها البعض ، بحيث تصف المواقع رؤوس المثلث مع موقع الربط المفترض الموجود في الوسط (الشكل 1A-D).
    2. إدخال أو تحديد بقايا السيستين (Cys) في مواقع وضع العلامات ذات الأهمية في البروتين الذي لا يحتوي على بقايا Cys أخرى ، لتحسين كفاءة وضع العلامات على الموقع المحدد37,38.
    3. إدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، على سبيل المثال ، p-azidophenylalanine لوضع العلامات مع كيمياء النقر ، من أجل تسمية بروتين واحد بشكل فعال في موقعين متميزين بأصباغ مختلفة39,40.
    4. اختبار طفرات Cys لفقدان الوظيفة. تحقق من نشاط المتحور الأقل Cys ومتحور الأحماض الأمينية غير الطبيعية باستخدام فحص النشاط المناسب. في هذه الحالة ، تم التحقق من النشاط من خلال فحص النمو متبوعا بفحص ATPase الأخضر في المختبر من الملكيت32,41,42

2. وضع العلامات على البروتين

  1. تنقية البروتين أو البروتينات ذات الأهمية إلى نقاء 95٪ على الأقل لوضع العلامات الدقيقة. تنقية بروتينات SecA و SecYEG باتباع البروتوكولات المفصلة في المرجع3. تأكد من أن لديك ما لا يقل عن 5 ميكروغرام من البروتين النقي لهذه الخطوة ، حيث سيتم فقدان بعض البروتين أثناء عملية وضع العلامات.
  2. اختر صبغتين لقياسات FRET اعتمادا على قيمة R0 الخاصة بهما والمسافات المتوقعة بين المواقع المصنفة. تقدير قيم R0 ومراقبة تداخل انبعاثات الجهات المانحة وامتصاص المستقبلات باستخدام المعلومات الواردة من قاعدة بيانات البروتين الفلوري ، والتي تعطي أيضا أطياف للأصباغ شائعة الاستخدام (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    ملاحظة: يتم تعريف R0 على أنه المسافة التي تكون فيها كفاءة النقل 50٪ لزوج صبغة معين. بالنسبة لتجارب رسم الخرائط، يجب أن تكون المسافات المتوقعة قريبة من قيمة R0 لزوج الصبغة لضمان إمكانية قياس المسافات بدقة.
  3. تسمية المواضع المحددة في الخطوة 1.1.1. مع زوج صبغة المتبرع والمتقبل.
    1. قم بتسمية البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع إيلاء اهتمام خاص لمعلمات مثل تركيز البروتين الأمثل ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة وطول الوقت والمخزن المؤقت للأصباغ المحددة المستخدمة43,44.
    2. تحضير البروتين بتركيز 1-2 ملغم / مل أو حوالي 10 ميكرومتر في 25 ملليمتر Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 25 mM KCl ، 1 mM EDTA (TKE) العازل. تذوب الصبغة في ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيز نهائي قدره 1 ملليمتر. أضف الصبغة قطرة إلى المحلول مع التحريك للوصول إلى صبغة: نسبة البروتين المولية 5: 1 (صبغة 50 ميكرومتر: بروتين 10 ميكرومتر).
    3. اسمح للتفاعل بالمتابعة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) في قارورة زجاجية مع هزاز لطيف أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. أوقف التفاعل بإضافة β-ميركابتوإيثانول.
      ملاحظة: إذا كان البروتين غير متوافق مع مخزن Tris المؤقت، يمكن استخدام مخازن الفوسفات أو HEPES. الحفاظ على درجة الحموضة في نطاق 7.0-7.5. إذا كان البروتين يحتوي على روابط ثاني كبريتيد ، فأضف عاملا مختزلا مثل DTT أو TCEP قبل وضع العلامات. إزالة DTT عن طريق غسيل الكلى أو الترشيح هلام قبل إضافة صبغة.
  4. للحصول على قياسات دقيقة من FRET ، قم بإزالة الصبغة الحرة باستخدام مكثف طرد مركزي مع قطع وزن جزيئي مناسب (MWCO) للسماح للصبغة الحرة بالتدفق مع الاحتفاظ بالبروتين الموسوم.
    1. قم بتحضير غشاء المكثف عن طريق وضع ~ 1 مل من الماء في الجزء العلوي من مكثف 3 مل ثم طرد الماء مركزيا من خلال الغشاء (على الأقل 10 دقائق عند 4300 × جم).
    2. قم بإزالة الصبغة الحرة عن طريق الطرد المركزي للعينة الموسومة في المكثف (20 دقيقة عند 4300 × جم). كرر 3-4 مرات وتخلص من التدفق من خلال.
    3. تحقق من كفاءة وضع العلامات على البروتين المسمى باستخدام التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: تتطلب قياسات FRET كفاءة وضع العلامات بنسبة 50٪ أو أكثر. تقلل كفاءة وضع العلامات المنخفضة من إشارة FRET ويمكن أن تؤدي إلى عدم الدقة في القياس.
    4. احصل على طيف UV-Vis للبروتين المسمى بنطاق يتراوح بين 250-700 نانومتر لمراقبة كل من نطاق امتصاص البروتين ونطاق امتصاص الصبغة الأقصى. قياس الامتصاص عند ذروة امتصاص الصبغة وعند 280 نانومتر للبروتين.
    5. أوجد تركيز البروتين وصحح أي مساهمات من الصبغة باستخدام عامل التصحيح، CF، والمعادلات التالية45,46:
      Equation 1
      حيث C هو تركيز البروتين (M) ، A 280 هو امتصاص العينة عند 280 نانومتر ،والحد الأقصى هو الامتصاص عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة ، ε البروتين هو معامل الانقراض للبروتين عند 280 نانومتر و CF هو عامل التصحيح ، A'280 / A'max ، حيث A'280 هو الامتصاص عند 280 نانومتر و A'max هو الامتصاص في ذروة الحد الأقصى للصبغة فقط.
    6. تحديد كفاءة وضع العلامات باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 2
      حيث ε الصبغة هي معامل الانقراض المولي للصبغة ، C هو تركيز البروتين كما هو محدد في الخطوة 2.4.5 ، و E هو كفاءة وضع العلامات. كرر الخطوة 2.4.2 حتى تستقر قيمة كفاءة وضع العلامات وتكون أقل من 100٪.

3. تحديد قيم R 0

  1. قم بقياس قيم R0 في الموقع. قم بإعداد عينتين من البروتين بنفس تركيز البروتين الكلي ، 4 ميكرومتر ، واحدة مع البروتين المسمى بصبغة المتبرع فقط وواحدة مع البروتين الموسوم بصبغة المتقبل فقط. بالنسبة ل SecA ، يعمل تركيز البروتين البالغ 4 ميكرومتر SecA مونومر بشكل جيد لهذه القياسات.
    1. قم بإعداد أحجام عينة تبلغ 2.5 مل لكوفيت 1 سم × 1 سم ، أو 600 ميكرولتر لكوفيت 5 مم × 5 مم أو 200 ميكرولتر لكوفيت 3 مم × 3 مم.
  2. قم بتشغيل مقياس الفلورومتر وافتح برنامج الاكتساب والتحليل الطيفي في برنامج التألق إذا كنت تستخدم مقياس الطيف الفلوري. انقر فوق M الأحمر لتوصيل الكمبيوتر بالأداة (الشكل 2A) واختر أطياف الانبعاثات.
    1. أدخل معلمات المسح الضوئي مثل الطول الموجي للإثارة، ونطاق فحص الانبعاثات، ودرجة الحرارة، وموضع مغير العينة باستخدام عنصر قائمة تجميع التجربة (الشكل 2B).
    2. انقر فوق RTC وقم بتحسين إعدادات الأداة (على سبيل المثال ، الشقوق الطيفية) من خلال مراقبة انبعاث التألق في الذروة باستخدام طول موجي مثير تم تعيينه عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة. بالنسبة إلى SecA ، قم بتعيين الإعدادات التالية: bandpass ك 1 نانومتر ؛ فتحات الإثارة والانبعاثات مثل 1 و 1.5 مم على التوالي ، مع درجة حرارة 25 درجة مئوية وسرعة التحريك عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: لا تتجاوز سعة العد في الثانية (cps) للأداة (عادة 2 × 106 cps).
  3. ضع عينة البروتين المصنفة من قبل المتبرع في حامل العينة وانقر فوق تشغيل لإنشاء مسح انبعاث للبروتين المسمى بصبغة المتبرع فقط (بروتين المتبرع فقط) عن طريق إثارة العينة عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة (على سبيل المثال، 488 نانومتر ل AF488) والمسح الضوئي فوق ذروة الانبعاثات (505-750 نانومتر للمتبرع فقط بروتين SecA المسمى AF488).
  4. قم بإنشاء خط أساس للفحص عن طريق تمديد المسح الضوئي 25-50 نانومتر إلى ما بعد نهاية الذروة. قياس العائد الكمومي للبروتين المتبرع فقط ، عن طريق إجراء قياسات الامتصاص والتألق على عينات بتركيزات مختلفة كما هو موضح47. حافظ على نفس إعدادات الشق لهذه القياسات.
    1. استخدم صبغة المتبرع الحرة كمرجع للعائد الكمومي. احصل على ما لا يقل عن أربعة قياسات للبروتين المتبرع فقط والصبغة الحرة بتركيزات مختلفة لتحديد دقيق.
    2. ارسم كثافة التألق أو المنطقة المتكاملة مقابل امتصاص البروتين المتبرع فقط والصبغة الحرة أو المرجع. حدد منحدرات البروتين المانح فقط (المنحدر D) والمرجع (المنحدرR).
    3. يتم حساب العائد الكمومي (Φ) باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 3
      هنا Φ D هو العائد الكمومي للبروتين المانح فقط ، Φ R هو العائد الكمومي للصبغة الحرة (يمكن الحصول على هذا عادة من الشركة المصنعة) ، المنحدر D والمنحدر R هما المنحدران المحددان في الخطوة 3.4.2 للمتبرع فقط البروتين والمرجع ، على التوالي η D و η R تمثل مؤشر انكسار البروتين المانح فقط ومحاليل الصبغة الخالية من المراجع ، على التوالي 47.
  5. احصل على طيف امتصاص للبروتين المتقبل فقط باستخدام خلية طول مسار 1 سم. قم بإنشاء طيف معامل انقراض من البروتين المتقبل فقط عن طريق تقسيم طيف الامتصاص على تركيز الصبغة.
  6. توليد التكامل التداخل الطيفي، J (λ) باستخدام برنامج تحليل رسومي. يمكن أيضا استخدام برنامج ورقة عمل قياسي (على سبيل المثال، جدول بيانات) لهذه العملية.
    1. اضرب طيف انبعاث التألق للبروتين المانح فقط (الخطوة 3.4) في طيف معامل الانقراض للبروتين المتقبل فقط لتوليد طيف التداخل.
    2. اضرب طيف التداخل الناتج في λ4.
    3. حدد المساحة تحت المنحنى عن طريق تكامل منطقة التداخل. وتعرف منطقة التداخل بأنها المنطقة التي ينتج فيها طيف الانبعاثات المانحة مضروبا في طيف معامل الانقراض المتقبل قيما إيجابية. يعرف تكامل التداخل الطيفي على النحو التالي:
      Equation 4
      حيث FD (λ) هو طيف انبعاث البروتين المانح فقط (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.4) و εA(λ) هو طيف معامل الانقراض للبروتين المتقبل فقط وله وحدات M-1 cm-1(تم الحصول عليها في الخطوة 3.5). يجب أن يكون للتداخل الطيفي الناتج وحدات M-1 cm-1nm 4.
    4. تطبيع التكامل الطيفي المتداخل. قسم التكامل التداخل على المنطقة المتكاملة من طيف البروتين المانح فقط على نفس النطاق الطيفي:
      Equation 5
    5. احسب قيمة R0 في Å باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 6
      حيث κ 2 هو عامل الاتجاه ، وعادة ما يؤخذ على أنه 2/3 للأصباغ الدوارة بحرية ، η هو مؤشر الانكسار ويمكن تقريبه إلى 1.33 للحلول المائية المخففة ، QD هو العائد الكمومي للمتبرع (الخطوة 3.4) و J (λ) هو تكامل التداخل الطيفي كما هو محدد في الخطوة 3.6.35. ملاحظة: إذا لم تكن الأصباغ تدور بحرية ، فيمكن إدخال التصحيحات كما وصفها إيفانوف 48 وتنفيذها بواسطة Auclair49 و Zhang 2,3.

4. إجراء القياسات الطيفية FRET

  1. تحضير عينات البروتين للمتبرع فقط، والبروتين المتقبل فقط، والبروتين المانح المتقبل بنفس التركيز؛ يوصى بتركيز 4 ميكرومتر. استخدم 200 ميكرولتر من المحلول ، إذا كنت تستخدم كوفيت 3 مم × 3 مم ، أو 600 ميكرولتر إذا كنت تستخدم كوفيت 5 مم × 5 مم ، أو 2.5 مل إذا كنت تستخدم كوفيت 1 سم × 1 سم.
    1. تحضير عينة البروتين بين المتبرع والمتقبل باستخدام كميات مولية متساوية من المتبرع فقط والبروتين المتقبل فقط.
    2. الحفاظ على نفس الكمية من العينة المصنفة في المتبرع المسيطر فقط وقبول عينات البروتين فقط من خلال إدخال البروتين غير المسمى بكمية مولية متساوية إما للمتبرع فقط أو للعينات المتقبلة فقط. على سبيل المثال، بالنسبة للمحاليل التي لها نفس التركيز، ستحتوي كل عينة من FRET للمتبرعين فقط على 100 ميكرولتر من البروتين المخصص للمتبرعين فقط و100 ميكرولتر من البروتين غير المسمى لحجم 200 ميكرولتر.
  2. توليد أطياف الانبعاثات الفلورية للمتبرع فقط، والمتقبل فقط، وعينات المتبرع المتقبل. قم بتحسين الإشارة كما هو موضح في الخطوة 3.2. بمجرد تحسينها ، حافظ على نفس الإعدادات لجميع العينات.
    1. احصل على الفحص الخاص بالجهات المانحة فقط كما هو موضح في الخطوة 3.3. إثارة الحل في الحد الأقصى لامتصاص صبغة المتبرع والمسح الضوئي على المتبرع وذروة الانبعاثات (المتوقعة) المتقبل.
    2. إما استبدال العينة بالبروتين المتقبل فقط أو تغيير موضع مغير العينة إلى كوفيت يحتوي على البروتين المتقبل فقط.
    3. احصل على فحص انبعاث للبروتين المسمى بصبغة المتقبل فقط (بروتين المتقبل فقط) باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 4.2.1. إثارة العينة عند الطول الموجي للإثارة المانحة.
      ملاحظة: يوفر هذا الطيف تصحيحا لمقدار المتقبل المثار عند الطول الموجي للمانح (FA في الخطوة 5.1.2)
    4. تبادل العينة إلى عينة البروتين المانح المتقبل أو قم بتغيير موضع مغير العينة إلى الكوفيت الذي يحتوي على البروتين المسمى المتبرع المتقبل.
    5. احصل على فحص انبعاث لعينة البروتين بين المتبرع والمتقبل باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوتين 4.2.1 و4.2.3.
    6. بالنسبة لجميع الأطياف، يرجى تصحيح تألق الخلفية عن طريق طرح أعداد الخلفية التي تم قياسها في نهاية الفحص.
  3. قياس عمر المتبرع للمتبرع فقط والعينات المتبرع المتقبل المعدة كما هو موضح في الخطوة 4.1.2. استخدم أداة تألق عد الفوتون الواحد المرتبطة بالوقت والقادرة على قياس وحل الاضمحلالات الفلورية في النطاق الزمني للنانوثانية (10-9 ثانية).
    ملاحظة: بالنسبة لأزواج صبغات FRET ، قم بمطابقة مصدر ضوء الإثارة مع الحد الأقصى لامتصاص صبغة المتبرع.
    1. قم بتشغيل الأداة. افتح برنامج الاستحواذ ، واستخدم برنامج التحكم في الأداة للحصول على البيانات باستخدام مطياف التألق.
    2. للاستحواذ، حدد TCSPC Decay، مع نطاق زمني يبلغ 55 ns، وكسب 1 و 4096 قناة.
    3. احصل على وظيفة استجابة الأداة (IRF) باستخدام محلول كريمة غير الألبان أو محلول تشتت تجاري وراقب التشتت عند 490 نانومتر. اضبط إعداد الشق واستخدم مرشحات الكثافة المحايدة حسب الحاجة للحفاظ على معدل عد منخفض بما يكفي لتجنب تراكم النبض5. انقر فوق قبول ثم ابدأ. هذا سيبدأ الاستحواذ.
      ملاحظة: يتم استخدام معدل عد أقصى يبلغ 4000 cps لمعدل تكرار 180 كيلو هرتز.
    4. اجمع IRF عند 490 نانومتر حتى تحتوي قناة الذروة على 20000 عدد كحد أقصى. جمع IRF قبل وبعد قياس كل تسوس التألق.
    5. الحصول على اضمحلال التألق للمتبرع فقط والعينات المانحة المتقبلة من خلال رصد انبعاث التألق عند الطول الموجي للانبعاثات لدى المتبرع ، 520 نانومتر.
    6. اضبط إعدادات الشق للحصول على معدل عد أقصى يبلغ 4000 cps أو أقل. عادة ما تكون إعدادات الشق عبارة عن ممر نطاق 15-20 نانومتر لعينات البروتين. جمع الاضمحلال حتى يتم الحصول على 20000 عدد في قناة الذروة.
  4. تحليل الاضمحلال أو شدة التألق (I) كدالة للوقت (t) لعمر التألق (τ). ضع الاضمحلال في مجموع الأس بالمعادلة التالية:
    Equation 7
    حيث α I هو العامل الأسي للمكون ith و τ I هو العمر. يتم إعادة تشكيل الملاءمة مع IRF لتتناسب مع اضمحلال التألق. احكم على جودة الملاءمة من معلمات Χ2 المخفضة.

5. تحليل بيانات FRET

  1. احسب كفاءة FRET من الانخفاض في كثافة المتبرع لعينة المتبرع المتقبل بالنسبة للمتبرع فقط بالمعادلة التالية.
    Equation 8
    حيث FDA هي شدة التألق لعينة المتبرع المتقبل و FD هي شدة التألق للعينة المانحة فقط في ذروة التألق المانح. استخدم المناطق المتكاملة للقمم إذا كانت البيانات صاخبة.
    1. صحيح لأي اختلافات في وضع العلامات بين العينات المانحة فقط وعينات المتبرع المتقبل. احسب التصحيحات بناء على درجة وضع العلامات من قبل المتبرع على النحو التالي.
      Equation 9
      حيث f DA هي كفاءة وضع العلامات على الجهات المانحة في عينة المتبرع - المتقبل و fD هي كفاءة وضع العلامات في عينة المتبرع فقط.
    2. صحيح لأي مساهمات من التألق المتقبل في الطيف المتحمس للمانح من خلال طرح طيف البروتين المتقبل فقط (الخطوة 4.2) من طيف البروتين بين المتبرع والمتقبل.
      Equation 14
    3. صحيح للاختلافات في كفاءة وضع العلامات على البروتين المتقبل فقط بالنسبة لعينة البروتين المتبرع المتقبل التي تنتج المعادلة التالية لحساب الكفاءة:
      Equation 10
      حيث يشير fA إلى المقدار الكسري لوضع العلامات على المتقبل. تتضمن هذه المعادلة جميع التصحيحات بسبب وضع العلامات على الصبغة وتألق المستقبل.
    4. احسب مسافات FRET من الكفاءات باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 11
      باستخدام قيمة R0 التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6.5.
    5. احسب كفاءة FRET باستخدام العمر الفلوري للمتبرع فقط والعينات المتقبلة للمتبرع المقاسة في الخطوة 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. استخدم العمر الافتراضي المرجح بالسعة لحساب كفاءات FRET ومقارنتها بنتائج الحالة الثابتة5.
      Equation 13
    7. احسب المسافة كما في الخطوة 5.1.4 من الكفاءات التي يحددها عمر التألق. قارن قيم الحالة الثابتة والقيم التي تم حلها عبر الزمن لكفاءة FRET والمسافات وتأكد من أنها تقع ضمن خطأ بعضها البعض.

6. رسم خرائط المسافات

  1. استخدم المسافات المحسوبة لتعيين موقع الربط على الهيكل ثلاثي الأبعاد. احسب المسافات والأخطاء لجميع أزواج الأصباغ والمواقع التي تم فحصها باستخدام المعادلة الواردة في قيم الخطوة 5.1.4 وR0 التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6.5 لكل زوج FRET.
    1. استخدم برنامج عرض رسومي ثلاثي الأبعاد مثل PyMOL50 لتعيين المسافات على الهيكل (البرنامج النصي الوارد في الملف التكميلي). يمكن إدخال الأوامر من البرنامج النصي مباشرة في نافذة الأوامر مع معلومات المسافة المناسبة.
    2. قم بإنشاء غلاف لكل مسافة تم قياسها والخطأ المرتبط بها (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الأشكال التكميلية 1-3).
    3. رسم خريطة للموقع من خلال تقاطع الأصداف المختلفة (الأشكال التكميلية 1-3). تم تعيين موقع ربط ببتيد الإشارة من خلال المواقع الثلاثة المختلفة على SecA و SecYEG وأربعة مواقع مختلفة على ببتيد الإشارة (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ركزت هذه الدراسة على تحديد موقع ربط ما قبل البروتين على SecA قبل إدخال البروتين المسبق في قناة SecYEG. لرسم خريطة لموقع الربط ، تم إجراء تجارب FRET بين مناطق مختلفة من البروتين المسبق وثلاثة مواقع متميزة على بروتينات SecA و SecYEG (الشكل 1A-D). من المسافات التي تم الحصول عليها والهياكل ثلاثية الأبعاد ل SecA و SecYEG و preprotein ، تم التنبؤ بموقع ربط ما قبل البروتين. بدلا من استخدام ثلاثة كيانات منفصلة (SecA و SecYEG و preprotein) لإجراء هذه القياسات ، تم إرفاق تسلسل إشارة PhoA ب SecA من خلال التعديل الوراثي بعد دمج رابط Gly-Ser 2,3. من أجل وضع العلامات السهلة مع الأصباغ ، تم إدخال بقايا Cys أو طفرات العنبر في المخلفات 2 و 22 و 35 و 45 في البروتين المسبق PhoA (الشكل 1E).

تحديد المواقع ووضع العلامات
وقد سبق تحديد موقع ربط مفترض لتسلسل الإشارة باستخدام أساليب رسم خرائط FRET مماثلة 2,32. وقد حددت هذه الدراسات وغيرها الإصبع الحلزوني (THF) ومجال الربط المتقاطع بين ما قبل البروتين كمواقع ربط محتملة لببتيد الإشارة مع اتجاه مقترح في موضع مواز ل THF 33,51,52,53,54 (الشكل 1F). وهكذا ، تم تحديد مواقع وضع العلامات المحتملة على بروتينات SecA و SecYEG بناء على موقع موقع الربط المفترض في البنية البلورية SecA و SecYEG (كما هو موضح باللون الأخضر في الشكل 1A-D). تم اختيار ثلاثة مواقع لتثليث موقع الربط المفترض ، حيث تشكل المواقع الثلاثة أساسا مثلثا حول موقع الربط المفترض. وكما هو مبين في الشكل 1، كانت المواقع الثلاثة ضمن نطاق FRET لموقع الربط (50-70 Å). تم اختيار زوج الصبغة Alexa Fluor 488 (AF488) و Alexa Fluor 647 (AF647) ، حيث تتوافق قيمة R0 البالغة 55.7 Å36 بشكل جيد مع المسافات المتوقعة بين المواقع المصنفة وموقع الربط المفترض لضمان دقة القياس.

تقع المواقع الثلاثة المختارة لوضع العلامات ، SecA37 و SecA321 و SecY292 (الموضحة ككرات أرجوانية وبنفسجية وسماوية في الشكل 1A-D) في جميع أنحاء مجمع البروتين الذي يشكل مثلثا حول موقع الربط المفترض. تم تحور المواقع الثلاثة بشكل منفصل إلى بقايا Cys في متحور أقل من Cys لضمان تسمية الموقع الصحيح فقط ب 2,37. بالنسبة لتجارب SecY292 ، تم تصنيف مواقع ما قبل البروتين PhoA مع AF647 وتم تصنيف بقايا SecY 292 مع AF488 باستخدام كيمياء ماليميد. في البروتين الخيمري ، تم تصنيف المواقع SecA37 و SecA321 ب AF647 وتم تسمية البروتين المسبق ب AF488. في البروتين الخيمري SecA-PhoA ، تم تحور كل من بقايا 2 و 22 و 37 و 45 من قطاع البروتين المسبق PhoA إلى كودون كهرماني في البروتينات الفردية. سمحت طفرات كودون العنبر بإدخال حمض أميني غير طبيعي ، p-azidophenylalanine ، في تلك المواضع ، والتي تم تصنيفها لاحقا باستخدام AF488 باستخدام كيمياء النقر39,40. تم إنشاء كل طفرة وتصنيفها بشكل مستقل لضمان وضع العلامات الصحيحة والتفاضلية لمكونات البروتين. تم تحديد درجة وضع العلامات لجميع البروتينات وكانت هناك حاجة عموما إلى أن تكون 50٪ أو أفضل من أجل المضي قدما في العينة.

تحديد كفاءات النقل والمسافات
قبل إجراء قياسات نقل الطاقة ، تم تحديد العائد الكمومي للمانح ، وتداخل التكامل وقيم R0 (الخطوات 3.4-3.6). تم قياس العائد الكمومي للمتبرع بالنسبة للصبغة ، الفلوريسين ، التي يبلغ محصولها الكمومي 0.79 في 0.1 M NaOH47. تم الحصول على أطياف انبعاث الامتصاص والتألق في سلسلة من التركيزات لتوليد مخطط خطي للامتصاص بالنسبة لكثافة انبعاثات التألق لتحديد العائد الكمومي. في هذه القياسات ، من الأهمية بمكان قياس الامتصاص في النطاق الخطي (0.1-1.0) ويجب إنشاء جميع قياسات الانبعاثات بنفس إعدادات الشق. نظرا لأن هذه القيم تستخدم لتحديد التكاملات المتداخلة وقيم R0 ، فيجب قياسها في ظل ظروف FRET. تؤثر البيئة المحلية للبروتين تأثيرا عميقا على انبعاث الصبغة ، وبالتالي ، يجب قياس الغلة الكمومية المانحة لكل موقع من المواقع التي تم التحقيق فيها. نلاحظ أن المواقع على SecA و SecYEG تؤثر على قيم R0 بقوة أكبر من تلك الموجودة في جزء PhoA من الوهم. بالنسبة لأزواج الصبغات التي لها نفس موقع SecA أو SecYEG ، تكون قيم R0 عادة ضمن 5 Å من بعضها البعض ؛ في حين أن قيم R 0 يمكن أن تختلف بمقدار 20 Å لموقعي SecA المختلفين (المخلفات 37 مقابل 321) ، مما يؤكد أهمية تحديد قيم R0 لكل زوج صبغة (الجدول 1).

يفترض حساب R0 أن الأصباغ المانحة والمتقبلة تدور بحرية وأن الدرجة التي لا تدور بها الأصباغ تساهم في عدم اليقين العام في القياس. لمراعاة الحركة النسبية للأصباغ وتوجهاتها بشكل مناسب ، تم إجراء قياسات تباين التألق في الحالة الثابتة على جميع الأصباغ المانحة والمتقبلة في مواضع وضع العلامات المختلفة. تم استخدام هذه القيم ، التي كانت في نطاق 0.10-0.21 ، لحساب الخطأ المرتبط بقياسات المسافة 2,3,48. تتوافق قيم التباين العالية نسبيا التي لوحظت لكل من الأصباغ المانحة والمتقبلة مع انخفاض في دوران الصبغة ، وهو ما لا يتفق مع افتراض الدوران الحر. يؤدي عدم وجود دوران حر إلى حدوث خطأ بنسبة 19٪ -25٪ في حسابات المسافة. وكما هو مبين في الجدول 1، أدى ذلك إلى عدم يقين متوسط في المسافات المقاسة التي لا تزيد ± 15 Å. عند رسم خرائط مسافات FRET ، تعد هذه الشكوك في قياسات المسافة اعتبارا مهما ، كما هو موضح أدناه.

وتستند المسافة المحسوبة بين أزواج المانحين والمتقبلين إلى العلاقة بين الكفاءة والمسافة، حيث تكون الكفاءة الأعلى مؤشرا على أزواج المانحين والمتقبلين التي تفصل بينها مسافة أقصر. لتحديد كفاءات FRET ، يتم الحصول على أطياف الانبعاثات الفلورية المثارة عند الطول الموجي لإثارة المتبرع (488 نانومتر) على عينات من المانحين فقط والمتقبلين من المانحين. وعادة ما يعني انخفاض كثافة انبعاثات الجهات المانحة وجود نقل للطاقة (الخطوة 5-1). ويصور الشكل 1G أطياف المتبرع - المتقبل لبقايا SecA 37 مع البقايا 2 أو 22 من وهم PhoA. يتم تسمية بقايا SecA37 ب AF647 أو صبغة المتقبل ، ويتم تسمية بقايا PhoA ب AF488 أو صبغة المتبرع. في أي من الوضعين ، يتم تقليل التألق المانح ويمكن ملاحظة زيادة طفيفة في شدة التألق المتقبل في عينات المتبرع - المتقبل. نظرا لأن الإثارة تتم عند الطول الموجي للإثارة المانحة البالغ 488 نانومتر ، والذي لا يثير المتقبل مباشرة ، فإن أي تألق متقبل لوحظ ينتج عن نقل الطاقة. وبالتالي ، فإن الانخفاض في كثافة المتبرعين والزيادة المصاحبة في كثافة المتقبلين ينتج عن نقل الطاقة بين الأصباغ. بشكل ملحوظ ، تكون كثافة التألق المانحة أعلى لموضع PhoA2 (الأزرق) بالنسبة إلى موضع PhoA22 (الأصفر) في وجود القبول. يشير هذا الاختلاف النسبي في انخفاض كثافة المتبرع إلى أن نقل الطاقة بين بقايا PhoA2 وبقايا SecA37 أضعف من النقل بين بقايا PhoA22 و SecA37 ، مما يعني أن بقايا PhoA2 تقع بعيدا عن SecA37 من PhoA22. يتم تحديد المسافات من العلاقة بين الكفاءة وقيم R0 (الخطوة 5.1.4).

نظرا لأن قياسات التألق ذات الحالة الثابتة يمكن أن تمثل في المتوسط مسافتين أو أكثر ، فقد أجرينا أيضا قياسات التألق التي تم حلها عبر الزمن. بالنسبة لهذه التجارب ، يتم قياس عمر صبغة المتبرع في وجود وغياب المتقبل (الشكل 1G). وإذا كانت هناك عمليتان متميزتان لنقل الطاقة تسهمان في قياس كفاءة التألق في الحالة الثابتة، فسيلاحظ أنهما عمران سريان، شريطة أن يكونا قابلين للحل ضمن الاستبانة الزمنية للأداة. لتعزيز القدرة على حل الحيوات ، يجب جمع 10000 عدد أو أكثر في الذروة ؛ ومع ذلك ، يجب موازنة ارتفاع الذروة أو عدد قنوات الذروة مع وقت الاكتساب والضرر المحتمل للعينة. أسفرت القياسات التي تم حلها عبر الزمن عن عمر واحد لكل زوج من المتبرعين والمتقبلين بما يتفق مع اتجاه أو مسافة واحدة فقط بين الأصباغ. نلاحظ أن الاختلافات الصغيرة في المسافة كما لوحظ في المناطق التي كشفت عنها تقنية رسم الخرائط FRET الخاصة بنا لن تؤدي إلى عمر افتراضي قابل للحل في نظامنا. علاوة على ذلك ، كانت الكفاءات التي تحددها قياسات التألق التي تم حلها زمنيا متفقة بشكل جيد مع تلك المحددة من قياسات الحالة الثابتة ، مما يوفر مزيدا من الدعم بأن الكفاءات المقاسة تنشأ من مسافة واحدة فقط بين أزواج الصبغات3.

رسم خرائط مسافات FRET على هيكل ثلاثي الأبعاد
تنتج قياسات نقل طاقة الرنين معلومات مسافة كافية لتحديد موقع الربط واتجاه تسلسل الإشارة على SecA. توفر المواقع الثلاثة على SecA و SecYEG إلى جانب المواقع الأربعة في منطقة PhoA في Chimera SecA-PhoA المسافات المختلفة ال 12 المستخدمة لرسم خريطة لموقع الربط (الجدول 1). تم تعيين المسافات الاثنتي عشرة على بنية البلورية المشتركة ثلاثية الأبعاد للأشعة السينية لمجمع Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) لتحديد موقع ربط تسلسل الإشارة33. يشبه هيكل مجمع SecA-SecYEG تلك التي لوحظت في E. coli كما يتضح من دراسة الربط الضوئي في الجسم الحي 55.

نستخدم بقايا البداية (PhoA2) والنهاية (PhoA22) لتسلسل إشارة PhoA في كيميرا SecA-PhoA لتوضيح كيفية تحديد مواقع المخلفات في مجمع SecA-SecYEG. نظرا لأن نقل الطاقة يمكن أن يحدث في جميع الاتجاهات ، فإن مسافات FRET والأخطاء المرتبطة بها تصف قشرة كروية ، مع تعيين أحد مواقع الصبغة من زوج المتبرع والمتقبل كمركز. في هذه الدراسة ، تشكل المخلفات SecA37 و SecA321 و SecY292 مراكز ثلاث قذائف كروية تصف موقع بقايا PhoA2 لتسلسل الإشارة. يظهر في الشكل 3 تصور للمناطق المتداخلة الناشئة عن المواقع الثلاثة المنفصلة، SecA37 (أرجواني)، SecA321 (أرجواني)، و SecY292 (سماوي). يتقاطع جزء فقط من كل قشرة FRET مع بنية البروتين ، ويتم تسليط الضوء على المخلفات والعمود الفقري التي تقع داخل تلك القشرة. وبالتالي ، فإن مناطق البروتين داخل القشرة المحددة بمسافة SecA37-PhoA2 موضحة باللون الأرجواني (الشكل 3A ، E) ، في حين تظهر المناطق المحددة بواسطة قذائف SecA321-PhoA2 و SecY292-PhoA2 باللون الأرجواني (الشكل 3B ، F) والسماوي (الشكل 3C ، G) ، على التوالي. يظهر موقع الربط المفترض ، الذي يتكون أساسا من إصبع الحلزون الثنائي ، باللون الأخضر.

كما هو موضح في الشكل 3 ، تحدد كل قشرة من قذائف FRET هذه قسما كبيرا نسبيا من مجمع البروتين. بالنسبة لجميع المواقع الثلاثة ، تتقاطع قشرة FRET مع موقع الربط المفترض ؛ ومع ذلك ، بالنسبة لبقايا SecA321 ، على سبيل المثال ، تكون المنطقة المتقاطعة أصغر وتقع نحو نهايات الأصابع مع تداخل كبير مع مجال السقالة الحلزونية. يحدد التقاطع أو المنطقة المشتركة لجميع قذائف FRET الثلاثة (الشكل 3D ، H) ، موقع بقايا PhoA2. هذه المنطقة أصغر بكثير من كل قشرة FRET وتشمل جزءا صغيرا فقط من THF مع مساهمة كبيرة من السقالة الحلزونية. يتم إعطاء البرامج النصية المستخدمة لتوليد قذائف FRET والمناطق المتقاطعة لبرنامج التصور الجزيئي ، PyMOL ، في المعلومات التكميلية. يتم تصور أجزاء من الأصداف كنقاط وردية على مجمع SecA-SecYEG في الأشكال التكميلية 1-3.

تم استخدام استراتيجية مماثلة لتحديد موقع بقايا PhoA22. تصف أغلفة FRET المحددة بمسافات PhoA22 FRET (الشكل 4A-C ، E-G) مساحة أصغر بالنسبة إلى بقايا PhoA2 (الشكل 4D ، H مقابل الشكل 3D ، H). نحن نفسر هذا الاختلاف على أنه يشير إلى أن بقايا PhoA2 والمنطقة المرتبطة بها أكثر مرونة ومرونة من PhoA22. ومن الجدير بالذكر أن المنطقة المنسوبة إلى بقايا PhoA22 تقع بالقرب من طرف THF ومصب قناة SecYEG ، مع تحديد مناطق SecY في المنطقة المشتركة (الشكل 3D ، H). تحدد جميع أزواج الأصباغ الثلاثة المناطق جنبا إلى جنب مع موقع الربط المفترض ؛ ومع ذلك ، فإن المناطق المشتركة المتقاطعة تتمركز في موقع PhoA22 (الشكل 4D ، H) في الطرف الآخر من THF بالنسبة لموقع PhoA2 (الشكل 3D ، H). تشير هذه النتائج إلى أن تسلسل إشارة البروتين المسبق الذي يمتد من المخلفات 2-22 ، يقع على طول THF في حالة غير منظمة نسبيا. وتتفق هذه النتيجة مع الدراسات السابقة التي تشير إلى أن تسلسل الإشارة يرتبط بالبروتين على طول THF في حالة ممتدة وأن الطرف C-terminal من SecA في البنية البلورية B. subtilis يقوم بشكل أساسي بنمذجة بنية ببتيد الإشارة ويحتل نفس الموقع (كما هو موضح باللون الأحمر الشكل 1F)2,26 . استخدمنا نهجا مشابها لتحديد موقعين في المنطقة الناضجة المبكرة (المخلفات 37 و 45) من كيميرا بروتين SecA-PhoA لزيادة تحديد ارتباط واتجاه تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة كما هو موضح أدناه. في دراسات أخرى ، تم استخدام مسافات FRET بشكل فعال لتحسين بنية موجودة أو نموذج مشتق من محاكاة الديناميكا الجزيئية18,19,56; لم نتمكن من القيام بذلك ، حيث لا توجد بنية لتسلسل الإشارة المرتبط ب SecA.  

Figure 1
الشكل 1: مواقع وضع العلامات في مجمع SecA-SecYEG مع أطياف FRET التمثيلية (A-D) أربعة مناظر مختلفة للبنية البلورية المشتركة SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33 حيث تظهر مواقع وضع العلامات الخاصة ب SecA37 و SecA321 و SecY292 ككرات أرجوانية وبنفسجية وسماوية ، على التوالي. A-C هي مناظر جانبية للمجمع و D هي وجهة نظر علوية. يظهر SecA باللون الرمادي الفاتح ، ويظهر SecYEG باللون الرمادي الداكن ويظهر موقع الربط المفترض ، THF ، باللون الأخضر. (ه) مخطط لبنية كيميرا SecA-PhoA ، التي تربط بروتين SecA بالبروتين المسبق PhoA من خلال رابط Ser-Gly (غير مرسوم على نطاق واسع). يتم إعطاء مواقع وضع العلامات على جزء PhoA من الوهم باللون الأزرق والأخضر والأصفر والأحمر ، المقابلة للمخلفات 2 و 22 و 37 و 45. (F) مخطط الشريط للبنية البلورية لبروتين B. subtilis SecA (PDBID: 1M6N) الملون حسب المجال حيث يظهر المجالان 1 و 2 المرتبطان بالنيوكليوتيدات باللون الأزرق والأزرق الفاتح ، على التوالي ، يظهر مجال الربط المتقاطع للبروتين المسبق باللون الذهبي ، والحلزون المركزي باللون الأخضر ، والإصبع الحلزوني المزدوج باللون السماوي ، ومجال الجناح الحلزوني باللون الأخضر الداكن ، والرابط C-terminal باللون الأحمر26 . تعمل المحطة C غير المنظمة كنموذج لببتيد إشارة PhoA المرتبط استنادا إلى دراسة رسم خرائط FRET سابقة2. (ز) أطياف التألق ذات الحالة الثابتة للعينات الفلورية للمتبرع فقط وللمانح - المتقبل للزوج SecA37-AF647 و PhoA2-AF488 FRET وزوج SecA37-AF647 و PhoA22-AF488 FRET. ويدل الانخفاض في كثافة المتبرعين لعينة المتبرع - المتقبل على نقل الطاقة. يحدث نقل أكبر للطاقة من PhoA22 بالنسبة لموقع PhoA2 بناء على انخفاض كثافة المانحين. (ح) أطياف اضمحلال المتبرع بالفلور الذي تم حله زمنيا فقط (أرجواني) والمانح - المتقبل (الأرجواني الخفيف) لأطياف الاضمحلال من زوج SecA37-AF647 و PhoA22-AF488 FRET. تظهر وظيفة استجابة الأداة باللون الرمادي. يعطي مجمع المتبرع المتقبل اضمحلالا أقصر وبالتالي عمرا أسرع يتوافق مع نقل الطاقة. تم إنشاء جميع الهياكل الجزيئية باستخدام ملف PDB المشار إليه و PyMOL50. وقد عدل الشكل 1E-H من Zhang et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: واجهة المستخدم لبرنامج FluorEssence . (أ) تظهر نافذة الافتتاح بدائرة حول M الأحمر. يجب النقر فوق هذا لتوصيل البرنامج بمقياس الفلورومتر. (ب) توضح نافذة إعداد التجربة المناطق المختلفة (الأحاديات وأجهزة الكشف والملحقات) حيث يتم إدخال المعلمات ذات الصلة بالمسح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قذائف مسافة FRET المحددة لموضع SecA-PhoA2. يتم تصوير قذائف مسافة FRET التي تم إنشاؤها من مسافات FRET والشكوك المرتبطة بها (الجدول 1) على مجمع SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (أ-ج) أغلفة مسافة FRET لموقع PhoA2 تم إنشاؤها باستخدام SecA37 (أرجواني) و SecA321 (بنفسجي) و SecY292 (سماوي) ، على التوالي في موضع المركز. يتم تلوين الأصداف وفقا لبقايا المركز. (د) يحدد تقاطع قذائف FRET الثلاثة موقع PhoA2 ، الموضح باللون الأزرق. (ه-ح) يتم تدوير المشاهدات بزاوية 180 درجة تقريبا من A-D. تم إنشاء جميع الهياكل الجزيئية باستخدام ملف PDB المشار إليه و PyMOL50. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: قذائف مسافة FRET المحددة لموضع SecA-PhoA22. يتم تصوير قذائف مسافة FRET التي تم إنشاؤها من مسافات FRET والشكوك المرتبطة بها (الجدول 1) على مجمع SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (أ-ج) قذائف مسافة FRET لموقع PhoA22 التي تم إنشاؤها باستخدام SecA37 (أرجواني) و SecA321 (بنفسجي) و SecY292 (سماوي) ، على التوالي في الموضع الأوسط. يتم تلوين الأصداف وفقا لبقايا المركز. (د) يحدد تقاطع قذائف FRET الثلاثة موقع PhoA22 ، الموضح باللون الأصفر. (ه-ح) يتم تدوير المشاهدات بزاوية 180 درجة تقريبا من A-D. تم إنشاء جميع الهياكل الجزيئية باستخدام ملف PDB المشار إليه و PyMOL50. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: المواقع المخططة من قبل FRET ل PhoA2 و PhoA22 و PhoA37 و PhoA45 المسقطة على بنية B. subtilis SecA - Geobacillus thermodenitrificans SecYE cocrystal (PDBID: 5EUL). (A) تلوين SecA-SecYE كما في الشكل 1. تظهر ركيزة الببتيد OmpA المدرجة في نهاية THF باللون الوردي. تم إنشاء المناطق التي تم تعيينها بواسطة FRET في وجود ATP-γS ، مع عرض PhoA2 باللون الأزرق ، و PhoA22 باللون الأخضر ، و PhoA37 باللون الأصفر ، و PhoA45 باللون الأحمر. تظهر المناطق المتداخلة بالزيتون (PhoA22 و PhoA37) والبرتقالي (PhoA37 و PhoA45). تم اقتطاع ركيزة الببتيد (بقايا 749-791 ، سماوي) من الهيكل الأصلي ونمذجتها في منطقة الربط المفترضة دون أي تغييرات على الهيكل (دائرة باللون الأحمر). (ب) عرض موسع لركيزة الببتيد النموذجية. يتم تصوير المخلفات 2 (Lys) و 22 (Tyr) و 37 (Gly) من ركيزة الببتيد OmpA في شكل عصا باللون الأزرق والأخضر والأصفر ، على التوالي. تظهر هذه المخلفات في الببتيدات النموذجية اتفاقا ممتازا مع المواقع المتوقعة التي تم تعيينها من قبل FRET. للتوضيح ، تم حذف النانو في الهيكل الأصلي. وقد عدل هذا الرقم من Zhang et al.3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

موقع مصنف على مجمع SecA-PhoA-SecYEG موقع مصنف على جزء الببتيد PhoA من SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
كفاءة FRET 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
بون 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
كفاءة FRET 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
بون 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
كفاءة FRET 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
بون 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
مقتبس من المرجع 3.
تم حساب قيم R0 الواردة في angstroms كما هو موضح في النص
تم حساب كفاءة FRET من الانخفاض في كثافة التألق المانحة في وجود المتقبل كما هو موضح. يتم الإبلاغ عن الخطأ على أنه SD من ثلاثة قياسات مستقلة.
يتم إعطاء المسافات بين المتبرع والمتقبل (R) في angstroms ويتم حسابها كما هو موضح في النص. ينتج الخطأ المبلغ عنه عن النظر في الخطأ التجريبي والخطأ الناشئ عن اتجاه الأصباغ.  يقدر اتجاه الصبغة من تباين التألق في الحالة الثابتة

الجدول 1: كفاءات النقل والمسافات المحددة لمجمع SecA-PhoA-SecYEG. يتم إعطاء كفاءات FRET والمسافات وقيم R0 للمسافات ال 12 المستخدمة لرسم خرائط لموقع ربط ما قبل البروتين.

الشكل التكميلي 1: تم تحديد غلاف مسافة FRET ، الموضح بنقاط وردية ، لبقايا SecA37 وبقايا PhoA 37 على مجمع SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). يظهر Sec A باللون الرمادي الفاتح ، ويظهر SecYEG باللون الرمادي الداكن ويظهر بقايا SecA37 باللون الأرجواني. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: غلاف مسافة FRET ، الموضح في نقاط وردية ، محدد لبقايا SecA321 وبقايا PhoA 37 على مجمع SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). يظهر Sec A باللون الرمادي الفاتح ، ويظهر SecYEG باللون الرمادي الداكن ويظهر بقايا SecA321 باللون البنفسجي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: غلاف مسافة FRET ، الموضح في نقاط وردية ، محدد لبقايا SecY292 وبقايا PhoA 37 على مجمع SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). يظهر Sec A باللون الرمادي الفاتح ، ويظهر SecYEG باللون الرمادي الداكن ويظهر بقايا SecY292 باللون السماوي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف تكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من خلال استخدام منهجية رسم الخرائط FRET ، حددنا موقع ربط تسلسل الإشارة على بروتين SecA. الأهم من ذلك ، أن وجود بنية بلورية 3-D للمجمع سهل دراستنا بشكل كبير. تكمن قوة منهجية رسم الخرائط هذه في القدرة على استخدام هيكل موجود لتحديد المواقع لوضع العلامات. لا يمكن استخدام هذه المنهجية لتحديد هيكل 3-D. ومع ذلك ، فإن تحديد العناصر الهيكلية56 ، أو صقل هيكل موجود49 ، أو تحديد موقع ملزم 2,32 ، أو توضيح الحركة الديناميكية57 ، كلها تطبيقات ممكنة لهذه الطريقة.

في مجمع SecYEG-SecA-PhoA ، تشكل مواقع وضع العلامات الثلاثة مثلثا حول موقع الربط المفترض (الشكل 1). إن استخدام قياسات المسافة المتعددة من قمم هذا المثلث إلى نفس البقايا يحسن معلومات الموقع المشابهة لطرق الملاحة GPS. تم تحديد ثلاثة مواقع ، SecA37 و SecA341 و SecY292 ، على SecA و SecY إلى جانب أربعة مواقع ، PhoA2 و PhoA22 و PhoA37 و PhoA45 في تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق لإعطاء ما مجموعه 12 مسافة لرسم خرائط لموقع ببتيد الإشارة (الجدول 1). الأهم من ذلك ، لتحسين دقة قياسات المسافة ، يجب أن تكون مواقع وضع العلامات موجودة في مناطق ثابتة نسبيا من البروتين ، مثل عناصر الهيكل الثانوي بدلا من الحلقات. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تكون المواقع أيضا في مواقع يسهل على المذيبات الوصول إليها نسبيا من أجل سهولة وضع العلامات وزيادة كفاءتها. داخل مجمع SecA-PhoA-SecYEG ، كان أداء قياسات المسافة من مواقع المثلث أو القمم إلى المخلفات في الركيزة الملزمة كافيا لتحديد موقع المخلفات في الركيزة الملزمة إلى منطقة صغيرة نسبيا (الشكل 3D و H والشكل 4D و H). إن تحديد المنطقة المتقاطعة من قياسات المسافات المتعددة يحسن بشكل كبير الموقع من موقع قياس المسافة الواحدة ، كما هو موضح في الشكل 3 والشكل 4. وبالتالي ، عند استخدام هذه الطريقة ، يوصى بشدة بقياس مسافات متعددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكنها تحديد مناطق الجزيئات المشاركة في الربط ، على سبيل المثال ، إلا أنها لا توفر معلومات هيكلية دقيقة ؛ من الأفضل الحصول على هذه المعلومات من الطرق الهيكلية الأخرى مثل الأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي و cryo-EM. يمكن استخدام مسافات FRET لتحسين بنية موجودة18,19 أو نموذج ، في هذه الحالة ، لم يكن ذلك ممكنا نظرا لعدم وجود نموذج لتسلسل الإشارة المرتبط ب SecA.

لضمان أن وضع العلامات على الأصباغ يحدث في المواقع المرغوبة فقط وأن قياسات مسافة FRET دقيقة ، يفضل استخدام الطفرات لوضع العلامات. يتطلب توليد متحور أقل من Cys طفرة محافظة نسبيا من بقايا Cys إلى Ser أو بقايا مماثلة في البروتين من النوع البري باستخدام طرق الطفرات الموجهة للموقع. في الدراسة الحالية ، تم إدخال طفرات Cys في إصدارات خالية من Cys من SecA و SecYEG لوضع العلاماتعلى 37. تم التحقق من نشاط البروتين المتحور من خلال فحص النمو متبوعا بفحص ATPase الأخضر في المختبر للمالاكيت41,42. تعتمد مقايسات النشاط ذات الصلة على وظيفة البروتين ، على سبيل المثال بالنسبة لبروتينات ربط الحمض النووي ، سيكون فحص ربط الحمض النووي مناسبا58. يمكن أن يؤدي الفشل في ضمان وضع العلامات في موقع واحد فقط إلى وضع علامات على أكثر من موقع واحد بنفس الصبغة ، مما يعقد بشكل كبير تحديد المسافة. وبالتالي ، يمكن إدخال ملصق ثان على نفس البروتين من خلال دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية عن طريق الطفرات الموجهة للموقع. استخدمنا هذه المنهجية لتسمية كيميرا SecA-PhoA في مواقع متميزة عن بقايا Cys من خلال إدخال الحمض الأميني غير الطبيعي ، p-azidophenylalanine ووضع العلامات باستخدام كيمياء النقر39,40.

هناك اعتبار مهم إضافي لهذه الطريقة هو اختيار الأصباغ المستخدمة وقيمة R0 المرتبطة بها. بعد تحديد مواقع وضع العلامات المحتملة ، يمكن تقدير المسافات التي سيتم قياسها من هيكل 3-D. باستخدام هذه المعلومات ، يمكن للمحققين اختيار أزواج الأصباغ مع قيم R0 التي تمتد على النطاق المطلوب من المسافات المتوقعة. على سبيل المثال ، يحتوي زوج الصبغات AF488-AF647 على R0 محسوب من 55.7 Å مما يوفر نطاقا جيدا لمواقع وضع العلامات التي تقع على بعد 40-75 Å من موقع الربط المفترض. على الرغم من أن قيم R0 المحسوبة في الخطوة 2.2 مفيدة لاختيار زوج الأصباغ الذي سيتم استخدامه لنظامك ، إلا أن ربط الأصباغ بالبروتين يمكن أن يغير خصائصها بشكل كبير. ولمزيد من الدقة، ينبغي حساب قيم R0 من التجارب الموقعية التي أجريت باستخدام البروتين المسمى (الخطوات 3-1 - 3-6-5).

يمكن قياس كفاءة النقل إما عن طريق رصد انبعاثات التألق في الحالة الثابتة وملاحظة إما انخفاض في انبعاثات الجهات المانحة أو زيادة في انبعاثات المتقبلين. على الرغم من أن ملاحظة كلا التأثيرين أمر مرغوب فيه ، إلا أنه يمكن حساب الكفاءة من أي منهما كما هو موضح 5,8. ويمكن أيضا حساب الكفاءة من الانخفاض في عمر المتبرع في عينة المتبرع - المتقبل بالنسبة للعينة المانحة فقط. يوصى بتحديد الكفاءة بأكثر من طريقة واحدة، ولا سيما استخدام أساليب تم حلها عبر الزمن لتحديد التجانس النسبي للكفاءات المقاسة.

سمحت لنا طريقة رسم الخرائط أيضا بتحديد الاتجاه النسبي لتسلسل الإشارة والمناطق الناضجة المبكرة من بروتين PhoA المسبق بالنسبة إلى SecA وموقع الربط المفترض. قدمت البنية البلورية للأشعة السينية SecA-SecYEG ودراسة cryo-EM اللاحقة وضوحا فيما يتعلق ببنية تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق فيما يتعلق بالقناة و SecA34,35. في بنية الأشعة السينية ، تم إرفاق بقايا 1-41 من بروتين OmpA المسبق بطرف إصبع الحلزون الثنائي وتصورها في بنية دبوس الشعر في القناة (كما هو موضح باللون الوردي ، الشكل 5). تم تعيين مواقع بقايا PhoA الأربعة في وهم SecA-PhoA على هذا الهيكل باستخدام نفس البروتوكول كما هو موضح أعلاه. كما هو موضح في الشكل 5 ، يقع موقع بقايا PhoA37 و PhoA45 (الأصفر والبرتقالي والأحمر) بين PhoA2 و PhoA22 ، مع PhoA45 أقرب إلى PhoA2. هذه النتائج ، وخاصة موقع PhoA45 ، تشير إلى أن بروتين PhoA المسبق كان يشكل بنية دبوس الشعر.

لمزيد من التحقق من صحة موقع الربط الذي حددته FERET ، أجرينا مقارنة لمواقعنا المخططة مع موقع بروتين OmpA ، عن طريق استئصال بنية ما قبل البروتين المتبقية 41 من القناة ونمذجتها في المناطق المحددة بواسطة رسم خرائط FRET (الشكل 5 ، سماوي). بدون أي تغيير في بنية الأشعة السينية قبل البروتين ، نجد أن مواقع المخلفات 2 و 22 و 37 (الموضحة باللون الأزرق والأخضر والأصفر) على بنية استئصال جزء ما قبل البروتين OmpA تتفق بشكل جيد بشكل ملحوظ مع المواقع المخططة ل FRET (الشكل 5B) وتشير إلى أن دبوس الشعر يتشكل قبل دخول القناة. ينتهي بروتين OmpA المسبق عند البقايا 41 في البنية البلورية للأشعة السينية. ومع ذلك ، فإن المحطة الطرفية C من SecY ، وهي غير منظمة ، توفر مؤشرا على الموقع المحتمل ل PhoA45. في هيكلنا النموذجي ، تقع حلقة دبوس الشعر عند فم القناة ، وتستعد لتسهيل نقل البروتين المسبق عبر الغشاء. وهكذا ، في هذا المثال ، تعزز منهجية رسم الخرائط FRET المعلومات الموجودة عن بنية SecA-SecYEG الثابتة ، من خلال توفير تلميح للحركة الديناميكية اللازمة لنقل البروتين عبر الغشاء. على الرغم من أنها ليست مناسبة لتحديد بنية de novo ، إذا كانت المعلومات الهيكلية ثلاثية الأبعاد متاحة ، فإن منهجية رسم الخرائط FRET يمكن أن تعزز الفهم الحالي للعلاقات بين البنية والوظيفة ، من خلال توضيح مواقع الربط والحركات الديناميكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R15GM135904 (الممنوحة ل IM) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة GM110552 (الممنوحة ل DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 181 ، التألق ، نقل الطاقة ، SecA ، نقل البروتين ، رسم خرائط FRET
رسم خرائط نقل الطاقة بالرنين Förster: منهجية جديدة لتوضيح الميزات الهيكلية العالمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter